Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee) - Stiftung Tierärztliche ...

Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee)
der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Braunschweig
Erstellung
α1,3- Galaktosyltransferase defizienter Schweine
durch somatischen Kerntransfer und homologe
Rekombination
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
zur Erlangung des Grades eines
DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Björn Petersen
aus Hamburg
Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. T. Leeb
Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2004
Die vorliegende Arbeit wurde durch finanzielle Mittel der DFG gefördert (SFB 265)

Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung ........................................................................................................... - 1 -
2. Schriftum........................................................................................................... - 5 -
2.1. Xenotransplantation: Das Schwein als potentieller Organspender .......... - 5 -
2.2. Abstoßungsreaktionen bei xenogener Organtransplantation ................... - 7 -
2.2.1. Hyperakute Abstoßungsreaktion (HAR) ............................................ - 7 -
2.2.2. Akute vaskuläre Abstoßungsreaktion (AVR) ................................... - 10 -
2.2.3. Zelluläre Abstoßungsreaktion.......................................................... - 14 -
2.3. Methoden zur Erstellung transgener Schweine........................................ - 16 -
2.3.1. Erstellung transgener Schweine durch DNA-Mikroinjektion ............ - 16 -
2.3.2. Generierung transgener Schweine durch somatischen
Kerntransfer .................................................................................... - 20 -
2.3.3. Spermienvermittelter Gentransfer ................................................... - 26 -
2.3.4. Lentivirale Transduktion porziner Zygoten ...................................... - 30 -
2.3.5. Gentransfer unter Verwendung künstlicher Chromosomen ............ - 32 -
2.3.6. Effizienz unterschiedlicher Methoden des Gentransfers ................. - 34 -
2.4. Ansätze zur Überwindung der Xenotransplantatabstoßung.................... - 36 -
2.4.1. Transgene Expression humaner Regulatoren der
Komplementaktivierung ................................................................... - 36 -
2.4.2. Eliminierung präformierter Anti-Gal Antikörper................................ - 38 -
2.4.3. Modulation der α1,3-Gal-Expression durch Gen-Targeting............. - 39 -
2.4.4. Modulation der Gal-α1,3Gal-Expression durch indirekte Verfahren - 44 -
2.4.4.1 Maskierung des Akzeptorsubstrates ....................................... - 44 -
2.4.4.2. Galaktosidase-vermittelte Eliminierung der Gal-Epitope ......... - 45 -
2.4.4.3. Gen-Knockout durch komplementäre RNAs ........................... - 47 -
3. Material und Methoden................................................................................... - 49 -
3.1 Kultur primärer Zelllinien ............................................................................. - 49 -
3.1.1 Medien ............................................................................................ - 49 -
3.1.1.1. D10-Medium ........................................................................... - 50 -
3.1.1.2. T3-Medium.............................................................................. - 50 -
3.1.1.3. Serumreduziertes Medium ...................................................... - 51 -
3.1.2. Etablierung primärer Zelllinien......................................................... - 51 -
3.1.2.1. Tiermaterial ............................................................................. - 51 -
3.1.2.2. Gewinnung porziner foetaler und adulter Fibroblasten............ - 51 -
3.1.2.3. Gewinnung porziner Kumuluszellen........................................ - 55 -

Inhaltsverzeichnis
3.2. Erstellung von Wachstumskurven............................................................. - 56 -
3.2.1. Trypsinisieren der Zellen................................................................. - 56 -
3.2.2. Zellzählung mittels Zählkammer...................................................... - 57 -
3.2.3. Populationsverdopplungen.............................................................. - 59 -
3.3. Zellzyklussynchronisation.......................................................................... - 60 -
3.3.1. Zellzyklussynchronisation mittels Kontaktinhibition ......................... - 60 -
3.3.2. Zellzyklussynchronisation durch Serumreduktion ........................... - 61 -
3.3.3. Bestimmung des Zellzyklus durch FACS ........................................ - 62 -
3.4. Somatischer Kerntransfer........................................................................... - 63 -
3.4.1. Präparation der Oozyten für den Kerntransfer ................................ - 63 -
3.4.2. Präparation der Spenderzellen für den Kerntransfer....................... - 63 -
3.4.3. Kerntransfer .................................................................................... - 66 -
3.4.4. Beurteilung der in-vitro- Entwicklung porziner
Kerntransferembryonen .................................................................. - 67 -
3.4.4.1. Morphologische Beurteilung der Embryonen .......................... - 67 -
3.4.4.2. Bestimmung der Kernzahlen der Klonembryonen................... - 67 -
3.5. Molekularbiologische Methoden ................................................................ - 68 -
3.5.1. Präparation von Plasmiden ............................................................. - 68 -
3.5.1.1. Transformation von Bakterien ................................................. - 68 -
3.5.1.2. Kultur der Bakterien ................................................................ - 69 -
3.5.1.3. Plasmid-Maxi-Präparation....................................................... - 69 -
3.5.1.4. Analytischer Verdau der DNA durch
Restriktionsendonukleasen ..................................................... - 70 -
3.5.1.5. Auftrennung von DNA durch Agarose- Gelelekrophorese....... - 70 -
3.6. Transfektion porziner Fibroblasten mit Plasmid-DNA.............................. - 71 -
3.6.1. Aufbau des Reportergenkonstruktes............................................... - 74 -
3.6.2. Beurteilung der EGFP-Expression .................................................. - 75 -
3.6.3. Ermittlung der Transfektionsrate ..................................................... - 76 -
3.7. Transfektionsversuche mit dem Knockout-Vektor PMW8-Neo für die
α1,3- Galaktosyltransferase ....................................................................... - 77 -
3.7.1. Aufbau des Konstruktes .................................................................. - 77 -
3.7.2. Selektionsmedium........................................................................... - 79 -
3.7.3. Charakterisierung isolierter G418-resistenter Zellklone .................. - 79 -
3.8. Polymerase Kettenreaktion (PCR).............................................................. - 81 -
3.8.1. Isolierung genomischer DNA........................................................... - 83 -
3.8.2. Primer ............................................................................................. - 84 -
3.8.3. Long-range (LR)- PCR .................................................................... - 85 -
3.8.4. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ..................... - 86 -
3.8.5. Nested-PCR.................................................................................... - 86 -

Inhaltsverzeichnis
3.9. In-vivo- Experimente zum Kerntransfer..................................................... - 87 -
3.9.1. Induktion einer Trächtigkeit mit geklonten porzinen Embryonen..... - 87 -
3.9.1.1. Pubertätsinduktion der Empfängertiere................................... - 87 -
3.9.1.2. Aufrechterhaltung der Trächtigkeit .......................................... - 87 -
3.9.1.3. Beurteilung der In- vivo- Entwicklungsfähigkeit....................... - 88 -
3.10. Charakterisierung der Klonferkel............................................................. - 88 -
3.10.1. Nachweis der genetischen Identität geborener Ferkel .................... - 88 -
3.10.2. Southern Blot .................................................................................. - 89 -
3.11. Statistische Auswertung........................................................................... - 91 -
3.12. Versuchsaufbau......................................................................................... - 92 -
4. Ergebnisse ...................................................................................................... - 93 -
4.1. Zellkulturen mit primären porzinen Zellen ................................................ - 94 -
4.1.1. Wachstumskurven in Abhängigkeit von Zelllinie und Kulturmedium - 94 -
4.1.1.1. Wachstumskurven foetaler Fibroblasten ................................. - 94 -
4.1.1.2. Wachstumskurven adulter transgener Fibroblasten ................ - 96 -
4.1.1.3. Wachstumskurven porziner Kumuluszellen ............................ - 98 -
4.1.2. Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse der Wachstumskurven- 98 -
4.2. Zellzyklussynchronisation durch Kontaktinhibition oder
Serumreduktion......................................................................................... - 101 -
4.3. Somatischer Kerntransfer......................................................................... - 105 -
4.3.1. In-vitro-Entwicklung geklonter Embryonen.................................... - 105 -
4.3.2. Qualität geklonter Embryonen....................................................... - 107 -
4.4. Erstellung transgener Spenderzellen unter Verwendung eines EGFP-
Reportergenkonstruktes (PGE 150)......................................................... - 109 -
4.4.1. Transfektionsraten nach Elektroporation....................................... - 110 -
4.4.2. EGFP-Expression ......................................................................... - 111 -
4.4.3. Erstellung EGFP- transgener Embryonen..................................... - 111 -
4.5. Erstellung heterozygoter alpha1,3 Gal- Knockout Spenderzellen
durch PMW8-Neo....................................................................................... - 113 -
4.5.1. Isolierte G418-resistente Zellklone................................................ - 114 -
4.5.2. Charakterisierung G418-resistenter Zellklone............................... - 115 -
4.5.3. PCR Ergebnisse G418-resistenter Zellklone................................. - 116 -
4.5.4. LR-PCR zum Nachweis der homologen Integration am 5´Ende ... - 117 -
4.5.5. Nested-PCR.................................................................................. - 118 -

Inhaltsverzeichnis
4.6. In-vivo Experimente zum somatischen Kerntransfer mit nicht-transgenen
Spenderzellen............................................................................................ - 121 -
4.7. Erstellung heterozygoter alpha1,3 Gal knockout Ferkel über somatischen
Kerntransfer............................................................................................... - 123 -
4.8. Charakterisierung der α1,3-Gal- Knockout Ferkel .................................. - 130 -
4.8.1. Nachweis der Integration des Knockout-Vektors........................... - 130 -
4.8.2. Nachweis der homologen Rekombination in den α1,3-Gal-Locus. - 131 -
4.8.3. Nachweis der Spezifität der LR-PCR Ergebnisse ......................... - 132 -
4.8.4. Southern Blot ................................................................................ - 133 -
5. Diskussion und Schlussfolgerungen.......................................................... - 134 -
5.1. Zellzyklussynchronisation und Qualität geklonter porziner
Embryonen ................................................................................................ - 134 -
5.2. Evaluierung des Wachstumspotentials von Spenderzellen in T3-Medium
und Erstellung eines Transfektionsprotokolls ....................................... - 140 -
5.3. Erstellung α1,3- Gal- Ko Ferkel ................................................................ - 143 -
5.4. Schlussfolgerungen und Ausblick........................................................... - 147 -
6. Zusammenfassung....................................................................................... - 148 -
7. Summary ....................................................................................................... - 152 -
8. Literaturverzeichnis ..................................................................................... - 156 -
9. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................... - 189 -
10. Anhang ........................................................................................................ - 193 -
10.1. Medium für die Bakterienkultur und Zusätze ........................................ - 193 -
10.2. Zellkulturmedien...................................................................................... - 194 -
11. Abbildungsverzeichnis .............................................................................. - 195 -
12. Tabellenverzeichnis ................................................................................... - 198 -

1.Einleitung
Einleitung
Die Transplantation ist bei Herz-, Leber- und Lungenversagen häufig die einzige
Rettung. Die Fortschritte der Transplantationsmedizin auf dem Gebiet der
Immunologie und der Entwicklung effektiver Immunsuppressiva, führten in den
letzten 20 Jahren dazu, dass das Langzeitüberleben nach Organtransplantation
heute bei 60-70% liegt (Deutsche Stiftung Organtransplantation 2003). Zur Zeit kann
der Bedarf an Allotransplantaten nicht gedeckt werden.
Seit der ersten erfolgreich durchgeführten Organtransplantation am Menschen
(MURRAY u. HOLDEN 1954) hat der Erfolg der Allotransplantation (Organtrans-
plantation innerhalb einer Spezies) zu einer wachsenden Diskrepanz zwischen
Organspenden und Menschen, die auf eine Organtransplantation warten (sog.
Warteliste), geführt. In Deutschland wurden seit 1963 ca. 66 000 Organe verpflanzt
(Deutsche Stiftung Organtransplantation 2003). Im Jahr 2002 wurden insgesamt
3 837 Organe in Deutschland übertragen. Dies beinhaltete 2 325 Nieren, 756 Lebern,
395 Herzen, 163 Pankreata und 198 Lungen.
Abbildung 1: Aktive Warteliste und Nierentransplantation (1993-2002)
(Quelle: Jahresbericht 2002, Deutsche Stiftung Organtransplantation)
- 1 -

- 2 -
Einleitung
Die Diskrepanz zwischen verfügbaren Organen und Patienten auf der Warteliste
lässt sich am deutlichsten bei der Nierentransplantation dokumentieren (Abbildung
1). 2 325 Nierentransplantationen standen 2002 etwa 10 000 Patienten auf der
Warteliste gegenüber (Deutsche Stiftung Organtransplantation 2003), dabei
überstieg die Zahl der Neuanmeldungen für eine Nierentransplantation die Zahl der
transplantierten Nieren deutlich. Diese Lücke ist kennzeichnend für die mangelhafte
Versorgungssituation; die Zahl der Wartenden vergrößert sich Jahr für Jahr.
Dabei sterben ca. 30% der Patienten innerhalb von 9-12 Monaten auf der Warteliste,
noch bevor ein geeignetes Organ für sie gefunden werden kann. Ca. 100 000
Patienten versterben, die aus Alters- oder anderen Gründen nicht auf eine Warteliste
gesetzt wurden.
Eine Möglichkeit den Organmangel zu überwinden, ist die Nutzung tierischer Organe,
die sogenannte Xenotransplantation. Xenotransplantation ist definiert als
Verpflanzung lebender Zellen oder Organe zwischen zwei Spezies. Als geeignete
Organspenderspezies kommen aufgrund der stammesgeschichtlichen
Verwandtschaft besonders Primaten in Betracht. Diese sind jedoch nicht in
ausreichender Zahl und unter den erforderlichen hygienischen Bedingungen
züchtbar. Ferner wurden starke ethische Bedenken aufgrund der Ähnlichkeit zum
Menschen geltend gemacht.
Das Schwein wird aus verschiedenen Gründen als der am besten geeignete
Organspender für den Menschen angesehen. Die immunologische Abstoßung stellt
die größte Hürde für den Einsatz porziner Organe in der Xenotransplantation dar.
Dabei treten drei zeitlich und mechanistisch unterscheidbare Abstoßungen auf; die
hyperakute Abstoßungsreaktion (HAR), die akut vaskuläre - (AVR) und die zelluläre
Abstoßung (CXR). Die HAR wird durch die Bindung präformierter humaner Anti-Gal
Antikörper gegen die α1,3-Gal- Epitope (GALILI et al. 1985) porziner Epithelien mit
anschließender Aktivierung der Komplementkaskade über den klassischen Weg,
induziert (PLATT et al. 1991a).
Die HAR kann durch die Erstellung transgener Schweine, die humane
komplementregulierende Gene exprimieren, inzwischen in klinisch relevanter Form
überwunden werden (BACH 1998). Nach heterotoper Transplantation eines

Einleitung
transgenen Schweineherzens in einen Pavian, konnte ein Überleben des
Empfängertiers bis zu 137 Tagen erreicht werden, ohne das Symptome einer HAR
beobachtet wurden (MCGREGOR et al. 2003). Die bisher erreichten langen
Überlebenszeiten transgener porziner Spenderorgane im Primatenmodell, konnten
nur durch die gleichzeitige Administration hoher Dosen Immunsuppressiva erzielt
werden, die die nachgeschalteten Immunabstoßungen unterdrücken. Für eine
klinisch relevante Xenotransplantation sind deshalb verbesserte transgene Organe
notwendig. Die Generierung multitransgener Schweine, die neben der HAR auch
nachgeschaltete Abstoßungsreaktionen unterdrücken, ist zur Zeit die
erfolgversprechendste Strategie (BACH et al. 1997).
Das porzine Hauptantigen für die HAR und AVR ist das α1,3-Gal-Epitop. Die
Erzeugung α1,3-Gal defizienter Schweine ist der sicherste Weg, die Expression
dieser Epitope dauerhaft zu unterbinden. Der somatische Kerntransfer bietet die
Möglichkeit, Gene gezielt durch homologe Rekombination auszuschalten (VANHOVE
et al. 1998; DENNING et al. 2001).
Eine erste Xenotransplantation von porzinen Nieren α1,3-Gal defizienter Schweine in
Paviane, zeigte eine deutliche Verbesserung der Akzeptanz des porzinen Organs.
Die renalen Funktionen konnten über 68 Tage aufrechterhalten werden, ohne dass
Symptome der hyperakuten oder akut vaskulären Abstoßungsreaktion beobachtet
wurden (YAMADA et al. 2003). Ein limitierender Faktor in der Erstellung transgener
Schweine für die Xenotransplantation ist die geringe Effizienz des somatischen
Kerntransfers, wobei die Effizienz beim Schwein unter 1% liegt (zum Überblick:
BREM u. KUHHOLZER 2002). Dies liegt unter anderem an
reproduktionsbiologischen Besonderheiten des Schweines, das mindestens vier
implantierte Embryonen zur Aufrechterhaltung einer Trächtigkeit benötigt.
Seit der Geburt des Klonschafes „Dolly“ (WILMUT et al. 1997), ist der Kerntransfer
bereits eine wichtige Methode in der Erstellung transgener Tiere, in der Erhaltung
bedrohter Rassen und wertvoller Vererber geworden (WELLS et al. 1998; LANZA et
al. 2000). Der Kerntransfer erlaubt die Untersuchung epigenetischer Mechanismen,
der Telomerenrestoration, heteromitochondrialer Verteilung und die Analyse von
- 3 -
Rückprogrammierungsmechanismen somatischer Zellkerne in der frühembryonalen

- 4 -
Einleitung
Entwicklung und adulter Klone. Der Einsatz des Kerntransfers für die Erstellung
transgener Tiere weist zahlreiche Vorteile gegenüber der bis dahin etablierten
Methode der DNA-Mikroinjektion auf (SCHNIEKE et al. 1997). Nach Selektion der
Spenderzellen sind alle Nachkommen aus dem Kerntransfer transgen. Dadurch ist
die Effizienz gegenüber der Mikroinjektion signifikant verbessert (NIEMANN u. KUES
2000). Die neue Technik ermöglicht zudem auch die gezielte genetische Modifikation
von Spenderzellen und damit den Knockout von Genen, insbesondere bei Tierarten,
von denen keine etablierten ES-Zelllinien zur Verfügung stehen.
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen eines SFB-geförderten Projektes zur
Erzeugung transgener Schweine für die Xenotransplantation angefertigt.
Ziel dieser Arbeit war es unter Verwendung des somatischen Kerntransfers α1,3-Gal
Knockout Schweine zu generieren, die frei von kommerziellen Beschränkungen in
Xenotransplantationsmodellen getestet werden können. Dazu sollten die
Spenderzellpräparation und die gezielte genetische Modifikation primärer Zellen für
das Schwein etabliert und optimiert werden.
In der ersten Versuchsphase wurden Versuche zur Zellzyklussynchronisation und zur
Transfektion porziner foetaler Fibroblasten durchgeführt. Weiterhin wurde untersucht,
welchen Einfluß das verwendete Zellkulturmedium auf die
Proliferationseigenschaften der Zellen hat. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse
wurden in in-vitro-Versuchen zum somatischen Kerntransfer eingesetzt. Als Kriterien
zur Ermittlung des Entwicklungspotentials der erzeugten geklonten Embryonen
sollten der Transfer auf synchronisierte Empfängertiere und die Geburt gesunder
Ferkel dienen. Anschließend wurden Kerntransferversuche mit transgenen
Spenderzellen durchgeführt und die rekonstruierten transgenen Embryonen auf
Empfängertiere übertragen.

2. Schriftum
Schriftum
2.1.Xenotransplantation: Das Schwein als potentieller Organspender
Eine erfolgversprechende Xenotransplantation wurde erst mit dem Verständnis
immunologischer Abstoßungsmechanismen und dem Einsatz von Immunsuppressiva
möglich.
Konkordante Xenotransplantationsversuche wurden mit Organen von Primaten und
Affen durchgeführt, da erwartet wurde, dass Abstoßungsreaktionen zwischen nahe
verwandten Spezies weniger stark ausgeprägt sind als zwischen diskordanten
Spezies. Das limitierende Problem ist die aufwendige Züchtung der Tiere, die in dem
Maße, wie sie für einen klinischen Einsatz der Xenotransplantation nötig wäre, nicht
durchführbar ist. Ferner sind ethische Bedenken, aufgrund der Ähnlichkeit zum
Menschen zu beachten. Die Gefahr der Verbreitung von Zoonosen ist zwischen
konkordanten Spezies höher und führte zur Suche nach anderen potentiellen
Donoren für die Xenotransplantation.
Das Schwein wird als geeignet angesehen (PINKERT 1994; NIEMANN u. KUES
2003), da Protokolle für die genetische Modifikation von Schweinen etabliert sind, die
Organe in Physiologie (s. Tabelle 1) und Anatomie nicht zu unterschiedlich von
denen des Menschen sind, das Schwein kurze Generationsintervalle, große Würfe
und ein schnelles Wachstum zeigt und unter hohen hygienischen Standards wie SPF
gehalten werden kann.
Ausserdem gibt es gute Erfahrungen in der klinischen Anwendung mit porzinem
Insulin, sowie porziner Hornhaut, Haut und porzinen Herzklappen.
- 5 -

- 6 -
Schriftum
Tabelle 1: Vergleichende Darstellung wichtiger renaler Parameter zwischen Mensch und
Schwein.
Bestimmung Mensch *
Schwein +
Glumeruläre Filtrationsrate
(ml/Min.)
0,9 0,9
Renaler Blutfluss
(ml/Min./g)
4,0 3,0-4,4
Konzentrationsfähigkeit
(mOsmol/l)
1160 1080
Anzahl Nephrone (in
Millionen)
2 2,5
Harnmenge (l/24 Std.) 0,9-1,5 2-4
Spezifisches Gewicht Urin
(g)
1,012-1,030 1,005-1,025
pH Sauer Alkalisch
Insulin- Clearance (ml x
Min. -1 x m -2) 50-90 60-80
Primärharn (l/ 24 Std.)
Endogene Kreatinin-
180 140
Clearance
(ml x Min. -1 x m -2 )
>50 75-105
Harnsäure im Urin (g/24
Std.)
0,2-1 0
* Aus: Schmidt RF, Thews G. Human Physiology. Berlin,Heidelberg,New York: Springer 1983; 610 ff
+ Aus: Kolb E. Lehrbuch der Physiologie der Haustiere. Jena: Gustav Fischer 1962; 520 ff
Eine essentielle Voraussetzung für den klinischen Einsatz porziner Organe ist die
Überwindung der auftretenden Abstoßungsreaktionen durch transgene
Modifikationen. In den folgenden Kapiteln werden diese gesondert dargestellt und
Strategien zu deren Überwindung aufgezeigt.

Schriftum
2.2. Abstoßungsreaktionen bei xenogener Organtransplantation
2.2.1. Hyperakute Abstoßungsreaktion (HAR)
Bei der Übertragung von Organen phylogenetisch weit voneinander entfernter
Spezies (diskordante Xenotransplantation) kommt es innerhalb weniger Minuten zu
einer heftigen Abstoßung (CALNE 1970; PLATT et al. 1990), die durch präformierte
xenoreaktive Antikörper (XNA) ausgelöst wird. Diese rufen eine
komplementinduzierte Schädigung des Xenotransplantatendothels, verbunden mit
einer Rekrutierung und Aktivierung von Blutzellen des Empfängerorganismus,
hervor. Dies führt zu einem interstitiellen Oedem, Haemorrhagie, Thrombusbildung
und letztendlich zur funktionellen Zerstörung des Transplantats (DALMASSO 1992).
Der klassische Weg der Komplementkaskade wird durch eine Antikörperbindung an
Antigene von xenogenen Zellen oder Pathogenen aktiviert (GOOD et al. 1992)
(Abbildung 2).
Der alternative Weg kann ausgelöst werden, wenn eine spontan aktivierte
Komplementkomponente an die Oberfläche eines Pathogens bindet. Gleichzeitig
bildet dieser Weg auch eine Verstärkerschleife des klassischen Weges (JANEWAY
u. TRAVERS 1997), da eine der aktivierten Komponenten des klassischen Weges,
auch den alternativen Weg in Gang setzen kann. Bei der diskordanten
Xenotransplantation wird die hyperakute Abstoßungsreaktion hauptsächlich über den
klassischen Weg der Komplementkaskade initiiert.
- 7 -

- 8 -
Schriftum
Abbildung 2: Übersicht über den Verlauf der Komplementkaskade (aus Xenotransplantation,
Helmut Grimm, Schattauer Verlag, Stuttgart, 2003). CD55 (DAF), CD46 (MCP) und CD59 sind
komplementregulierende Faktoren, die die Aktivierung der Komplementkaskade an den
dargestellten Punkten hemmen können.
Das Hauptantigen, welches die Komplementkaskade aktiviert, sind Galaktose-α1,3-
Galaktose-Epitope auf porzinen Endothelien. Menschen und Altweltaffen besitzen
natürliche Anti-αGal Antikörper, da sie kein funktionelles α-Galaktosyltransferasegen
besitzen (LARSEN et al. 1990). Ungefähr 1% aller menschlichen Immunglobuline
sind natürliche Antikörper gegen αGal-Epitope (GALILI et al. 1985 u. 1988).
Menschliche Anti-αGal Antikörper sind hauptsächlich vom IgM- und IgG-Typ
(DALMASSO et al. 1992).
Durch die Bindung der Antikörper an die Gal-Epitope des Xenotransplantats kommt
es zur Aktivierung des C1 Proteins der Komplementkaskade (s. Abbildung 2), was
aus C1q, C1r und C1s besteht. C1q wird durch ein an ein Antigen gebundenes
Molekül IgM oder von 2 Molekülen IgG gebunden. Durch die erforderliche mehrfache
Bindung von IgG-Molekülen, die nur 30-40 nm auseinanderliegen dürfen, benötigt die

Schriftum
Aktivierung der Komplementkaskade eine Vielzahl gebundener IgGs. Aus diesem
Grund aktiviert IgM Komplement weitaus effektiver als IgG. Die Bindung von C1q
führt zur Bildung von C1s (ZICCARDI 1983), das seinerseits C4 in C4a und C4b
spaltet. In Gegenwart von Mg 2+ , dient C4b als Rezeptor für C2, welches
anschließend von C1s in C2a und C2b gespalten wird. C2b bleibt an C4b gebunden
und bildet den C4b2b-Komplex, der als Konvertase für C3 dient. C3 wird hierbei in
C3a und C3b aufgespalten. C3b bindet an den C4b2b-Komplex und bildet einen
C4b2b3b-Komplex, der C5 in C5a und C5b spaltet. C5b bindet an C6 und bildet den
C5b6-Komplex, welcher sich an C7 anlagert. Dies führt zu einer
Konformationsänderung, wobei eine hydrophobe Stelle auf C7 zugänglich wird, was
das Eindringen des C5bC6C7-Komplexes in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran
ermöglicht. An diesen membranassoziierten Komplex bindet C8, das schließlich zehn
bis 16 C9-Moleküle bindet und diese zu einer ringförmigen Struktur polymerisiert,
dem membranangreifenden Komplex (MAC) (PODACK 1986; JANEWAY u.
TRAVERS 1997). Der so entstandene Kanal führt zu einem Verlust der Homöostase,
zur Zerstörung von Protonengradienten, zum Eindringen von Enzymen und
schließlich zur Zerstörung der Zelle (ROOS u. DAHA 2002).
Die kleinen Peptide C4a, C3a und besonders C5a, die durch die Spaltung von C4,
C3 und C5 entstehen, dienen als lokale Entzündungsmediatoren. Neben
apoptotischen Vorgängen kommt es zur Aktivierung der Gerinnungskaskade, sowie
zur Erhöhung der Thrombogenizität des Endothels durch Abspaltung des
membrangebundenen Heparansulfats (ROBSON et al. 2000). Es kommt zu
Gefäßthrombosen und zum Absterben des Xenotransplantats (ROSE et al. 1991).
Im Gegensatz zur klassischen Aktivierung der Komplementkaskade, spielt der
alternative Weg bei der Aktivierung in der hyperakuten Abstoßungsreaktion nur eine
untergeordnete Rolle. Hierbei ist die Bindung von C3b an ein Pathogen der
auslösende Schritt. An diesen kann Faktor B, ein Analogon zu C2 (PORTER 1985),
an C3b binden, wodurch dieser von der Plasmaprotease D gespalten werden kann.
Dabei entstehen Ba und Bb. Bb bleibt an C3b gebunden und bildet den C3bBb-
- 9 -
Komplex, der die Konvertase für den alternativen Weg darstellt. Hierbei ist C3bBb

- 10 -
Schriftum
funktionell und strukturell homolog zu C4b2b des klassischen Weges (JANEWAY u.
TRAVERS 1997).
CD55 (DAF), CD46 (MCP) und CD59 sind komplementregulierende Faktoren, die die
Aktivierung der Komplementkaskade hemmen können (Abbildung 2). Sie sind ein
Molekülsystem für die Erstellung von Schweinen, die in der
Xenotransplantationsforschung eingesetzt werden können.
2.2.2. Akute vaskuläre Abstoßungsreaktion (AVR)
Innerhalb von Tagen bis Wochen nach Xenotransplantation kommt es zur akut
vaskulären (AVR) oder auch verzögerten Abstoßung (BACH et al. 1996), die im
wesentlichen durch induzierte Antikörper hervorgerufen wird. Die AVR ist eine
komplexe Reaktion, bestehend aus vielen ineinander greifenden immunologischen
Prozessen.
Die Komplementkaskade (s. HAR) spielt in diesem Prozess nur eine untergeordnete
Rolle, ihre Aktivierung, vor allem über den alternativen Weg, konnte jedoch durch die
Anwesenheit des Komplementproteins C3a und des MAC (C5b-9) nachgewiesen
werden (LOSS et al. 2000). Bei der AVR kommt es zur xenogenen
Endothelzellaktivierung des Typs II durch Nicht-anti-αGal-Antikörper (NGA)
(MANEZ et al. 2000; SCHUURMAN et al. 2003). ZHU und HURST (2002) wiesen
eine Spezifität der NGA vor allem gegen Kohlenhydratverbindungen mit einem
terminal gebundenen N-Glycolylneuraminsäure-Rest nach. Diese
Oberflächenstrukturen werden auf menschlichen Zellen nicht exprimiert; 85% aller
Menschen tragen Antikörper gegen diese Strukturen (ZHU u. HURST 2002). Zudem
konnte eine zytolytische Wirksamkeit der NGAs nachgewiesen werden (DEHOUX et
al. 2003).
Die Bindung von Antikörpern an die Epitope des porzinen Xenotransplantats führt zur
Aktivierung der Endothelzellen (Typ II), verbunden mit der Infiltration natürlicher
Killerzellen (NK) und Makrophagen. Im Gegensatz zur HAR spielen vor allem IgG-
Antikörper eine wichtige Rolle (PLATT et al. 1991b). Sie haben eine synergistische

Schriftum
- 11 -
Wirkung im Zusammenspiel mit den NK und verstärken die Aktivierung der
Endothelzellen, was den antikoagulativen in einen prokoagulativen Zustand
überführt. NK-Zellen und Monozyten sezernieren Cytokine wie TNF-α und IFN-γ
(BLAKELY et al. 1994), was die zytotoxische Wirkung der NK-Zellen verstärkt
(GOODMAN et al. 1996).
Die Endothel-Aktivierung vom Typ II ist mit der Synthese von Proteinen durch die
Endothelzellen verbunden. Die vaskuläre Expression von Adhäsionsmolekülen wie
E-Selektin, ICAM I, VCAM I sowie Faktor VII/VIIa- Rezeptor führt zur Adhäsion von
Leukozyten an das xenogene Gefäßendothel (OSBORN 1990). Die Expression von
Chemokinen wie IL-8 und MCP-1 induziert die Einwanderung neutrophiler
Granulozyten, natürlicher Killerzellen, sowie weiterer Leukozyten und Monozyten
(HOFER et al. 1994).
Die endotheliale Produktion von „Tissue Factor“ (TF) und
Plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1) hat einschneidende Auswirkungen auf das
Gerinnungsgleichgewicht (SEARPATI u. SADLER 1989; MACKMANN et al. 1990).
Insgesamt entsteht eine prokoagulatorische Tendenz. Das
Gerinnungsungleichgewicht wird durch eine aktivierungsassoziierte
Endothelzellretraktion verstärkt, was zur Freilegung subendothelialer Matrix,
insbesondere von Kollagen und von-Willebrand-Faktor, zwischen den Endothelzellen
führt (LAWSON u. PLATT 1996). Blutplättchen binden über Rezeptoren an Kollagen
und von-Willebrand-Faktor, was zur Freisetzung von Chemokinen führt und
Monozyten und NK-Zellen des Empfängerorganismus aktiviert. Zudem wurde die
Inkompatibilität von porzinem von-Willebrand-Faktor (pvWF) mit humanen Plättchen
nachgewiesen. Nach Stress bindet und aktiviert pvWF humane Plättchen und löst
eine disseminierte intravasale Gerinnung aus (MAZZUCATO et al. 1996; GACA et al.
2002). Aktivierte xenogene Endothelzellen verlieren die Fähigkeit, ATP-
Diphosphohydrolase an der Zelloberfläche zu exprimieren (ROBSON et al. 1997).
Die ATP-Diphosphohydrolase wird für die Inhibition der Plättchenaggregation
benötigt, was den prokoagulatorischen Zustand der Endothelzellen verstärkt. Durch
diese Vorgänge an den xenogenen Endothelzellen kommt es zur Induktion der
Gerinnungskaskade. Alle aufgeführten Reaktionen können letztendlich zum

- 12 -
Schriftum
Erscheinungsbild der disseminierten intravasalen Gerinnung, verbunden mit dem
Absterben des Xenotransplantats führen (ROBSON et al. 2000).
Eine Übersicht über die wichtigsten Vorgänge während der xenogenen
Endothelzellaktivierung ist in Abbildung 3 gegeben.
Bindung α1,3 Gal Antikörper
oder NGA (hauptsächlich IgG)
Aktivierung
NK-Zellen
Monozyten
Sekretion von TNF-α,INF-γ,IL-1β
ICAM-1
Expression
VCAM-1
von
Adhäsionsmolekülen wie ICAM-
1,VCAM-1 und Verlust von ATP-
Diphosphohydrolase
Abbildung 3: AVR in der xenogenen Situation.
Bindung
von
Leukozyten
Aktivierung
Thrombusbildung
pvWF
Xenogener Endothelzellverband mit Kollagenmatrix
Die Bindung induzierter Antikörper führt zu Aktivierung porziner Endothelzellen. Diese
exprimieren vermehrt ICAM-1 und VCAM-1 auf der Zelloberfläche, was zur Bindung humaner
Leukozyten mit anschließender Thrombusbildung führt. Dadurch werden Monozyten und NK-
Zellen zur Sekretion von Cytokinen stimuliert, die die Endothelzellaktivierung verstärkt.
Humane Zellen sind türkis oder rot, porzine Zellen braun dargestellt.
Weitere Faktoren, die zu einer akut vaskulären Abstoßungsreaktion gegen das
Xenotransplantat führen, sind in jüngster Zeit identifiziert worden. NK-Zellen werden
direkt über die Bindung von CD28 an porzinem CD86 auf den xenogenen

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- 13 -
Endothelzellen aktiviert (COSTA et al. 2002a). So führen spezies-spezifische
Inkompatibilitäten von Faktoren der Gerinnungkaskade zu einer weiteren
Verstärkung der intravasalen Gerinnung (COWAN et al. 2000). Ein Beispiel ist das
Thrombomodulin. Thrombomodulin agiert als Co-Faktor von Thrombin bei der
Aktivierung von Protein C. Thrombin und aktiviertes Protein C inaktivieren die
Faktoren Va und VIIIa und unterbinden dadurch die weitere Generierung von
Thrombin. Die Bindung von Thrombomodulin an Thrombin blockt zudem effektiv die
Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, die Aktivierung der Faktoren V,VIII und XIII
und somit die Plättchenaktivierung (ESMON 1989; ESMON et al. 1983), was
Thrombomodulin zu einem wichtigen Regulator der Thrombinaktivität macht (s.
Abbildung 4). Zwischen porzinem Thrombomodulin und humanem Thrombin und
Protein C konnten Inkompatibilitäten nachgewiesen werden, was mit einer
verminderten Generierung von aktivem Protein C und damit einer ineffizienten
Antikoagulationsreaktion verbunden war (SIEGEL et al. 1997; LAWSON et al. 1997).
Eine Transfektion porziner Endothelzellen mit humanem Thrombomodulin, führte
nach Perfusion mit humanem Blut zu einer 620-fach höheren Aktivierung von
humanem Protein C (KOPP et al. 1998; SHIRAISHI et al. 2001).
Protein C
Aktiviertes
Protein C
Thrombin
Expression von Thrombomodulin
Endothelzellverband
Induktion der Fibrinolyse
-
Protein S
Antikoagulatorische
Aktivität (Inaktivierung
Faktor Va und VIIIa) VIIIa)
Abbildung 4: Zusammenspiel von Thrombomodulin und Thrombin in der physiologischen
Situation. Die Interaktion zwischen Thrombin und Thrombomodulin (gepunktete Linie) findet in
der xenogenen Situation, aufgrund von Inkompatibilitäten, nicht statt.

- 14 -
Schriftum
2.2.3. Zelluläre Abstoßungsreaktion
Die zelluläre Abstoßung tritt innerhalb von Wochen auf und beruht auf einer
Aktivierung von T-Zellen im Empfängerorganismus. Die T-Zell-vermittelte
Immunantwort lässt sich in zwei Phasen einteilen: in die Induktionsphase und die
Effektorphase. In der Induktionsphase erkennen CD4-positive T-Helferzellen
Peptidantigene, die an MHC-Klasse-II-Moleküle gebunden sind, dabei gibt es eine
direkte und eine indirekte Antigenpräsentation (BEUTNER 2003). Zellen, die
Antigene an ihren Oberflächen präsentieren können, werden auch
antigenpräsentierende Zellen (APC) genannt. Zu ihnen gehören dendritische Zellen,
Makrophagen, B-Zellen, aktivierte T-Zellen und aktivierte Endothelzellen.
Die indirekte Antigenpräsentation beinhaltet die Phagozytose von Zellen oder
Proteinen des Xenotransplantats und die anschließende Präsentation an MHC-
Klasse-II-Molekülen auf der Zelloberfläche der APCs des Empfängers.
Bei der direkten Antigenpräsentation können die T-Zellen selbst xenogene MHC-
Klasse-II-Moleküle auf den APCs des Transplantats erkennen.
In der Effektorphase kommt es zur Schädigung des Transplantats durch die
Ausschüttung von Zytokinen wie TNF-α oder TNF-β durch T-Helferzellen oder durch
die Aktivierung von CD8-positiven T-Zellen zu zytotoxischen T-Zellen (JANEWAY u.
TRAVERS 1997).
Bisherige Erkenntnisse zur zellulären Abstoßungsreaktion xenogener Transplantate
wurden vor allem im SCID-(severe combined immunodeficiency)-Mausmodell
gewonnen. Diesen Mäusen fehlt das adaptive Immunsystem. Durch Infusion
humaner T-Zellen kann teilweise ein humanes Immunsystem nachgeahmt werden.
Durch Implantation porziner Inselzell-Cluster wurde eine wichtige Rolle CD4-positiver
T-Zellen in der xenogenen T-Zell-vermittelten Immunantwort nachgewiesen
(FRIEDMAN et al. 1999). Die fehlende oder geringe Infiltration CD8-positiver Zellen
könnte darin begründet liegen, dass CD8-Zellen nach einem solchen Transfer nicht
mehr proliferieren (BEUTNER u. MACDONALD 1998). Das Überleben eines
Xenotransplantats wurde bei gleichzeitiger Depletion von CD4 -und CD8-Zellen
gegenüber der einfachen Depletion von CD4-Zellen verlängert, was eine Beteiligung

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- 15 -
von CD8-positiven Zellen in der zellulären Abstoßungsreaktion nahe legte (PIERSON
et al. 1989).
Trotz der phylogenetischen Distanz zwischen Mensch und Schwein kann eine direkte
T-Zell-Aktivierung humaner T-Zellen in-vitro stattfinden (KIRK et al. 1993; SATAKE et
al. 1994; HERRLINGER et al. 1998). Durch Entfernen humaner APCs oder durch
Blockierung mit Anti-HLA-II und Anti-SLA-II-(porzines Equivalent zu humanem
Leukozyten Antigen-II (HLA-II) Antikörpern) konnte nachgewiesen werden, dass etwa
70 bis 80% der T-Zell-Stimulierung über das direkte Erkennen porziner SLA-II-
Moleküle erfolgte und nur etwa 20-30% über die indirekte Antigenpräsentation.

- 16 -
Schriftum
2.3. Methoden zur Erstellung transgener Schweine
Zur Überwindung der Abstoßungsreaktion gegen porzine Xenotransplantate ist die
genetische Modifikation der Spendertiere die erfolgversprechendste Möglichkeit.
Ein Gentransfer ist definiert als das Einbringen von Fremd-DNA in das Genom mit
dem Ziel der Beteiligung an der Proteinproduktion des Empfängerorganismus. Zur
Erstellung transgener Schweine werden verschiedene Methoden angewandt, die im
weiteren näher beschrieben werden.
2.3.1. Erstellung transgener Schweine durch DNA-Mikroinjektion
Die Mikroinjektion von DNA-Sequenzen in einen Vorkern befruchteter Eizellen
(Abbildung 5) ist die am besten etablierte Methode zur Erstellung genetisch
modifizierter Schweine (NIEMANN u. KUES 2003).
Im Vergleich zur Labormaus ist die Mikroinjektion bei Nutztieren erheblich
schwieriger und aufwendiger, und zudem mit deutlich geringeren Erfolgsraten, d.h
Entwicklung transgener Foundertiere verbunden (PURSEL u. REXROAD 1993b). Die
Effizienz des Gentransfers über Mikroinjektion ist niedrig und beträgt zwischen 0,3-
4% beim Schwein, 1,1- 4,5% beim Schaf und 0,3- 2,6% beim Rind. Sie liegt damit
deutlich unter den bei der Maus erzielten Erfolgsquoten von etwa 10- 15% (PURSEL
u. REXROAD 1993a). Als Ursache dafür werden u.a. Einflüsse des Integrationsortes
im Wirtsgenom und der Anzahl integrierter Kopien der DNA diskutiert. Der
chromosomale Integrationsort kann das Expressionsmuster des Transgens
hinsichtlich seiner Gewebe- und Entwicklungsspezifität erheblich beeinflussen
(JAENISCH et al. 1981; HARBERS et al. 1981; SORIANO et al. 1986). Aufgrund der
zufallsmäßigen Integration ist eine gezielte genetische Modifikation nicht möglich.

TG
Schriftum
1. DNA-Mikroinjektion in
einen Vorkern einer
Zygote
2. Übertragung der Zygoten
auf ein synchronisiertes
Empfängertier
3. Untersuchung der Nachkommen
auf Integration und Expression des
Transgens.
TG TG 4. Etablierung von Founder-Linien
Abbildung 5: Generierung transgener Schweine durch Mikroinjektion.
- 17 -
15- 18 Stunden nach der 2. Verpaarung werden die Zygoten nach Schlachtung der Tiere durch
Spülung der Ovidukte gewonnen. Es werden ca. 2 pl eines DNA- Konstruktes in einen Vorkern
injiziert. Anschließend erfolgt die Übertragung der Zygoten auf ein synchronisiertes
Empfängertier. Generierte Nachkommen werden mit molekularbiologischen Methoden auf
Integration und Expression des Transgens untersucht. Verpaarungen transgener Nachkommen
(Founder) mit nicht-transgenen Schweinen geben Aufschluß über eine Keimbahnbeteiligung
des Transgens (TG).
1985 gelang es erstmals ein Transgen, ein Genkonstrukt für das humane
Wachstumshormon, durch Mikroinjektion in das Genom von Schweinen stabil zu
integrieren und zu exprimieren (HAMMER et al. 1985).
Der Mechanismus, mit dem die pronuklear injizierten DNA-Fragmente nach der
Vorkerninjektion in das Genom der Embryonen integrieren, ist nicht sicher bekannt.
Aufgrund der begrenzten Anzahl transgener Nachkommen im Verhältnis zu der

- 18 -
Schriftum
Anzahl mikroinjizierter Zygoten und der Tatsache, dass zumeist nur eine Kopie des
Transgens in das Genom des Empfängers integriert wird, ist von einem sehr
seltenen Ereignis auszugehen. Denkbar ist die Integration im Zusammenhang mit
der Reparatur eines zufälligen Chromosomen- oder Einzelstrangbruchs (PEREZ et
al. 1985).
DNA- Strangbrüche, als vermutete Voraussetzung für die Integration eines Gens,
sind in weiblichen Vorkernen und dekondensierten Spermienköpfen nachgewiesen
worden (KIESSLING u. MARKOULAKI 2000). Die Topoisomerase I könnte eine
zusätzliche, indirekte Rolle in diesem Prozess spielen, da Integrationstellen häufig in
der Nähe von Schnittstellen dieses Enzyms liegen (KONOPKA 1988). Ähnliche
Beobachtungen wurden bei der Transgenintegration durch retrovirale Vektoren
gemacht (VIJAYA et al. 1986; SCHERDIN et al. 1990). Für den Integrationsort des
Transgens gibt es keine Hinweise auf bevorzugte Loci bzw. chromosomale
Regionen; die Integration wird als zufällig betrachtet (LACY et al. 1983;
MICHALOVA et al. 1988; FESTENSTEIN et al. 1996; DOBIE et al. 1996; BOYER et
al. 1997). Die Kopienanzahl mit der das Transgen in das Empfängergenom integriert
kann nicht gesteuert werden (PURSEL u. REXROAD 1993a). Häufig wird eine
unterschiedliche Anzahl von Kopien des Gens in einer Kopf-Schwanz- oder Kopf-
Kopfanordnung an einer Stelle oder seltener an mehreren Stellen im Genom
integriert (PURSEL u. REXROAD 1993b). Sie werden in dieser Form als stabiler,
hemizygoter Locus an die F1-Generation weitervererbt.
Die Expression des übertragenen Gens ist im Allgemeinen nicht von der Anzahl
integrierter Kopien abhängig, wird jedoch durch den Integrationsort beeinflusst
(GANNON et al. 1990). Stark variierende Expressionsmuster und –niveaus zwischen
transgenen Linien aus der Injektion des gleichen Konstrukts werden hauptsächlich
auf den Einfluß des Integrationsort zurückgeführt (CASTILLO et al. 1995;
HERGERSBERG et al. 1995). Dieser Positionseffekt beruht auf einer Transkriptionsund
Promoterinterferenz zwischen Transgen und benachbarten endogenen aktiven
Loci. Eine gegenseitige Beeinflussung ist möglich (ALLEN et al. 1988).
Bei landwirtschaftlichen Nutztieren zeigen ca. 80% der transgenen Foundertiere eine
Weitergabe des Transgens an die Nachkommen. 20- 30% der Founder geben das

Schriftum
- 19 -
Gen zu weniger als den erwarteten 50% an ihre Nachkommen weiter, was bei
vollständiger Hemizygotie zu erwarten wäre (PURSEL et al. 1990). Der
Entwicklungsstand der befruchteten Eizelle bei der Integration des Transgens ist
ausschlaggebend dafür, in welchem Umfang die Körper- und Keimzellen eines
Founders das Transgen besitzen. Zum Zeitpunkt der Vorkerninjektion, beim Schwein
15-18 Stunden nach der Befruchtung (NIEMANN et al. 2001), vollzieht sich in der
Zygote bereits die erste DNA-Replikation. Für die Entwicklung eines vollständig
hemizygoten transgenen Tieres müsste das Integrationsereignis also unmittelbar
vorher eintreten. Eine spätere Integration kann dagegen zur Entwicklung einer
Mosaikexpression des Transgens führen (BURDON u. WALL 1992; MURAKAMI et
al. 1999).
In den meisten Fällen wird das Transgen nach den Mendel´schen-Regeln vererbt, so
dass transgene Linien erstellt werden können. Durch Verpaarung von Linien mit
unterschiedlichen Transgenen, können multitransgene Schweine erstellt werden, die
im Hinblick auf ihre Eignung für die Xenotransplantation mehrere
immunomodulatorische Gene tragen.
COWAN et al. (2000) generierten dreifach-transgene Schweine durch Koinjektion
von drei komplementregulierenden Transgenen. Nur 2 von 76 geborenen Ferkeln
zeigten eine Expression aller drei Transgene auf sehr niedrigem Niveau.
Insbesondere für die Entwicklung transgener Nutztiere mit langen Trächtigkeitszeiten
wäre der Nachweis einer stabilen Integration vor dem Embryotransfer von großem
Vorteil. Die dazu nötige Isolierung einzelner Blastomeren aus kultivierten Embryonen
ist technisch möglich (LIU et al. 1993). Durch die lange Persistenz der Transgene als
nicht-integrierte Moleküle und deren ungleichmäßige Verteilung auf die Blastomeren,
ist der PCR-Nachweis jedoch nur wenig aussagekräftig. Dies macht eine
zeitaufwendige und teure Untersuchung aller Nachkommen und der F1-
Nachkommen nötig.

- 20 -
Schriftum
2.3.2. Generierung transgener Schweine durch somatischen Kerntransfer
Im Jahr 2000 berichteten mehrere Forschergruppen fast zeitgleich über Erfolge beim
Klonen von Schweinen durch somatischen Kerntransfer (BETTHAUSER et al. 2000;
ONISHI et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000). Beim Kerntransfer wird eine
Spenderzelle in eine vorher entkernte Oozyte übertragen (Abbildung 6). Die Fusion
der beiden Zellen wird meist durch elektrische Impulse erreicht (MCGRATH u.
SOLTER 1983). Nach erfolgreicher Fusion werden die rekonstruierten Embryonen
bis zum gewünschten Stadium in-vivo oder in-vitro kultiviert (NIEMANN u.
MEINECKE 1993). Insbesondere bei Rind und Schaf hat diese Technologie einen
beachtlichen Effizienzgrad erreicht (Tabelle 2) (BREM u. KUHHOLZER 2002).
Aufgrund der reproduktionsbiologischen Besonderheiten wie der Tatsache, dass vier
implantierte Foeten zur Aufrechterhaltung der Trächtigkeit benötigt werden und des
Fehlens ausgereifter in-vitro-Kulturtechniken für porzine Embryonen, konnten beim
Schwein lange Zeit keine Erfolge mit dem Kerntransfer erzielt werden. Lediglich ein
Ferkel wurde nach Verwendung embryonaler Spenderzellen geboren (PRATHER et
al. 1989).
Trotz intensiver Forschungsarbeiten ist die Effizienz des somatischen Klonens bei
vielen Tierarten, vor allem dem Schwein noch sehr gering. Nur aus

Schriftum
- 21 -
Tabelle 2: Übersicht über die bisher durch somatischen Kerntransfer generierten Tiere und die
dabei erzielten Effizienzen.
Tierart
Lebensfähige
Nachkommen/
transferierten Embryo
Geschätzte
Anzahl lebender
Klone (n)
Erstes gelungenes
Experiment
(Referenz)
Schaf 3-8%

- 22 -
Schriftum
selektiv endogene Gene auszuschalten (Knockout). Durch Integration der
gewünschten Gensequenz innerhalb der beiden homologen Bereiche des Konstrukts
kann diese gezielt in Bereiche des Genoms integriert werden (Knock-in), was
Integrationsmutationen und Positionseffekte vermeidet. Durch die Anwendung der in-
vitro-Selektion kann diese Technik effizient eingesetzt werden und sollte, bei
geeigneter Selektion ausschließlich in transgenen Nachkommen resultieren.
Ein limitierender Faktor ist das Fehlen embryonaler Stammzellen in allen
Nutztierspezies, was genetische Modifikationen an primären Zelllinien erforderlich
macht. Bereits Hayflick (HAYFLICK 1961) hatte die begrenzte Lebensfähigkeit
somatischer Zellen unter in-vitro-Bedingungen aufgezeigt. Von der Isolierung
primärer Zelllinien, über Transfektion und Selektion bis zum Einsatz im somatischen
Kerntransfer, werden mindestens 45 Populationsverdopplungen in-vitro benötigt
(CLARK et al. 2000). In Kultur zeigten primäre porzine Zellen eine Transformation
nach 40 Populationsverdopplungen verbunden mit einem veränderten Karyotyp
(DENNING et al. 2001).

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Geklonte
Embryonen
Abbildung 6: Generierung transgener Schweine durch somatischen Kerntransfer
- 23 -
Der Vorteil des somatischen Klonens ist, dass alle Tiere denselben Phänotyp zeigen
und genetisch identisch sind. Zudem ist die Keimbahngängigkeit des Transgens
immer vorhanden, da die Tiere aus der Erbinformation einer einzigen Zellen

- 24 -
Schriftum
entstammen; aufwendige Untersuchungen der Keimbahnbeteiligung des Transgens
durch Verpaarung der Foundertieren sind nicht mehr erforderlich. Vorhandene Tiere
mit transgenen Eigenschaften können gezielt geklont werden. Auf diese Weise kann
gewährleistet werden, dass die transgene Eigenschaft in identischer Form an die
geklonten Nachkommen weitergegeben wird und nicht durch die Neukombination
des genetischen Materials, wie sie während der Meiose erfolgt, modifiziert wird.
Durch die Möglichkeit der gezielten Veränderung des Erbgutes ist es nun möglich,
gezielt Gene im porzinen Genom auszuschalten oder zu integrieren.

Tabelle 3: Transgene Ferkel aus somatischem Kerntransfer mit genetisch modifizierten Zellen
geborene
Ferkel (n)
2
Würfe (n) 1
trächtig (%)
40,0
trächtig (n) 2
Trägertiere (n) 5
Embryonen/
Trägertier (n) 44
Kernspenderzelle
(Transgen)
Autor
adulte Fibroblasten
(humane α1,2 Fucosyltransferase)
(BONDIOLI et al.
2001)
5
1
3
102
foetale Fibroblasten
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
(PARK et al. 2001b)
4
1
20,0
1
5
91
foetale Fibroblasten
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
(PARK et al. 2002)
Schriftum
7
3
10,7
3
28
113
foetale Fibroblasten
(heterozygoter α1,3-Gal Knockout)
(LAI et al. 2002)
6
3 2
43,6
17
39
163
foetale Fibroblasten
(heterozygoter α1,3-Gal Knockout)
(DAI et al. 2002)
5
2
62,5
10
16
foetale Fibroblasten
(homozygoter α1,3-Gal Knockout)
(PHELPS et al. 2003)
6
3
35,0
7
20
146
foetale Fibroblasten
(humane α1,2 Fucosyltransferase)
(heterozygoter α1,3-Gal Knockout)
(RAMSOONDAR et
al. 2003)
1
1
48,0
12
25
150
foetale Fibroblasten
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
(HYUN et al. 2003)
4
3
66,6
6
9
76
adulte Fibroblasten
(porzines Lactoferrin)
(humaner Faktor IX)
(LEE et al. 2003c)
- 25 -
2 14 Sauen hatten bei Veröffentlichung noch nicht geworfen

- 26 -
Schriftum
2.3.3. Spermienvermittelter Gentransfer
Der spermienvermittelte Gentransfer ist eine Methode, mit der bisher zwei
Arbeitsgruppen die Erstellung transgener Schweine gelang. Nach künstlicher
Besamung mit hDAF-beladenem Sperma konnten in 8 Experimenten mit 15
Empfängertieren 93 Ferkel generiert werden. Von diesen wiesen 53 (57%) eine
stabile Integration des hDAF-Gens auf. In 34 (37%) der Nachkommen konnte eine
Expression des Transgens in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Zehn
in der Zucht eingesetzte Founder zeugten insgesamt 205 F1-Nachkommen.
Bei 20-50% der Nachkommen konnten Integration und Expression des Transgens
und somit eine Keimbahnbeteiligung des Transgens bei den Foundertieren
nachgewiesen werden (LAVITRANO et al. 2002). Eine Übersicht über diese Methode
der Erstellung transgener Tiere ist Abbildung 7 zu entnehmen. Zur Bindung exogener
DNA an die Spermien ist auch ein Verbindungsprotein eingesetzt worden. Hierbei
handelte es sich um einen an Antigenstrukturen der Spermienoberfläche bindenden
monoklonalen Antikörper (mAB C). Dieser besitzt zugleich die Fähigkeit, DNA zu
binden. Nach Verpaarung der Founder, konnten in der F1-Generation 37,5%
transgene Nachkommen nachgewiesen werden (CHANG et al. 2002).
Die Erstellung transgener Mäuse durch spermienvermittelten Gentransfer wurde
erstmalig von LAVITRANO et al. (1989) postuliert. Diese Arbeit wurde kontrovers
diskutiert und war nicht reproduzierbar.
Eine modifizierte Methode des spermienvermittelten Gentransfers stellt die
intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) dar. Nach Gefrieren oder Behandlung
der Spermien mit Triton X-100 vor der Inkubation mit exogener DNA, kommt es nicht
zur Aktivierung der Nuklease. Eine anschließende intrazytoplasmatische
Spermieninjektion führte zu 20% transgenen Nachkommen bei der Maus (PERRY et
al. 1999).
Die Fähigkeit von Spermien, freie DNA- Moleküle an der Oberfläche zu binden und
während des Befruchtungsvorganges auf die Eizelle zu übertragen, wurde erstmals
bei Spermien von Kaninchen nachgewiesen (BRACKETT et al. 1971). An
Kaninchensperma ohne Seminalflüssigkeit wurde nach einer Inkubationsphase mit
radioaktiv markierter viraler DNA, exogene DNA vorwiegend im postakrosomalen

Schriftum
- 27 -
Bereich des Spermienkopfes nachgewiesen (BRACKETT et al. 1971). Auch bei
Spermien anderer Spezies stellte der postakrosomale Bereich die
Hauptbindungsstelle für exogene DNA dar (ATKINSON et al. 1991; FRANCOLINI et
al. 1993; SPERANDINO et al. 1996). DNA- Moleküle in einem Größenbereich von
weniger als 100 bp bis zu 23 kb können mit Spermienzellen interagieren (HORAN et
al. 1991; CHAN et al. 1995), wobei größere Fragmente effizienter gebunden werden
(LAVITRANO et al. 1992). Die Bindungskapazität motiler Spermien war deutlich
höher als für nicht motile (HORAN et al. 1991). Die Angaben über den relativen
Anteil an Spermien im Ejakulat, die nach Inkubation mit exogener DNA assoziiert
waren, schwanken zwischen 30% bei Schweinen und 90% bei Labormäusen
(HORAN et al. 1991).
Durch konfokale Lasermikroskopie (BACHILLER et al. 1991) sowie durch
Autoradiographie an Dünnschnitten von Säugerspermien und präparierten
Spermienkernen (FRANCOLINI et al. 1993) konnte markierte exogene DNA auch
direkt im Kern der Spermienköpfe dargestellt werden. Hier assoziiert sie mit einer
spezifischen Region der nukleären Matrix, die mit dem Äquatorialsegment des
Spermienkopfes korreliert. LAVITRANO et al. (1992) machten für die Bindung mit
Fremd-DNA eine 30-35 kD- Proteingruppe des Spermienkopfes als möglichen
Rezeptor verantwortlich, die sie als DNA-bindendes Protein bezeichneten (DBP). Die
Beobachtung, dass Seminalplasma eine Bindung exogener DNA an den
Spermienkopf inhibiert, führte zu der Entdeckung eines 37 kD stark glykosylierten
Proteins im Seminalplasma, dass eine hohe Bindungsaffinität zur Gruppe der DBP
hat. Dieses als Inhibitory factor-1 (IF-1) bezeichnete Protein schützt unter natürlichen
Bedingungen die Spermien im Ejakulat vor einer Kontamination mit exogener DNA
(ZANI et al. 1995).
Eine Schlüsselrolle bei der Aufnahme gebundener exogener DNA in den
Spermienkopf spielt das CD4-Molekül auf der Plasmamembran. In Mausmutanten
mit einer homozygoten Nullmutation für CD4 war zwar die DNA- Bindungsfähigkeit
der Spermien unbeeinflusst; die Aufnahme exogener DNA in den Spermienkopf
jedoch vollständig unterbunden. Die Behandlung von Wildtypmäusen mit Anti-CD4-
Antikörpern verhinderte eine Aufnahme fremder DNA in den Spermienkopf

- 28 -
Schriftum
(LAVITRANO et al. 1997). Daher wird ein Modell der DNA-Bindung und -Aufnahme
fremder DNA angenommen, in dem DBP und CD4 gemeinsam verantwortlich sind
(SPADAFORA 1998).
Trotz der äußerst kompakten Chromatinstruktur aus DNA und Protaminen können
DNA-Sequenzen in den Kern lebender Spermien aufgenommenen und stabil in das
haploide Genom der Spermien integriert werden (ZORAQI u. SPADAFORA 1997).
Transformationsverfahren wie Elektroporation (SIN et al. 1993) und Lipofektion
(BACHILLER et al. 1991) verbesserten qualitativ und quantitiv die Assoziation der
Spermien mit exogener DNA, führten jedoch nach in-vitro-Fertilisation oder
künstlicher Besamung nicht zu Nachkommen mit Keimbahnbeteiligung der exogenen
DNA.
Für die Effizienz des Gentransfers sind der relative Anteil befruchtungsfähiger
Spermien mit assoziierter exogener DNA und die stabile Übertragung in die Oozyte
ausschlaggebend. Die behandelten Spermien können in der in-vitro-Fertilisation oder
der künstliche Befruchtung eingesetzt werden. Untersuchungen über eine
Benachteiligung beladener Spermien während des Befruchtungsprozesses liegen
nicht vor.
Verschiedene noch nicht geklärte Faktoren während der Übertragung von
Transgenen durch Spermien können eine stabile Integration eines Transgens
beeinflussen.
Die Nachteile dieser Methode entsprechen denen der Mikroinjektion und liegen
hauptsächlich in der fehlenden Möglichkeit gezielte Modifikationen des Genoms
durchzuführen. Zudem ist weiterhin eine aufwendige Untersuchung der F1-
Nachkommen auf Keimbahnbeteiligung des Transgens nötig.

Schriftum
Abbildung 7: Erstellung transgener Tiere durch spermienvermittelten Gentransfer.
- 29 -
Nach Inkubation seminalplasmabefreiter Spermien mit exogener DNA, können diese in der
künstlichen Besamung eingesetzt werden. Alternativ kann auch in-vitro-Fertilisation (IVF) oder
intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit anschließender Übertragung der
Embryonen auf ein Empfängertier erfolgen. Die generierten Nachkommen werden auf
Integration und Expression des Transgens untersucht. Anschließend kann durch Verpaarung
eine Keimbahnbeteiligung des Transgens evaluiert werden.

- 30 -
Schriftum
2.3.4. Lentivirale Transduktion porziner Zygoten
Lentivirale Vektoren, die zur Klasse der komplexen Retroviren gehören, wurden
kürzlich zur Transduktion muriner Embryonen und ES-Zellen verwendet und führten
zur Generierung transgener Chimären und mosaik-exprimierender Nachkommen
(LOIS et al. 2002). Auch die Weitergabe des Transgens über die Keimbahn an die
Nachkommen konnte nachgewiesen werden. Tiere der F1-Generation zeigten eine
Expression des Transgens in allen untersuchten Geweben (LOIS et al. 2002;
PFEIFER et al. 2002). Mit dieser Methode wurden auch transgene Schweine
generiert. In 32 der 46 (70%) Ferkel konnte eine Integration eines GFP-Konstrukts
nachgewiesen werden, von denen 30 (94%) eine Expression des grün
fluoreszierenden Proteins zeigten. Bei allen 30 Ferkeln konnte eine
Keimbahnbeteiligung des Transgens durch Verpaarung mit nicht-transgenen
Schweinen nachgewiesen werden (HOFMANN et al. 2003). Eine Inaktivierung des
Transgens durch Hypermethylierung wurde bisher im Gegensatz zu anderen
Retroviren bei der lentiviralen Transduktion nicht beobachtet. Durch Deletion für die
Replikation des Virus wichtiger kodierender Sequenzen, kann die eigenständige
Replikation des Virus im Wirtsorganismus unterbunden werden. Die Fähigkeit zur
Infektion von Zellen und Integration von DNA-Sequenzen in das Genom der
Wirtszelle bleibt dabei erhalten. Gleichzeitig konnte durch die Deletion viraler
Sequenzen im Vektor ausreichend Platz für die Aufnahme transgener DNA-
Sequenzen geschaffen werden (CEPKO et al. 1984). Die Kapazität des Genoms zur
Aufnahme fremder DNA-Sequenzen von Lentiviren ist auf ca. 7 kb limitiert.
An Rinderembryonen wurden verschiedene Versuche mit viralen Vektoren
unternommen (HASKELL u. BOWEN 1995). Die retroviralen Partikel wurden in den
perivitellinen Raum befruchteter Eizellen injiziert und führten zu mehreren mosaiktransgenen
Feten. Auch die Injektion replikationsdefekter retroviraler Vektoren in den
perivitellinen Raum boviner MII-Oozyten, führte mit hoher Frequenz zu Nachkommen
mit stabiler Integration des Transgens (CHAN et al. 1998). Über die Expression des
Transgens wurde nicht berichtet. In der Maus werden retrovirale DNA-Elemente in

Schriftum
- 31 -
der Keimbahn hypermethyliert und führen nicht zur transgenen Expression
(JAEHNER et al. 1982).
Charakteristisch für extrazelluläre Retroviren ist ihr Genom, das aus zwei weitgehend
identischen RNA-Einzelsträngen mit einer Länge von etwa 7-10 kb besteht und über
eine DNA-Zwischensequenz repliziert wird. Nach Infektion einer Wirtszelle wird die
RNA mit Hilfe viruseigener Enzyme in einen DNA-Doppelstrang umgeschrieben
(reverse Transkription) und dieser als Einzelkopie stabil in ein Chromosom der
Wirtszelle integriert (VARMUS 1988).
In der Maus wurde fast ausschließlich eine Mosaikexpression des Transgens
beobachtet. Meistens konnte keine Keimbahnbeteiligung des Transgens erzielt
werden, was mit einem Verlust des Transgens in der Weiterzucht transgener
Founder verbunden war (JAEHNER u. JAENISCH 1980). Die Expression retroviral
übertragener Transgene ist meistens schlecht, insbesondere wenn sie unter
Kontrolle viraler LTRs (Long terminal repeats) gestellt wurden. Als Ursache für die
Inaktivierung wird eine Hypermethylierung proviraler Sequenzen angenommen, die
sowohl in undifferenzierten embryonalen Zelllinien als auch nach
Keimbahntransmission in Mäusen nachgewiesen wurde (STUHLMANN et al. 1981;
STEWART et al. 1982). Verschiedene Wissenschaftler sehen in der de-novo-
Methylierung viraler Sequenzen einen Schutzmechanismus gegen retrovirale bzw.
generell gegen die Aktivität parasitärer DNA-Sequenzen (DOERFLER et al. 1995).
Der Einsatz retroviraler Vektoren ist auf den additiven Gentransfer beschränkt. Ein
Vorteil liegt jedoch in der Integration einer Einzelkopie des Transgens in das Genom
des Wirtsorganismus.

- 32 -
Schriftum
2.3.5. Gentransfer unter Verwendung künstlicher Chromosomen
Der Einsatz artifizieller Chromosomen für die Erstellung transgener Nutztiere ist ein
innovativer Ansatz, mit dem 2002 erstmals transchromosomale Kälber erstellt
wurden (KUROIWA et al. 2002). Dabei konnte ein künstliches humanes Chromosom
(HACs: human artificial chromosomes) das für die gesamten Gensequenzen der
leichten und schweren Ketten des humanen Immunglobulins kodiert, in foetale
Fibroblasten des Rindes integriert werden. Nach Einsatz im somatischen
Kerntransfer wurden transchromosomale Kälber geboren, die humanes
Immunglobulin im Blut exprimierten.
Vorteile artifizieller Chromosomen sind das Fehlen von Positionseffekten und
Integrationsmutationen; zudem ermöglichen sie die gleichzeitige Integration mehrerer
Transgene. Die Generierung solcher Chromosomen ist jedoch schwierig, so dass es
sich bisher um keine Standardtechnik handelt.
Künstliche Chromosome sind DNA-Moleküle, die in-vitro konstruiert sind und alle
wesentlichen Bestandteile natürlicher Chromosomen aufweisen. Der Begriff künstlich
bezieht sich auf die Herstellung der Chromsomen und ihre genetische Modifikation,
da wesentliche Bestandteile wie das Zentromer, die zwei Telomere und die
Initiationstellen der Replikation aus natürlichen Chromosomen stammen (BROWN et
al. 2000; ROBL et al. 2003). Die ersten künstlichen Chromosomen wurden aus Hefen
(Saccharomyces cerevisiae) hergestellt. Künstliche Hefechromosome (YACs: yeast
artificial chromosomes) sind erfolgreich in Zelllinien eingebracht worden (STRAUSS
et al. 1993). YACs können wesentlich mehr DNA-Information in eine Zelle
transferieren als alle anderen bekannten Methoden des Gentransfers. Ein 250 kb
genomisches YAC für die murine Tyrosinase konnte durch Mikroinjektion erfolgreich
in murine Zygoten eingebracht werden. Die resultierenden Nachkommen waren
transgen und exprimierten das Transgen. Die Expression war nicht durch
Positionseffekte beeinflusst, jedoch zeigte sich eine positive Korrelation in der Anzahl
eingebrachter Kopien mit der Expressionstärke des Transgens (SCHEDL et al.
1993). FUJIWARA et al. (1997) mikroinjizierten ein 210 kb YAC-Konstrukt kodierend
für α-Laktoglobulin und humanem Wachstumsfaktor in den Vorkern von Ratten-
Zygoten. Bisher gibt es keine Berichte über eine erfolgreiche Generierung transgener

Schriftum
- 33 -
Nutztiere mit Hilfe von YACs. Dies mag an den Schwierigkeiten der Gewinnung einer
ausreichenden Menge hochreiner YACs liegen. Zudem konnte gezeigt werden, dass
YACs mitotisch hoch instabil sind, verbunden mit dem Verlust wichtiger Regionen im
Bereich des Inserts (MONACO u. LARIN 1994).
Künstliche Chromosomen können auch aus Bakterien generiert werden (BACs:
bacterial artificial chromosomes). BACs sind einfacher genetisch zu modifizieren als
YACs und ermöglichen zudem die gezielte Modifikation über homologe
Rekombination. Die Vorkerninjektion von BACs in Mäusezygoten führte zu
Nachkommen, in denen eine Weitergabe des BACs in der Keimbahn nachgewiesen
werden konnte (YANG et al. 1997).
Künstliche Chromosomen, die auf Satelliten DNA basieren (SATAC: Satellite-DNA
based artificial chromosomes), werden durch de-novo-Amplifikation perizentrisch
Heterochromatin enthaltenen Chromosomen geformt und können als chromosomaler
Vektor für exogene DNA dienen (PEREZ et al. 2000). Auch hiermit konnten
transgene Mäuse und Rinder erzeugt werden. Eine Keimbahngängigkeit des
Transgens konnte über drei Generationen gezeigt werden (CO et al. 2000).
Unter Verwendung chromosomaler Elemente aus YACs oder extrachromosomalen
Elementen aus Viren oder BACs und P1 künstlichen Chromosomen (PACs: P1
artificial chromosomes), konnten künstliche Chromosomen von Säugetieren generiert
werden (MACs: Mammalian artificial chromosomes) (VOS 1997). Im Vergleich zu
YACs ist die Konstruktion von MACs wesentlich komplizierter. Das Zentromer ist bis
zu 1000fach größer und durch seinen Aufbau aus repetitiver Alpha-Satelliten-DNA
ein kritischer Punkt bei der de-novo-Formation von MACs.
Via mikrozellvermitteltem Chromosomentransfer wurden Chromosomenfragmente
humanen Ursprungs aus foetalen Fibroblasten auf pluripotente murine ES-Zellen
übertragen, aus denen sich lebensfähige chimäre Mäuse entwickelten (TOMIZUKA
et al. 1997). Ausgehend von weiblichen und männlichen Chimären vererbte sich das
übertragene Fragment des humanen Chromosoms 2 über vier Generationen weiter.
Dabei blieb das künstliche Chromosomenfragment, das die humane Zentromerregion
besaß, als separate Struktur erhalten und wurde nicht in ein Mäuse-Chromosom

- 34 -
Schriftum
integriert. Die untersuchten F1- Nachkommen besaßen somit 40 normale
Chromosomen und zusätzlich das übertragene Fragment humanen Ursprungs,
dessen Loci gewebespezifisch exprimiert wurden. Obwohl das Fragment nicht als
Paar vorlag, wurde die Meiose in den Keimzellen beider Geschlechter nicht gestört
(TOMIZUKA et al. 1997). Durch den Einsatz eines Minichromosomes gelang es,
doppelt transchromosomale Mäuse zu generieren, die die humanen Loci für IgH (Ig
heavy chain 1,5 Mb) und Igκ (2 Mb) integriert hatten. Unter Verwendung eines
Knockout-Mäusestammes, in dem die endogenen Loci für IgH und Igκ deletiert
waren, zeigten die Nachkommen eine Expression der humanen IgH und Igκ und eine
vollständige Zusammensetzung der Ketten zu funktionalem humanem Ig
(TOMIZUKA et al. 2000). MACs mit einer Größe von 1-5 Mb können nach
Übertragung in eine Zelllinie getrennt von den natürlichen Chromosomen
weitergegeben werden (IKENO et al. 1998)
2.3.6. Effizienz unterschiedlicher Methoden des Gentransfers
In Tabelle 4 ist eine Übersicht über die Effizienz unterschiedlicher Methoden zur
Generierung transgener Tiere gegeben. Hierbei wurden nur Berichte herangezogen,
die sich auf die Erstellung transgener Schweine beziehen. Lediglichdie genetische
Modifizierung durch künstliche Chromosomen ist bisher nur beim Rind, als Nutztier
erfolgreich gewesen.

Tabelle 4: Übersicht über die Effizienz zur Generierung transgener Schweine
Referenz
Transgene
Nachkommen
/ geborene
Nachkommen
(%)
Transgene
Nachkommen/
übertragene
Embryonen
(%)
Max. Größe
der
übertragenen
exogenen
DNA
Möglichkeit
des Gen-
Knockout
Methode des
Gentransfers
(HOFMANN
et al. 2003)
68 %
13,1 %
~ 7 kb
nein
Retroviral
(Lentivirus)
Schriftum
(LAI et al.
2002)
100 %
~1 %
> 100 kb
ja
Somatischer
Kerntransfer
(NIEMANN u.
RATH 2001)
< 15 %
~1 %
~ 100 kb
nein
Mikroinjektion
(LAVITRANO
et al. 2002)
50 %
Künstliche
Besamung
> 6 kb
nein
Spermienvermittelter
Gentransfer
(KUROIWA et
al. 2002)
100%
7,3 %
> 100 Mb
nein
Künstliche
Chromosomen a
a : unter Verwendung des somatischen Kerntransfers zur Erstellung von Nachkommen.
- 35 -
Ergebnisse liegen nur für das Rind vor.

- 36 -
Schriftum
2.4. Ansätze zur Überwindung der Xenotransplantatabstoßung
2.4.1. Transgene Expression humaner Regulatoren der
Komplementaktivierung
Die nach heutigen Erkenntnissen erfolgversprechendste Strategie, um Organe von
Schweinen für die humane Organtransplantation verfügbar zu machen, ist die
Synthese humaner Regulatoren der Komplementaktivität in transgenen Schweinen.
(MCCURRY et al. 1995; COZZI u. WHITE 1995). Nach Generierung der ersten
transgenen Nutztiere und vor allem der ersten Schweine durch Mikroinjektion
(HAMMER et al. 1985), wurde diese Technik bald dazu genutzt, Schweine zu
produzieren, die transgen für humane Regulatoren der Komplementaktivität waren.
Als Regulatoren sind bekannt: CD59, das die Anlagerung von C9 an den C5b-C8
Komplex und damit die Bildung des MAC verhindert. CD46 (Membrane cofactor
protein= MCP), das die C5-Konvertase durch Spaltung inaktiviert und CD55 (decay
accelerating factor= DAF), der an die C3- bzw. C5-Konvertase bindet und diese
durch Spaltung inaktiviert. Eine Übersicht über die verschiedenen Angriffspunkte der
Regulatoren ist in Abbildung 2 gegeben. Nach Transplantation in einen
Empfängerorganismus exprimieren transgene Schweine die
komplementregulierenden Faktoren und schützen so die xenogenen Zellen vor der
Lysis durch Komplement. Durch Mikroinjektion wurden bereits vor 10 Jahren erste
hCD59-transgene Schweine und DAF-transgene Schweine generiert (FODOR et al.
1994; YANNOUTSOS et al. 1995). Organe von transgenen Schweinen zeigten ein
deutlich verlängertes Überleben nach Xenotransplantation in Primaten, hierbei
wurden Überlebenszeiten von durchschnittlich 40 Tagen nach heterotoper
Herztransplantation bei DAF-transgenen Schweinen erreicht (LANGFORD et al.
1994; COZZI u. WHITE 1995). Die orthotope (lebenserhaltende) Transplantation
eines DAF-transgenen Herzens in Primaten, führte zu einem Überleben von 10
Tagen (BACH 1998), während in beiden Experimenten Kontrollorgane nichttransgener
Schweine innerhalb weniger Minuten abgestoßen wurden. Mittlerweile
sind Überlebenszeiten für Herzen DAF-transgener Schweine nach heterotoper

Schriftum
- 37 -
Transplantation in Primaten von 90 Tagen (COZZI et al. 2000) und nach orthotoper
(lebenserhaltender) Transplantation von 39 Tagen (VIAL et al. 2000) erreicht worden.
Auch Organe hCD59-transgener Schweine zeigten nach Transplantation in Primaten
eine größere Resistenz gegen Komplement (MCCURRY et al. 1995).
Schweine, die hCD46 an der Zelloberfläche exprimieren, wiesen nach
Herztransplantation in Primaten ein verlängertes Überleben bis Tag 23 post
operationem auf, während Kontrollorgane bereits nach 90 Minuten abgestoßen
wurden (DIAMOND et al. 2001). Überlebenszeiten von bis zu 137 Tagen wurden
nach heterotoper Herztransplantation CD46-transgener Herzen in Paviane erreicht
(MCGREGOR et al. 2003). In allen Experimenten wurden die Empfänger zur
Unterdrückung der Abstoßungsreaktionen zusätzlich mit Immunsuppressiva
behandelt (Tabelle 5).
Durch Kreuzungen transgener Schweine wurden doppelt- und dreifach-transgene
Tiere generiert. Dreifach-transgene (CD59/DAF/H-Transferase) Schweine wurden
berichtet (COWAN et al. 2000), andere Arbeitsgruppen berichteten von doppelt-
transgenen Tieren (CHEN et al. 1999; COSTA et al. 2002b; ZHOU et al. 2002). Es
konnten jedoch keine signifikanten Verlängerungen in den Überlebenszeiten
transgener Organe nach Transplantation gegenüber einfach-transgenen Organen
erzielt werden, was wahrscheinlich durch unterschiedliche Expressionsmuster und
Expressionsstärken in den Geweben bedingt ist (HECKL-ÖSTREICHER et al. 1995).

- 38 -
Schriftum
Tabelle 5: Überlebenszeiten porziner Herzen nach Xenotransplantation in Primaten
Transgen
CD46
(MCP)
CD55
(DAF)
Organ/
Transplantationsart
Herz,
heterotop
Herz,
heterotop
Herz,
orthotop
Rezipient Immunsuppression Überleben
(in Tagen)
Pavian stark 137
Pavian
Pavian
CD59 Herz Pavian
moderat
moderat
99
39
stark 30h
2.4.2. Eliminierung präformierter Anti-Gal Antikörper
Referenz
(MCGREGOR
et al. 2003)
(BHATTI et al.
1999
(VIAL et al.
2000)
(MCCURRY
et al. 1995)
Die Modulation der Gal-α1,3-Gal Expression stellt einen weiteren vielversprechenden
Ansatz dar. Zu den ersten Bemühungen, natürliche Anti-Gal Antikörper zu
eliminieren, gehörten Ex-vivo-Perfusionen von Empfängerblut durch porzine Organe
wie Leber oder Niere (BREIMER u. SVALANDER 1996). Präformierte Antikörper
binden an das Xenotransplantat. Nach anschließender Rückführung des Blutes in
den Empfängerorganismus, konnte eine deutliche Reduzierung der XNAs
nachgewiesen werden. 1995 gelang die Eliminierung der natürlichen humanen Anti-
Gal Antikörper aus Serum bzw. Plasma der Empfänger mit Hilfe einer XNA-
bindenden Affinitätssäule (KROSHUS et al. 1995). Diese Säule enthielt polyklonale,
an Sepharose konjungierte, anti-humane IgG (KROSHUS et al. 1995; KOZLOWSKI
et al. 1998). Andere Ansätze neutralisierten die Anti-Gal Antikörper des Empfängers
durch Verwendung löslicher α-Gal Zucker wie Melibiose, Arabino-Galaktose (SIMON

Schriftum
- 39 -
et al. 1998), Dextransulfat (FIORANTE et al. 2001), beziehungsweise α-Gal Ricin
(TANEMURA et al. 2002). Aufgrund der hohen einzusetzenden Konzentrationen kam
es jedoch meist zu toxischen Nebenwirkungen (ROMANO et al. 1999). Kürzlich ist
das α-Galaktoseanalogon Gas914 ohne die beschriebenen Nebenwirkungen
erfolgreich im Primatenmodell eingesetzt worden (GHANEKAR et al. 2001).
2.4.3. Modulation der α1,3-Gal-Expression durch Gen-Targeting
Mit den ersten Berichten über das erfolgreiche Klonen eines Säugetiers durch
somatischen Kerntransfer (WILMUT et al. 1997), wurde die gezielte genetische
Modifikation von Nutztieren möglich.
Der Großteil der präformierten xenogenen Antikörper (XNA), der verantwortlich für
die HAR und die AVR ist, richtet sich gegen das Galaktose-α-1,3 Galaktoseepitop
(Gal-α1,3-Gal) auf den Zelloberflächen porziner Zellen.
Diese Epitope sind erstmals 1983 bei Ehrlich Aszites Tumorzellen beschrieben
worden (ECKHARDT u. GOLDSTEIN 1983). Aufgrund eines Gendefektes
exprimieren Menschen und Altweltaffen kein Gal-α1,3-Gal. (GALILI et al. 1987 u.
1988). Die fehlende Expression und damit verbundene Bildung natürlicher Antikörper
gegen die Gal-α1,3-Gal-Epitope wird als evolutionärer Selektionsvorteil gesehen
(GALILI et al. 1987). Die Bildung präformierter Antikörper gegen Gal-α1,3-Gal stellt
eine Reaktion des Immunsystems auf den Kontakt mit Gal-α1,3-Gal positiven
Mikroorganismen dar, insbesondere auf die Kolonisierung des Dickdarmes mit
gastrointestinalen Keimen wie Salmonellen, Klebsiellen, E. coli und Klostridien und
führt zu einer schnellen ersten Immunantwort (KRIVAN et al. 1986; GALILI et al.
1988).
Die α1,3-Galaktosyltransferase (α1,3-GT) gehört zur Familie der
Glykosyltransferasen. Diese transferieren Zuckerreste von einem aktiven
Donorsubstrat auf eine wachsende Carbohydratgruppe und sind zumeist im
Golgiapparat der Zelle lokalisiert. Die biochemische Reaktion der α1,3-GT wurde
erstmals 1973 beschrieben (BASU u. BASU 1973). Als Substrat dient N-

- 40 -
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Acetyllactosamin, an das unter Beteiligung von Manganionen aktivierte Galaktose
transferiert wird, hierbei entsteht das Gal-α1,3-Gal-Epitop (s.Abbildung 8).
Abbildung 8: Enzymatische Aktivität der α1,3-Galaktosyltransferase
Die erste Darstellung einer Galaktosyltransferase (bovine α-1,3GT) eines Säugetiers
gelang bereits 1985 (BLANKEN u. VAN DEN EIJNDEN 1985). Mittlerweile wurde
auch das Gen für die α1,3- Galaktosyltransferase der Maus kloniert (LARSEN et al.
1989; JOZIASSE et al. 1992) und die Organisation des bovinen
Galaktosyltransferase Locus weiter entschlüsselt (JOZIASSE et al. 1989).
Aufgrund der besonderen Funktion der porzinen α1,3-Galaktosyltransferase im
Hinblick auf die Xenotransplantation wurden in den letzten Jahren erhebliche
Anstrengungen unternommen, die genaue Organisation des Genlocus (GGTA-1) im
Schwein aufzuklären. Mittlerweile gelang es mehreren Forscherteams den GGTA-1-
Locus zu klonieren, so dass sein vollständiger Aufbau bekannt ist (DABKOWSKI et
al. 1993 u. 1994; SANDRIN et al. 1994; STRAHAN et al. 1995a u. 1995b).
Die genomische Organisation des porzinen α1,3-GT Gens wurde erstmals 1998
beschrieben (KATAYAMA et al. 1998), zwei weitere Arbeiten komplettierten die
Informationen (KOIKE et al. 2000b; MERCIER et al. 2002). MERCIER et al. (2002)
gelang es, aus einer genomischen Library aus PK15-Zellen, die Promoterbereiche zu
subklonieren.

Schriftum
- 41 -
Die porzine Galaktosyltransferase ist ein hochkonserviertes Gen und weist in den
Aminosäurensequenzen eine 76%ige Homologie zur Sequenz der Maus und eine
85%ige zur Rindersequenz auf.
Das Gen der porzinen α1,3-GT liegt auf Chromosom 1 (STRAHAN et al. 1995b) und
umfasst mit vier nicht kodierenden Exons am 5´-Ende, sowie sechs kodierenden
Exons, einen Bereich von mehr als 52 kb (KOIKE et al. 2000a; MERCIER et al.
2002). Der „Open-reading-Frame“ (ORF) besteht aus 1116 bp und wird aus sechs
Exons gebildet (Exon 4-9). Das Startkodon und die transmembrane Domäne
befinden sich in Exon 4 (SANDRIN et al. 1994), das Stopkodon in Exon 9. Die Exons
5, 6 und 7 kodieren für die Stammregion des Gens. Die katalytische Domäne
befindet sich in Exon 9 (KATAYAMA et al. 1998; HENION et al. 1999). Bisher sind 4
gewebespezifisch regulierte Spleißvarianten für diesen Bereich beschrieben worden
(VANHOVE et al. 1997; KATAYAMA et al. 1998; KOIKE et al. 2000b).
Da die konservativen Methoden zur Modulation der Gal-α1,3-Gal-Expression
lediglich zu einer verminderten Expression führen und somit eine Aktivierung des
Immunsystems durch verbleibende Gal-Epitope nicht ausgeschlossen werden kann,
wurde die vollständige Eliminierung der α1,3-Galaktosyltransferase durch homologe
Rekombination als vielversprechende Möglichkeit gesehen, diese Schwierigkeiten zu
überwinden (MACHATY et al. 2002). Das Prinzip dieser Technik wurde an
Hefezellen entwickelt, bei denen im Gegensatz zu Säugerzellen, die
Rekombinationen zwischen genomischer und transgener DNA vorrangig homolog
erfolgen. Zielsetzung bei der homologen Rekombination ist die gezielte Integration
eines Transgens in das Genom und damit verbunden eine Mutation in einem
bestimmten Genort (CAPECCHI 1989). Die nötige Kontrolle des Integrationsortes der
Fremd-DNA erfolgt durch Rekombination zwischen homologen DNA-Sequenzen. In
Säugerzellen wurde die enzymatische Maschinerie nachgewiesen, die eine
homologe Rekombination wie in Hefezellen ermöglicht (FOLGER et al. 1982).
Hierbei handelt es sich um die zellulären Proteine recA, B und C, die identische
DNA-Bereiche zwischen homologen Chromosomen wechselseitig austauschen. Dies
dient in erster Linie der Neukombination des Erbguts während der Meiose (LIN et al.
1985). Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurde die als „Gene Targeting“

- 42 -
Schriftum
bezeichnete Methode der gezielten Mutation spezifischer, chromosomaler Loci bei
der Labormaus entwickelt (SMITHIES et al. 1985; THOMAS et al. 1986; THOMAS u.
CAPECCHI 1986) und erstmals erfolgreich in kultivierten ES-Zellen zur Mutation des
endogenen Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (Hprt)- Gens
eingesetzt (DOETSCHMAN et al. 1987; THOMAS u. CAPECCHI 1987).
Die gezielte Mutation nicht direkt selektierbarer Gene wurde durch die Einführung
von Selektionsmarkern als Teil der „Targeting“-Konstrukte möglich. Am häufigsten
wird das bakterielle Gen für die Neomycin Phosphotransferase als Selektionsmarker
verwendet. Dieses verleiht eine Resistenz gegen Geneticin (G418). G418 blockt bei
nicht transfizierten Zellen durch Eingreifen in die Ribosomenfunktion die
Proteinsynthese (SOUTHERN u. BERG 1982). Das Einfügen eines zweiten
Selektionsmarkers erlaubt eine positiv-negativ Selektion. Ein weiteres Verfahren zur
Steigerung der Selektionseffizienz stellt die Verwendung promoterfreier DNA-
Konstrukte dar. Diese Konstrukte sind für die Expression auf einen aktiven
endogenen Promoter angewiesen. Dadurch konnte die Selektionseffizienz um das
500-1000 fache gegenüber allen anderen Selektionsmethoden gesteigert werden
(HANSON u. SEDIVY 1995; SEDIVY u. DUTRIAUX 1999).
Durch Injektion selektierter Klone in eine murine Wirtsblastozyste konnten aus den
entstandenen Chimären über Inzuchtkreuzungen Knockout-Mäuse generiert werden.
Die hohe Effizienz, das Vorhandensein von ES-Zellen und das kurze
Generationsintervall ließen diese Technologie zum Standard für die Erstellung von
Ko-Linien bei der Maus werden. Mehr als 1000 Ko-Linien sind bisher bei Mäusen
bekannt. In der Zwischenzeit wurden weitere Strategien zur Generierung von
Knockout-Mäusen erstellt (KÜHN et al. 1995; MAYFORD et al. 1997). Nach
umfangreichen Bemühungen gelang es zwar Stammzellkulturen auch von
nichtmurinen Spezies zu etablieren (WHEELER MB 1994; SIMS u. FIRST 1994;
CAMPBELL et al. 1996a), eine erfolgreiche Keimbahnbeteiligung ist bisher jedoch
nur für ES-Zellen der Maus und bei Nichtsäugern für ES-Zellen vom Huhn (PAIN et
al. 1996) nachgewiesen.
1995 wurde erstmalig von einer homozygoten α1,3-Gal-Ko Mauslinie berichtet
(THALL et al. 1995). Gal-Ko-Zellen von der Maus zeigten nach Perfusion mit

Schriftum
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humanem Blut eine signifikant verlängerte Überlebenszeit und Symptome der HAR
und AVR waren stark reduziert (TEARLE et al. 1996).
Mit der Veröffentlichung über die Geburt des ersten geklonten Säugetieres aus
somatischem Kerntransfer im Jahre 1997 (WILMUT et al. 1997) und der
erfolgreichen Anwendung dieser Technologie am Schwein 2000 (BETTHAUSER et
al. 2000; ONISHI et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000), waren wichtige
Voraussetzungen für die Generierung von Gal-Ko Schweinen geschaffen. 2002
wurde von der Etablierung einer heterozygoten α1,3-Gal-Ko Zelllinie berichtet
(HARRISON et al. 2002). Fast zeitgleich veröffentlichten zwei Arbeitsgruppen noch
im gleichen Jahr die Generierung von heterozygoten α1,3Gal-Ko Ferkeln (LAI et al.
2002; DAI et al. 2002). HARRISON et al. (2002) verwendete zum Knockout der α1,3-
Galaktosyltransferase einen Knockout-Vektor, der die Deletion von Exon 4 zur Folge
hatte. Exon 4 beinhaltet das Startkodon der α1,3-Galaktosyltransferase. Alle anderen
Gruppen zielten auf eine Deletion der katalytischen Domäne, die in Exon 9 lokalisiert
ist.
2003 wurden die ersten Ferkel geboren, in denen beide Allele der α1,3-
Galaktosyltransferase inaktiviert waren (PHELPS et al. 2003). Erste
Xenotransplantationsversuche mit porzinen Gal-negativen Nieren in
immunsupprimierte Paviane mit gleichzeitiger Kotransplantation von porzinem
Thymusgewebe, führten zu einem Überleben des Organs über 68 Tage. In der
histologischen Untersuchung konnten typische Anzeichen einer Abstoßungsreaktion
nicht gefunden werden (YAMADA et al. 2003). Trotz der vollständigen Inaktivierung
der α1,3-Galaktosyltransferase wurden jedoch niedrige Mengen an Gal-α1,3Gal
Epitopen auf den untersuchten porzinen Geweben nachgewiesen (SHARMA et al.
2003), was die Beteiligung eines weiteren Genlocus an der Expression von Gal-
Epitopen vermuten lässt.

- 44 -
Schriftum
2.4.4. Modulation der Gal-α1,3Gal-Expression durch indirekte Verfahren
Potentielle Ansätze die Expression des porzinen α1,3-Galaktosyltransferase Gens zu
modifizieren sind die folgenden:
- Maskierung des Akzeptorsubstrates durch Expression kompetitiver
Glykosyltransferasen
- Galaktosidase- vermittelte Eliminierung der Gal- Epitope
- siRNA- vermittelte Unterdrückung der α1,3- Galaktosyltransferase- Expression
2.4.4.1 Maskierung des Akzeptorsubstrates
Eine Methode zur Reduzierung der Expression Gal-α1,3-Gal-Epitope ist die
kompetitive Entfernung der Zielsubstrate durch andere Glykosyltransferasen. Durch
in-vitro- und in-vivo-Studien wurde gezeigt, dass es, in einer kompetitiven Situation,
zu einer präferentiellen Expression von α1,2- Fucosyltransferase und damit
verbunden, zu einer Reduktion der Gal-α1,3Gal-Epitope auf porzinen und murinen
Zelloberflächen kommt. Dabei wurde eine Reduktion der Gal-α1,3-Gal-Epitope um
bis zu 90% festgestellt (SANDRIN et al. 1995; COHNEY et al. 1997; KOIKE et al.
1997). Die α1,3-Galaktosyltransferase, α1,2-Fucosyltransferase sowie die α2,3- und
α2,6- Sialyltransferase verwenden alle N-Acetyllactosamin als Akzeptorsubstrat. Die
α1,2-Fucosyltransferase ist verantwortlich für die Ausbildung fucosylierter Strukturen
an der Zelloberfläche und auch als H-Antigen bzw. 0-Blutgruppenantigen bekannt
(KOIKE et al. 1996). Die α1,3-Galaktosyltransferase ist nicht im Stande, fucosyliertes
N-Acetyllactosamin als Zielsubstrat zu verwenden (BLANKEN u. VAN DEN EIJNDEN
1985).
Einige japanische Forschergruppen konnten ähnliche Erfolge mit der α2,3- und α2,6-
Sialyltransferase erzielen (TANEMURA et al. 1998; KOMA et al. 2000). Hierbei

Schriftum
- 45 -
wurde eine Reduktion der Gal-α1,3-Gal-Epitope um 80% beobachtet, was mit einer
verminderten Bindung von Anti-Gal Antikörpern verbunden war. In Mäusen konnte
gezeigt werden, dass durch Koexpression von hCD59 und α1,2-Fucosyltransferase
die serumvermittelte Zytolysis stark vermindert war (COSTA et al. 1999).
Der Nachteil dieser Verfahren zur Reduktion der Gal-α1,3Gal-Epitope auf porzinen
Zellen ist die gleichzeitige Veränderung im Glykolisierungsmuster der Zellen, was zu
einem Auftreten humaner Antikörper gegen diese neu-exponierten Strukturen führen
kann (SHINKEL et al. 1997).
2.4.4.2. Galaktosidase-vermittelte Eliminierung der Gal-Epitope
Ein anderer Ansatz zur Minimierung der Expression von α1,3-Gal Epitopen auf
porzinen Zelloberflächen, ist die Verwendung von Galaktosidasen. Galaktosidasen
sind Enzyme, die terminal gebundene Galaktosylreste von angehängten
Kohlenhydratgruppen trennen. Bisher wurde der Einsatz von zwei Galaktosidasen
zur Reduktion der α1,3-Gal Epitope beschrieben, der α-Galaktosidase und der Endo-
β-Galaktosidase C (EndoGalC). Die Behandlung von Kaninchen-Erythrozyten,
porzinen Lymphozyten und Endothelzellen mit α-Galaktosidase führte zur Reduktion
von α1,3-Gal Epitopen und zu einer Protektion der Zellen gegenüber humanem
Serum (ORIOL et al. 1993; CAIRNS et al. 1994; HOLZKNECHT u. PLATT 1995).
Eine bis zu 30-fach verminderte Expression von Gal-α1,3-Gal auf den
Zelloberflächen wurde erreicht. In in-vitro-Versuchen mit humanem Serum konnte
eine 10-fach schwächere Zellreaktivität mit humanen XNAs festgestellt werden.
Diese Ergebnisse standen in Einklang mit früheren Versuchen, in denen die α-
Galaktosidase von Kaffebohnen oder einer bakteriellen α-Galaktosidase eingesetzt
wurden (CAIRNS et al. 1994; HOLZKNECHT u. PLATT 1995; LAVECCHIO et al.
1995; WATIER et al. 1996). Kürzlich wurde eine 61%ige Reduktion der IgM- Bindung
an porzine Erythrozyten nach Überführung in humanes Blut und anschließende α-
Galaktosidase-Infusion gegenüber eine Kontrollgruppe nachgewiesen (DOUCET et
al. 2004).
In In-vivo-Perfusionsversuchen porziner Organe mit aufgereinigten α-
Galaktosidasen, wurde eine signifikante Reduzierung der Gal-Epitope, die mit einer

- 46 -
Schriftum
verminderten HAR einherging, beobachtet (CAIRNS et al. 1994). Nach Beendigung
der Perfusion mit α-Galaktosidase wurden jedoch wieder Gal-Epitope auf den
Zelloberflächen des porzinen Organs nachgewiesen. Deshalb wären
Dauerinfusionen mit α-Galaktosidase nötig, was einen klinischen Einsatz unmöglich
macht. Aus diesem Grund wurden porzine Zellen genetisch modifiziert, so dass es zu
einer permanenten Expression der Galaktosidase kommt.
Eine kombinierte Transfektion von COS-Zellen mit α1,3-Galaktosyltransferase, α-
Galaktosidase und α1,2 Fucosyltransferase, führte in COS-Zellen nicht zur Bindung
von IB4, einem an Gal-α1,3-Gal bindendem Lektin. Gleichzeitig wurde eine
Protektion gegenüber einer Lysis durch humanes Komplement beobachtet (OSMAN
et al. 1997).
Durch Transfektion porziner Endothelzellen mit EndoGalC konnte die Gal-Expression
stabil um 90% vermindert werden. Kürzlich wurden 98% aller Gal-Epitope in zwei
Zelllinien eliminiert (ONISHI et al. 2003). Das für die Transfektion eingesetzte
Konstrukt trug zusätzlich zu der Information für die EndoGalC den zytoplasmatischen
Schwanz, die transmembrane Domäne und die Stammregion der α1,3-
Galaktosyltransferase. Die beschriebenen Zelllinien wurden im somatischen
Kerntransfer eingesetzt. Nach Übertragung der rekonstruierten Embryonen auf 15
Empfängertiere, konnten 8 Trächtigkeiten erzielt werden (ONISHI et al. 2003).

Schriftum
2.4.4.3. Gen-Knockout durch komplementäre RNAs
- 47 -
RNA-RNA Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen.
Die Anwesenheit freier doppelsträngiger RNA löst RNA-Interferenz (RNAi) aus,
indem sie einen Proteinkomplex anlockt, der eine RNA-Nuklease und eine RNA-
Helikase enthält (ALBERTS et al. 1995). Dieser Proteinkomplex spaltet die
doppelsträngige RNA in kleine, etwa 23 Nukleotidpaare lange Bruchstücke (siRNA:
small interfering RNA), die mit dem Enzym verbunden bleiben. Die gebundenen
RNA-Fragmente leiten den Enzymkomplex zu anderen RNA-Molekülen, die eine
komplementäre Nukleotidsequenz besitzen und führt zu deren Spaltung. So können
gezielt bestimmte mRNAs einer Zelle inaktiviert werden, indem ein doppelsträngiges
RNA-Molekül künstlich eingeführt wird (ALBERTS et al. 1995)(Abbildung 9).
Antisense RNA-Konstrukte wurden bereits erfolgreich für die Inhibition von
Genfunktionen in Pflanzen und Tieren eingesetzt (DAY et al. 1991; HAN et al. 1991).
STRAHAN et al. (1995c) verabreichten intravenös Antisense-Oligonukleotide der
α1,3-Galaktosyltransferase, was zu einer Reduktion der Gal-α1,3-Gal Epitope um
40% führte.
Durch große (>50 bp) doppelsträngige RNA wird eine unspezifische inhibitorische
Antwort der Zelle durch Interferonaktivierung ausgelöst, die zu einer Degradation
aller RNA, verbunden mit dem Tod der Zelle, führt (MCMANUS u. SHARP 2002).
Kleine doppelsträngige RNA-Moleküle, die direkt als siRNA interagieren, halfen
dieses Problem zu überwinden. Gene im Säugetiergenom konnten so stillgelegt
werden, ohne eine Aktivierung von Interferon auszulösen (ELBASHIR et al. 2002).
SLEDZ et al. (2003) berichteten kürzlich jedoch auch von einer Aktivierung von
Interferon durch siRNA. Die Entwicklung von Expressionsvektoren für die
intrazelluläre Expression von siRNA ermöglicht eine stabile Transfektion von Zellen.
Der Transfer eines siRNA Expressionsvektor in murine ES-Zellen führte zum
Ausschalten des spezifischen Gens (Rasa1), wobei die erhaltenen Embryonen
denselben Phänotyp aufwiesen, wie Mäuse mit einem klassischen Knockout des
Gens (KUNATH et al. 2003). Ein Einsatz von siRNA Expressionsvektoren zur

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Schriftum
Inhibition der Translation der α1,3-Galaktosyltransferase mRNA wurde noch nicht
untersucht.
A
B
Abbildung 9: siRNA-vermittelte Gen-Inaktivierung.
A) Aufbau einer siRNA
B)Ein ds-RNA-Molekül wird durch endozelluläre Dicer gespalten. Die entstehende siRNA-
Moleküle binden an RISC (RNA Induced Silencing Complex). Sie können komplementäre mRNA
Strukturen erkennen und führen zu deren Spaltung, was eine Translation an den Ribosomen
verhindert. An Stelle eines ds-RNA-Moleküls können auch sofort siRNA-Moleküle synthetisiert
werden. Hierbei soll, im Gegensatz zum Einsatz von ds-RNA-Molekülen, eine Aktivierung des
Interferons nicht auftreten.

3. Material und Methoden
Material und Methoden
- 49 -
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines effizienten Protokolls zur
Präparation porziner Spenderzellen für das Klonen von Schweinen über somatischen
Kerntransfer. In diesem Protokoll sollten genetische Modifikationen porziner Zellen
eingebunden werden. Unterschiedliche Methoden der Zellzyklussynchronisation
wurden auf ihre Effektivität untersucht und die Zellen anschließend zur Bestimmung
des Entwicklungspotentials in In-vitro-Versuchen zum Kerntransfer eingesetzt.
Schließlich wurden Kerntransferembryonen auf synchronisierte Empfängertiere
übertragen und ausgetragen. Der gesamte Versuchsaufbau dieser Arbeit kann in vier
Abschnitte eingeteilt werden (zur graphischen Übersicht s. Abbildung 24).
Alle Zellkulturverfahren, die im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführt wurden,
wurden unter strengster Beachtung der Hygiene zur Vermeidung von
Kontaminationen der Zellkulturen durchgeführt und fanden unter einer sterilen
Werkbank der Sicherheitsstufe 2 mit laminarem Luftstrom statt (KR Biowizard 130,
Kojair, Tampere, Finnland).
3.1 Kultur primärer Zelllinien
3.1.1 Medien
Für die Kultivierung potentieller Spenderzellen wurden 3 verschiedene Kulturmedien
eingesetzt. Ihr Einfluß auf die Spenderzellen und die Möglichkeiten des Einsatzes
verschiedener Medien bei den unterschiedlichen Schritten der
Spenderzellpräparation wurden evaluiert. Für die Zellkultur wurden nur Medien
eingesetzt, die zuvor mittels 1N Natriumhydroxid bzw. 1N Salzsäure auf einen pH
von 7,1- 7,4 eingestellt waren, alle Medien basierten auf Dulbecco`s Modified
Eagle`s Medium (DMEM, #D-2554, Sigma Aldrich, MO, USA) und wurden mit
Natriumbikarbonat (#S-4019, Sigma Aldrich, MO, USA) abgepuffert.

- 50 -
Material und Methoden
Eine detaillierte Auflistung der Inhaltsstoffe des Zellkulturmediums ist dem Anhang zu
entnehmen (Tabelle 23). Der DMEM- Grundstock enthielt als pH- Indikator Phenolrot.
Eine Änderung des PH- Wertes äußert sich in einer Farbänderung nach Gelb
(sauer), bedingt durch die Verstoffwechslung der Glucose zu Laktat, bzw. nach
Violett (basisch), durch Wechselwirkung mit Luftsauerstoff, wodurch Natriumhydroxid
entsteht. Es wurde nur Medium mit normaler roter Farbe verwendet. Reaktionen des
Natriumbikarbonats mit Sauerstoff (NaOH- Freisetzung), die bei leerer werdenden
Flaschen des angesetzten Mediums auftreten können und zu einer Änderung des
pH- Wertes in den basischen Bereich führen, wurde durch rechtzeitiges Umfüllen in
ein kleineres Gefäß verhindert.
Das verwendete FCS (FCS, #10270-106, GIBCO TM , FA. INVITROGEN
CORPORATION, CA, USA) wurde vor dem ersten Gebrauch auf seine
Eigenschaften bezüglich Wachstum und Überleben der Zellen an einer Standard-
Fibroblasten- Kultur getestet und stammte für die gesamte Dauer der Versuche aus
einer reservierten Charge.
Die gebrauchsfertigen Medien wurden gekühlt (4°C) gelagert und vor Gebrauch in
einem 37°C warmen Wasserbad erwärmt.
3.1.1.1. D10-Medium
Das D10- Medium diente sowohl als Standardkulturmedium für die Kultivierung
foetaler und adulter porziner Fibroblasten als auch für Kumuluszellen. Es entspricht
der angegebenen Zusammensetzung (s. Anhang) und wies im Gegensatz zu den
anderen Zellkulturmedien einen FCS- Anteil von 10% auf.
3.1.1.2. T3-Medium
Das T3- Medium wurde als modifiziertes D10- Medium für die Zellkultur eingesetzt
und unterschied sich vom D10 durch seinen auf 30% erhöhten FCS- Anteil. Dieses
Medium wurde für die Ermittlung von Wachstumskurven bei verschiedenen Zellarten
sowie in der klonalen Expansion transfizierter Zellen eingesetzt.

Material und Methoden
3.1.1.3. Serumreduziertes Medium
- 51 -
Vor dem somatischen Kerntransfer wurden die Spenderzellen in einem
serumreduzierten Medium kultiviert. Dieses unterschied sich von den beiden anderen
Medien durch einen auf 0,5% reduzierten FCS- Anteil.
3.1.2. Etablierung primärer Zelllinien
3.1.2.1. Tiermaterial
Als Spendertiere für adulte porzine Fibroblasten und für die Gewinnung foetaler
porziner Fibroblasten am 25. Tag der Trächtigkeit dienten institutseigene Schweine
der Deutschen Landrasse.
3.1.2.2. Gewinnung porziner foetaler und adulter Fibroblasten
Zur Etablierung foetaler und adulter porziner Fibroblasten wurden Explantatkulturen
angelegt. Für die Gewinnung porziner foetaler Fibroblasten (pfF) wurden
natürlicherweise östrische Sauen aus dem institutseigenen Bestand mit einem
Deckeber belegt. Trächtigkeiten wurden am Tag 23 mittels Real-time Ultraschall
(Modell CS 9100, Fa. Picker International GmbH, Espelkamp, 5MHz Schallkopf)
festgestellt.
Als tragend diagnostizierte Sauen wurden am Tag 25 im institutseigenen
Schlachthaus getötet und hysterektomiert. Der Uterus wurde sofort in das
Zellkulturlabor gebracht und dort mit einer geknöpften Darmschere eröffnet. Die
Foeten (Abbildung 10) wurden mitsamt ihrer Fruchtblase mit Hilfe einer Pinzette und
Schere aus dem Uterus herausgeholt und sofort in eine mit PBS mit 200 U/ml
Penicillin und 200 µg/ml Streptomycin (Dulbecco`s Phosphat-gepufferte Salzlösung,
#D5652, Penicillin G, # PEN-NA, Streptomycin, #S-6501, Sigma Aldrich, MO, USA)
gefüllte Petrischale überführt. Die Foeten wurden aus den Fruchtblasen isoliert und
anschließend zweimal mit antibiotikahaltiger PBS- Lösung gewaschen. Nach
Eviszeration, Dekapitation und Amputation der Extremitäten wurde der verbleibende

- 52 -
Material und Methoden
Corpus mit Hilfe von zwei Kanülen der Stärke 18-gauge in 1-2 mm große Stückchen
zerlegt.
Parallel hierzu wurden in Zellkulturflaschen (T25-Zellkulturschale, Tissue Culture
Flask, #9025, Fa. TPP/Schweiz) je 12 rekalzifizierte Plasmatropfen (9 Teile Bovines
Plasma, #P-4639, Sigma Aldrich, MO, USA + 1 Teil 0,5 M CaCl2) mit Hilfe einer
Glaspipette aufgebracht. In diese Plasmatropfen wurden einzelne kleine
Gewebsstücke verbracht. Je nach Verwendung der Zellen wurde eine Mischkultur
von mehreren Foeten (gepoolte Zellkultur) oder eine Einzelfoetus-Kultur angelegt.
Anschließend wurden die Zellkulturflaschen zur Agglutination des Plasmatropfens für
20- 60 Minuten in einen Wärmeschrank (Hera Cell, Typ BB16, Fa. Heraus
Instruments, Hanau) bei 38°C eingestellt. Sobald die Gewebestücke durch die
Plasmakoagulation fixiert waren, wurden den Zellkulturflaschen 5 ml D10- Medium
mit 2,5 µg/ml Amphotericin B (Amphotericin B preparation 250µg/ml, #A-2942,
Sigma Aldrich, MO, USA) für die ersten 2- 3 Tage hinzugegeben. Die Zellen wurden
bei 37°C und 5% CO2 in einem Wärmeschrank kultiviert. Alle 2-3 Tage wurde das
Medium mit einer Glaspipette abgesaugt und durch 5 ml frisches D10- Medium ohne
Zusatz von Amphotericin B erneuert. Wenn die auswachsenden Fibroblasten einen
Hof von 2 cm um das Explantat erreicht hatten (Abbildung 11), wurden das Medium
abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und 10 Minuten mit 1ml einer
0,05 % EDTA/ Trypsin Lösung bei 37°C inkubiert. Unter einem Stereomikroskop
(Leica DM IRB, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) wurden Abrunden und
Ablösen der Fibroblasten kontrolliert. Anschließend wurden 9 ml PBS hinzugefügt,
die Zellen mittels einer 10 ml Pipette, durch Auf- und Abpipettieren vereinzelt, in ein
15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und bei 200 g für 3 Minuten zentrifugiert
(Megafuge 1.0, Fa. Instruments, Hanau, Deutschland). Der Überstand wurde mit
einer Glaspipette abgesaugt, das Zellpellet in 10 ml D10- Medium aufgenommen und
die Zellen in einer 75 cm 2 Zellkulturflasche (T75-Zellkulturschale, Tissue Culture
Flask, #9296, Fa. TPP/Schweiz) ausgesät. Wenn die Zellkulturen eine Konfluenz von
ca. 70-80 % erreicht hatten, wurden sie erneut mit EDTA/ Trypsin behandelt, nach
erfolgter Inkubation in 10 ml PBS aufgenommen und zentrifugiert. Zeitgleich wurde
D10- Medium im Verhältnis 9:1 DMSO (Dimethyl Sulphoxide, #D2650, SIGMA

Material und Methoden
- 53 -
Aldrich, MO, USA) als Kryoprotektivum zugegeben. Der Überstand wurde nach dem
Zentrifugieren abgesaugt, das Zellpellet durch Schaben gelockert, in 3 ml
Einfriermedium aufgenommen und in 3 Kryoröhrchen (Cryo.S, Greiner Bio-one,
Frickenhausen, Deutschland) á 1 ml überführt. Nach einer Lagerung für 24 Stunden
bei – 80°C wurden die Aliquots in flüssigen Stickstoff überführt.
Die Gewinnung porziner adulter Fibroblasten (paF) unterschied sich von der
Gewinnung von pfF lediglich im Ausgangsmaterial. Dafür wurden Kontrolltieren und
transgenen Tieren (hCD59, Linien 1 und 5) (NIEMANN et al. 2001) des
institutseigenen Bestandes Ohrkerben mittels einer Kerbzange entnommen und
sofort in PBS mit Antibiotika überführt. Die Ohrkerben wurden zweimal in
antibiotikahaltigem PBS gewaschen, anschließend wurde die umgebende Epidermis
entfernt und das Unterhautbindegewebe freipräpariert. Dieses wurde dann in 1-2 mm
große Stücke zerkleinert. Das weitere Vorgehen entspricht der Präparation der
foetalen Zellen (s.oben).

- 54 -
Material und Methoden
Abbildung 10: 25 Tage alter Schweinefoetus
Explantat
Explantat
Auswachsender
Fibroblast
Auswachsende
Fibroblasten
Abbildung 11: Aus einem Explantat auswachsende Fibroblasten (Tag 7)

Material und Methoden
3.1.2.3. Gewinnung porziner Kumuluszellen
- 55 -
Die Gewinnung von Kumuluszellen erfolgte wie in der Dissertation von Michael
Hölker (HOELKER 2003), beschrieben, die in enger Kooperation mit der
vorliegenden Doktorarbeit durchgeführt wurde. Gewonnene Kumulus-Oozyten-
Komplexe wurden in eine 4-Well-Zellkulturschale überführt und in 500 µl D10-
Medium kultiviert. Kumuluszellen hafteten sich nach 2 Tagen an die Oberfläche der
Zellkulturschale und begannen zu proliferierten (Abbildung 12), wobei sich die
Oozyten ablösten und beim Mediumwechsel abgesaugt wurden (Abbildung 13).
Erreichten die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % wurden sie in einem Verhältnis von
1 zu 4 auf eine größere Zellkulturschale neu ausgesät.
Oozyte
Abbildung 12: Auswachsende Kumuluszellen am Tag 2

- 56 -
Material und Methoden
Abgelöste
Oozyte
Abbildung 13: Kumuluszelllayer am Tag 8 mit Oozyte
Abbildung 13: Kumuluszelllayer am Tag mit abgelöster Oozyte.
3.2. Erstellung von Wachstumskurven
Zur Evaluierung des Wachstumspotentials und der Proliferationseigenschaften der
verschiedenen primären Zelllinien (foetale Fibroblasten, adulte Fibroblasten,
Kumuluszellen) in den beiden unterschiedlichen Medien (D10-, T3- Medium), wurden
Wachstumskurven erstellt.
3.2.1. Trypsinisieren der Zellen
Die am weitesten verbreitete Methode, adhärente Zelllinien zu subkultivieren, ist der
Gebrauch von Trypsin in Verbindung mit EDTA (Trypsin- EDTA, T-4174, Sigma
Aldrich, MO, USA). Dabei ist darauf zu achten, dass die Zellen nicht zu lange mit der
Trypsin- EDTA- Lösung in Kontakt bleiben, da längere Einwirkzeiten die
Lebensfähigkeit der Zellen irreversibel schädigen können. In Vorversuchen wurde
eine Einwirkzeit der Trypsin- EDTA- Lösung von 10 Minuten als am besten geeignet
ermittelt. 50ml einer 10-fach konzentrierten Trypsin- EDTA- Lösung wurden vor
Beginn der Versuche jeweils 1/10 mit PBS verdünnt, um eine einfach konzentrierte
Lösung zu erhalten. Die einfach konzentrierte Lösung enthielt 0,05% Trypsin und

Material und Methoden
- 57 -
0,02% EDTA in PBS- Lösung bei einem pH von 7,2. Jeweils 10 ml dieser Lösung
wurden in 15 ml Röhrchen überführt und bei -20° Celsius bis zum Gebrauch gelagert.
Vor Zugabe der Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen wurden diese zweimal mit
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Kalzium und Magnesium gewaschen,
um Reste des foetalen Rinderserums zu entfernen, das die Trypsinwirkung inhibiert.
Ein Aliquot der einfach konzentrierten Trypsin- EDTA- Lösung wurde vor der
Inkubation der Zellen in einem Wasserbad auf 37°C erwärmt. Die Erwärmung auf
37°C führt hierbei zu einer optimalen Aktivität des Trypsins, verbunden mit der
effizienten Ablösung der Zellen nach einer möglichst kurzen Einwirkzeit. Die optimale
Temperatur für die Trypsinwirkung wurde auch während der Einwirkzeit durch
Überführung der Zellkulturplatte in einen auf 37°C erwärmten Wärmeschrank
beibehalten. Ablösung und Abrunden der Zellen wurden nach der Einwirkzeit unter
einem Phasenkontrastmikroskop (Leica DM IRB, Leica Microsystems, Wetzlar,
Deutschland) kontrolliert.
3.2.2. Zellzählung mittels Zählkammer
Zur Erstellung von Wachstumskurven wurden die zu untersuchenden Zelllinien (eine
Zelllinie gepoolter foetaler Fibroblasten aus 6 Foeten, zwei Linien adulter
Fibroblasten, eine Zelllinie Kumuluszellen) jeweils auf zwei Vertiefungen (1x in D10-
Medium, 1x T3- Medium) einer 6-Well Zellkulturplatte ausplattiert. In einer Vertiefung
wurden die Zellen in 2 ml D10- Medium, in der anderen Vertiefung in 2 ml T3-
Medium kultiviert. Bei Erreichen einer Konfluenz von 70- 80 %, wurden die Zellen
gezählt und in einer Dichte von 0,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung wieder ausgesät. Vor
der Zählung wurde das Medium in der Zellkulturschale vollständig abgesaugt. Die
Zellen wurden zweimal mit PBS ohne Magnesium und Kalzium gewaschen und
anschließend mit 0,5 ml/ pro Vertiefung in 37°C vorgewärmter EDTA/ Trypsin-
Lösung bei 37°C in einem Wärmeschrank für 10 Minuten inkubiert.
Abrunden und Ablösen der Zellen wurden unter einem Phasenkontrastmikroskop am
Ende der Inkubationszeit kontrolliert. Zu den abgelösten Zellen wurden 1,5 ml des
entsprechenden Mediums hinzupipettiert, so dass eine Verdünnung der Zellen von 1

- 58 -
Material und Methoden
zu 2 hergestellt wurde. Anschließend wurden die Zellsuspensionen von zwei
Vertiefungen einer Zelllinie, kultiviert in demselben Medium (D10-D10, T3-T3)
zusammengeführt. Vereinzelung der Zellen und homogene Durchmischung der
Zellsuspension wurden durch Auf- und Abpipettieren mit einer 1000 µl Eppendorf-
Pipette erreicht.
Die Zellen wurde mit Hilfe eines Hämocytometers (Neubauer-Zählkammer) gezählt.
Die Neubauer- Zählkammer besteht aus neun großen Quadraten, die jeweils eine
Fläche von 1 mm 2 besitzen. Dies ergibt bei einer Tiefe von 0,1 mm ein Volumen von
0,1 µl pro großem Quadrat und insgesamt ein Volumen von 0,9 µl.
Die Oberfläche und das dazugehörige Deckglas der Zählkammer wurden vor der
Zellzählung mit 70%igem Ethanol gut gereinigt. Anschließend wurde das Deckglas
leicht angefeuchtet und auf die Zählkammer gelegt. Das Erscheinen von
sogenannten „Newtonringen“, diente als Kontrolle der richtigen Lage des Deckglases
auf der Zählkammeroberfläche. Ein großes Quadrat konnte bei 100facher
Vergrößerung ausgezählt werden.
Hierzu wurde die Zellsuspension mit einer 100 µl Eppendorf-Pipette in die
Zählkammer gefüllt. Kapillarkräfte zogen die Zellsuspension in den Zwischenraum
zwischen Deckglas und Zählkammer. Dabei wurde strengstens darauf geachtet,
dass die Kammer nicht über- bzw. unterfüllt war, da die Oberflächenspannung das
Volumen der Zählkammer verändern kann. Anschließend wurden bei 100 facher
Vergrößerung mit einem Phasenkontrastmikroskop mindestens 4 große Quadrate
ausgezählt. Um Doppelzählungen zu verhindern, wurden nur solche Zellen
mitgezählt, die oben und links vom Betrachter auf den Linien lagen (s. Abbildung 14).

Material und Methoden
- 59 -
Abbildung 14: Im linken Bild ist der Aufbau einer Neubauer- Zählkammer mit eingezeichneten
Quadraten zu sehen.
Das rechte Bild demonstriert das Schema der Zellzählung. Um Doppelzählungen zu vermeiden
werden nur die links und oben auf den Linien liegenden Zellen gezählt (schwarz dargestellt).
3.2.3. Populationsverdopplungen
Für die Ermittlung der Populationsverdopplungen (PV) wurden pro Zelllinie und
Medium 10 große Quadrate ausgezählt (zweimalige Auszählung jeder Zelllinie) und
anschließend der Mittelwert gebildet. Der Mittelwert wurde mit 10 4 multipliziert, was
die Zellkonzentration pro Milliliter ergibt. Die Gesamtzahl der Zellen konnte aus dem
Volumen der Zellsuspension (hier 2 ml) multipliziert mit der Gesamtzahl der Zellen
pro Milliliter errechnet werden. Zur Berechnung der Populationsverdopplungen wurde
folgende Formel verwendet:
PV= log (A/B) / log2.
A ist die Gesamtzahl der gezählten Zellen und B stellt die Anzahl der ausgesäten
Zellen dar.

- 60 -
3.3. Zellzyklussynchronisation
Material und Methoden
Zur Synchronisation der Spenderzellen in der G0/G1 Phase des Zellzyklus vor dem
somatischen Kerntransfer, wurden Kontaktinhibition und Serumreduktion eingesetzt
und auf ihre Effizienz bezüglich der Synchronisation der Spenderzellen und auf
etwaige Einflüsse auf die Effizienz des somatischen Kerntransfers beim Schwein
untersucht.
3.3.1. Zellzyklussynchronisation mittels Kontaktinhibition
Für die Zellzyklussynchronisation mittels Kontaktinhibition wurden 5x 10 4 foetale
Fibroblasten pro Vertiefung einer 6-Well Platte ausgesät.
Die Zellkulturen wurden täglich mikroskopisch auf ihre Konfluenz untersucht, der
Zustand der Kontaktinhibition war bei 100% Konfluenz erreicht. Je nach Versuch
wurden die Zellen für weitere 24, 48, 72 oder 96 Stunden nach Erreichen der
Kontaktinhibition in D10- Medium kultiviert. Die erstellten Wachstumskurven für die
unterschiedlichen Zelllinien ergaben erste Hinweise zu den
Populationsverdopplungszeiten. Da jedoch keine objektive Methode zur Ermittlung
des Erreichens der Kontaktinhibition existiert, wurde die Kultur wiederholt visuell
untersucht. Zur Überprüfung der Methode wurde eine FACS- Analyse (Fluorescence
Activated Cell Sorter) der Zellen 24 Stunden nach Feststellen der Kontaktinhibition
und nach Beendigung der jeweiligen Kontaktinhibitionszeiten (24 – 96 h)
durchgeführt. Weiterhin wurden die Zellen nach erfolgter Zellzyklussynchronisation,
entweder 1 zu 4 gesplittet und erneut ausgesät, oder nach Serumreduktion (SR) und
Splitten in serumhaltiges Medium (10% FCS) überführt. Hier erfolgte eine FACS-
Analyse 24 Stunden später (s. Abbildung 15). In der FACS- Analyse wurden Zellen
untersucht, die für 20 Passagen in T3- Medium kultiviert wurden. Diese Analyse
diente der Klärung der Frage, ob in T3-Medium kultivierte Zellen transformieren, d.h.
eine Veränderung ihres Chromosomengehalts aufweisen, oder weiterhin einen
diploiden Chromosomensatz besitzen.

Material und Methoden
- 61 -
Alle weiteren Untersuchungen zur Zellzyklussynchronisation wurden mindestens
dreimal wiederholt und immer mit Zellen eines Aliquots durchgeführt. Aufgrund der
Ergebnisse der Wachstumskurvenerstellung kamen in diesen Versuchen nur foetale
porzine Fibroblasten der Passage 2-4 zum Einsatz.
Abbildung 15: Schematische Darstellung der gewählten Zeitpunkte für die FACS-Analyse
während der Zellzyklussynchronisation (KI: Kontaktinhibition, jeweils 3 Proben je
Untersuchungsgruppe).
3.3.2. Zellzyklussynchronisation durch Serumreduktion
Im Gegensatz zur Kontaktinhibition handelt es sich bei der Serumreduktion um eine
objektiv definierte Dauer der Zellzyklussynchronisation, beginnend mit dem
Austausch des Standardkulturmediums (D10) durch ein Medium mit deutlich
verringertem Serumgehalt und endend mit der Gewinnung der Zellen, oder deren
Überführung in Standardmedium. Aufgrund vorangegangener Untersuchungen zur
Zellzyklussynchronisation über Serumreduktion wurde der Serumgehalt des
Kulturmediums auf 0,5%, für 48 Stunden vermindert (KUES et al. 2000). Die
Effektivität des Serumentzugs zur Zellzyklussynchronisation der Spenderzellen in der
G0/ G1 Phase des Zellzyklus wurde mittels FACS- Analyse mit dreifacher
Wiederholung ermittelt.
24 - 96 h KI
¼ Splitting nach
KI - Zeit
3 Proben Jeweils 3 Jeweils 3 Jeweils 3
Zyklische Proben Proben Proben
Fibroblasten
(Kontrolle)
nach 24h
KI
nach Ende
der KI
24h nach
Splitting

- 62 -
Material und Methoden
3.3.3. Bestimmung des Zellzyklus durch FACS
Um den Anteil der Zellen nach der Zellzyklussynchronisation zu bestimmen, der sich
in der gewünschten G0/G1- Phase des Zellzyklus befand, wurde eine FACS-Analyse
durchgeführt. Dabei wird der DNA-Gehalt untersucht, was Rückschlüsse auf den
Zellzyklus erlaubt.
Hierzu wurden die Zellen in einer T25- Zellkulturflasche hochgezogen und
anschließend der Zellzyklus mittels Kontaktinhibition oder Serumreduktion
synchronisiert. Anschließend wurden das Medium abgesaugt, die Zellen zweimal mit
PBS gewaschen und 10 Minuten bei 37°C im Wärmeschrank mit 1 ml EDTA/ Trypsin
inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurden 9 ml PBS der Zellkulturflasche
hinzugefügt, die Zellen mit Hilfe einer 10 ml Pipette, angeschlossen an eine
Pipettierhilfe, durch Auf- und Abpipettieren vereinzelt und in ein Zentrifugenröhrchen
überführt. Nach Zentrifugation bei 200 g für 3 Minuten wurde der Überstand
abgesaugt. Für die Fixation der Zellen wurden dem Zellpellet tropfenweise 1 ml -
20°C kaltes, 80%iges Methanol hinzupipettiert und anschließend das
Zentrifugenröhrchen bis zur weiteren Präparation in einem -20°C Gefrierschrank
gelagert.
Für die FACS- Analyse wurden die Zellen mit Propidiumjodid angefärbt.
Propidiumjodid ist stark basisch und kann gut in den aziden Zellkern penetrieren.
Hierbei lagert sich der Farbstoff in die helikale Struktur der DNA ein und kann, durch
den Laserstrahl des Cytometers angeregt, zur Fluoreszenz gebracht werden. Das
Propidiumjodid Anregungsmaximum liegt bei 488 nm; es emittiert bei 690 nm. Vor
der FACS- Messung wurden die Zellen abzentrifugiert (1500 U/min für 5 Minuten)
und 2-3 mal in PBS+ 0,1% Saponin gewaschen. Das Pellet wurde in 1 ml PBS+
0,1% Saponin+ 20 µg/ ml Propidiumjodid+ 1 mg/ ml RNase resuspendiert und 30
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte eine weitere Waschung der Zellen
in PBS+ 0,1% Saponin. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml PBS aufgenommen
und in das FACS-Röhrchen überführt. Zur Messung wurden alle Proben im Dunkeln
aufbewahrt. Im FACS-Gerät werden die Partikelgröße und die Intensität der
Propidiumjodid-Fluoreszenz gemessen. Daraus kann der Anteil der Zellen in den
Phasen des Zellzyklus ermittelt werden. Als Messgerät wurde ein Becton Dickinson

Material und Methoden
- 63 -
FACScan- Gerät (BD Biosciences, CA, USA) benutzt. Jeweils 10 000 Zellen wurden
gezählt und mit Modfit Cell Cycle Analysis Programm ausgewertet. Die FACS-
Analysen wurden im Labor von Dr. H-J. Hauser, Gesellschaft für Biotechnologische
Forschung (GBF) in Braunschweig durchgeführt.
3.4. Somatischer Kerntransfer
Zur Evaluierung des Entwicklungspotentials geklonter Embryonen, die mit
verschiedenen Zellpräparationen hergestellt worden waren, sind In-vitro- und In-vivo-
Untersuchungen durchgeführt worden. Diese Untersuchungen wurden zusammen
mit einer weiteren Dissertation in der Arbeitsgruppe des Forschungsbereiches
Biotechnologie am Institut für Tierzucht in Mariensee mit dem Titel „Experimentelle
Untersuchungen zum somatischen Klonen beim Schwein: In-vitro- und In-vivo-
Entwicklung von Kerntransferkomplexen aus in vitro gereiften Oozyten“ (HOELKER
2003), durchgeführt. Die Schritte der Oozytenreifung und Enukleation sowie das
Einbringen der Spenderzellen, Fusion und anschließende Aktivierung der Komplexe
wurden von Michael Hölker durchgeführt und sind detailliert in der oben genannten
Dissertation nachzulesen.
3.4.1. Präparation der Oozyten für den Kerntransfer
In den In-vitro-Versuchen wurden 38h, 40h und 42h in NCSU37 gereifte porzine
Oozyten eingesetzt, die vor dem Einbringen der Spenderzellen enukleiert worden
waren.
3.4.2. Präparation der Spenderzellen für den Kerntransfer
Für die In-vitro- Versuche zum somatischen Kerntransfer beim Schwein wurden
ausschließlich foetale porzine Fibroblasten in 2.-4. Passage verwendet. Lediglich in
zwei Durchgängen wurden auch adulte hCD59-EGFP-transgene porzine
Fibroblasten der Passage 3 eingesetzt. An den Versuchstagen wurden die
Spenderzellen wie folgt präpariert:

- 64 -
Material und Methoden
Vor dem Einsatz im somatischen Kerntransfer wurden fetale Fibroblasten, je nach
Versuch nach einer der bereits beschriebenen Methoden in der G0/ G1- Phase des
Zellzyklus synchronisiert. Nach Beendigung der Zellzyklussynchronisation wurden
am Versuchstag, ca. 1 Stunde vor Beginn des somatischen Kerntransfers
enzymatisch von der Zellkulturschale gelöst. Vollständige Ablösung und Abrundung
der Zellen von der Oberfläche der Zellkulturplatte wurden nach der Einwirkung der
EDTA/ Trypsin-Lösung mit einem Phasenkontrastmikroskop kontrolliert.
Vollständiges Ablösen der Zellen von der Zellkulturplattenoberfläche wurde durch
leichtes Klopfen auf die Tischoberfläche unterstützt. Die Zellsuspension wurde in
einem nächsten Schritt mit 4,5 ml PBS aufgefüllt und in ein 15 ml
Zentrifugenröhrchen überführt. Zur Inhibition der Trypsinwirkung wurden 100 µl FCS
in das Röhrchen hinzugegeben. Anschließend wurden die Zellen bei 200g für drei
Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Zellpellet durch
Schaben auf der Tischoberfläche der sterilen Werkbank gelockert. Dieser
Waschschritt wurde zweimal durchgeführt. Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt
wurden der Überstand abgesogen, das Zellpellet gelockert, in 1 ml kalziumfreies Tl-
Hepes296 aufgenommen und in ein 2 ml Eppendorf Röhrchen überführt. Das Tl-
Hepes Medium besaß eine Osmolarität von 296 mOsmol, die verringerte Osmolarität
des Tl- Hepes gegenüber dem Zellkulturmedium (~ 310 mOsmol) führte zu einem
Wassereinstrom durch die Zellmembran in die Zellen und damit verbunden zu einem
„Aufblähen“ der Zellen. Dies stellte sich in weiteren Untersuchungen als positiv in
Bezug auf die spätere Fusionsrate im Kerntransfer heraus (HOELKER 2003) und ist
leicht mit dem dadurch erzielten intensiven Membrankontakt zwischen Spenderzelle
und Oozyte zu erklären. Eine Darstellung der gesamten Präparation der
Spenderzellen von der Gewinnung bis zum Einsatz im somatischen Kerntransfer ist
Abbildung 16 zu entnehmen.

Material und Methoden
Abbildung 16: Darstellung der Spenderzellpräparation
- 65 -

- 66 -
3.4.3. Kerntransfer
Material und Methoden
Der somatische Kerntransfer umfasst folgende Schritte: Enukleation der Eizelle,
Einbringen der Spenderzelle in den perivitellinen Raum einer enukleierten Oozyte,
die Fusion beider Zellen und die anschließende Aktivierung der Fibroblasten-
Oozyten-Komplexe (s. Abbildung 17).
Abbildung 17: Darstellung der Schritte beim somatischen Kerntransfer. Eine Oozyte wird nach
der Reifung enukleiert, dabei wird das haploide genetische Material der Oozyte vollständig
entfernt. Anschließend wird eine Spenderzelle in den perivitellinen Raum eingebracht. Nach
Fusion und Aktivierung kann eine Übertragung in synchronisierte Empfängertiere durchgeführt
werden. Alternativ erfolgten eine in-vitro-Kultur oder das Einfrieren der Embryonen.

Material und Methoden
- 67 -
Anschließend wurden die Kerntransferembryonen für sieben Tage in NCSU23 bei
38,5°C und 5% CO2 in einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre im Wärmeschrank
inkubiert.
3.4.4. Beurteilung der In-vitro- Entwicklung porziner Kerntransferembryonen
3.4.4.1. Morphologische Beurteilung der Embryonen
Die Beurteilung der In-vitro-Entwicklung der porzinen Embryonen erfolgte am Tag 7
nach Aktivierung. Hierzu wurde für jeden einzelnen Embryo nach Ablauf der
Kulturphase ermittelt, ob das Blastozystenstadium erreicht wurde. Die Beurteilung
der Embryonen wurde unter einem Stereomikroskop (Olympus SZ-PT, Fa. Olympus
optical CO., Japan) bei 10- 100 facher Vergrößerung durchgeführt. Als Kriterien für
Blastozysten wurden herangezogen: flüssigkeitsgefüllte Hohlraumbildung
(Blastozoel), Bildung eines Trophektoderms (TE) und der inneren Zellmasse (ICM).
3.4.4.2. Bestimmung der Kernzahlen der Klonembryonen
Nach DNA Färbung mit Hoechst 33342 wurden die Embryonen zwischen einem
Objektträger und einem Deckgläschen, das durch beidseitig aufgesetzte
Vaselinestege auf Abstand gehalten wurde, fixiert. Unter einem
Fluoreszenzmikroskop (Olympus Bx60F-3, Olympus Optical CO., Japan) mit
integrierter UV-Dampfleuchte (Modell U-ULS100HG, Olympus Optical CO., Japan)
wurde für jeden einzelnen Embryo die Anzahl fluoreszierender Zellkerne ermittelt.

- 68 -
Material und Methoden
3.5. Molekularbiologische Methoden
3.5.1. Präparation von Plasmid-DNA
Für die Transfektion potentieller Spenderzellen wurden zwei verschiedene Plasmide
eingesetzt. Zum einen PMW8-Neo, ein Konstrukt, das von PD Dr. Ulrich Martin und
Frau Dr. Monica Winkler vom Leibniz Forschungslaboratorium für Biotechnologie und
künstliche Organe (LEBAO) an der Medizinischen Hochschule Hannover innerhalb
eines Verbundes zur Erforschung neuer Ansätze in der Xenotransplantation, zur
Verfügung gestellt worden war und dazu dienen sollte, in transfizierten Zellen einen
Knockout der α1,3-Galaktosyltransferase zu bewirken.
Das zweite eingesetzte Plasmid war PGE150, ein Konstrukt, das die Informationen
für das „Enhanced Green Fluorescence Protein (EGFP)“ trug und zur Erstellung
eines effizienten Transfektionsprotokolls für potentielle Spenderzellen sowie der
Überprüfung des somatischen Kerntransfers genutzt wurde.
3.5.1.1. Transformation von Bakterien
Ein Aliquot kompetenter Bakterien des DH5α-Stammes wurde auf Eis aufgetaut. 50
ng Plasmid-DNA wurden in 100 µl mit kompetenten Zellen für 30 Minuten bei 4°C
inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 1 Minute bei 42°C wurde der
Transformationsansatz für 10 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend wurden 0,5 ml
LB-Medium (Luria Bertani-Medium, s. Anhang) hinzugegeben und auf einem
Schüttler bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze auf
LB- Agarplatten mit geeignetem Antibiotikumzusatz für 16- 24 Stunden in einem
Brutschrank bei 37°C kultiviert.

3.5.1.2. Kultur der Bakterien
Material und Methoden
- 69 -
Nach der Kultivierung in einem Brutschrank bei 37°C wurden antibiotikaresistente
Kolonien mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in 100 ml flüssiges LB- Medium mit
Antibiotikazusatz in einen Erlenmeyerkolben überführt und unter Schütteln (300
U/min.) bei 37°C für 16 Stunden kultiviert.
3.5.1.3. Plasmid-Maxi-Präparation
Für die Plasmid Präparation wurde ein Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen GmbH,
Hilden, Deutschland) verwendet und die Präparation nach Anleitung des
Handbuches durchgeführt. Die Bakteriensuspension wurde in ein 50 ml
Zentrifugenröhrchen überführt und bei 6000 g und 4°C für 15 Minuten zentrifugiert
(Cryofuge, Haeraus Instruments, Hanau, Deutschland). Nach der Zentrifugation
wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 10 ml Puffer 1 (50 mM Tris-Cl pH
8,0 , 10mM EDTA, 100 µg/ ml RNase A) durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert.
10 ml Puffer 2 (200 mM NaOH, 1% SDS) wurden der Suspension zugegeben und
durch mehrmaliges Umdrehen des Zentrifugenröhrchens vorsichtig durchmischt.
Anschließend wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der
Inkubation wurden 10 ml von 4°C gekühltem Puffer 3 (3,0 M Kaliumazetat pH 5,5)
zugegeben und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde in ein 30 ml
Corex Röhrchen überführt und zweimal bei 20000 g und 4°C für 30 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine zuvor mit 10ml Puffer QBT (750 mM
NaCl, 50 mM MOPS pH 7,0, 15% Isopropanol, 0,15% Triton X-100) äquilibrierte
Qiagen- Säule 500 gegeben. Nach Durchlauf des Überstandes durch die Säule
wurde diese zweimal mit 30 ml QC- Puffer (1,0 M NaCl, 50 mM MOPS pH 7,0, 15%
Isopropanol) gewaschen. Anschließend wurde die Plasmid- DNA aus der Säule
mittels 15ml QF- Puffer (1,25 M NaCl, 50 mM Tris- Cl pH 8,5 , 15% Isopropanol)
eluiert und in einem 30 ml Röhrchen aufgefangen. Zur Präzipitation der eluierten
DNA wurden 10,5ml Isopropanol hinzugefügt, gemischt und bei 4°C für 30 Minuten
bei 15 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit 5 ml

- 70 -
Material und Methoden
70%igen Ethanol versetzt und bei 15 000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand wurde erneut verworfen, das Pellet für 15 Minuten an der Luft getrocknet
und dann in 200 µl Aqua dest. über Nacht bei 4°C gelöst. Die DNA- Konzentration
wurde anschließend photometrisch bestimmt.
3.5.1.4. Analytischer Verdau der DNA durch
Restriktionsendonukleasen
500 ng Plasmid- DNA wurden mit 2 µl des entsprechenden Puffers und 1µl
Restriktionsenzym versetzt und mit Aqua dest. auf 20 µl aufgefüllt. Es folgte eine
Inkubation für 1 Stunde bei 37°C im Heizblock.
Bei PMW8- Neo, mit dem eine stabile Transfektion der Zellen verbunden mit dem
Knockout des α1,3- Gal Gens durch homologe Rekombination erzielt werden sollte,
wurde nach dem analytischen Verdau die gesamte Plasmid- DNA mit Mlu I verdaut.
Mlu I besitzt eine Schnittstelle in PMW8- Neo und führt dadurch zu einer
Linearisierung des Konstruktes. Hierfür wurden 200 µl des aufgereinigten PMW8-
Neos (140 µg) mit 14 µl Mlu I (10 Units/ml, #R0198S, New England Laboratories,
Frankfurt a.M., Deutschland), 28 µl NEB Puffer 3 und 8 µl Aqua dest. versetzt und für
6 Stunden bei 37°C im Heizblock inkubiert. Es folgte eine Aufreinigung der DNA
mittels Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol (25:24:1) Extraktion, Ethanolfällung und
anschließender Aufnahme in 100 µl TE (10 mM Tris- Cl pH 8,0, 1mM EDTA). Die
Linearisierung der DNA wurde durch die Auftrennung eines Aliquots (5 µl) der DNA
durch die Agarose- Gelelektrophorese überprüft.
3.5.1.5. Auftrennung von DNA durch Agarose- Gelelekrophorese
Die Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten für Analyse, Quantifizierung oder
Aufreinigung wurde über die Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt.
Das Wanderungsverhalten der negativ geladenen Nukleinsäuren innerhalb eines
Spannungsfeldes ist dabei von mehreren Faktoren, wie dem Trennverhalten des
Agarosegels, der Fragmentgröße und der Konformation (geschnitten, ungeschnitten,
„supercoiled“ Plasmide) der Nukleinsäure abhängig. Die aufgetrennten Fragmente

Material und Methoden
- 71 -
können durch Versetzen des Gels mit dem nukleinsäureinterkalierenden
Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (EtBr) und Bestrahlung mit UV- Licht sichtbar
gemacht werden. Eine semiquantitive Konzentrations- und Längenbestimmung
erfolgte mit Hilfe kommerzieller Standards (MWM: Molecular Weight Marker).
Die verwendete Agarosekonzentration richtete sich dabei nach der Größe der
aufzutrennenden Nukleinsäurefragmente:
1,5 - >12 kb : 0,7 %
0,5 – 10 kb : 1,0 %
0,2 – 3 kb : 1,5 %
< 0,5 kb : 2,0 %
Üblicherweise wurde ein Gelvolumen von 100 ml zubereitet. Die entsprechende
Agarosemenge wurde in 1x TBE- Puffer (Tris- Borat- EDTA- Puffer) durch Aufkochen
in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlung auf ca. 60°C wurden 8 µl EtBr
hinzugegeben und das Gel in einen an den Seiten hermetisch abgeschlossenen,
Gelschlitten gegossen. Als Laufpuffer diente ebenfalls 1x TBE- Puffer.
Die in 10x Ladepuffer aufgenommenen Proben wurden in die Geltaschen pipettiert
und bei 100 V für 30- 60 Minuten aufgetrennt. Anschließend wurde die DNA auf
einem UV- Tisch sichtbar gemacht und das Ergebnis mit einer Digitalkamera
dokumentiert.
3.6. Transfektion porziner Fibroblasten mit Plasmid-DNA
Für die Transfektion der Zellen mit PGE150 durch Elektroporation wurde ein Aliquot
eingefrorener foetaler Fibroblasten (25 cm 2 ) aufgetaut, mit PBS gewaschen und in
D10- Medium in einer T25- Zellkulturflasche ausgesät. Am nächsten Tag wurde das
Medium gewechselt; weitere Medienwechsel folgten alle 2-3 Tage. Bei Erreichen von
70-80% Konfluenz wurden die Zellen trypsinisiert und in einer T75- Zellkulturflasche
erneut in D10- Medium ausgesät. Bei erneuter Konfluenz von 70-80% (~3x 10 6
Zellen) wurden sie mit PBS gewaschen, trypsinisiert und zentrifugiert. Der Überstand

- 72 -
Material und Methoden
wurde mit einer Pasteurglaspipette abgesaugt, das Zellpellet durch Schaben
gelockert und anschließend in 0,8 ml PBS (ohne Ca 2+ , Mg 2+ ) aufgenommen. Durch
Auf- und Abpipettieren mit einer Eppendorf Pipette wurden die Zellen vereinzelt und
homogen durchmischt. Nach Überführung in eine vorgekühlte
Elektroporationsküvette (# 71-1030, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen,
Deutschland) mit einem Elektrodenabstand von 0,4 cm, wurden 10 µg Plasmid- DNA
von PGE150 der Zellsuspension zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten
äquilibriert.
Für die Transfektion porziner foetaler Fibroblasten mit PGE150 wurde als Methode
die Elektroporation gewählt. Diese bietet die Möglichkeit, eine sehr große Anzahl
Zellen auf einmal zu transfizieren, was vor allem im Hinblick auf eine spätere
Transfektion der Zellen mit dem Knockout-Vektor bedeutsam ist. Hierzu wurde
zunächst ein Transfektionsprotokoll etabliert, das eine Transfektion porziner foetaler
Fibroblasten mit ausreichend hoher Effizienz erlaubte. Entscheidend für eine hohe
Effizienz sind die geeigneten Richtgrößen bei der Elektroporation in Bezug auf
Spannung und Kapazität. Durch das angelegte Stromfeld wird die Membran der
Zellen porös, was ein Eindringen der Fremd- DNA ermöglicht. Für jede Zellart muß
ein spezifisches Transfektionsprotokoll etabliert werden, das hohe Effizienz der
Transfektion mit guten Überlebensraten der Zellen verbindet. In diesen Versuchen
wurden drei verschiedene in der Literatur beschriebene Transfektionsprotokolle für
porzine foetale Fibroblasten auf ihre Eignung untersucht (Tabelle 6). Eines dieser
Transfektionsprotokolle stellt den Standard für die Elektroporation muriner ES-Zellen
dar. Die von LAI et al. (2002) und RAMSOONDAR et al. (2003) veröffentlichten
Transfektionsprotokolle dienten zur Transfektion porziner foetaler Fibroblasten mit
einem Knockout-Vektor für die α1,3- Galaktosyltransferase.

Material und Methoden
Tabelle 6: Verschiedene Elektroporationsparameter, die für die Transfektion eukaryontischer
Zellen eingesetzt wurden
Spannung (V) Kapazität (F) Referenz
260 V 960 µF (LAI et al. 2002)
450 V 350 µF (RAMSOONDAR et al.
2003)
240 V 500 µF Standard für ES-Zellen
- 73 -
In allen Transfektionsexperimenten wurden Aliquots einer einzigen Zelllinie
eingesetzt. Zur Elektroporation wurde ein Gene Pulser II- System (Biorad, CA, USA),
bestehend aus dem Gene Pulser II mit angeschlossener Elektroporationskammer
und einem Erweiterungsgerät, das den Einsatz höherer Kapazitäten erlaubt
(Capacitance Extender Plus), eingesetzt. Elektroporationsküvetten mit einem
Elektrodenabstand von 0,4 cm wurden verwendet.
Zellen, die nach dem oben beschriebenen Schema für die Elektroporation präpariert
waren, wurden anschließend mit der Elektroporationsküvette in die
Elektroporationskammer geschoben, bis die Elektroporationsküvette fest einhakte.
Dadurch wurde der Kontakt der Elektroden der Elektroporationseinheit mit den
Metallplatten der Elektroporationsküvette hergestellt. Spannung und Kapazität für
den jeweiligen Versuch wurden am Gerät eingestellt und der Puls ausgelöst. Die
Impulsdauer betrug in allen Experimenten 5- 7 msec. Nach erfolgter Elektroporation
wurde die Zellsuspension für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und
anschließend in 30 ml vorgewärmten D10– Medium aufgenommen, ehe sie wieder
ausgesät wurde.

- 74 -
Material und Methoden
Abbildung 18: Elektroporationseinheit Gene Pulser II ( Biorad)
Nach Elektroporation und Aufnahme in vorgewärmten D10- Medium wurden jeweils
10 ml der Zellsuspension (je~1x 10 6 Zellen) auf 3 Zellkultur-Petrischalen ausgesät.
Am darauf folgenden Tag wurde das Medium komplett abgesaugt und durch neues
Medium ersetzt.
3.6.1. Aufbau des Reportergenkonstruktes
Basierend auf dem Vektor pEGFP- N1 (# 6479-1, BD Biosciences, Clontech, CA,
USA) kodiert PGE150 für die red-shifted Variante des „grün fluoreszierenden
Proteins“(GFP) unter Kontrolle des Human Cytomegalovirus (CMV) immediate early
Promoters, der ubiquitär exprimiert. Bei der red- shifted Variante des GFP handelt es
sich um eine gezielte Mutante des Wildtyp GFP, bei der an den Positionen 64 und 65
des Proteins Phe durch Leu bzw. Ser durch Thr ausgetauscht sind. Diese Variante
wird als Enhanced GFP (EGFP) bezeichnet und zeichnet sich durch eine 35-fach
stärkere Fluoreszenz als das einfache GFP aus. Hierbei zeigt EGFP einen

Material und Methoden
- 75 -
Absorptionspeak bei 395 nm; der zweite verbleibende Peak ist bei einem
Emissionsmaximum von 509 nm zu 488 nm verschoben.
Eine Plasmidkarte von pEGFP- N1 ist der unten angegebenen Darstellung (s.
Abbildung 19) zu entnehmen.
3.6.2. Beurteilung der EGFP-Expression
Abbildung 19: Plasmidkarte von pEGFP- N1
Um die Effizienz einer transienten Transfektion der Zellen mit EGFP- kodierender
Plasmid- DNA zu ermitteln, wurde die EGFP- Expression am zweiten Tag nach der
Elektroporation ermittelt. In diesem Zeitraum war das Maximum der EGFP-
Expression zu erwarten. Die Plasmid- DNA wird anschließend wieder aus dem
Säugetiergenom ausgeschleust. Später weisen nur noch Transfektanten, bei denen
die Fremd- DNA stabil integriert ist (~0,1 % aller transfizierten Zellen) eine
Fluoreszenz auf. Zur Detektion der Fluoreszenz wurden das Medium abgesaugt, die
Zellen zweimal in PBS gewaschen und anschließend für 10 Minuten in 2 ml EDTA/

- 76 -
Material und Methoden
Trypsin- Lösung bei 37°C inkubiert. Nach Ablösen wurden die Zellen in 5 ml PBS
aufgenommen und analog der Zellzählung in eine Neubauer- Zählkammer überführt.
Unter einem Phasenkontrastmikroskop mit FITC- Filterset und angeschlossener
Quecksilberdampfkurzbogenlampe (HBO 50, Zeiss, Oberkochen, Deutschland)
konnte die Fluoreszenz der Zellen detektiert werden. Die transgene
Fibroblastenkultur wurde während der Beurteilung der EGFP- Expression mit einer
Wellenlänge von 450- 490 nm bestrahlt. EGFP hat einen Absorptionspeak bei 395
nm; der zweite verbleibende Peak ist auf 488 nm verschoben, mit einem
Emissionsmaximum von 509 nm, was durch eine leuchtend grüne Fluoreszenz mit
dem bloßen Auge gut zu erkennen ist.
3.6.3. Ermittlung der Transfektionsrate
Pro Transfektionsversuch wurden mindestens 500 Zellen unter einer Neubauer-
Zählkammer mit einem Phasenkontrastmikroskop mit FITC- Filterset und
angeschlossener Quecksilberdampfkurzbogenlampe, ausgezählt und für jede Zelle
notiert, ob sie eine Fluoreszenz aufweist oder nicht. Mit der Formel:
Transfektionsrate (%)= F* 100/ n
F= ist die Gesamtzahl fluoreszierender Zellen und n= ist die Gesamtzahl der
ausgezählten Zellen. Die prozentuale Transfektionsrate wurde für jeden einzelnen
Elektroporationsversuch ermittelt. Jeder Elektroporationsversuch wurde zweimal
wiederholt, was eine Gesamtzahl von 6 Elektroporationsversuchen mit PGE150
ergibt.

Material und Methoden
- 77 -
3.7. Transfektionsversuche mit dem Knockout-Vektor PMW8-
Neo für die α1,3- Galaktosyltransferase
Mit dem aus den Transfektionsversuchen mit PGE150 erstellten
Transfektionsprotokoll wurden Fibroblasten mit dem Knockout-Vektor für die porzine
α1,3- Galaktosyltransferase transfiziert. Eine detaillierte Darstellung der Generierung
dieses Konstrukts ist der Dissertation mit dem Titel „ Untersuchungen zur Infektiosität
von porzinen endogenen Retroviren (PERV)“ nachzulesen (WINKLER 2003) .
3.7.1. Aufbau des Konstruktes
PMW8- Neo (Abbildung 20) wurde als Knockout-Vektor für das porzine α1,3-
Galaktosyltransferase Gen konzipiert. Ziel war die Eliminierung der Exons 5-9 des
endogenen Gens und damit aller katalytischen Bereiche durch homologe
Rekombination. Hierzu wurden zwei homologe Bereiche des α1,3-
Galaktosyltransferasegens in PMW8- Neo integriert, eine 6500 bp lange homologe
Sequenz zum Intron 4 mit vorgeschaltetem 58 bp langen Rest von Exon 4 am 5´
Ende und die 3´UTR mit 1600 bp von Exon 9. Die Sequenzen hierfür wurden aus
Klonen einer porzinen genomischen „Bacterial artificial chromosome“ (BAC)-
Bibliothek gewonnen (nicht-isogene DNA). Bei einer Gesamtgröße von 13 850 bp,
kodiert PMW8- Neo für eine Antibiotikumkassette, die die Selektion der transfizierten
somatischen Zellen ermöglichen sollte. Als Antibiotikumresistenz wurde die Neo-
Phosphotransferase gewählt, die genetisch modifizierten Zellen eine Resistenz
gegen das Selektionsantibiotikum Geneticin (G418) vermittelt. PMW8- Neo besitzt
keinen Promoter für die Expression der Neomycin-Resistenzkassette, was eine
Expression und damit vermittelte Resistenz gegen G418 nur bei korrekter Integration
innerhalb eines aktiven Genlocus erlaubt. Eine Ablesung der Neo-Kassette (810bp)
erfolgt dann durch den endogenen Promoter. Durch die Verwendung promoterloser
Vektoren, sogenannter „Promoter trap-Vektoren“, wird die Rate der zufällig
integrierten und damit falsch positiven Klone, um den Faktor 500- 1000 verringert
(SEDIVY u. DUTRIAUX 1999). Hierbei sind falsch positive Klone als solche zu
bezeichnen, die eine Resistenz gegen das Selektionsantibiotikum aufweisen, aber

- 78 -
Material und Methoden
nur zufällig und nicht gezielt (mittels homologer Rekombination) im Genom der Zelle
integrierten
Eine der Neo- Kassette vorgeschaltete IRES- Sequenz erlaubt die Translation zweier
offener Leserahmen von einer mRNA aus und dient damit, aufgrund des fehlenden
eigenen Promoters der Neo- Kassette, der Translation der eingefügten
Antibiotikaresistenz. IRES- Sequenzen sind interne Ribosomenbindungsstellen
(Internal Ribosome Entry Sites) und ermöglichen eine von der 5´- Cap- Struktur und
dem Cap- Bindungskomplex unabhängige Translation eukaryotischer mRNA. Diese
Sequenzen wurden bisher im Genom von Picornaviren und des Hepatitis-C- Virus
identifiziert. .
Die Neo- Kassette mit vorgeschalteter IRES- Sequenz wird zudem noch von zwei
LoxP- Sequenzen flankiert. Das Cre-lox- Rekombinationssystem stammt
ursprünglich aus dem Bakteriophagen P1. Die Expression des Enzyms Cre-
Rekombinase in der Zelle bewirkt eine Excision von zwischen zwei LoxP- Sequenzen
befindlichen Genbereichen. Die Einführung der LoxP- Bereiche soll in PMW8- Neo
eine Option zur Eliminierung der Antibiotikumresistenz ermöglichen.
BstBI
HINDIII
EcoRV loxP Neomycin Not I
r
3xStop IRES
SV40 poly(A) loxP
Intron 4
HINDIII
EcoRV
pMW 8 Neo
BstBI
13850bp
BstBI
3´ UTR
HINDIII
MluI
XhoI
Kanamycin
Abbildung 20: Darstellung des Aufbaus von PMW8- Neo, eingefügt sind
bekannte Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen
Zeozin
XhoI

Material und Methoden
- 79 -
Vor den Transfektionsversuchen mit PMW8-Neo wurde der Vektor in Bakterien des
Stammes DH5α amplifiziert und ein Verdau mit den Restriktionsendonukleasen Mlu I
und Xho I durchgeführt, um die Richtigkeit des amplifizierten Vektors festzustellen.
Ein Aliquot des Plasmids wurde anschließend mit Mlu I linearisiert und für die
Transfektionsversuche eingesetzt. Die Transfektion wurde wie in Kapitel 3.6.
beschrieben durchgeführt. Als Transfektionsparameter wurden zwei Varianten
durchgeführt, mit 240V, 500 µF oder 450V, 350 µF. Die Zellen wurden nach der
Transfektion in 96- Well Zellkulturschalen in einer Dichte von ~8000 Zellen/
Vertiefung in je 125 µl T3- Medium ausgesät. Ein Mediumwechsel erfolgte am
drauffolgenden Tag.
3.7.2. Selektionsmedium
Für die Selektion der mit dem Knockout-Vektor transfizierten Zellen wurde T3-
Medium mit Zusatz von Geneticin (G418, # 11811-031, Gibco BRL, Auckland,
Neuseeland) verwendet. In Vorversuchen wurde die letale Dosis von G418 für
porzine foetale Fibroblasten mit 400 µg/ ml nachgewiesen. Dies war die
Konzentration, bei der nicht-transfizierte Zellen (Wildtyp) innerhalb einer
Inkubationszeit von 2 Wochen degenerierten. Um den Selektionsdruck auf die
transfizierten Zellen weiter zu erhöhen, wurde mit einer Konzentration von 800 µg/ml
G418 im Selektionsmedium gearbeitet. Ab dem dritten Tag nach Transfektion
wurden die Zellen dann für 14 Tage in geneticinhaltigem Medium kultiviert.
Mediumwechsel wurden alle 2-3 Tage durchgeführt. Dadurch konnten nur Zellen mit
einer stabilen Integration von PMW8- Neo in einen aktiven Genlocus überleben.
Resistente Zellklone wurden bei Erreichen von 70- 80 % Konfluenz abtrypsinisiert
und auf 2 Vertiefungen einer 96- Well Zellkulturschale ausgesät. Nach 14 Tagen im
Selektionsmedium wurden die Zellklone weiter in G418- freiem T3- Medium kultiviert.
3.7.3. Charakterisierung isolierter G418-resistenter Zellklone
Nur Zellen mit stabiler Integration des Knockout-Vektors überlebten die 14tägige
Inkubation in T3- Selektionsmedium mit 800 µg/ ml G418. Nach dieser Inkubation

- 80 -
Material und Methoden
wurden die erhaltenen Klone auf zwei Vertiefungen einer 96-Well Zellkulturschale
ausgesät. Bei vollständiger Konfluenz wurde eine dieser Vertiefungen mit 50 µl
Lysispuffer für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Proteinase K
hitzeinaktiviert und das Lysat für das Screening der Zellen mittels PCR verwendet.
Für die Charakterisierung der isolierten G418- resistenten Zellklone wurden
verschiedene PCR- Ansätze (Polymerase chain reaction) gewählt. Hierfür wurden
verschiede Primer generiert. Die wichtigsten sind in den Abbildung 21 und 22
dargestellt und mit ihrer Lage innerhalb des Knockout-Vektors und des α1,3- Gal-
Locus aufgeführt. Ein erstes Screening der Klone auf Abwesenheit von
persistierenden Vektorsequenzen am 5´- und 3´-Ende wurde mit den
Primerkombinationen XE83/ T7 und XE156/ 157 durchgeführt. Dies ist eine
Grundbedingung für eine erfolgreiche Integration des Knockout-Vektors in den
porzinen α1,3- Gal Locus. Wenn in der PCR keine Vektorsequenzen nachgewiesen
werden konnten, wurde eine PCR, die spezifisch für die Segmente der
Neomycinresistenzkassette war, mit der Primerkombination pMA1/pMA2
angeschlossen. Klone, bei denen keine Vektorsequenzen, aber die Neo®- Kassette
nachweisbar waren, wurden anschließend in einer Long-range PCR (LR-PCR) mit
der Primerkombination Ko1/Ko2 auf die richtige Integration des Knockout-Vektors am
5´Ende untersucht.
Wenn ein Amplifikat mit der spezifischen Größe amplifiziert werden konnte, wurde es
mit zwei Nested- PCR Ansätzen validiert. Zudem sind weite Teile des Fragments
nicht bekannt, da es das vollständige Intron 4 beinhaltet, das bis zu diesem Zeitpunkt
beim Schwein nur am Anfang und Ende in Ansätzen sequenziert und bekannt ist
(~800 bp). Weiterhin wurde die korrekte Integration des Vektors am 3´Ende mit der
Primerkombination WO21/TAR1 überprüft und eine Geschlechtsdeterminierung
mittels Y- Chromosomen- spezifischer Primer (SRY1/ SRY2) durchgeführt.

Homologe Rekombination
Material und Methoden
pMW8Neo
α-1,3 α-1,3 Gal Gen Intron 4
Neo® 3´ UTR
XE123 XE82
pMA1 pMA2
Ko1 Ko2
α-1,3 α-1,3 Gal Gen
WO21 pGalwt pGal wt TAR1
- 81 -
Abbildung 21: Darstellung der wichtigsten Primer zur Charakterisierung G418- resistenter
Klone im Falle der Integration durch homologe Rekombination in den α1,3 Gal-Locus
Zufällige Integration
pMW8Neo
Vektor Intron Intron 4 4
Neo® 3´ UTR Vektor
XE156 XE157 T7
XE83
Abbildung 22: Darstellung der Lage der Primer zur Charakterisierung G418- resistenter Klone
im Falle der zufälligen Integration bei persistierender Vektorsequenzen
3.8. Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die PCR ist ein Verfahren zur selektiven Anreicherung spezifischer Sequenzen aus
einem komplexen Gemisch von Nukleinsäuren. Mit Hilfe zweier synthetischer
Oligonukleotid- Primer, die die terminalen Bereiche der zu amplifizierenden Sequenz
komplementät flankieren und der thermostabilen Polymerase, wird in einer sich
wiederholenden dreiteiligen Reaktion aus:
1. Hitze- Denaturierung der doppelsträngigen DNA
2. Anlagerung (Annealing) der Oligonukleotid-Primer
3. Synthese der neuen Stränge mit Polymerase (Elongation)
eine exponentielle selektive Amplifikation erreicht.

- 82 -
Material und Methoden
Ein PCR- Ansatz wurde nach folgendem Schema in einem 0,2 ml PCR Softtube
(PCR Softtube 0,2 ml, Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland) angesetzt:
5 µl Zelllysat (~ 100 ng genomische DNA)
5 µl 10x PCR Puffer (200 mM Tris- HCl (pH 8,0), 500 mM KCl)
1,5 µl MgCl2 (50 mM)
0,4 µl dNTPs (10 mM)
1,25 µl je Primer (100 pmol/ µl)
0,25 µl Taq DNA Polymerase (5U/ µl)
ad 50 µl mit Aqua dest.
Alle PCR Reagenzien stammten, wenn nicht anders angegeben, von der Firma
Invitrogen (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland). Als Polymerase wurde die
Taq DNA Polymerase aus Thermus aquaticus genutzt.
Alle PCR Untersuchungen der erhaltenen G418- resistenten Zellklone wurden in
einem Thermocycler durchgeführt (PTC-200 Thermocycler, MJ Research, NV, USA).
Das Standard PCR- Programm für die Amplifikation der aufgezeigten Fragmente sah
wie folgt aus:
Vorzyklus 1 Minute 94°C
Hauptzyklus 30 sec. 94°C
45 sec. 54- 62°C ( je nach TM der Primer)
90- 120 sec. 72°C ( je nach Länge des Fragmentes)
Endzyklus 5 Minuten 72°C, dann bei 8°C halten
30-35x

3.8.1. Isolierung genomischer DNA
Material und Methoden
- 83 -
Aufgrund der geringen Zellzahl und damit verbundenen geringen DNA-
Konzentration wurde in Anlehnung an WANG et al. (2003), genomische DNA ohne
Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol Aufreinigung und Ethanolfällung gewonnen. Die
PCR- Ergebnisse mit dem Zelllysat wurden mit PCR- Ergebnissen aufgereinigter
genomischer DNA aus porzinen Biopsieproben verglichen. Hierzu wurde genomische
DNA nicht transfizierter porziner foetaler Fibroblasten mit einem Lysispuffer
extrahiert. Das Zelllysat wurde nach Hitzeinaktivierung der Proteinase K bei 95°C für
12 Minuten direkt in der PCR eingesetzt. Als Vergleich diente aufgereinigte
genomische DNA aus einer porzinen Biopsieprobe. Mit Hilfe der Primerkombination
pGalwt/ TAR1 wurde ein Teil des Exon 9 des Galaktosyltransferasegens amplifiziert.
Unterschiede in den PCR- Ergebnissen beider Verfahren zur Extraktion genomischer
DNA konnten nicht festgestellt werden.
Somit wurde das Protokoll für die weitere Isolierung genomischer DNA aus den
G418- resistenten Zellklonen übernommen.
Der Lysispuffer hatte folgende Zusammensetzung:
10%ige SDS-Lösung 20 µl
Proteinase K ( 20mg/ml) 25 µl
10x PCR Puffer 1 ml
ad 10 ml Aqua dest.
Resistente Zellklone in einer Vertiefung einer 96-Well Zellkulturschale wurden vor der
Zugabe des Lysispuffers einmal mit PBS gewaschen und anschließend in 50 µl des
Lysispuffers für 24 Stunden bei 37°C im Wärmeschrank inkubiert. Nach der
Inkubationszeit wurde Proteinase K hitzeinaktiviert und ein Zentrifugationsschritt mit
10 000 U/min. für 5 Minuten angeschlossen. 5 µl des Zelllysates wurden für die PCR
eingesetzt.

- 84 -
3.8.2. Primer
Material und Methoden
Für die Charakterisierung der G418- resistenten Zellklone und Klonferkel wurde eine
Vielzahl von Primern generiert. Die wichtigsten und ihre Verwendung sind den
Tabellen 7 und 8 zu entnehmen.
Tabelle 7: Übersicht über die verwendeten Primer
Name Sequenz (5´→3´) Anwendung (Größe des
Amplifikats)
XE157 AAC TCT CTG GAA TGC TTT
CTT ACG
XE156 GAA TAC TCA AGC TAT GCA
TCA AGC
T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GG
XE83 GTG CCA GCA GTT TTC TGA
pMA1 CAG GAT GAT CTG GAC GAA
GA
pMA2 ACT CGT CAA GAA GGC GAT
AG
XE82 GAC TGG TAT ATC CAG AAC
AAA GAAC
XE123 ACT ATG CCA CAG CAG GAA
CTC
WO21 GCT GGC ACT CTG TCG ATA
CC
TAR1 CCA CAA TCC ATG ACC AGA
CC
Ko1 AAT GTC AAA GGA AGA GTG
GT
Ko2 GGT GGG GAA AAG GAA
GAA AC
Nachweis von
Vektorsequenzen am 5´Ende
(254bp)
Nachweis von
Vektorsequenzen am 3´Ende
(2kb)
Nachweis der
Neomycinresistenz-Kassette
(325bp)
Nachweis Intron 4→Exon 5
(510bp), für Nested-PCR
gebraucht
Nachweis der korrekten
Integration von PMW8-Neo am
3´Ende. (2kb)
Nachweis der korrekten
Integration von PMW8- Neo am
5´Ende, LR-PCR (~9kb)
Tabelle 8: Primer für die Geschlechtsdeterminierung eingesetzter Spenderzellen
Name Sequenz (5´→3´) Anwendung
SRYP1 GTG GCT GGG ATG CAA GTG
GAA AATG
SRYP2 TGG CCT TGG CGA CTG TGT
ATG TGAA
Geschlechtsdeterminierung der
Spenderzellen, Nachweis des
Y- Chromosomens (230bp)

3.8.3. Long-range (LR)- PCR
Material und Methoden
- 85 -
Für die LR- PCR mit Primerpaar Ko1/ Ko2 zur Evaluierung der korrekten Integration
des Knockout-Vektors in den α1,3-Galaktosyltransferase Genlocus wurde das
„Expand long template PCR System“ der Firma Roche Diagnostics verwendet (# 1
681 834, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). Zur Amplifikation des
ca. 9kb großen Fragments wurden folgende Ansätze gewählt:
Zelllysat 5 µl
Primer (Ko1/Ko2) je 1,5 µl
10mM dNTPs 2 µl
Puffer 2 5 µl
Enzym Mix 0,75 µl
ad 50 µl Aqua dest.
Das Expand long template PCR System weist zwei Polymerasen auf. Zum einen ist
dies die Taq Polymerase, zum anderen die Tgo DNA Polymerase, eine thermostabile
Polymerase mit proofreading Funktion. Um die Spezifität der PCR innerhalb der LR-
PCR weiter zu erhöhen, wurde ein Hot start durchgeführt.
Vorzyklus 2 Minuten 94°C
Hauptzyklus 10 sec. 94°C
45 sec. 57°C
8 Minuten 68° C
2. Hauptzyklus 15 sec. 94°C
45 sec. 57°C
8 Minuten 68°C
+20sec./ Zyklus
10x
30x
Endzyklus 7 Minuten 68°C, danach halten bei 8°C

- 86 -
Material und Methoden
3.8.4. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
Für die Nested- PCR wurden 9kb aus der LR- PCR mit dem GFX PCR DNA and Gel
Band Purification Kit (# 27-9602-01, Amersham Bioscience, Freiberg, Deutschland)
aus dem Agarosegel isoliert. Die Bande wurde unter UV- Licht-Kontrolle mit einem
Skalpell aus dem Agorosegel herausgeschnitten. Dabei wurde so dicht wie möglich
an der Bande entlang geschnitten. Das herausgeschnittene Gelstück wurde in einem
1,5 ml Eppendorf Röhrchen gewogen und entsprechend des Gewichtes 10 µl/ 10 mg
Capture Puffer zugefügt und bei 60°C für 5- 15 Minuten in einem Thermoschüttler
inkubiert. Mit der gelösten Agarose wurde anschließend eine GFX- Säule beladen
und 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation in einer
Mikrozentrifuge bei voller Umdrehung für 30 Sekunden, folgte das Verwerfen des
Durchflusses und das Waschen der Säule mit 500 µl Waschpuffer. Erneut wurde
zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Die GFX- Säule wurde mit 50 µl Aqua
bidest. beladen und für 1 Minute inkubiert, anschließend für 1 Minute zentrifugiert
und 5 µl der eluierten DNA als Template für den nachfolgenden PCR- Schritt genutzt.
3.8.5. Nested-PCR
Als Nested- PCR wird eine PCR bezeichnet, in der die Primer der zweiten PCR-
Reaktion innerhalb („nested“) der Sequenz des Fragmentes liegt, das in einer ersten
PCR amplifiziert wurde.
Für die Nested- PCR wurden die 9 kb Banden aus der LR- PCR wie beschrieben aus
dem Agarosegel isoliert und als Template für eine PCR mit den Primerkombinationen
pMA1/ pMA2 und XE123/ XE82 genutzt. Die Lage der Primer für die LR- PCR, sowie
für die Nested- PCR sind Abbildung 21 zu entnehmen.

Material und Methoden
3.9. In-vivo- Experimente zum Kerntransfer
3.9.1. Induktion einer Trächtigkeit mit geklonten porzinen Embryonen
- 87 -
Bis zum eigentlichen Embryotransfer wurden die rekonstruierten Embryonen bis zu 2
Stunden in einem Brutschrank (Nuaire Nu 2700 E, Fa. Zapf Instrumente, Sarstedt),
bei 38,5°C und 5% CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft, in 500 µl NCSU23
Kulturmedium aufbewahrt.
3.9.1.1. Pubertätsinduktion der Empfängertiere
Als Empfängertiere für die chirurgische Embryonenübertragung dienten ca. 90 kg
schwere, präpuberale, mindestens fünf Monate alte, geschlechts- und
allgemeingesunde Jungsauen der deutschen Landrasse aus institutseigener Zucht.
Zur Ovulationsinduktion wurden jedem Tier 5 Tage vor dem Embryonentransfer
jeweils 1500 I.E. eCG (equine Chorionic Gonadotropin, Intergonan®, Fa. Intervet.
Tönisvorst) und 72 h später 500 I.E. hCG (human Chorionic Gonadotropin,
Ovogest®, Fa. Intervet, Tönisvorst) intramuskulär injiziert. Zu jedem
Embryonentransfertermin wurden zwei bis drei Jungsauen nach beschriebenem
Muster synchronisiert, wobei am Vorabend und am Morgen des Embryotransfertages
Rauschekontrollen durchgeführt wurden. Embryonen wurden nur auf Jungsauen
übertragen, die spätestens am Morgen des Embryotransfertages „in Rausche
standen“, und deren Ovarien mehrere Ovulationsstellen aufwiesen.
3.9.1.2. Aufrechterhaltung der Trächtigkeit
Zur Erhöhung der Progesteronspiegel an den Tagen 11-14 durch akzessorisches
Gelbkörper wurden jedem Empfängertier an Tag 9 nach Embryotransfer 1000 I.E.
eCG (equine Chorionic Gonadotropin, Intergonan®, Fa. Intervet. Tönisvorst,
Deutschland) und 72 h später 500 I.E. hCG (human Chorionic Gonadotropin,
Ovogest®, Fa. Intervet, Tönisvorst, Deutschland) intramuskulär injiziert.

- 88 -
Material und Methoden
3.9.1.3. Beurteilung der In- vivo- Entwicklungsfähigkeit
Das In-vivo-Entwicklungspotential der porzinen Kerntransferembryonen wurde durch
sonographische Untersuchung auf Trächtigkeit an den Tagen 26, 33 und 42 nach
Transfer mit Hilfe eines Real-time Ultraschallgerätes (Modell CS 9100, Fa. Picker
International GmbH, Espelkamp, Deutschland) ermittelt.
Die Geburtsgewichte der Ferkel und deren weitere Lebensfähigkeit wurden
dokumentiert. Verstorbene Ferkel wurden zur pathologischen Untersuchung dem
Pathologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover übergeben.
3.10. Charakterisierung der Klonferkel
Die Charakterisierung geborener Klonferkel beinhaltete sowohl den Nachweis der
genetischen Identität als auch den Nachweis der Transgenität bzw. des
heterozygoten Knockouts des α1,3- Galaktosaltransferase Gens (GGTA-1).
Zur Charakterisierung der geborenen Klonferkel wurden von allen Ferkeln
Biopsieproben von Ohr, Schwanz und den Plazenten gewonnen. Die Gewebe
wurden lysiert, die DNA extrahiert und anschließend mit PCR analysiert.
3.10.1. Nachweis der genetischen Identität geborener Ferkel
Der Nachweis der genetischen Identität der aus geklonten Embryonen geborenen
Ferkel und der Ausschluss des Empfängertieres als genetische Mutter, erfolgten
durch eine Abstammungskontrolle mittels DNA-Marker. Hierzu wurde eine Analyse
zwölf verschiedener hochpolymorpher Mikrosatellitenloci (s. Tabelle 9) ausgewertet.
Probenmaterial der Zellkulturen, aus denen die Spenderzellen für den Kerntransfer
stammten, des Trägertieres und der Ferkel wurden entnommen und für jeden
Mikrosatellitenlocus über PCR amplifiziert (Mastercycler, Fa. Eppendorf- Netheler-
Hinz GmbH, Hamburg, Deutschland). Auftrennung und Längenbestimmung der PCR-
Produkte erfolgten mit einem automatischem Sequenziergerät (LI-COR, DNA-
Sequenzer Modell 4000l, Fa. MWG-BIOTECH) in einem Polyacrylamidgel (6%,

Material und Methoden
- 89 -
rotiphorese® Gel 40, #3030.1, Fa. Roth+Co., Karlsruhe, Deutschland). Die
Elektrophoresegele wurden mit Hilfe des Programms „RFLPscan®, Version 3.5“
ausgewertet. Alle Arbeitsschritte für die Abstammungskontrolle wurden im Labor von
Dr. Steffen Weigend (Forschungsbereich Genetik) durchgeführt.
Tabelle 9: Überblick über die zum Abstammungsnachweis eingesetzten Mikrosatelliten
Mikrosatellit
Chromosomen
(Nr.)
Länge
(Basenpaare) Literaturreferenz
CGA 1 263-318 (MORAN 1993)
S0002 3 169-216
S0068 13 226-260
S0178 8 106-120
S0090 12 244-251
(FREDHOLM et al. 1993)
(ELLENGREN et al. 1993)
S0101 7 197-216 (ELLENGREN et al. 1994)
SW122 6 95-119
SW632 7 159-180
SW911 9 147-196
SW951 10 120-132
SW857 14 138-161
SW936 15 81-116
3.10.2. Southern Blot
(ROHRER et al. 1994)
Zwei DNA-Sonden wurden mit dem PCR-DIG-Labeling System (#1585550,
Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) Dig-markiert und in der Southern
Blot Hybridisierung eingesetzt (Die Lage der Sonden ist in Abbildung 23 dargestellt).
Genomische DNA der 5 Klonferkel und eines Kontrolltieres wurde über Nacht bei
60°C mit dem Enzym BstE II verdaut. Anschließend wurden die DNA-Fragmente in
einer Gelelektrophorese aufgetrennt. Durch Diffusionsblotting in 10x SSC für ca. 16-
24 h bei Raumtemperatur wurde die DNA über Kapillarkräfte auf eine Nylonmembran
übertragen. Nach Denaturieren, Neutralisieren und Nachpuffern wurde die Membran

- 90 -
Material und Methoden
2x mit UV-Licht von 0,06J/ cm 2 kreuzvernetzt und die DNA dadurch immobilisiert.
Nach Überführung in eine Hybridisierungsröhre und 30 minütiger Prähybridisierung
bei 68°C in 10 ml Hybridisierungslösung wurde die DIG-markierte Sonde
hinzugegeben und für 18-24 Stunden hybridisiert. Nach einer stringenten Wäsche bei
65°C und anschließender Absättigung in Maleinsäurepuffer+ Blockingreagenz, folgte
eine Inkubation für 30 min. bei Raumtemperatur mit einem anti-DIG-alkalischen
Phosphatase– Antikörper (Verdünnung 1: 10 000). Nach zweimaligem Waschen mit
Waschpuffer, fand eine Äquilibrierung der Nylonmembran in Detektionspuffer statt.
Anschließend wurde die Membran in eine Tüte gegeben und mit 5-7 ml CDP-Star
geknetet und für weitere 15 Minuten im Brutschrank inkubiert. Nach Abnahme des
CDP-Star wurde ein Röntgenfilm für 10-15 Minuten mit der Membran belichtet.
BstE II
Abbildung 23: Darstellung von homologen Sequenzen und homologer Rekombination von
PMW8-Neo in den GGTA-1 Locus. Im oberen Bereich ist die Lage der Enzymschnittstellen (Bste
II) und der gewählten Sonden für den Southern-Blot ersichtlich. Die Sonden liegen außerhalb
des homologen Bereiches und führen bei porziner Wildtyp-DNA zu einer 7kb- Bande. Bei
homologer Rekombination ist eine zweite größere Bande festzustellen. Die genaue Größe ist
nicht bekannt, da keine BstE II- Enzymschnittstelle für PMW8-Neo kartiert ist.

3.11. Statistische Auswertung
Material und Methoden
- 91 -
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms „Sigma Stat for
Windows®“ (Jandel Scientific Cooperation, Erkrath, Deutschland). Für die einzelnen
Versuche wurden zunächst der arithmetische Mittelwert ( x ) und die
Standardabweichung (± SD) berechnet. Bei gegebener Normalverteilung
(Kolmogorov-Smirnov-Test mit Lillefor-Korrektur) und gleicher Varianz (Levene-
Median-Test) wurde die Signifikanz über One way ANOVA (Tukey Test) oder t- Test
berechnet. Unterschiede zwischen den Gruppen galten ab einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant und ab einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,001 als hochsignifikant.

- 92 -
3.12. Versuchsaufbau
Präparation der Spenderzellen und
Transfektionsversuche
Gewinnung verschiedener
Spenderzellen
• Wahl eines
geeigneten
Zellkulturmediums
• Erstellung von
Wachstumskurven zur
Evaluierung der Eignung
verschiedener
Erstellung
Spenderzellarten
von
für die
Wachstumskurven
Generierung transgener
und
Evaluierung
Spenderzellen
verschiedener
Zellarten auf ihre Eignung
zur Transfektion
• Ermittlung eines
Verfahrens zur
Kontaktinhibition
• Erstellung eines
Transfektionsprotokolls
• Erstellung transgener
Transfektionsversuche Spenderzellen und
Erstellung transgener
Spenderzellen
Material und Methoden
Versuche zur
Zellzyklussynchronisation
Abbildung 24: Übersicht über die durchgeführten Versuchen.
In-vitro-Versuche zum Kerntransfer
In-vitro-Versuche mit
Spenderzellen nach
unterschiedlicher
Zellzyklussynchronisation
Auswahl einer
geeigneten
Spenderzellpräparation
Überprüfung des
Entwicklungspotentials
transgener Spenderzellen
(EGFP) in-vitro
In-vivo-Versuche zum Kerntransfer
Bestimmung der Invivo-
Entwicklung
Bestimmung der In-vivo-
Entwicklung transgener
Spenderzellen
Bestimmung der genetischen Identität und
Charakterisierung der Klonferkel

4. Ergebnisse
Ergebnisse
Der Versuchsaufbau gliederte sich in vier Phasen:
- 93 -
1) In der ersten Versuchsphase wurde das Wachstumsverhalten foetaler und adulter
primärer porziner Fibroblasten und Kumuluszellen in zwei unterschiedlichen
Zellkulturmedien untersucht. Außerdem wurde die Eignung der Zellen für die
genetische Modifikation geprüft. Zudem wurden zwei unterschiedliche Methoden der
Zellzyklussynchronisation auf ihre Effektivität untersucht.
2) In der zweiten Phase der Versuche wurden Spenderzellen nach unterschiedlichen
Verfahren bzw. Zeitdauern einer Zellzyklussynchronisation, in In-vitro-Experimenten
zum somatischen Kerntransfer eingesetzt und der Einfluß hinsichtlich Effizienz und
Entwicklungspotential in-vitro erstellter Kerntransferembryonen untersucht.
3) In der dritten Versuchsphase wurden Transfektionsexperimente zur Etablierung
eines geeigneten Transfektionsprotokolls potentieller Spenderzellen durchgeführt.
Für diese Transfektionsexperimente wurde zunächst ein Reportergenkonstrukt
(CMV-EGFP) verwendet und die Transfektionsrate durch Expression des
grünfluoreszierenden Proteins ermittelt. Die mit CMV-EGFP erarbeiteten Parameter
wurden dann für die Transfektion mit dem Targeting-Vektor für die porzine α1,3-
Galaktosyltransferase (PMW8-Neo) eingesetzt. Transfizierte Zellen wurden ebenfalls
für in-vitro-Experimente zum Kerntransfer verwendet und auf ihre
Entwicklungsfähigkeit untersucht.
4) In der vierten Versuchsphase wurden über homologe Rekombination genetisch
modifizierte Kerntransfer-Komplexe auf synchronisierte Empfängertiere übertragen
und ausgetragen.

- 94 -
Ergebnisse
4.1. Zellkulturen mit primären porzinen Zellen
4.1.1. Wachstumskurven in Abhängigkeit von Zelllinie und Kulturmedium
In dieser Versuchsphase sollten Wachstumseigenschaften und
Proliferationskapazität der etablierten primären Zelllinien untersucht werden, um
dadurch Rückschlüsse zu ziehen, ob und inwiefern sich die Zelllinien für eine weitere
Transfektion bzw. den Knockout eines Gens mittels homologer Rekombination
eignen. Für eine genetische Modifizierung endogener Gene einer
Spenderzellpopulation sind die Proliferationseigenschaften von essentieller
Bedeutung. Nur Zellen, die eine ausreichend hohe Proliferationsbereitschaft
aufweisen, werden nach Transfektion, Selektion und klonaler Expansion, in
ausreichender Menge für einen somatischen Kerntransfer zur Verfügung stehen.
Primäre porzine Fibroblasten teilen sich unter in-vitro-Bedingungen ca. 40mal, ehe
sie transformierten (Veränderung des Karyotyps) oder das Wachstum einstellten, ein
Phänomen, das als Zellalterung oder Seneszenz bezeichnet wird (DENNING et al.
2001). Die Lebenspanne der Zellen ist von mehreren Faktoren abhängig, wie den
Kulturbedingungen, dem Alter des Spendertieres, sowie der Zellart und der Spezies
(FALANGA u. KIRSNER 1993; KASINATHAN et al. 2001; RUBIN 1997). In
vorangegangenen Versuchen war ein verändertes Wachstumsverhalten primärer
Zellen in Kulturmedium mit einem hohen FCS- Gehalt beobachtet worden (KUES et
al. 2004).
Für die primären Zelllinien wurden Wachstumskurven in zwei unterschiedlichen
Medien erstellt. Die Medien differierten im FCS- Gehalt (10% FCS- 30% FCS).
4.1.1.1. Wachstumskurven foetaler Fibroblasten
Die Erstellung der Wachstumskurve für foetale porzine Fibroblasten erstreckte sich
über insgesamt 171 Tage. Die Zellen wurden bei Erreichen einer Konfluenz von 70-
80% abtrypsinisiert, gezählt und anschließend in einer Konzentration von 0,5 x 10 5

Ergebnisse
- 95 -
Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well Zellkulturschale ausgesät. Die
Populationsverdopplungen (PV) wurden errechnet (Formel s. Kapitel 3.2.3.) und pro
Zeiteinheit dargestellt (Abbildung 25).
P
V
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171
Abbildung 25: Wachstumskurve porziner foetaler Fibroblasten für zwei verschiedene
Zellkulturmedien. (ANOVA, Tukey Test, a:b < 0,05)
In den Proliferationseigenschaften foetaler Fibroblasten in T3- Medium gegenüber in
D10- Kultur bestanden signifikante Unterschiede. Foetale Fibroblasten erreichten
nach 171 Tagen Kultur in D10- Medium 54,20 PV gegenüber 83,35 PV in T3-
Medium. In D10- Medium kultivierte foetale Fibroblasten gingen zum Zeitpunkt der
Beendigung des Versuches in den Zustand der Seneszenz über, charakterisiert
durch eine deutlich reduzierte Proliferation, verbunden mit dem völligen Einstellen
des Wachstums und letztendlich der Apoptose der Zellen (ALBERTS et al. 1995).
Foetale Fibroblasten in T3- Medium zeigten bei Beendigung der Kultur immer noch
einen linearen Anstieg der PV.
Tage
a
b
T3
D10

- 96 -
Ergebnisse
4.1.1.2. Wachstumskurven adulter transgener Fibroblasten
In diesen Versuchen sollte evaluiert werden, inwiefern sich adulte, transgene
Fibroblasten für eine spätere Transfektion und anschließende Kultur eignen und ob
Unterschiede in den Proliferationseigenschaften transgener und nicht transgener
adulter Fibroblasten bestehen. Als Kontrolle dienten Fibroblasten eines nicht
transgenen Tieres des Bestandes gleichen Alters und Geschlechts.
Für die Erstellung von Wachstumskurven adulter transgener porziner Fibroblasten
wurden Zellen eines weiblichen 6 Monate alten Tieres aus dem institutseigenen
Bestand verwendet (Tiernummer 179). Das Tier zeigt transgene Expression für den
humanen komplementregulierenden Faktor CD59 (hCD59) und gehört zur F1-
Generation eines Foundertieres der transgenen Linie 5 (NIEMANN et al. 2001).
Die Erstellung der Wachstumskurven erstreckte sich über einen Zeitraum von 131
Tagen für transgene Fibroblasten und über 171 Tage für nicht transgene
Fibroblasten. Ein statistisch signikanter Unterschied in den
Proliferationseigenschaften adulter transgener und nicht transgener Fibroblasten
konnte in keinem der beiden Medien ermittelt werden. Jedoch zeigten transgene
Zellen in T3- Medium signifikant bessere Proliferationseigenschaften als die Kultur in
D10- Medium. Transgene Fibroblasten in T3- Medium erreichten 70,08
Populationsverdopplungen, während transgene Zellen in D10- Medium nur 33,43 PV
erreichten. Kontrollzellen in T3- Medium wiesen nach Beendigung des Versuches am
171. Tag 67,5 Populationsverdopplungen auf. Zellen, die in D10- Medium kultiviert
wurden, erreichten 26,87 PV und zeigten beginnende Seneszenz. Eine grafische
Darstellung der Wachstumskurven ist den Abbildungen 26 und 27 zu entnehmen.

PV
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ergebnisse
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131
paF= porzine adulte Fibroblasten
Tage
a
- 97 -
paF T3 (179)
b paF D10 (179)
Abbildung 26: Wachstumskurve adulter hCD59- transgener porziner Fibroblasten (Tier 179) in
Abhängigkeit vom Kulturmedium (ANOVA, Tukey Test a:b < 0,05)
PV
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101111121131141151161
171
paF= porzine adulte Fibroblasten
Tage
Abbildung 27: Wachstumskurven porziner adulter Fibroblasten (Kontrolle nicht transgen) in
Abhängigkeit vom Kulturmedium (ANOVA, Tukey Test, a:b< 0,001)
a
b
paF T3
paF D10

- 98 -
Ergebnisse
4.1.1.3. Wachstumskurven porziner Kumuluszellen
Kumuluszellen zeigten in D10- Medium ein stark eingeschränktes Wachstum und
gingen sehr schnell in Seneszenz über. Lediglich 0,94 PV wurden nach 22 Tagen
Kultur in D10- Medium erreicht. Demgegenüber zeigten Kumuluszellen in T3-
Medium ein uneingeschränktes Wachstum und waren auch nach 131 Tagen Kultur
noch in einem linearen Anstieg der Wachstumskurve. 52,63 PV sind hochsignifikant
unterschiedlich gegenüber der Kultur von Kumuluszellen in D10- Medium
(s.Abbildung 28). Die Ergebnisse waren in drei Wiederholungen konstant.
PV
60
50
40
30
20
10
0
a
b
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131
Kum= Kumuluszellen
Tage
Abbildung 28: Populationsverdopplungen porziner Kumuluszellen in Abhängigkeit zum
Zellkulturmedium (ANOVA, Tukey-Test a

Ergebnisse
- 99 -
transgene Fibroblasten. Lediglich gegenüber Kumuluszellen ließ sich eine
signifikante bzw. hochsignifikant höhere Proliferationsrate feststellen. Adulte porzine
Fibroblasten hatten eine ähnliche Wachstumskurve in T3- Medium wie
Kumuluszellen. Eine Kultivierung von Kumuluszellen über einen längeren Zeitraum
ist nur in T3- Medium möglich. Wahrscheinlich kann das D10- Kulturmedium die
Anforderungen von Kumuluszellen an eine in-vitro-Kultur nicht erfüllen. Aufgrund
dieser Ergebnisse wurden für die Transfektionsexperimente foetale und adulte
transgene Fibroblasten in T3-Medium kultiviert. Eine Kultur der Zellen in T3-Medium
bietet ausreichende Proliferationskapazität, um den Knockout eines Gens zu
erreichen und die Zellen anschließend im somatischen Kerntransfer einzusetzen. Zur
Übersicht s. Abbildungen 29 und 31.
90
80
a
70
ab
ab
60
50
PV
40
b
pfF T3.0
paF T3.0
paF T3.0(179)
30
20
10
0
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101111121131141151161 171
pfF= porzine foetale Fibroblasten; paF= porzine adulte Fibroblasten; Kum= Kumuluszellen
Kum T3.0
Abbildung 29: Wachstumskurve aller eingesetzter Zelllinien in T3-Medium (ANOVA, Tukey-
Test, a:b

- 100 -
Ergebnisse
Transformation von Zellen kommt es, ähnlich wie bei Tumorzellen, zur Bildung
mehrkerniger Riesenzellen, was mit einer Erhöhung des Chromosomengehalts
einhergeht. Zugleich wird die G0/ G1 Phase deutlich verkürzt, was sich in der FACS-
Analyse in einer Verschiebung zur G2/M Phase der Zellen darstellt. Von einer
Transformation porziner Fibroblasten nach in-vitro-Kultur wurde berichtet. Diese
zeigten nach mehreren Passagen eine gesteigerte Proliferation verbunden mit
Aneuploidie (DENNING et al. 2001). Bei der Analyse der T3-kultivierten Fibroblasten
waren jedoch keine Anzeichen für Änderungen im DNA-Gehalt festzustellen, was
eine Transformation ausschließen läßt (s.Abbildung 30).
Abbildung
30: FACS- Analyse foetaler Fibroblasten kultiviert für 20 Passagen in T3- Medium,
verglichen mit Zellen aus D10-Medium (Passage 2). Beide Zellkulturen weisen die gleiche
Verteilung an Zellen in G0/G1 und G2/M-Phase auf.

PV
60
50
Ergebnisse
Wachstumskurve für die Kultur primärer Zelllinien in D10- Medium
a
- 101 -
40
30
b
pfF D10
paF D10
paF D10(179)
20
bc Kum D10
10
0
d
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101111121131141151161171
Tage
pfF: porzine foetale Fibroblasten; paF: porzine adulte Fibroblasten; Kum: Kumuluszellen
Abbildung 31: Wachstumskurven in D10- Medium für alle eingesetzten Zelllinien im Vergleich
(ANOVA, Tukey- Test a:b < 0,05; a:bc < 0,001, a:d < 0,001; b:d < 0,001)
4.2. Zellzyklussynchronisation durch Kontaktinhibition oder
Serumreduktion
Diese Versuche dienten zur Erstellung eines Protokolls für die
Zellzyklussynchronisation vor dem somatischen Kerntransfer. Dabei sollte untersucht
werden, welche Einflüsse Methoden der Zyklussynchronisation auf die Effizienz des
Kerntransfers, definiert durch Blastozystenrate und Qualität der geklonten
Embryonen (Kernzahl), ausüben. Als Spenderzelllinie dienten foetale Fibroblasten,
die 2 unterschiedlichen Methoden zur Zellzyklussynchronisation zur Arretierung in
der G0/G1-Phase ausgesetzt wurden. Die erste Gruppe bestand aus Zellen, die
unterschiedlich lange kontaktinhibiert wurden. Die zweite Gruppe wurde für 48
Stunden in serumreduziertem Medium kultiviert. Proben zur Feststellung des

- 102 -
Ergebnisse
jeweiligen Zellzyklus wurden entnommen und mit FACS analysiert. Zum Vergleich
wurden zyklische Fibroblasten, sowie Proben, die 24 Stunden nach Beginn oder am
Ende der Kontaktinhibition entnommen wurden, analysiert. Um die Reversibilität der
Zyklussynchronisation zu prüfen, wurden die Zellen am Ende der Kontaktinhibition im
Verhältnis ¼ gesplittet und ausgesät bzw. Zellen nach Serumentzug wieder in D10-
Medium überführt, 24 Stunden später wurde dann der Anteil der einzelnen Phasen in
den Zellen untersucht. Insgesamt wurden 14 Proben genommen, die aus drei
verschiedenen Kulturen stammten, was ein gesamtes Probenvolumen von 42
untersuchten Proben ergibt. 24 Stunden nach Beginn der Kontaktinhibition war kein
Unterschied im Anteil von Zellen in der G0/ G1 Phase des Zellzyklus bei Zellen, die
für 48, 72 oder 96 Stunden kontaktinhibiert wurden, festzustellen. Dieses Ergebnis
bestätigte die subjektiven Befunde der morphologischen Beurteilung der
Kontaktinhibition. Nach Beendigung der Kontaktinhibition bzw. nach 48- stündigem
Serumentzug waren keine Unterschiede zwischen den verschiedenen
Zellzyklussynchronisationsprotokollen festzustellen. Nach beiden
Synchronisationsprotokollen zeigte sich jedoch eine signifikante Anreicherung von
Zellen in G0/ G1 gegenüber zyklischen Fibroblasten. Zyklische Fibroblasten
befanden sich zu 76% ± 1,7 in der G0/ G1 Phase, während nach
Zellzyklussynchronisation 85% ± 2,4 (24h Ki) bis 87,3% ± 0,6 (72h Ki) der Zellen in
der G0/ G1 Phase waren (p< 0,001). Somit zeigte sich, dass beide Methoden
(Kontaktinhibition und Serumreduktion) geeignet waren, Zellen in der G0/ G1 Phase
des Zellzyklus anzureichern. Die Reversibilität der Zellzyklussynchronisation war
jedoch signifikant unterschiedlich zwischen den einzelnen Protokollen. 24 Stunden
nach dem Splitten bzw. der Überführung in D10- Medium waren Zellen nach 24- und
48 stündiger Kontaktinhibition noch zu 86% ± 2,0 (48h Ki) bzw. 86,7% ± 1,5 Zellen in
der G0/ G1 Phase. Dagegen zeigten Zellen nach 72h Ki, 96h Ki und nach 48stündigem
Serumentzug einen deutlich verringerten Anteil von Zellen in der G0/ G1
Phase. Damit war eine Verschiebung des Zellzyklus zur S und G2/ M Phase
verbunden.Die Zahlen und Signifikanzen sind Abbildung 32 und den Tabellen 10 und
11 zu entnehmen.

Prozent
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
cycl. Fibros
a
24h Ki
48h Ki
72h Ki
Ergebnisse
Cycl.= zyklische Fibroblasten; Ki= Kontaktinhibition;
48h 0,5%FCS= serumreduzierte Zellen
Zellzyklussynchronisation und ihre Reversibilität
A b b b
b
b B
a a C
b
G0/G1
b b b
96h Ki
48h 0,5% FCS
b
48h Ki after 24h
S
72h Ki after 24h
96h Ki after 24h
24h Ki split 24h
a
G2/M
a
48h Ki split 24h
a
ab
b
72h Ki split 24
b
bc
96h Ki split 24h
- 103 -
c
G0/G1
S
G2/M
bc
c
d
48h 0,5%FCS 24h Sadd
Abbildung 32 Verteilung der Zellen auf die Phasen des Zellzyklus nach unterschiedlichen
Protokollen zur Zellzyklussynchronisation (ANOVA, Tukey- Test, a:b < 0,001, b:c < 0,05, c:d <
0,001, x ± SD).
A zeigt die Verteilung nach Beendigung der Synchronisation. Keine Unterschiede sind
zwischen den unterschiedlichen Methoden festzustellen. Verglichen mit zyklischen
Fibroblasten konnte eine signifikante Anreicherung in der G0/G1 Phase mit allen untersuchten
Methoden erzielt werden.
B zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse 24 Stunden nach Beginn der Kontaktinhibition für
48h, 72h und 96h Kontaktinhibition.
C zeigt die Reversibilität der Zellzyklussynchronisation 24 Stunden nach Splitten der Zellen
(kontaktinhibierte Zellen) bzw. Überführung in D10-Medium (serumreduzierte Zellen). Für 72 h
und 96 h kontaktinhibierte sowie serumreduzierte Zellen zeigen mitotische Aktivität, erkennbar
am verringerten Anteil von Zellen in der G0/G1 Phase und ansteigendem Anteil von Zellen in
der Synthesephase (S-Phase) des Zellzyklus. Zellen nach 24- und 48 stündiger
Kontaktinhibition sind dagegen mitotisch inaktiv.
c
d

- 104 -
Ergebnisse
Tabelle 10: Verteilung der Zellen auf die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus nach
verschiedenen Kontaktinhibitionszeiten und nach Serumreduktion (grafische Darstellung in
Abbildung 32A)
G0/G1 Phase
Zellen (%)
Zyklische Fibroblasten 76,0 ± 1,7
(ANOVA, Tukey-Test, a:b < 0,001, x ± SD )
a
24h Kontaktinhibition 85,0 ± 2,4 b
48h Kontaktinhibition 85,8 ± 0,4 b
72h Kontaktinhibition 87,3 ± 0,6 b
96h Kontaktinhibition 85,5 ± 0,6 b
0,5% FCS für 48h 86,3 ± 2,5 b
S Phase Zellen
(%)
12,7 ± 0,6 a
2,3 ± 0,8 b
2,0 ± 0,0 b
1,0 ± 0,0 b
1,2 ± 0,4 b
4,3 ± 0,6 b
G2/M
(%)
11,3 ± 1,5
12,7 ± 1,8
12,2 ± 0,4
11,7 ± 0,6
13,3 ± 0,8
9,3 ± 2,5
Tabelle 11: Darstellung der Reversibilität der Zellzyklussynchronisation nach Splitten der
Zellen, bzw. nach Überführung in Medium mit 10%FCS (grafische Darstellung in Abbildung
32C)
24h nach Splitting bzw. Zugabe von FCS ins Kulturmedium (%)
24h Kontaktinhibition 86,7 ± 1,5 a
4,7 ± 3,8 a
8,7 ± 5,1 a
48h Kontaktinhibition 86,0 ± 2,0 a
2,3 ± 0,6 a
11,7 ± 1,5 ab
72h Kontaktinhibition 50,7 ± 3,1 b
29,3 ± 1,2 b
20,0 ± 4,0 bc
96h Kontaktinhibition 40,3 ± 5,1 c
36,3 ± 1,5 bc
23,3 ± 4,5 c
0,5% FCS für 48h 22,3 ± 3,1 d
40,7 ± 5,1 c
37,0 ± 4,4 d
(ANOVA, Tukey-Test, a:b < 0,001, a:c < 0,001, b:c < 0,05, b:d < 0,001, c:d < 0,001, x ± SD)

4.3. Somatischer Kerntransfer
Ergebnisse
4.3.1. In-vitro-Entwicklung geklonter Embryonen
- 105 -
Zur Evaluierung des Entwicklungspotentials wurden unterschiedlich synchronisierte
Spenderzellen im Kerntransfer eingesetzt und die rekonstruierten Embryonen in-vitro
kultiviert. In einem 3x3x2 Versuchsmodell wurde der Einfluss der Oozyten-
Reifungsdauer (38h, 40h, 42h) und der Dauer der Kontaktinhibition (24h, 48h, 72h)
untersucht. Bei zwei Wiederholungen je Kombinationsmöglichkeit, wurden an 18
Versuchstagen 1113 Fibroblasten- Oozytenkomplexe hergestellt, die mit einer
durchschnittlichen Effizienz von 78,9% fusioniert werden konnten. Die
durchschnittliche Blastozystenrate von insgesamt 878 fusionierten und aktivierten
Kerntransferkomplexen lag bei 9,6%. Während die Kontaktinhibitionsdauer foetaler
Fibroblasten (Passage 2-3) keinen signifikanten Einfluss auf die Blastozystenrate
aufwies (8,8%± 4,2 vs. 9,2%± 5,0 vs. 10,9%± 5,1), wurde für die Reifungsdauer der
Oozyten ein hochsignifikanter (p< 0,001) Einfluss festgestellt. Für Einzelheiten s.
Dissertation HOELKER (2003).
Tabelle 12 stellt die in-vitro-Entwicklung rekonstruierter Kerntransferembryonen in
Abhängigkeit zur Reifungsdauer der Oozyten und der Kontaktinhibitionszeit foetaler
Fibroblasten dar.
Da Kerntransfer-Embryonen, rekonstruiert aus 40h maturierten Oozyten, das größte
Entwicklungspotential aufwiesen, wurden weitere Versuche mit 48h
serumreduzierten foetalen Fibroblasten nur mit 40h gereiften Oozyten durchgeführt.
An 4 Versuchstagen wurden mit 48h serumreduzierten Spenderzellen insgesamt 215
Fibroblasten- Oozytenkomplexe erstellt, von denen 188 fusionierten. Die Ergebnisse
wurden mit denen kontaktinhibierter Spenderzellen (bei 40h maturierten Oozyten als
Empfängerzellen, n= 118-128) verglichen. Hierbei konnten keine Unterschiede
zwischen den unterschiedlichen Methoden der Zellzyklussynchronisation festgestellt
werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestelt.

-106-
Ergebnisse
- 106 -
Kontaktinhibitionsdauer der foetalen
Fibroblasten
24h
48h
72h
Ergebnisse
In-vitro-Reifungsdauer
38h 40h 42h Gesamt
FR 99 (73.3% ± 9,8) 100 (84.7% ± 1,9) 118 (90.1% ± 2,9) 317 (82.6% ± 9,1)
TR 85 (85.9% ± 5,6) 81 (81.0% ± 1,0) 104 (88.1% ± 7,1) 270 (85.2% ± 5,2)
BR 8 (8.1% ± 1,6) 14 (14.0% ± 0,5) 6 (5.1% ± 2,4) 28 (8.8% ± 4,2)
n 135 118 131 384
FR 99 (77.3% ± 2,8) 84 (65.6% ± 3,1) 112 (81.8% ± 7,3) 295 (75.1% ± 8,4)
TR 87 (87.9% ± 2,3) 65 (77.4% ± 7,4) 98 (87.5% ± 2,6) 250 (84.7% ± 6,1)
BR 10 (10.1% ± 1,0) 12 (14.3% ± 3,0) 5 (4.5% ± 3,0 ) 27 (9.2% ± 5,0)
n 128 128 137 393
FR 87 (82.9% ± 2,4) 95 (74.8% ± 11,4) 84 (80.8% ± 6,2) 266 (79.2% ± 7,0)
TR 65 (74.7% ± 6,2) 80 (84.2% ± 1,1) 70 (83.3% ± 5,8) 215 (80.8% ± 6,1)
BR 9 (10.3% ± 3,2) 15 (15.8% ± 1,1) 5 (6.0% ± 2,3) 29 (10.9% ± 5,1)
n 105 127 104 336
FR 285 (77.4% ± 6,5) 279 (74.8% ± 10,2) 314 (84.4% ± 6,7) 878 (78,89%)
gesamt TR 237 (83.2% ± 7,1) 226 (81.0% ± 4,3) 272 (86.6% ± 4,5) 735 (83,71%)
BR 27 (9.5% ± 2,1) a
41 (14.7% ± 1,7) b
16 (5.1% ± 2,1) c
84 (9,56%)
n 368 373 372 1113
Tabelle 12: In-vitro-Entwicklung rekonstruierter porziner Kerntransfer-Embryonen in Relation zur Reifungsdauer der Oozyten und
der Kontaktinhibitionsdauer foetaler Fibroblasten (ANOVA, Tukey Test a:b< 0,001 b:c < 0,05 x ±SD)
FR: Fusionsrate
TR: Teilungsrate
BR: Blastozystenrate

Ergebnisse
- 107 -
Tabelle 13: Ergebnisse der in-vitro-Entwicklung rekonstruierter Embryonen in Relation zur
Spenderzellpräparation bei gleicher Oozytenmaturation (x ±SD)
Dauer der
Kontakt-
Ergebnisse der in-vitro-Versuche zum Kerntransfer in Abhängigkeit zur
Spenderzellpräparation
(40 h maturierte Eizellen als Empfängerzellen)
inhibition n FR TR BR BR/ geteilte
24h Ki 118 100 (84.7% ± 1,9)
48h Ki 128 84 (65.6% ± 3,1)
81 (81.0% ± 1,0) 14 (14.0% ± 0,5) 17,3% ± 0,6
65 (77.4% ± 7,4) 12 (14.3% ± 3,0) 18,5% ± 1,4
72h Ki 127 95 (74.8% ± 11,4) 80 (84.2% ± 1,1) 15 (15.8% ± 1,1) 18,8% ± 1,1
48h SR 215 188 (87,4% ± 5,9)
163 (86,4% ± 7,5) 33 (17,6% ± 5,2) 20,3% ± 2,3
Gesamt 588 466 (79,3% ± 10,5) 389 (83,5% ± 6,0) 74 (15,9% ± 3,5) 19,0% ± 3,0
BR: Blastozystenrate
FR: Fusionsrate
TR: Teilungsrate
4.3.2. Qualität geklonter Embryonen
Als Kriterium für die Qualität der geklonten Embryonen wurde die Kernzahl der
Blastozysten nach Färbung mit Hoechst 33342 herangezogen. Blastozysten aus
kontaktinhibierten Spenderzellen wurden miteinander verglichen. Blastozysten aus
48h kontaktinhibierten Spenderzellen hatten signifikant höhere Kernzahlen als
Blastozysten aus 72h kontaktinhibierten Spenderzellen (p< 0,05). Zwischen 24h und
72h kontaktinhibierten Spenderzellen wurde kein statistisch signifikanter Unterschied
in den Kernzahlen gefunden (Abbildung 33).

- 108 -
Ergebnisse
Abbildung 33: Kernzahlen in Blastozysten nach somatischem Kerntransfer in Relation zur
Spenderzellpräparation (ANOVA, Tukey-test, b:c< 0,05, x ± SEM)
Kernzahlen geklonter Blastozysten aus serumreduzierten Spenderzellen wurden mit
Blastozysten, die aus kontaktinhibierten Spenderzellen und einer 40h maturierten
Oozyten erstellt worden waren, verglichen. Serumreduzierte Spenderzellen führten
zu signifikant höheren Kernzahlen im Vergleich zu Blastozysten aus 72h
kontaktinhibierten Spenderzellen (p< 0,05). Innerhalb der Gruppe geklonter
Embryonen aus 40h maturierten Oozyten als Empfängerzellen wiesen Blastozysten
aus 48h kontaktinhibierten Spenderzellen signifikant mehr Kerne als Blastozysten,
die aus 24h und 72h kontaktinhibierten Spenderzellen erstellt wurden, auf (p< 0,05).
Eine grafische Darstellung der Ergebnisse ist Abbildung 34 zu entnehmen.

Ergebnisse
- 109 -
Abbildung 34: Kernzahlen von Blastozysten nach somatischem Kerntransfer in Abhängigkeit
zur Spenderzellpräparation bei 40h maturierten Oozyten als Empfängerzellen (ANOVA, Tukey-
test, a:b< 0,05, b:ac< 0,05, ab:ac< 0,05, x ± SEM)
4.4. Erstellung transgener Spenderzellen unter Verwendung
eines EGFP- Reportergenkonstruktes (PGE 150)
Zur Etablierung eines effizienten Transfektionsprotokolls wurden Versuche mit einem
EGFP- Reportergenkonstrukt durchgeführt.
Hierzu wurden 3 verschiedene Elektroporationsstärken (240V/ 500µF, 260V/ 960µF,
450V/ 350µF) verwendet und auf ihre Effektivität in Bezug auf eine Transfektion
foetaler und adulter porziner Fibroblasten untersucht. Pro Transfektionsversuch
wurden 2 Wiederholungen durchgeführt. Je Transfektion wurden 3x 10 6 Zellen
eingesetzt. Am zweiten Tag nach der Transfektion wurden jeweils 500 Zellen mit
einem Phasenkontrastmikroskop mit angeschlossener UV- Lampe und einem FITC-

- 110 -
Ergebnisse
Filterset, auf Fluoreszenz kontrolliert und das Verhältnis von fluoreszierenden zu
nicht fluoreszierenden Zellen dokumentiert.
4.4.1. Transfektionsraten nach Elektroporation
Zwischen den drei getesteten Transfektionsprotokollen war kein signifikanter
Unterschied festzustellen. Die Transfektionsparameter 450V/ 350µF (39,3% ± 2,1)
und 240V/ 500µF (37,1% ± 6,6) wiesen jedoch die höchste Transfektionsrate auf,
während bei 260V/ 960µF nur 34,7% ± 4,1 der Zellen eine grüne Fluoreszenz
zeigten. Somit wurden die Zellen mit einem α1,3-Galaktosyltransferase-Knockout-
Vektor mit einer Stärke von 450V/ 350µF und 240V/ 500µF transfiziert. Die
Ergebnisse der Transfektionsversuche mit dem EGFP- Reportergenkonstrukt sind
Tabelle 14 zu entnehmen.
Tabelle 14: Ergebnisse der Transfektionsexperimente mit einem Reportergenkonstrukt.
Insgesamt konnte eine Transfektionsrate von 37,3 % ± 2,3 erreicht werden. Grün-leuchtende
Zellen wurden als erfolgreich transfiziert angesehen.
Transfektionsexperimente mit einem EGFP-Reportergenkonstrukt
EGFP- Expression
Stärke der n gezählte Zellen
n %
Elektroporation
(gesamt)
189 37,80%
450V/ 350µF 2 1000 204 40,80%
Gesamt 393 39,3% ± 2,1
159 31,80%
260V/ 960µF 2 1000 188 37,60%
Gesamt 347 34,7% ± 4,1
162 32,40%
240V/ 500µF 2 1000 209 41,80%
Gesamt 371 37,1% ± 6,6
Insgesamt 6 3000 1111 37,3% ± 2,3

4.4.2. EGFP-Expression
Ergebnisse
- 111 -
Anhand der Fluoreszenz wurde der Anteil EGFP-positiver Zellen, bezogen auf die
Gesamtzahl gezählter Zellen bestimmt (Transfektionsrate). Die
Fluoreszenzintensität, die unter dem Mikroskop beobachtet werden konnte, variierte
teilweise erheblich. Zum Teil war die Fluoreszenz sehr stark und auch mit Hellfeld-
Durchlicht erkennbar. Teilweise war die grüne Fluoreszenz nur nach längerer
Adaptation des Auges an das Dunkelfeld erkennbar und konnte auf einem Fotofilm
nicht dokumentiert werden (s. Abbildung 35). Die Fluoreszenz war stabil, auch bei
länger andauernder Bestrahlung von bis zu ca. drei Minuten nahm die Leuchtkraft
nicht ab.
Abbildung 35 Links: Abtrypsinisierte EGFP-transgene foetale Fibroblasten. unter Hellfeld,
rechts unter UV- Licht mit FITC- Filterset. Schwach grün fluoreszierende Zellen sind aufgrund
der Belichtungszeit nicht darstellbar, mit dem bloßen Auge aber detektierbar. Die
Transfektionsrate betrug ca. 40%. (Vergrößerung 100x)
4.4.3. Erstellung EGFP- transgener Embryonen
Insgesamt wurden 94 rekonstruierte Fibroblasten-Oozytenkomplexe erstellt, von
denen 81 (86,2%) fusioniert werden konnten. 14 Blastozysten wurden aus beiden
Versuchen erhalten, von denen 11 (78,6%) eine grüne Fluoreszenz aufwiesen.
Ein Einbringen von ausschließlich grün fluoreszierenden Spenderzellen im
somatischen Kerntransfer, war aufgrund des Fehlens eines geeigneten Filtersets am

- 112 -
Ergebnisse
Manipulationsmikroskop, nicht möglich. Die Spenderzellpopulation wies einen Anteil
von ca. 40% EGFP-positiven Zellen auf. Deshalb war nicht zu erwarten, dass alle
Blastozysten grün leuchten würden. Die EGFP- Expression fiel nach Einbringen der
Spenderzelle in die entkernte Oozyte bis zum Erreichen des 4-Zellstadiums ab und
nahm vom 8-Zellstadium an wieder an Intensität zu, was mit dem Übergang von der
maternalen zur embryonalen Kontrolle der Genexpression, zu erklären ist. Die
EGFP-positiven Blastozysten zeigten eine generalisierte Expression des Transgens
sowohl im Trophektoderm als auch in der inneren Zellmasse (s. Abbildung 36). Eine
Mosaikexpression konnte nur in 2 Blastozysten beobachtet werden, in denen wenige
Blastomeren keine bzw. eine abgeschwächte EGFP- Expression zeigten, ein
Phänomen, das schon früher bei geklonten EGFP-transgenen Embryonen
beschrieben wurde (PARK et al. 2002). Eine Übersicht der Ergebnisse zur Erstellung
EGFP-transgener Embryonen ist Tabelle 15 zu entnehmen.
Tabelle 15: Übersicht zu Ergebnissen zum somatischen Kerntransfer mit EGFP-transgenen
Spenderzellen
Versuche mit Reportergen-transfizierten Spenderzellen
n FR TR BR
EGFP-pos.
Blastozysten
Foetale Fibroblasten 43 38 (88,4%) 35 (92,1%) 9 (23,7%) 6 (66,7%)
Adulte Fibroblasten 51 43 (84,3%) 35 (81,4%) 5 (11,6%) 5 (100%)
Gesamt 94 81 (86,2%) 70 (86,4%) 14 (17,3%) 11 (78,6%)
FR: Fusionsrate; TR: Teilungsrate; BR: Blastozystenrate

Ergebnisse
- 113 -
Abbildung 36: EGFP-positive Blastozyste nach somatischen Kerntransfer mit transgenen
Spenderzellen (links: im Hellfeld, rechts: im Fluoreszenzmikroskop, Vergrößerung 100x)
4.5. Erstellung heterozygoter α1,3 Gal- Knockout
Spenderzellen durch PMW8-Neo
Mit Hilfe des Knockout-Vektors PMW8- Neo wurde der Knockout eines Allels des
porzinen Gens für die α1,3-Galaktosyltransferase über homologe Rekombination
angestrebt. Es wurden insgesamt 6 Transfektionen foetaler Fibroblasten durch
Elektroporation durchgeführt. Je Transfektion wurden 3x 10 6 Zellen eingesetzt, was
einer Gesamtzahl von 1,8x 10 7 Zellen entspricht. Als Elektroporationsparameter
dienten die durch die Transfektionsversuche mit einem EGFP- Reportergenkonstrukt
ermittelten Werte von 450V/ 350µF und 240V/ 500µF. Zwei der 6 Versuche wurden
mit 450V/ 350µF durchgeführt, vier Versuche mit 240V/ 500µF. Nach der
Elektroporation wurden die Zellen in T3- Medium aufgenommen und in einer
Konzentration von ~ 8000 Zellen pro Vertiefung auf vier 96- Well Zellkulturschalen
ausgesät. Am darauffolgenden Tag wurde das Medium gewechselt. Drei Tage nach
erfolgreicher Transfektion wurden die Zellen in Selektionsmedium überführt.
Um den Knockout-Vektor stabil in das porzine Genom zu integrieren, musste
zunächst das Plasmid mittels einer Restriktionsendonuklease linearisiert werden.

- 114 -
Ergebnisse
Dies wurde mit Mlu I erreicht. Um die Authenzität des amplifizierten Plasmids zu
überprüfen, wurde zugleich mit XhoI/ Mlu I analytisch verdaut. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 37 dargestellt.
Plasmid
zirkulär
Linearisierung mit Mlu I
Analytischer Verdau mit
XhoI/ Mlu I
2-log
Ladder
Abbildung 37: Restriktionsverdau von PMW8- Neo. Hierbei zeigt das Plasmid nach Verdau mit
XhoI/ Mlu I drei Banden mit der erwarteten Größe (1900, 3500, 8400bp).
4.5.1. Isolierte G418-resistente Zellklone
Insgesamt wurden aus den Transfektionsexperimenten 428 G418- resistente Klone
gewonnen (s.Tabelle 16). 165 Klone (38,6%), die die Selektion überlebt hatten,
jedoch keine ausreichende Teilungsfähigkeit besaßen, um gesplittet und neu
ausgesät zu werden, wurden als seneszent eingestuft und nicht weiter
charakterisiert. Die verbleibenden 263 proliferierenden Klone wurden für die weitere
Charakterisierung mittels PCR verwendet.
4 kb
3 kb
2 kb
1,5 kb

Ergebnisse
4.5.2. Charakterisierung G418-resistenter Zellklone
- 115 -
263 klonal expandierte, G418- resistente Kolonien wurde mittels PCR mit den
Primerkombinationen T7/ XE83 (3´Ende) und XE156/ XE157 (5´Ende) auf die
Anwesenheit von Vektorsequenzen am 5´ und 3´Ende untersucht. Klone, die keine
Vektorsequenzen aufwiesen, wurden mit den Primern pMA1/ pMA2 anschließend auf
Integration der Neomycinresistenz- Kassette untersucht. Klone mit Integration
wurden mit einer LR-PCR (Primer Ko1/ Ko2) auf korrekte Integration am 5´Ende
innerhalb des Gal-Locus analysiert. Eine Amplifikation über den gesamten GGTA1-
Locus von Exon 4 bis Exon 9, mit außerhalb der homologen Bereiche gelegenen
Primern, um eine korrekte Integration am 5´- und 3´-Ende zu zeigen, wurde
angestrebt. Die Amplifikation eines Fragments am 3´-Ende, mit einem in PMW8-Neo
und einem außerhalb der Targeting Region gelegenen Primer, gelang aber trotz
mehrerer Optimierungsschritte und unterschiedlicher Primerkombinationen, nicht.
Viel mehr zeigten sich viele unspezifische Banden, die aber keinen sicheren Hinweis
auf die korrekte Integration von PMW8-Neo in den GGTA-1 Locus erbrachten. Als
Kontrolle für Intaktheit und Konzentration der eingesetzten DNA wurde in jeder
Reaktion eine PCR mit den Primern pGalwt/ TAR 1, zur Amplifikation des Wildtyp-
Exon 9 durchgeführt. Wenn möglich wurde außerdem eine Positiv-Kontrolle (Plasmid
PMW8-Neo, LR-PCR positive Klone) mitgeführt. Als Negativ-Kontrolle diente eine
Wasserprobe und bei Amplifikation vektorspezifischer Elemente (Neo-Kassette, LR-
PCR) Wildtyp- DNA. Die Lage der Primer und die erwarteten Größen der Amplifikate
sind Abbildung 21 und Kapitel 3.8.2. zu entnehmen.

- 116 -
Ergebnisse
4.5.3. PCR Ergebnisse G418-resistenter Zellklone
Insgesamt wurden 263 Zellklone auf Vektorsequenzen untersucht (Beispiel s.
Abbildung 39). Bei einer korrekten homologen Rekombination müssen die
Vektorsequenzen deletiert worden sein. Ein positiver Nachweis von
Vektorsequenzen spricht also für eine zufällige Integration. Bei 227 Klonen (86,3%)
konnten Vektorsequenzen nachgewiesen werden, was eine korrekte Integration von
PMW8-Neo ausschloss. Von diesen wurden bei 86 am 5´Ende (37,9%), 77 am
3´Ende (33,9%) und 64 am 5´und am 3´Ende (28,2%) Vektorsequenzen amplifiziert.
36 Klone wiesen keine Vektorsequenzen auf. Bei 29 (81%) der verbliebenen 36
Klone konnte die Neomycinresistenz- Kassette mit der Primerkombination
pMA1/pMA2 nachgewiesen werden. Diese wurden in einer LR- PCR auf die richtige
Integration des Konstruktes am 5´Ende untersucht. Eine genaue Darstellung der
Ergebnisse aus den Untersuchungen über PCR ist Tabelle 16 zu entnehmen.
254 bp
Abbildung 38: Lage der Primer zum Nachweis von Vektorsequenzen am 5´-und 3´Ende
XE83
2 kb

Klon 2C10
5´VS 3´VS
Ergebnisse
Klon 1D10
5´VS 3´VS
100bp
Ladder
2 kb
600bp
254bp
Abbildung 39: Nachweis von Vektorsequenzen. Die Klone 2C10 und 1D10
weisen Vektorsequenzen am 5´und am 3´Ende auf.
- 117 -
4.5.4. LR-PCR zum Nachweis der homologen Integration am 5´Ende
Insgesamt 29 Klone wurden mit Hilfe einer LR- PCR auf die richtige Integration am
5´Ende untersucht. Dabei wurden die Primer so gewählt, dass Ko1 ausserhalb der
homologen Targeting-Region und Ko2 innerhalb des Knockout-Vektors lag. Bei
Klonen mit korrekter Integration von PMW8-Neo wurde eine Bande von ca. 9 kb in
der LR-PCR erwartet (s. Abbildung 40). Neun Klone (3,4% aller 428 erhaltenen
G418-resistenten Klone) wiesen eine Bande in der erwarteten Größe auf. Da
innerhalb dieser Banden nicht ausreichend DNA für einen analytischen Verdau mit
Restriktionsendonukleasen vorhanden war, wurde die Richtigkeit der erhaltenen
Banden mit Nested- PCR untersucht. LR- PCR positive Klone (9 kb Bande, s.
Abbildung 41) wurden, bei Erreichen von 100% Konfluenz auf einer 4-Well
Zellkulturschale, für einen späteren Einsatz im somatischen Kerntransfer eingefroren.

- 118 -
Ergebnisse
Abbildung 40: Lage der Primer zur Amplifikation des 9kb- Fragments. Primer Ko1 liegt
außerhalb der homologen Region in Exon 4 des GGTA-1 Locus. Primer Ko2 liegt innerhalb von
PMW8-Neo. Eine 9kb-Bande wird nur bei korrekter Integration am 5´-Ende von PMW8-Neo in
den GGTA-1 Locus amplifiziert.
10 kb
3 kb
1 2 3 4
1kb MWM 3E11 24G5 1E11
~9 kb
Abbildung 41: LR-PCR von Klon 24G5, deutlich ist die Bande bei 9 kb zu erkennen (Spur 1: 1 kb
Ladder, Spur 2: Klon 3E11 (neg.), Spur 3: Klon 24G5 (pos.), Spur 4: Klon 1E11 (neg.)
4.5.5. Nested-PCR
Um die Spezifität der aus der LR- PCR erhaltenen 9 kb Bande zu überprüfen, wurde
diese aus dem Agarosegel geschnitten, eluiert und mit GFX- Säulen aufgereinigt.
1-10 µl des erhaltenen Eluats wurden als Template für eine PCR mit dem Primerpaar
pMA1/ pMA2, das spezifisch für die Neomycinresistenz- Kassette war, verwendet
(zur Übersicht Abbildung 42). In der Nested- PCR ließ sich das erwartete Amplifikat
für die Neomycinresistenz- Kassette nachweisen, was die Spezifität der 9 kb Bande

Ergebnisse
- 119 -
aus der LR-PCR bestätigte. Eine weitere Nested- PCR mit den Primern XE123/
XE82, die am Beginn von Intron 4 positioniert sind und ein 500 bp großes Amplifikat
generieren, konnte ebenfalls die Spezifität der LR- PCR nachweisen (Ergebnis s.
Abbildung 43 und 52) Beide Amplifikate liegen innerhalb des Konstruktes lediglich
1,5 kb voneinander entfernt. Somit wurde bei 9 Klonen von einem richtigen Einbau
des Vektors in den α1,3- Gal-Locus zumindest am 5´Ende ausgegangen.
Abbildung 42: Darstellung der Lage der bei den Nested-PCRs eingesetzten Primer. Als
Template diente das in der LR-PCR amplifizierte Fragment.
600 bp
325 bp
1 2 3 4 5
MWM 1µl 3µl 5µl 10µl
Abbildung 43: Ergebnisse der Nested-PCR hier als Beispiel an Klon 24G5 dargestellt.
Die Abbildung zeigt die Amplifikation der Neo- Kassette aus der 9kb Bande der LR- PCR (Klon
24G5, Spur 1: 100bp Ladder, Spur 2-5: Amplifikation mit verschiedenen Mengen Eluat als
Template, von links nach rechts: 1µl, 3µl, 5µl, 10µl).

- 120-
Ergebnisse
- 120 -
Ergebnisse
Tabelle 16: Übersicht über die Ergebnisse der Transfektion foetaler Fibroblasten mit dem Knockout-Vektor PMW8- Neo in
Relation zum verwendeten Elektroporationsprotokoll.
Elektroporations-
parameter
n
Gesamtzahl
eingesetzter
Zellen
450V/ 350 µF 2 6x10 6
240V/ 500 µF 4 1,2x10 7
G418resistente
Kolonien Seneszenz
159
Transfektionsversuche mit PMW8- Neo
Nachweis von
5´Ende
Vektorsequenzen 3´Ende VS 5´+3´Ende VS keine VS
Neo®positiv
LR-
PCR
positiv
52 20 44 28 15 14 5
32,70% 18,70% 41,10% 26,20% 14,00% 13,10% 4,70%
269 113
66 33 36 21 15 4
42,00% 42,30% 21,20% 23,10% 13,50% 9,60% 2,60%
Gesamt 6 1,8x 10 7
428 165 86 77 64 36 29 9
38,60% 32,70% 29,30% 24,30% 13,70% 81% a
3,40%
Alle prozentualen Angaben sind auf die Gesamtzahl erhaltener G418-resistenten Klone berechnet a
: bezogen auf Vektorsequenzen-freie Klone (29/36)

Ergebnisse
- 121 -
4.6. In-vivo- Experimente zum somatischen Kerntransfer mit
nicht-transgenen Spenderzellen
Für die Überprüfung der In-vitro-Ergebnisse unter In-vivo- Bedingungen, wurden
gepoolte nicht-transgene foetale Fibroblasten (Passage 2-3) verwendet, die zuvor
einer 48 stündigen Zellzyklussynchronisation durch Kontaktinhibition unterworfen
worden waren. Zur Herstellung der Fibroblasten-Oozytenkomplexe wurden 40 h in
NCSU37 gereifte Oozyten eingesetzt. Über vier Versuchstage konnten bei einer
Fusionsrate von durchschnittlich 77,1% 641 fusionierte Komplexe erzeugt werden,
wobei sich insgesamt 599 rekonstruierte Embryonen nach der Aktivierung als
transfertauglich erwiesen (Tabelle 17). Auf vier zyklussynchronisierte
Empfängerschweine wurden chirurgisch durchschnittlich 150 rekonstruierte
Kerntransfer-Embryonen übertragen. Tabelle 18 dokumentiert die Ergebnisse, die bei
diesem ersten Transfer erzielt wurden. Genaue Abgaben sind bei (HOELKER 2003)
zu finden.
Tabelle 17: Ergebnisse der ersten Transferversuche von porzinen Kerntransfer-Embryonen auf
synchronisierte Empfängertiere
Sau-Nr.
Gesamt-
Komplexe
(n)
fusionierte
Komplexe
(n) (%)
übertragene
Komplexe
Trächtigkeitstag
(n) 26 33 34 115
1. ET 10/5 200 166 83,0 161 (+) (+) 4 Ferkel
2. ET 969/20 202 158 78,2 144 (-) (-)
3. ET 868/85 213 166 77,9 156 (+) (-) 5 Implantationen
4. ET 978/25 218 151 69,3 138 (-) (-)
x = 208 160 77,1 150
(+) : positiver Ultraschallbefund, (-) : negativer Ultraschallbefund

- 122 -
Ergebnisse
Tabelle 18: Übersicht über das Geschlecht und die Geburtsgewichte der aus somatischem
Kerntransfer erhaltenen Ferkel.
Geburtsgewicht Geschlecht Vitalität
Ferkel Nr.1 1480 g weiblich tot
Ferkel Nr.2 400 g weiblich lebensschwach 1
Ferkel Nr.3 680 g weiblich munter
Ferkel Nr.4 1550 g weiblich munter
1 : Ferkel verstarb 8h nach Geburt
Ein Ausschluß des Empfängertieres als biologische Mutter wurde über eine
Mikrosatelliten-Analyse 12 hochpolymorphe Loci erreicht. In einem Locus (SW632)
war jedes Ferkel ohne allelische Übereinstimmung mit dem Empfängertier. Es konnte
zudem gezeigt werden, dass Ferkel 1 und 3, sowie 2 und 4 genetisch identisch
waren, da sie jeweils in allen 12 Loci übereinstimmten. Ebenfalls wurde
nachgewiesen, dass sie aus der Zellkultur stammen, da sie in keinem der Loci eine
Abweichung gegenüber der Spenderzellkultur aufwiesen. Diese Ergebnisse
vereinbaren sich mit der Tatsache, dass eine aus 2 Foeten gepoolte
Fibroblastenkultur als Spenderzellen eingesetzt wurde.
Bis heute zeigen beide aus dem somatischen Kerntransfer entstandenen Tiere eine
unauffällige Entwicklung, die sich von der Entwicklung anderer Schweine des
Bestands nicht unterscheidet. Das Reproduktionsverhalten beider Tiere ist normal.
Sie zeigten eine normale Rausche im Alter von 8 Monaten und wurden dann mit
einem institutseigenen Eber im Natursprung belegt. Eine Ultraschalluntersuchung an
Tag 26 bestätigte eine bestehende Trächtigkeit beider Tiere, wodurch von einer
normalen Reproduktionsfähigkeit beider Tiere ausgegangen werden kann. Die Tiere
zeigen eine ungestörte Trächtigkeit und werden im März 2004 abferkeln.

Ergebnisse
4.7. Erstellung heterozygoter alpha1,3 Gal- Knockout Ferkel
über somatischen Kerntransfer
- 123 -
Nachdem in den unter 4.6. dargestellten Versuchen der somatische Kerntransfer
beim Schwein mit den in der internationalen Literatur gezeigten, noch geringen
Erfolgsraten etabliert werden konnte, wurden in den folgenden Experimenten
transgene Spenderzellen eingesetzt. Ein Zellklon mit korrekt integriertem PMW8-
Neo-Konstrukt wurde vor dem Einsatz im somatischen Kerntransfer einer Y-
Chromosomen spezifischen Geschlechtsdeterminierung durch PCR (POMP et al.
1995) mit der Primerkombination SRYP1/SRYP2 unterzogen. Als Negativ- Kontrolle
diente eine weibliche Zelllinie (Abbildung 44), als Positiv- Kontrolle eine männliche
Zelllinie (hier nicht dargestellt). Männliche transgene Nachkommen haben den Vorteil
einer schnelleren Vermehrung durch natürliche Verpaarung oder künstliche
Besamung. Klon 24G5 zeigte in der geschlechtsdeterminierenden PCR eine
spezifische Bande bei 230bp auf, die für das männliche Geschlecht typisch ist. Klon
24G5 wurde für die Erstellung transgener α1,3-Galaktosyltransferase defizienter
Ferkel ausgewählt.
600bp
230bp
1 2 3
Spur 1: MWM 100bp
Spur 2: Klon 24G5
Spur 3: neg. Kontrolle
Abbildung 44: PCR-Ergebnis Klon 24G5 (Spur 2) mit SRYP1/SRYP2. Deutlich ist
die Y-Chromosomen spezifische Bande bei 230 bp dargestellt. Die neg.Kontrolle
(weibliche Zelllinie) weist dagegen nur unspezifische Banden auf.

- 124 -
Ergebnisse
Es wurden Embryotransfers mit rekonstruierten Embryonen aus einer nicht-
transgenen Spenderzelllinie und zwei aus dem homolog rekombiniertem Zellklon
24G5 durchgeführt. Insgesamt wurden 571 Fibroblasten-Oozytenkomplexe erstellt,
von denen 455 (79,7%) fusionierten. 416 Komplexe wurden als transfertauglich
angesehen (Tabelle 19). Von den 4 Empfängertieren war bei zwei an Tag 26 nach
Embryotransfer eine Trächtigkeit im Ultraschall nachzuweisen. Die
Ultraschallbefunde sind in den Abbildung 45 undAbbildung 46 dargestellt.
Tabelle19: Transfer geklonter Embryonen aus serumreduzierten (1.+2.ET) und α1,3-Gal-Ko
(3.+4.ET) Spenderzellen
Sau-Nr.
Gesamt-
Komplexe
(n)
fusionierte
Komplexe
(n) (%)
übertragene
Komplexe
(n)
Spender
Trächtigkeitstag
zelltyp 26 33 115
1. ET 18/15 110 (+) (-) (-)
297 228 76,8%
SR pfF
2. ET 18/17
110
(-) (-) (-)
3. ET 18/13 100 (+) (+) 5 Ferkel
274 227 82,9%
24G5
4. ET 5/23
96
x = 571 455 79,7% 416
(+) : positiver Ultraschallbefund, (-) : negativer Ultraschallbefund,
SR pfF: serumreduzierte foetale Fibroblasten
(-) (-) (-)

Ergebnisse
- 125 -
Abbildung 45: Ultraschallbefund des Empfängertiers 18/15 an Tag 26 der Trächtigkeit aus
nicht-transgenen Embryonen.
Abbildung 46: Ultraschallbefund des Empfängertiers 18/13 an Tag 42 der Trächtigkeit aus α-
Gal-knockout Embryonen.

- 126 -
Ergebnisse
Das Empfängertier 18/15 (nicht-transgene Spenderzellen) zeigte an Tag 33 deutliche
Rauschesymptome. Das Empfängertier 18/13, bei dem eine Trächtigkeit mit
Embryonen aus transgenen Spenderzellen etabliert werden konnte, zeigte weiterhin
eine unauffällige Trächtigkeit und warf an Tag 115 der Trächtigkeit 5 männliche
Ferkel. Zwei Ferkel wurden tot geboren und zeigten Deformationen im
Schädelbereich. Ein Ferkel mit offener Gaumenspalte wurde am darauffolgenden
Tag euthanasiert. Die drei Ferkel wurden zur weiteren Untersuchung in das
Pathologische Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesandt. Bei allen
Ferkeln wurde eine Verkrümmung von Oberkiefer und Nase diagnostiziert. Zudem
wiesen die Ferkel einen unvollständigen Schluss des Schädeldaches auf. Alle Ferkel
hatten zudem ein deutlich reduziertes Geburtsgewicht (Tabelle 20). Die Ursache der
Missbildungen konnte nicht ermittelt werden. Hinweise auf infektiöse oder
degenerative Erkrankungen wurden nicht gefunden.
Tabelle 20: Übersicht über den Entwicklungszustand der Klonferkel nach der Geburt.
Geburtsgewicht Geschlecht Vitalität
Ferkel Nr.1 500 g männlich lebensschwach
Ferkel Nr.2 760 g männlich euthanasiert
Ferkel Nr.3 680 g männlich munter
Ferkel Nr.4 220 g männlich tot
Ferkel Nr.5 330 g männlich tot
Neben dem geringen Geburtsgewicht und dem unreifen Entwicklungszustand,
wiesen die Ferkel zudem eine Spreizung der Extremitäten auf, was einen weiteren
Verbleib bei dem Empfängertier ausschloss. Den Ferkeln wurden deshalb 2-stündlich
mit Hilfe eines Kleintierkatheters parenteral 15ml Kolostralmilch, die nach Anrüsten
des Empfängertieres gewonnen wurden, verabreicht. Am 3. Tag wurde auf bovine
Kolostralmilch umgestellt. Die Ferkel nahmen an Gewicht zu und konnten bald aus

Ergebnisse
- 127 -
eigener Kraft stehen (Abbildung 47). Ferkel Nr.1 verstarb jedoch am Tag 24. Eine
pathologische Untersuchung stellte ein akutes Herz-Kreislauf- Versagen unbekannter
Genese als Todesursache fest.
Das verbleibende Jungtier konnte nach Erreichen eines ausreichenden Gewichtes an
eine Amme angesetzt werden (Abbildung 48). Seitdem entwickelt es sich normal und
zeigt ein Verhalten, das sich nicht von anderen Tieren des Bestands und gleichen
Alters unterscheidet.
Abbildung 47: Klonferkel 1 und 3 im Alter von 18 Tagen. Die ersten durch
somatischen Kerntransfer generierten transgenen Schweine Deutschlands.

- 128 -
Ergebnisse
Abbildung 48: Klonferkel 3 mit heterozygotem Knockout der α1,3-
Galaktosyltransferase.
Zur Bestimmung der genetischen Identität der Ferkel wurden 12 polymorphe Loci in
einer Mikrosatellitenanalyse untersucht. Als Ausgangsmaterial dienten die
Spenderzellkultur, Blut des Empfängertieres und Biopsieproben der geborenen
Ferkel. Ein Mikrosatellit (CGA) konnte in keiner der Proben amplifiziert werden.

Ergebnisse
- 129 -
Tabelle 21: Übersicht über die Ergebnisse der Mikrosatelliten-Analyse der 5 geklonten Ferkel,
der Zelllinie und des Empfängertieres.
Mikro-
satellit
Spender
Zellen
Herkunft des Probenmaterials
Ferkel 1 Ferkel 2 Ferkel 3 Ferkel 4 Ferkel 5 Empfängertier
S0068 ca ca ca ca ca ca ab
S0178 aa aa aa aa aa aa aa
SW911 ab ab ab ab ab ab aa
SW122 bc bc bc bc bc bc ab
S0090 ab ab ab ab ab ab ab
SW632 bb bb bb bb bb bb ab
S0002 ac ac ac ac ac ac ab
S0101 ac ac ac ac ac ac ab
SW857 ab ab ab ab ab ab aa
SW926 ab ab ab ab ab ab bc
SW951 ab ab ab ab ab ab aa
a,b,c stehen für unterschiedliche Längen der einzelnen Mikrosatelliten. Gleiche Buchstaben
innerhalb einer Zeile stehen für gleiche Größen in den einzelnen Mikrosatelliten.
Wie aus der Tabelle 21 ersichtlich ist, weisen die Zellkultur und die fünf Ferkel in
allen 11 Mikrosatelliten dieselben Allele auf. Das Empfängertier besitzt jeweils
mindestens ein gemeinsames Allel je typisiertem Locus mit der Zelllinie und den
Ferkeln. Allein aufgrund dieser Ergebnisse ist es sehr unwahrscheinlich, dass das
Empfängertier auch die biologische Mutter ist, denn dann müssten alle anderen
Allele vom Vater kommen und zugleich mit der Zelllinie übereinstimmen. Zu erklären
ist dieses Ergebnis mit dem hohen Inzuchtgrad innerhalb des Schweinebestandes in
Mariensee, aus dem auch die Foeten für die Etablierung der primären foetalen
Fibroblasten stammen. Für eine eindeutige Aussage müssten weitere Mikrosatelliten
analysiert werden. Zusammen mit dem Nachweis der Neomycinresistenz-Kassette
(s. Abbildung 49) konnte das Empfängertier jedoch als biologische Mutter
ausgeschlossen werden.

- 130 -
Ergebnisse
4.8. Charakterisierung der α1,3- Gal- Knockout Ferkel
4.8.1. Nachweis der Integration des Knockout-Vektors
Über eine PCR mit der Primerkombination pMA1/pMA2 (325 bp Amplifikat) gelang
der Nachweis der Integration des Targeting-Kontrukts. Beide Primer binden
spezifisch in der für die Neomycinresistenz-Kassette kodierenden Region. Über den
Nachweis der Neo®-Kassette konnte zugleich ein Ausschluß des Trägertieres als
biologische Mutter erfolgen. In dieser PCR konnte bei allen 5 Klonferkeln die
Neomycinresistenz- Kassette nachgewiesen werden. In Abbildung 49 sind die
Ergebnisse der PCR dargestellt.
2 kb
500 bp
325 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9
- + + + + +
Spur 1: MWM 100bp
Spur 2: Empfängertier
Spur 3: Ferkel 1
Spur 4: Ferkel 2
Spur 5: Ferkel 3
Spur 6: Ferkel 4
Spur 7: Ferkel 5
Spur 8: MWM 100bp
Spur 9: H2O
Abbildung 49: PCR Ergebnis mit der Primerkombination pMA1/pMA2. Alle 5 Klonferkel (Spur 3-
7) weisen die erwartete Bande bei 325 bp auf, wohingegen die Neoprimer aus der genomischen
DNA des Empfängertieres kein spezifisches Produkt amplifizieren konnten (Spur 2)

Ergebnisse
4.8.2. Nachweis der homologen Rekombination in den α1,3-Gal-
Locus
- 131 -
Eine LR- PCR mit den Primern Ko1/Ko2, wobei Ko1 außerhalb des rekombinierten
Bereiches und Ko2 innerhalb des Knockout-Vektors bindet, wurde mit allen 5 Ferkeln
durchgeführt. Ein PCR-Produkt von ~ 9kb sollte nur von einem korrekt
rekombinierten Allel amplifiziert werden. Als Negativ-Kontrolle dienten H2O und nicht-
transgene porzine foetale Fibroblasten. Klonferkel 2 und 3 zeigten hierbei die
erwartete Bande bei ~9kb (Abbildung 50). Um die Spezifität der PCR zu erhöhen,
wurde als Wiederholung eine optimierte PCR mit Hot-Start durchgeführt. Auch hier
zeigten die Klonferkel 2 und 3 die erwartete Bande (Abbildung 51).
10 kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Spur 1: MWM 1kb
Spur 2: H2O
Spur 3: neg. Kontrolle
Spur 4: Ferkel Nr.1
Spur 5: Ferkel Nr.2
Spur 6: Ferkel Nr.3
Spur 7: Ferkel Nr.4
Spur 8: Ferkel Nr.5
Spur 9: MWM 1kb
Abbildung 50: LR-PCR Ergebnisse der Klonferkel 1-5. Als Negativ-Kontrollen dienten H2O (Spur
2) und nicht-transgene porzine foetale Fibroblasten (Spur 3)

- 132 -
Ergebnisse
Spur
1 2 3
Ferkel 2 Ferkel 3 MWM
1 kb
10 kb
8 kb
6 kb
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1,5 kb
1 kb
Abbildung 51: Optimierte LR- PCR mit Ferkeln Nr. 2 (Spur 1) und Nr. 3 (Spur 2)
4.8.3. Nachweis der Spezifität der LR-PCR Ergebnisse
Die ~9 kb Banden der Ferkel 2 und 3 aus der LR-PCR wurde aus dem Agarosegel
eluiert und zwei Nested-PCR auf ihre Spezifität mit den Primerkombinationen
pMA1/pMA2 und XE123/XE82 untersucht. Hierbei konnte in beiden Nested-PCR das
erwartete Fragment amplifiziert werden (Abbildung 52), so dass von einer korrekten
Integration des Knockout-Vektors in den α1,3-Gal-Locus durch homologe
Rekombination am 5´Ende ausgegangen werden kann.

325 bp
Ergebnisse
- 133 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7
1,5µl 3µl 5µl 1,5µl 3µl 5µl
Abbildung 52: Ergebnisse der Nested-PCR
500 bp
Links: Nested-PCR mit der Primerkombination pMA1/pMA2, spezifisch für die Neo®-Kassette
(325 bp) : Spur 1: MWM 100bp, Spur 2: nicht-transgene Kontroll-DNA, Spur 3- 5:
unterschiedliche Mengen Eluat aus LR-PCR (9kb Bande) von Ferkel 2 als Template 1,5 µl, 3µl,
5µl, Spur 6: MWM 100bp, Spur 7-9: Eluat aus LR-PCR (9kb Bande) von Ferkel 3, Spur 10: MWM
100bp
Rechts: Nested-PCR mit der Primerkombination XE123/XE82 spezifisch für Intron 4 (500 bp) mit
verschiedenen Annealing Temperaturen (Spur 2-6) zur Optimierung der PCR-Reaktion. Als
Template dienten 5 µl Eluat der LR-PCR (9kb Bande) von Ferkel Nr.3. In allen 5 Reaktionen
konnte die erwartete Bande bei 500bp amplifiziert werden.
4.8.4. Southern Blot
Zur endgültigen Bestätigung der korrekten Integration des Knockout-Vektors in den
α1,3- Galaktosyltransferase Locus der geklonten Ferkel wurden zwei Southern Blots
mit Sonden spezifisch für die Targeting Region am 3´Ende durchgeführt .
Hierbei hybridisierten die gewählten Sonden unspezisch mit verdauter Schweine-
DNA, so dass bisher keine eindeutigen Ergebnisse erzielt werden konnten.

- 134 -
Diskussion
5. Diskussion und Schlussfolgerungen
Eine erfolgreiche Fortsetzung der bisherigen Ansätze zur immunverträglichen
Xenotransplantation erfordert verbesserte transgene Techniken beim Nutztier. Eine
wesentliche Voraussetzung für die Erstellung von Knockout Nutztieren ist das
somatische Klonen. Eine zweite Voraussetzung ist das Vorhandensein eines
Transfektionsprotokolls für die gezielte genetische Modifikation primärer Zellen. Für
die sich an die Transfektion anschließenden Phasen wie Selektion, Expansion und
Präparation der Donorzellen für den Kerntransfer ist eine Kultur der Zellen
erforderlich, die ein möglichst langes Überleben der Zellen unter in-vitro-
Bedingungen gewährleistet.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden das somatische Klonen und die gezielte
genetische Modifikation von Schweinen als Xenotransplantationsmodell erfolgreich
etabliert. Damit wird erstmals eine weitergehende Forschung in diesem Bereich ohne
kommerzielle Beteiligung möglich.
5.1. Zellzyklussynchronisation und Qualität geklonter porziner
Embryonen
Der somatische Kerntransfer ist bis heute bei 10 Säugerspezies erfolgreich mit der
Geburt vitaler Nachkommen etabliert. Beim Schwein ist die Erfolgsrate des
somatischen Kerntransfers noch gering; nur 1-2% der rekonstruierten Embryonen
entwickeln sich zu lebenden Nachkommen. Lediglich beim Rind sind Erfolgsraten mit
15-20% berichtet worden, was auf die intensiver erforschten und etablierten in-vitro-
Techniken beim Rind zurückgeführt wird (DINNYES et al. 2002). Der Synchronität
des Zellzyklus zwischen Empfängeroozyte und Spenderzelle wird eine große
Bedeutung für die normale Entwicklung von Kerntransferembryonen zugesprochen
(WILMUT et al. 1997; WELLS et al. 1997). Unter Verwendung Metaphase-IIarretierter
Empfängeroozyten, sollte der Spenderzellkern in der G0/G1- Phase des
Zellzyklus sein, damit Schädigungen der DNA verhindert und eine normale Ploidie

Diskussion
- 135 -
des Kerntransferembryos gewährleistet werden kann (CAMPBELL et al. 1993;
CAMPBELL et al. 1996b; CAMPBELL u. ALBERIO 2003). Jede mitotisch aktive Zelle
unterliegt dem Zellzyklus, der Zellwachstum und Zellteilung koordiniert. Seine Dauer
ist je nach Zelltyp unterschiedlich. Im Allgemeinen wird der Zellzyklus in 2
Hauptphasen eingeteilt, von denen die Mitose (M-Phase) die eigentliche Zellteilung
darstellt. Zu Beginn der Mitose, der Prophase, zerfällt die Kernmembran, der Inhalt
des Zellkerns kondensiert zu sichtbaren Chromosomen und zelluläre Mikrotubuli
bilden die Mitosespindel, die schließlich die Chromosomen trennt. Daraufhin scheint
die Zelle kurz in einem als Metaphase bezeichneten Stadium zu verharren, in dem
die bereits verdoppelten Chromosomen an der Mitosespindel aufgereiht werden. Die
Trennung der verdoppelten Chromosomen markiert den Beginn der Anaphase, in der
sich die Chromosomen zu den jeweiligen Polen der Spindel hinbewegen, wo sie in
der Telophase dekondensieren und neue intakte Zellkerne bilden. In der sich
anschließenden Zytokinese teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen, was als die
Beendigung der M-Phase des Zellzyklus betrachtet wird (ALBERTS et al. 1995). Der
Zeitabschnitt zwischen den Mitosen, der den größten Teil im Zyklus ausmacht und in
dem Zellwachstum und DNA-Replikation erfolgen, bezeichnet man als Interphase.
Diese wird in die G1-Phase (engl. gap = Lücke zwischen M-Phase und S-Phase), die
S-Phase (Synthesephase) und die G2-Phase (Lücke zwischen S-Phase und M-
Phase) unterteilt (ALBERTS et al. 1995). Aus der G1-Phase können die Zellen, z.B.
durch Kontaktinhibition oder Serumentzug, in ein Ruhestadium (G0-Phase) gelangen
(BOQUEST et al. 1999). Da die DNA-Replikation in der S-Phase erfolgt, besitzen
Zellen in der G0/G1-Phase einen diploiden Chromosomensatz, in der G2- und M-
Phase einen tetraploiden Chromosomensatz, sowie in der S-Phase einen DNA-
Gehalt, der zwischen diesen Werten liegt (BOQUEST et al. 1999).
Um den Anteil an Spenderzellen in der G0/G1- Phase zu erhöhen, wird im
allgemeinen eine Synchronisation des Zellzyklus angestrebt. Dafür stehen
verschiedene methodische Ansätze zur Verfügung, wie chemische Inhibitoren,
Serumreduktion oder Kontaktinhibition. In der vorliegenden Arbeit wurden die zwei
meist eingesetzten Methoden, Serumreduktion und Kontaktinhibition, auf ihre
Effizienz zur Anreicherung porziner Spenderzellen in der G0/G1-Phase untersucht.

- 136 -
Diskussion
Der Einfluss der Spenderzellpräparation auf die Entwicklungsfähigkeit porziner
Kerntransferembryonen wurde anhand der Blastozystenrate und der Kernzahlen
erhaltener Blastozysten untersucht. In vorangegangenen Arbeiten aus dem gleichen
Labor war gezeigt worden, dass die Dauer der Serumreduktion die Integrität der
zellulären DNA beeinflussen kann. Zellen, die für 72 Stunden in serumreduziertem
Medium (0,2% FCS) kultiviert worden waren, wiesen apoptotische Erscheinungen mit
DNA-Fragmentation auf (KUES et al. 2002). Hierbei handelte es sich um eine
unkonventionelle Form des Zelltods, da klassische Faktoren wie die Aufspaltung der
DNA in die typischen nukleosomalen Multimere und die Aktivierung von Caspase-3,
einem wichtigen Enzym in der Apoptosekaskade, fehlten. Für die beschriebenen
Versuche wurden deshalb die Spenderzellen für 48 Stunden in serumreduziertem
Medium kultiviert. In dieser Zeit sollte ein möglichst hoher Anteil an
Zellzyklussynchronität erreicht werden und apoptotische Veränderungen an den
Zellen so gering wie möglich gehalten werden.
Durchschnittlich wurden 86,3% ± 2,5 der Zellen auf diese Weise in der G0/G1-Phase
des Zellzyklus arretiert, was den Werten vorausgegangener Untersuchungen im
eigenen Labor und anderen Arbeitsgruppen weitgehend entspricht (BOQUEST et al.
1999; KUES et al. 2000). Auch nach Kontaktinhibition wurden gleichartige Anteile an
Zellen in der G0/G1- Phase erhalten (BOQUEST et al. 1999).
Nach 24 Stunden Kontaktinhibition befanden sich 85,0% ± 2,4 der Zellen in der
G0/G1- Phase des Zellzyklus. Dieser Anteil konnte durch Verlängerung der
Kontaktinhibition nicht gesteigert werden.
In der Blastozystenrate nach Kerntransfer bestand kein signifikanter Unterschied
zwischen Serumreduktion und Kontaktinhibition mit unterschiedlichen
Kontaktinhibitionszeiten (24-72 Stunden). Die besten Blastozystenraten von 17,6%
und 15,8% wurden nach Kerntransfer mit serumreduzierten und für 72 Stunden
kontaktinhibierten Spenderzellen erzielt.
Andere Arbeitsgruppen konnten Blastozystenraten von 21,2%- 37% erzielen
(BOQUEST et al. 2002; LEE et al. 2003b; HYUN et al. 2003; LEE et al. 2003c).
Jedoch enthalten diese Arbeiten einige Besonderheiten, die die Ergebnisse nur

Diskussion
- 137 -
schwerlich mit den in dieser Arbeit erzielten Resultaten vergleichen lassen.
BOQUEST et al. (2002) setzten in-vivo gereifte Schweineoozyten ein, die ein
höheres Entwicklungspotential besitzen als in-vitro-gereifte Oozyten (LEE et al.
2003a). Zudem wurden die MII-Oozyten ohne Zusatz von Hoechst 33342 enukleiert,
was eine Kontrolle der Enukleation unmöglich macht. In den Untersuchungen von
LEE et al. (2003c) wurde der Erfolg der Enukleation ebenfalls nicht kontrolliert.
Zudem wurden die Spenderzellen durch intrazytoplasmatische Injektion in die
Oozyten eingebracht. Bei Fehlen einer Enukleationskontrolle muss davon
ausgegangen werden, dass ein Teil der Blastozysten parthenogenetisch entwickelt
war. HYUN et al. (2003) benutzten Oozyten von älteren Sauen für die in-vitro-
Reifung, während in der vorliegenden Arbeit vor allem Oozyten präpuberaler
Jungsauen verwendet wurden. Oozyten geschlechtsreifer Sauen sind Oozyten
präpuberaler Jungsauen im Hinblick auf ihr Entwicklungspotential nach in-vitro-
Reifung überlegen (MARCHAL et al. 2001).
Hinsichtlich der Kernzahlen der erhaltenen Blastozysten ließ sich ein signifikanter
Einfluss der Spenderzellpräparation nachweisen. Blastozysten aus Spenderzellen
nach 48-stündiger Kontaktinhibition hatten mit durchschnittlich 21,6 Kernen
signifikant höhere Werte als die anderen Versuchsgruppen mit 13,9 und 12,5 Kernen
pro Blastozyste. Im Vergleich mit serumreduzierten Spenderzellen war ein
signifikanter Unterschied nur zu 72h kontaktinhibierten Spenderzellen festzustellen.
Die Kulturbedingungen porziner Embryonen sind suboptimal. Auch nach IVP oder
Kerntransfer sind die Anzahl der Zellen pro Blastozyste nach wie vor niedrig, was
das verringerte Entwicklungspotential erklären kann (NIEMANN u. RATH 2001).
PARK et al. (2001 u. 2002) berichteten über Kernzahlen von 33,5 ± 2,2 und 45,7 ±
6,4 nach Kerntransfer in in-vitro-maturierte präpuberale Oozyten. Nach IVP wurde
von 50-90 Kernen pro Blastozyste berichtet (MACHATY et al 1998; YOSHIOKA et al.
2002).
Der Einfluß der Dauer der Zellzyklussynchronisation auf die Effizienz des
Kerntransfers und die Kernzahlen erhaltener Blastozysten war bisher nicht
beschrieben worden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die besten
Ergebnisse mit 48h kontaktinhibierten Spenderzellen erzielt wurden.

- 138 -
Diskussion
Bei primären porzinen foetalen Fibroblasten bestehen deutliche Unterschiede mit
Hinblick auf die Reversibilität der Zellzyklussynchronisation. Serumreduzierte Zellen
vollzogen nach Überführung in reguläres Kulturmedium die erste Zellteilung,
während 48h kontaktinhibierte Zellen einen nahezu unveränderten Anteil von Zellen
in der G0/G1-Phase (86% ± 2,0) des Zellzyklus aufwiesen. 72h und 96h
kontaktinhibierte Zellen zeigten bereits einen Übergang in die S-Phase. Vermutlich
wird der Zellzyklus in länger kontaktinhibierten porzinen Zellen schneller aktiviert als
in kürzer kontaktinhibierten Zellen.
Um eine korrekte Embryonalentwicklung zu gewährleisten muß, der Spenderzellkern
in der Oozyte rückprogrammiert werden, d.h. das Genexpressionsprofil muss dem
einer frühembryonalen Zelle angeglichen werden. Dies beinhaltet die Remodellierung
chromatiner Strukturen, globale Veränderungen der DNA-Methylierung, die
Expression unterdrückter Gene, Wiederherstellung der Telomerenlänge, X-
chromosomale Inaktivierung sowie eine Reihe weiterer Vorgänge der
frühembryonalen Entwicklung (GURDON u. COLMAN 1999). Das Zytoplasma
gereifter Oozyten enthält Faktoren, die eine Rückprogrammierung der Zellkerne
gewährleisten können. Embryonale Fehlentwicklungen werden auch auf eine
unvollständige oder fehlerhafte Rückprogrammierung des Spenderzellkerns
zurückgeführt (HAN et al. 2003). Beim Rind ist gezeigt worden, dass
Kerntransferembryonen Unterschiede im Genexpressionsprofil
entwicklungsrelevanter Gene aufweisen, die an den auftretenden Missbildungen
geklonter Kälbern mitbeteiligt sein sollen (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Methoden der Zellzyklussynchronisation können auch das foetale und neonatale
Überleben beeinflussen. Nach Behandlung boviner Spenderzellen mit Roscovitine,
einem spezifischen Inhibitor der Cyclin-abhängigen Kinase 2 (CDK2), wurden mehr
Trächtigkeiten ausgetragen, zudem erschienen die Kälber vitaler zu sein. Obwohl
höhere Blastozystenraten unter Einsatz serumreduzierter Spenderzellen erreicht
wurden, war bei Verwendung Roscovitine-behandelter Zellen die foetale
Überlebensrate erhöht (ALESSI et al. 1998). Die Qualität von

Diskussion
- 139 -
Kerntransferembryonen kann daher nicht aus der Blastozystenrate abgeleitet
werden, sondern stellt sich erst nach Übertragung in ein Empfängertier heraus.
Durch Mikroarrays konnte zudem gezeigt werden, dass Roscovitine-behandelte
Zellen ein anderes Genexpressionsprofil aufwiesen als serumreduzierte Zellen
(MIYOSHI et al. 2003), was eine Beteiligung der Zellzyklussynchronisation an der
epigenetischen Rückprogrammierung vermuten läßt.
Bei Untersuchungen an murinen ES-Zellen aus Inzuchtstämmen konnte gezeigt
werden, dass der Grad der Konfluenz der Kultur die Effizienz des Kerntransfers
beeinflussen kann. Obwohl sich gleiche Teile der Zellen in der G0/G1-Phase des
Zellzyklus befanden, waren mit konfluent gewachsenen ES-Zellen im Kerntransfer
höhere Erfolgsraten zu erzielen (GAO et al. 2003). In somatischen Zellkulturen wurde
die Genexpression der beiden Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I,
IGF-II) signifikant von der Zelldichte beeinflusst (KUTOH et al. 1995; WANG u.
ADAMO 2000). Die IGF-mRNA Transkription war in C6-Glioma Zellen im Zustand der
Konfluenz 200fach höher und IGF-II-mRNA stieg in BRL-3A Zellen um das 20fache.
Nach Serumreduktion und Kontaktinhibition wurden IGF-II und H19 in murinen ES-
Zellen überexprimiert (BAQIR u. SMITH 2004). IGF-I und IGF-II spielen eine
bedeutende Rolle in der Embryonalentwicklung (DECHIARA et al. 1990; POWELL-
BRAXTON et al. 1993). Nach Kerntransfer könnte demnach das Expressionsmuster
spezifischer Gene konfluenter Zellen und andere wichtige Faktoren wie die
Chromatinstruktur eher eine normale embryonale Entwicklung gewährleisten.
Die Methode der Zellzyklussynchronisation kann also den Erfolg des Kerntransfers
beeinflussen. Eine Kontaktinhibition der Zellen für 48 Stunden könnte eine
Anreicherung von Zellen, die in einem für die Rückprogrammierung günstigen
Zustand (Genexpression, Chromatinstruktur) sind, zur Folge haben.
Weitere vergleichende Untersuchungen unter Verwendung unterschiedlich
präparierter Spenderzellen im Kerntransfer sind jedoch erforderlich, um Einflüsse auf
die In-vivo-Entwicklung nachzuweisen.

- 140 -
Diskussion
5.2. Evaluierung des Wachstumspotentials von Spenderzellen in
T3-Medium und Erstellung eines Transfektionsprotokolls
Die Mikroinjektion ist die am weitesten verbreitete Methode zur Erstellung transgener
Tiere bei einer Vielzahl von Spezies. Jedoch ist die Effizienz dieser Methode gering,
da sich lediglich 1-2% der mikroinjizierten Zygoten zu transgenen Nachkommen
entwickeln (NIEMANN u. KUES 2003). Zudem werden nach Mikroinjektion zufällig
mehrere Kopien eines Transgens in das Wirtsgenom integriert. Damit verbunden
sind variable Expressionsmuster der Transgene (CLARK et al. 1994). Da lediglich bei
der Maus embryonale Stammzellen verfügbar sind, konnten gezielte genetische
Modifikationen bei Großtieren bisher nicht erzielt werden. Erst mit Geburt des ersten
Tieres aus somatischen Kerntransfer (WILMUT et al. 1997), wurden gezielte
genetische Modifikationen somatischer Zellen mit anschließender Generierung
transgener Tiere möglich (CLARK et al. 2000). Dies erfordert eine Reihe
unterschiedlicher Schritte: Etablierung einer Zelllinie, Transfektion der Zellen mit
einem geeignetem Vektor, Selektion mit Hilfe eines Selektionsantibiotikums, klonale
Expansion resistenter Klone, Untersuchung der Zellen auf Integration des Transgens
und anschließender Einsatz im somatischen Kerntransfer.
HAYFLICK (1961) konnte zeigen, dass primäre humane Zellen nur etwa 25- 40
Populationsverdopplungen in-vitro vollziehen, ehe das Wachstum eingestellt wird.
Diese Beobachtung wird auch als Zellalterung oder Seneszenz („Hayflick-Limit“)
bezeichnet Die reduzierte Lebenspanne primärer somatischer Zellen unter in-vitro-
Bedingungen stellt in diesem Zusammenhang einen limitierenden Faktor dar. Etwa
45 Populationsverdopplungen sind notwendig, um alle Schritte der genetischen
Modifikation bis zur Erstellung des Tieres durch somatischen Kerntransfer zu
erreichen (CLARK et al. 2000). Jüngste Untersuchungen in unserem Labor haben
gezeigt, dass Medium mit einem erhöhten Serumanteil zu veränderten
Wachstumseigenschaften porziner foetaler Fibroblasten führt (KUES et al. 2004).
Aus diesem Grunde wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss des Mediums auf
die Wachstumseigenschaften verschiedener primärer Zelllinien untersucht. T3-
Medium mit einem 30%igem Serumanteil führte zu einer signifikant erhöhten
Proliferation aller untersuchten Zelllinien gegenüber einer Kultur in

Diskussion
- 141 -
Standardkulturmedium. In T3-Medium wurden bei foetalen Fibroblasten über 80
Populationsverdopplungen erreicht, während in D10- Medium lediglich 54
Populationsverdopplungen und Erscheinungen von Seneszenz beobachtet wurden.
Unter konventionellen Kulturbedingungen zeigten porzine foetale Fibroblasten eine
Transformation nach ca. 40 Verdopplungen, was mit einem tri-und tetraploiden
Karyotyp der Zellen einherging. Lediglich 15% der Zellen wiesen nach 51
Populationsverdopplungen noch einen normalen Chromosomensatz auf (DENNING
et al. 2001). Eine FACS-Analyse nach 20 Passagen (~50 Populationsverdopplungen)
in T3-Medium, ergab in dieser Studie keine Hinweise auf einen veränderten
Karyotyp. Warum der erhöhte Serumanteil die Lebenspanne von Zellen unter in-vitro-
Bedingungen verlängert, ist bisher noch unbekannt. In foetalem Kälberserum
befinden sich aber zahlreiche Wachstumsfaktoren und Hormone und andere
wachstumsfördernde Substanzen. Zur Zeit werden im Labor in Mariensee Arbeiten
durchgeführt, um über Dialyse des foetalen Serums erste Hinweise über die
beteiligten Faktoren zu erhalten.
Eine mögliche Erklärung könnte die beobachtete selektive Anreicherung von Zellen
mit stammzellähnlichen Eigenschaften aus einer Explantatkultur bei Verwendung des
T3-Mediums sein (KUES et al. 2004). Diese Zellen zeigten Eigenschaften wie die
Bildung von „Embryoid Bodies“, Expression alkalischer Phosphatase, Verlust der
Kontaktinhibition und Wachstum in Suspensionskultur (KUES et al. 2004). Da auch
die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zellen mittels Explantatkultur und
anschließender Kultivierung in T3-Medium gewonnen wurden, könnten
stammzellähnliche Zellen durch das T3-Medium angereichert worden sein, was
deutlich mehr Passagierungen erlaubt. Die Entdeckung der deutlich gesteigerten
Lebensspanne kultivierter Zellen in Medium mit erhöhtem Serumanteil kann
vorteilhaft für die klonale Expansion homolog rekombinierter Zellklone sein. Aus
diesem Grund wurde das T3-Medium als Kulturmedium nach Zelltransfektion
eingesetzt.
Transfektionsversuche wurden mit drei verschiedenen Elektroporationstärken
durchgeführt. Die homologe Rekombination ist in somatischen Zellen ein sehr
seltenes Ereignis. In einer von ca. 10 6 – 10 7 mit einem Knockout-Vektor transfizierten

- 142 -
Diskussion
Zellen, wird das Konstrukt mit homologer Rekombination in den gewünschten Locus
integriert (KIM et al. 1991). Daher kommen der Transfektions- und
Selektionseffizienz entscheidende Bedeutung für den Erfolg des Gentransfers zu.
Um die Effizienz des Transfektionsprotokolls zu bestimmen, sind zunächst
Experimente mit einem Reportergenkonstrukt, das für das grün-fluoreszierende
Protein kodiert, durchgeführt worden. Zwischen den drei Transfektionsparametern
bestand aber kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Transfektionsrate. Auch
andere Arbeitsgruppen haben die Spenderzellen vor einem Einsatz im somatischen
Kerntransfer mit einem EGFP-Konstrukt transfiziert (PARK et al. 2001b; PARK et al.
2002; HYUN et al. 2003), aber keine Transfektionseffizienz angegeben und die
Zellen durch Selektion mit einem Antibiotikum oder mittels FACS- Sortierung
angereichert. Eine Transfektionseffizienz von 30- 50% wurde nach Liposomenvermitteltem
Gentransfer eines Konstrukts, das u.a. auch für EGFP kodierte erreicht
(AWASTHI u. COX 2003). Eine Transfektionseffizienz von 31- 44 % nach
Elektroporation unter Verwendung eines EGFP/ CD34- Konstrukts berichteten Wu et
al. (WU et al. 2001). Allerdings ist zu beachten, dass in beiden Arbeitsgruppen keine
foetalen Fibroblasten, sondern dendritische bzw. hämatopoetische Zellen für die
Transfektion verwendet wurden. Unter Berücksichtigung der Wahrscheinlichkeit
eines gezielten Einbaus des Konstruktes durch homologe Rekombination, ist die
erzielte Transfektionseffizienz als ausreichend anzusehen.

Diskussion
5.3. Erstellung α1,3- Gal- Knockout Ferkel
- 143 -
Das Enzym α1,3-Galaktosyltransferase synthetisiert Gal-α1,3-Gal Epitope auf den
Zelloberflächen aller Säugetiere mit Ausnahme des Menschen, Affen und
Altweltaffen (GALILI et al. 1988).
Ein Knockout des GGTA-1 Locus sollte demnach die HAR nach Übertragung eines
porzinen Xenotransplantats in Primaten minimieren oder vollständig unterbinden. Mit
einem Knockout-Vektor (PMW8-NEO), der flankierende homologe Sequenzen zum
porzinen GGTA-1 Locus aufwies, wurde ein Knockout der α1,3-Galaktosyltransferase
angestrebt. Zellen mit einem Knockout wurden anschließend für die Generierung von
Ferkeln durch somatischen Kerntransfer verwendet.
Das Knockout-Konstrukt wies am 5´- Ende einen 6,5 kb homologen Arm zum Ende
des Exons 4 und zum anschließenden Intron 4 auf; das 3´-Ende ist über 1,5 kb
homolog zur 3´UTR des Exon 9. Dadurch sollten nach homologer Rekombination alle
kodierenden Exons des chromosomalen GGTA-1 Locus deletiert werden
(KATAYAMA et al. 1998; KOIKE et al. 2000a). PMW8-Neo trägt einen promoterlosen
Selektionsmarker (Neo®), der nur durch Integration in einen aktiven Genort
exprimiert wird. Durch die Verwendung eines promoterlosen Vektors kann die
Selektionseffizienz um das 500- 1000 fache gesteigert werden (HANSON u. SEDIVY
1995).
In der vorliegenden Arbeit wurden nach Transfektion foetaler Fibroblasten mit
PMW8-Neo und anschließender 14-tägiger Selektion mit 800 µg/ml Geneticin (G418)
insgesamt 428 resistente Zellklone erhalten, was einer Integrationsfrequenz von 2,4x
10 -5 entspricht. Dieses Ergebnis entspricht der Effizienz, wie sie in früheren Arbeiten
für diesen Zelltyp beschrieben worden waren (DENNING et al. 2000). Trotz
Verwendung von T3-Medium konnten jedoch 38,6% der resistenten Klone nicht
ausreichend expandiert werden, so dass sie für eine Untersuchung auf korrekte
Integration durch PCR nicht zur Verfügung standen. Ursache hierfür könnte,
zumindest in einem Teil der Fälle, die zufällige Integration von PMW8-Neo in einen
für die Regulierung wichtiger Stoffwechsel- oder Zellteilungsvorgänge
verantwortlichen Genlocus gewesen sein. Zudem konnte gezeigt, dass Zellen

- 144 -
Diskussion
innerhalb einer identischen Zellpopulation unterschiedliche Lebensspannen
aufweisen (DENNING et al. 2001). Durch die klonale Expansion der Zellen während
der Selektion überleben nur Zellen die zusätzlich zur Integration des Konstrukts eine
ausreichende Lebensspanne aufweisen. Angaben über den prozentualen Anteil
seneszenter Klone nach Selektion wurden bisher nicht veröffentlicht. Dadurch ist
eine objektive Einschätzung des positiven Einflusses des T3-Mediums nach
Transfektion und Selektion nicht möglich. Vergleichende Untersuchung mit einer
Kultur in D10- Selektionsmedium sind hierzu erforderlich.
Mit Hilfe von LR-PCR wurden 9 von 263 Zellklonen identifiziert, die am 5´Ende eine
korrekte homologe Rekombination aufwiesen. Dieses Ergebnis entspricht einer
Frequenz für die homologe Rekombination von 8x 10 -7 , berechnet auf alle
eingesetzten Zellen bzw. 3,4 % in Bezug auf alle erhaltenen G418-resistenten Klone.
Diese Rate liegt im Rahmen der von anderen Arbeitsgruppen ermittelten Werten
(KIM et al. 1991). So berichteten DENNING et al. (2001) von einer Effizienz von 2,75
x 10 -6 – 2,8 x 10 -7 bezogen auf die Gesamtzahl eingesetzter Zellen. Einen etwas
geringeren Wert berichten HARRISON et al. (2002); hier zeigten 2,4% aller
erhaltenen resistenten Klone eine korrekte Integration in den GGTA-1 Locus.
Das in dieser Arbeit erzielte Ergebnis muss aber relativiert werden, da bisher keine
Verifizierung mit Southern Blot gelungen ist. Dies könnte zwei Ursachen haben. Zum
einen weist Exon 9 außerhalb des homologen Bereiches von PMW8-Neo einen
hohen GC-Gehalt und zahlreiche repetitive Sequenzen auf, was die Durchführung
einer spezifischen PCR erschwert (KIM et al. 1991). Andererseits zielten alle
bisherigen Veröffentlichungen auf die Deletion eines einzigen Exons. Zwei
Arbeitsgruppen generierten Vektoren, die auf eine Deletion von Exon 4 des GGTA-1
Locus, in dem das Startcodon beherbergt ist, abzielten (DENNING et al. 2001;
RAMSOONDAR et al. 2003). Andere Untersucher deletierten Exon 9, das die
katalytische Domäne enthält (HARRISON et al. 2002; LAI et al. 2002; DAI et al.
2002; PHELPS et al. 2003). Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Vektor
PMW8-Neo weist am 5´-Ende einen 6,5 kb homologen Arm zum Intron 4 und am 3´-
Ende einen 1,5 kb langen homologen Arm zum Exon 9 auf. Dadurch wird bei
korrekter Integration ein Bereich von etwa 23 kb, der die Exons 5,6,7,8 und 9

Diskussion
- 145 -
einschließt, innerhalb des GGTA-1 Locus deletiert. Da das 5´-Ende einen hohen
Anteil homologer Sequenzen aufweist, könnte dieser Bereich bevorzugt homolog
rekombiniert werden. Eine homologe Rekombination nur am 5´-Ende könnte die
Schwierigkeiten erklären, am 3`-Ende ein Fragment zu amplifizieren.
Weitere Untersuchungen mit einem verbessertem Southern Blot Protokoll sind
notwendig, um eine unabhängige Verfizierung des α-Gal-Knockouts zu erhalten. Ein
ausschließlich am 5`-Ende korrekt integrierter Knockout-Vektor würde aber mit sehr
hoher Wahrscheinlichkeit durch die Verschiebung des Leserahmens zu einem
funktionellen Knockout der α1,3-Galaktosyltransferase führen. Die in PMW8-Neo
integrierte IRES-Sequenz verfügt zudem über drei vorgeschaltete Stopkodons, die
eine Transkription der α1,3-Galaktosyltransferase beenden würden. Durch Einsatz
von Zelllen des transgenen Tieres in einer zweiten Transfektion mit dem Knockout-
Vektor wird zur Zeit ein homozygoter Knockout der α1,3-Galaktosyltransferase
angestrebt. Durch Inkubation dieser Zellen mit einem α1,3-Gal- spezifischen Lektin
(IB4) kann durch FACS-Analyse ein funktioneller Knockout nachgewiesen werden.
Eine Kolonie, aus der in der LR-PCR ein 9kb Fragment amplifiziert werden konnte,
wurde 48 Stunden in serumreduziertem Medium kultiviert und anschließend im
somatischen Kerntransfer eingesetzt. Es wurden jeweils 100 rekonstruierte
Komplexe in zwei synchronisierte Empfängertiere übertragen. Eines der beiden
Empfängertiere etablierte eine Trächtigkeit und warf am 115. Tag 5 männliche
Ferkel. Damit konnte gezeigt werden, dass das in Zusammenarbeit mit der parallel
durchgeführten Arbeit (HOELKER 2003) erstellte Kerntransferprotokoll
reproduzierbare Ergebnisse liefert und auch bei genetisch veränderten Zellen
erfolgreich ist.
Ein erhöhter Anteil an Missbildungen nach Verwendung homolog rekombinierter
Zellen im Kerntransfer ist beschrieben worden (MCCREATH et al. 2000; LAI et al.
2002).
Das aus der vorliegenden Arbeit resultierende vitale α-gal-knockout Ferkel zeigt ein
altersgemäßes normales Verhalten und unterscheidet sich nicht von anderen
Jungschweinen des Bestandes. Aus Gewebeproben der fünf Klonferkel wurde mit
PCR bei 2 Ferkeln (darunter das Überlebende) die 9 kb Bande amplifiziert. Das

- 146 -
Diskussion
Fehlen der den Knockout anzeigenden 9 kb Bande bei 3 Ferkeln, weist auf eine
Kontamination des Spenderzellklons mit einem nicht homolog rekombinierten
Zellklon hin. Alternativ könnte eine simultan aufgetretende gezielte und zufällige
Integration des Knockout-Vektors in 2 verschiedene Chromosomen einer Zelle zu
zwei Tochterzellen führen, von denen eine einen gezielten Einbau des Vektors und
die andere einen zufälligen Einbau aufweist. DENNING et al. (2001) beschrieben das
Vorhandensein von Zellen mit zufälliger Transgen-Integration in eine klonal
expandierten Zellkultur homolog rekombinierter Zellen. Aus einer Gewebeprobe des
Klonferkels in der vorliegenden Untersuchung wurde eine Zellkultur angelegt, in der
mit PMW8-Neo auch das zweite Allel der α1,3-Galaktosyltransferase ausgeschaltet
werden soll. Ein homozygoter Knockout der α1,3-Galaktosyltransferase ist mit der
normalen Entwicklung vereinbar (PHELPS et al. 2003).
Nieren von einem Schwein mit Doppelknockout für die α1,3-Galaktosyltransferse
wurden in einen Pavian transplantiert, der normale Nierenwerte aufwies und 68 Tage
überlebte. Aufgrund einer Infektion musste das Tier dann getötet werden. Eine
histopathologische Untersuchung erbrachte keine Hinweise auf eine hyperakute oder
akut vaskuläre Abstoßungsreaktion. Damit ist wissenschaftlich gezeigt worden, dass
mit Hilfe der Knockout-Strategie gegen α-Gal die Xenotransplantation verbessert
werden kann (YAMADA et al. 2003). Trotz des homozygoten α1,3-
Galaktosyltransferase Knockouts konnte aber mit Hilfe monoklonaler Antikörper,
gerichtet gegen das Gal-α1,3-Gal-Epitop, die Anwesenheit von Gal-Epitopen auf
porzinen Organen nachgewiesen werden. Die Expression entsprach etwa 1-2% des
normalen Levels (SHARMA et al. 2003).

Diskussion
5.4. Schlussfolgerungen und Ausblick
- 147 -
Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurden wichtige Fortschritte im Hinblick
auf die Generierung transgener Tiere mit spezifischen genetischen Veränderungen
für die Verwendung in der Xenotransplantation erzielt. Die in dieser Arbeit ermittelten
Resultate weisen den Einfluss der Zellzyklussynchronisation auf die Effizienz des
somatischen Kerntransfers nach. Zudem konnte ein neuartiges Zellkulturmedium
entwickelt werden, das die Lebensspanne primärer Zellen unter in-vitro-Bedingungen
deutlich verlängert und das Hayflick-Limit überwindet. Ein effizientes
Transfektionsprotokoll wurde für foetale Fibroblasten erarbeitet, mit dessen Hilfe die
gezielte genetische Modifikation porziner Fibroblasten möglich ist. Die erzielten
Ergebnisse konnten erfolgreich für die Generierung eines heterozygot α1,3-
Galaktosyltransferase defizienten Schweines durch somatischen Kerntransfer
angewandt werden. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate werden wesentlich zu
Fortschritten in Richtung einer (prä)-klinischen Erprobung der Xenotransplantation
beitragen.
Das in dieser Arbeit erstellte α-Gal defiziente Schwein kann als Grundlage für die
Generierung neuer transgener Schweinelinien dienen, die zusätzlich humane
komplement- und koagulationsregulatorische Gene tragen. In der Arbeitsgruppe in
Mariensee werden zur Zeit in Kooperation mit weiteren Partnern im Rahmen eines
DFG geförderten Transregio-Projektes „Xenotransplantation“, große Anstrengungen
unternommen, multitransgene Schweine mit mehreren relevanten genetischen
Veränderungen, zu erzeugen. Auf der Basis Gal-negativer Schweine könnten
Schweine generiert werden, die eine Überwindung der HAR und der später
auftretenden AVR nach Xenotransplantation im Primatenmodell dauerhaft
gewährleisten. Sollte sich diese Einschätzung bewahrheiten, könnten multitransgene
Schweine, in Kombination mit geeigneten Immunsuppressiva bereits in absehbarer
Zeit als Organdonoren eingesetzt werden und so helfen, das akute Problem des
Spenderorganmangels zu minimieren.

- 148 -
6. Zusammenfassung
Zusammenfassung
Björn Petersen
Erstellung
α1,3- Galaktosyltransferase defizienter Schweine
durch somatischen Kerntransfer und homologe
Rekombination
Zielsetzung dieser Arbeit war die Erstellung α1,3- Galaktosyltransferase defizienter
Schweine durch somatischen Kerntransfer.
Hierzu wurden in einer ersten Versuchsphase primäre foetale und adulte porzine
Fibroblasten und Kumuluszellen gewonnen und das Wachstumsverhalten in zwei
unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Zudem wurden zwei unterschiedliche
Methoden der Zellzyklussynchronisation auf ihre Effektivität untersucht.
In der zweiten Versuchsphase wurden Spenderzellen nach unterschiedlichen
Verfahren bzw. Zeitdauern der Zellzyklussynchronisation in in-vitro-Experimenten
zum somatischen Kerntransfer eingesetzt und auf ihren Einfluß hinsichtlich Effizienz
und Entwicklungspotential in-vitro erstellter Kerntransferembryonen untersucht.
In der dritten Versuchsphase wurden Transfektionsexperimente zur Etablierung
eines geeigneten Transfektionsprotokolls potentieller Spenderzellen durchgeführt.
Für diese Experimente wurde zunächst ein Reportergenkonstrukt (CMV-eGFP)
verwendet und die Transfektionsrate durch Expression des grün-fluoreszierenden
Proteins ermittelt. Diese Ergebnisse führten zur Entwicklung eines effizienten
Transfektionsprotokolls, das für die Transfektion mit einem Knockout-Vektor für die
porzine α1,3-Galaktosyltransferase eingesetzt wurde.

Zusammenfassung
- 149 -
In der vierten Versuchsphase wurden die erstellten α1,3-Gal Knockout Spenderzellen
in In-vivo-Versuchen zum somatischen Kerntransfer erfolgreich zur Generierung
α1,3-Gal defizienter Klonferkel verwendet.
Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:
1. Bei Verwendung eines Zellkulturmediums mit 30%igem Serumgehalt (T3-
Medium), konnte bei allen primären Zelllinien die Proliferationsfähigkeit
gegenüber einem Standardkulturmedium (10% FCS) signifikant gesteigert
werden.
2. Foetale Fibroblasten wiesen die größte Proliferationsfähigkeit mit 83,35
Populationsverdopplungen auf. Eine Änderung des Karyotyps konnte dabei
nicht festgestellt werden. Eine Transformation der Zellen scheint demnach
nicht zu erfolgen.
3. Kontaktinhibition und Serumreduktion führten zu einer signifikant erhöhten
Anreicherung foetaler Fibroblasten in der G0/G1- Phase des Zellzyklus
gegenüber zyklischen Zellen (p< 0,001). Mit beiden Methoden konnten mehr
als 85% der Zellen in der G0/G1- Phase des Zellzyklus arretiert werden.
4. Nach Splitten der Zellen wurden Unterschiede in der Reversibilität der
Zellzyklussynchronisation zwischen 24- und 48 stündiger Kontaktinhibition im
Vergleich zu 72- und 96 stündiger Kontaktinhibition, sowie 48 Stunden
serumreduzierten Zellen nachgewiesen (p< 0,001).
5. Die Methode der Zellzyklussynchronisation hatte keinen Einfluß auf die
Blastozystenrate nach somatischem Kerntransfer. Unter Verwendung 40 h
gereifter Oozyten konnten Blastozystenraten zwischen 14,0% (24 h
Kontaktinhibition) und 17,6% (48 h Serumreduktion) erzielt werden.

- 150 -
Zusammenfassung
6. Innerhalb der Gruppe geklonter Embryonen aus 40 h gereiften Oozyten als
Empfängerzellen wiesen Blastozysten aus 48 h kontaktinhibierten
Spenderzellen signifikant mehr Kerne auf, als Blastozysten, die aus 24 h und
72 h kontaktinhibierten Spenderzellen erstellt wurden (p< 0,05).
7. In Transfektionsexperimenten mit einem EGFP- Reportergen wurden drei
Elektroporationsparameter (240V/ 500µF, 260V/ 960µF, 450V/ 350µF) auf ihre
Transfektionseffizienz untersucht. Ein signifikanter Unterschied konnte nicht
festgestellt werden. Ca. 40% der Zellen konnten erfolgreich mit dem EGFP-
Reportergenkonstrukt transfiziert werden.
8. Nach Transfektion foetaler Fibroblasten mit einem Knockout-Vektor für die
porzine α1,3-Galaktosyltransferase (GGTA-1 Locus), konnten 428 G418-
resistente Zellklone gewonnen werden. Durch Long- Range PCR wurde in 9
Klonen eine korrekte Integration des Knockout- Vektors in den α1,3-
Galaktosyltransferase Locus nachgewiesen.
9. In Vorversuchen zum somatischen Kerntransfer wurden unter Verwendung
48 h kontaktinhibierten foetalen Fibroblasten und 40 h gereiften Eizellen
Kerntransferembryonen erstellt. Nach Übertragung von durchschnittlich
jeweils 150 geklonter Embronen auf 4 Empfängertiere, konnten 2
Trächtigkeiten etabliert werden; ein Empfängertier kam zur Geburt und warf 4
Ferkel. Hiervon waren 2 vital und entwickeln sich bis heute normal.
10. Unter Verwendung eines Galaktosyltransferase- Knockout Klons wurden
geklonte Embryonen erstellt. Nach Übertragung auf 2 Empfängertiere konnte
eine Trächtigkeiten etabliert werden. Das Empfängertier kam zur Geburt und
warf 5 Ferkel. 3 Ferkel wiesen Missbildungen auf und 1 Ferkel verstarb nach 3
Wochen aus unbekannter Genese. In allen Ferkeln konnte der Knockout-
Vektor durch PCR nachgewiesen werden. 2 Ferkel, darunter das

Zusammenfassung
- 151 -
Überlebende, wiesen eine korrekte Integration in den GGTA-1 Locus auf. Das
Ferkel entwickelt sich bis heute normal.
11. Durch Mikrosatellitenanalyse von 12 verschiedenen DNA- Loci konnte in allen
Kerntransferversuchen das Empfängertier als biologische Mutter
ausgeschlossen werden.
Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurden wichtige Fortschritte im Hinblick
auf die Generierung transgener Tiere insbesondere für die Verwendung genetisch
veränderter Schweine für die Xenotransplantation erzielt. Die in dieser Arbeit
ermittelten Ergebnisse weisen den Einfluss der Zellzyklussynchronisation auf die
Effizienz des somatischen Kerntransfers nach. Zudem konnte ein neuartiges
Zellkulturmedium entwickelt werden, das die Lebensspanne primärer Zellen unter in-
vitro-Bedingungen verlängert und das Hayflick-Limit überwindet. Ein effizientes
Transfektionsprotokoll für foetale Fibroblasten wurde erarbeitet, mit dessen Hilfe die
gezielte genetische Modifikation porziner Fibroblasten möglich ist. Die in der
vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse konnten erfolgreich für die Generierung
eines heterozygot α1,3-Galaktosyltransferase defizienten Schweines durch
somatischen Kerntransfer angewandt werden. Dieses Tier kann als Grundlage für die
Generierung neuer transgener Schweinelinien dienen, die zusätzliche humane
komplement- und koagulationsregulatorische Gene tragen. Auf der Basis Gal-
negativer Schweine könnten Schweine generiert werden, die eine Überwindung der
HAR und der später auftretenden AVR nach Xenotransplantation im Primatenmodell
gewährleisten können. Sollte sich diese Einschätzung bewahrheiten, könnten
multitransgene Schweine, in Kombination mit geeigneten Immunsuppressiva, in
absehbarer Zeit als Organdonoren eingesetzt werden und so helfen, das akute
Problem des Spenderorganmangels zu minimieren.

- 152 -
7. Summary
Summary
Björn Petersen
Generation of α1,3-galactosyltransferase deficient pigs
by somatic nuclear transfer and homologous recombination.
The goal of this project was to produce α1,3-galactosyltransferase (α1,3-Gal)
deficient pigs by somatic nuclear transfer following homologous recombination.
In the first phase of the project, primary porcine fetal cells, adult porcine fibroblasts
and porcine cumulous cells were produced and their growth rate was determined in
two different growth media. The results allowed the selection of a cell culture system
which significantly improved the proliferative properties of primary cells. This was
critical for the efficiency of subsequent steps involving the transfection of cells with a
targeting vector followed by selection and clonal selection. Similarly, the
effectiveness of two different methods for cell cycle synchronization was evaluated.
In the second phase of the project, donor cells exposed to a variety of preparative
protocols, including exposure to agents causing cell cycle synchronization for various
periods of time, were used for somatic nuclear transfer and in vitro culture. Different
preparative protocols were thus evaluated for their effect on the efficiency of nuclear
transfer and on the developmental potential of in vitro produced nuclear transfer
embryos.
In the third phase of the project, experiments were carried out to establish a suitable
transfection protocol for potential nuclear donor cells. In these experiments, a
reporter gene construct (CMV-EGFP) was used so that transfection efficiency could
be monitored by the expression of green fluorescent protein. These experiments led
to the development of an efficient transfection protocol which was subsequently used

Summary
- 153 -
for the transfection of donor cells with a vector which targeted integration to the gene
for porcine α1,3-galactosyltransferase.
In the fourth phase, α1,3-galactosyltransferase knockout donor cells were
successfully used in somatic nuclear transfer to generate α1,3-galactosyltransferase
(α1,3-Gal) deficient cloned piglets.
The following results were obtained:
1) The use of cell culture medium with 30% serum (T3-medium with 30% FCS)
gave a significant increase in proliferation for all primary cells in comparison to
that of normal medium.
2) Fetal fibroblasts showed the greatest proliferation potential with 83.35
population doublings. Alteration of the caryotype was not observed.
3) Both contact inhibition and serum reduction led to a significant enrichment of
fetal fibroblasts in the G0/G1 phase of the cell cycle as compared to cycling
cells (p

- 154 -
Summary
6) There were significantly (p

Summary
- 155 -
11) Microsatellite analysis at 12 loci was used to exclude the possibility that the
foster mother could have been the biological mother.
With the results obtained in this study, important progress has been made in the
generation of transgenic animals and specifically in the production of genetically
modified pigs for use in xenotransplantation experiments. The information gained
from the study demonstrate the influence of cell cycle synchronization on the
efficiency of somatic nuclear transfer. In addition to this, a new culture medium was
established which extended the number of cell divisions which non-transformed
primary cells could achieve under in vitro conditions. In this investigation, an efficient
protocol was developed for the transfection of fetal fibroblast cells which made it
possible to achieve targeted genetic modification of in these cells prior to using them
as nuclear transfer donors. Used together, these methodological improvements
resulted in the successful production of a heterozygous α1,3-galactosyltransferase
deficient pig.This animal and the new techniques provide a basis for generating new
transgenic pig lines carrying genes regulating human complement activity and clot
formation. Using this strategy and starting from the basis of the Gal negative pig, it
will be possible to generate multitransgenic pigs whose organs would be predicted to
avoid both hyper acute rejection (HAR) and acute vascular rejection (AVR) following
xenotransplantation into a primate model. If such tests meet expectations,
multitransgenic pigs in combination with appropriate levels of immunosuppression
may eventually serve as organ donors for humans, relieving the current shortage of
donor organs.

- 156 -
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9. Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
APC Antigenpräsentierende Zellen
AVR Akut Vaskuläre Reaktion
BAC Bacterial Artificial Chromosome
BR BlatozystenRate
ca. cirka
cm Centimeter
CMV CytoMegaloVirus
CXR Cellular Xenogeneic Rejection
DAF Decay Accelerating Factor
DBP DNA-Bindendes Protein
d.h. das heißt
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
DMSO Di-Methyl-Sulf-Oxid
DNA Desoxyribo Nucleotide Acid (Desoxyribonukleinsäure)
ds-RNA doppelsträngige Ribo Nucleotide Acid
eCG equine Chorionic Gonadrotropin
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acid
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
EtBr EthidiumBromid
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
FCS Fetal Calf Serum
- 189 -

- 190 -
FR FusionsRate
G0-Phase Gap0-Phase
G1-Phase Gap1-Phase
G2-Phase Gap2-Phase
Gal Galaktosyltransferase
h Stunden
Abkürzungsverzeichnis
HAC Human Artificial Chromosomes
HAR Hyperakute AbstoßungsReaktion
hCG human Chorionic Gonadotropin
Hprt Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
ICM Inner Cell Mass
ICSI Intracytoplasmatische Spermieninjektion
I.E. Internationale Einheiten
IGF I und II Insuline-like-Growth-Factor
IVF In-Vitro-Fertilisation
kb kilobasen
Ki Kontaktinhibition
kJ Kilo Joule
Kum Kumuluszellen
LB-Medium Luria Bertani-Medium
LEBAO Leibnitz Forschungslaboratorium für Biotechnologie und
künstliche Organe
LR-PCR Long Range- Polymerase Chain Reaction
lsg. Lösung

Abkürzungsverzeichnis
LTR Long Terminal Repeats
MAC Mammalian Artificial Chromosomes
mb Megabasen Paare
MCP Membrane Cofactor Protein
ml milliliter
M-Phase Mitose-Phase
m-RNA messenger- Ribo Nucleotide Acid
msec Milliseconds (Millisekunden)
MWM Molecular Weight Marker
N Normal
NCSU North Carolina State University (Medium)
NGA Nicht- AntiGal- Antikörper
nm nanometer
ORF Open-Reading-Frame
PAC P1 Artificial Chromosomes
PAF Porzine Adulte Fibroblasten
PBS Phosphat Buffered Saline (Medium)
PCR Polymerase Chain Reaction
PERV Porzine Endogene Retroviren
pFF porzine Foetale Fibroblasten
PV PopulationsVerdopplung
RISC RNA Induced Silencing Complex
RNA Ribo Nucleotide Acid (Ribonukleinsäure)
RNAi Ribo Nucleotide Acid interferenz
- 191 -

- 192 -
s. siehe
Abkürzungsverzeichnis
SATAC Satellite-DNA based Artificial Chromosomes
SCID Severe Combined ImmunoDefciency
SD Standard Deviation (Standardabweichung)
siRNA small interfering RNA
S-Phase Synthesephase
SR SerumReduktion
TBE-Puffer Tris-Borat-Ethylen-Diamin-Tetra-Acid
TE TrophEktoderm
TF Tissue Factor
TR TeilungsRate
U/min Umdrehungen pro Minute
V Volt
VNTR Variable Number of Tandem Repeats
x arithmetischer Mittelwert
XNA Xenogene Natürliche Antikörper
YAC Yeast Artificial Chromosomes
z.B. zum Beispiel

10. Anhang
Anhang
10.1. Medium für die Bakterienkultur und Zusätze
Tabelle 22: Zusammensetzung des Luria-Bertani-Flüssigmediums (LB-Medium)
Komponente Hersteller Menge
Trypton Sigma, T-2559 10 g
Hefe Extrakt DIFCO, 0127-15-1 5 g
NaCl Roth, 3957.2 10 g
H2O autoklav. 1 l
Kanamycin Sigma, K-0879 25 µg/ ml
- 193 -
Bei Verwendung von Agarplatten zur Aufzucht von Bakterien wurde Agar-Agar dem
Medium zugegeben (1,5% (w/v) Bacto- Agar, DIFCO,Detroit,Michigan,USA)

- 194 -
10.2. Zellkulturmedien
Anhang
Tabelle 23: Zusammensetzung der Zellkulturmedien
Komponente Hersteller Menge
DMEM (10x) Sigma, D-2554 100 ml
H2O autoklav. 839 ml
NaHCO3 Riedel, 31437 50 ml
L- Glutamine Sigma, G-5763 10 ml
β-Merkapthoethanol
Sigma, M-7522 1 ml
einer 7,5%
igen
Stocklsg.
einer 2,9%
igen
Stocklsg.
einer 1 M
Stocklsg.
Endkonzentration
im
Zellkulturmedium
4,5 mM
2 mM
0,1 mM
68 a bzw. 88 ml dieser Stocklösung wurden supplementiert mit:
einer
Penicillin G Sigma, PEN-NA Stocklsg.
bestehend
100 U/ml
Streptomycin
Sulfat
Sigma, S-6501
1 ml
aus 0,6g
Penicillin G
und 1g
Streptomycin
Sulfat
50 µg/ml
Fetal Calf
Serum (FCS)
Gibco, 10270-106
10ml
bzw.
30ml a
MEM Nonessential
Amino
Acid Solution
Sigma, M-7145 1ml
G418 b
einer 400
Gibco, 11811-031 200µl
mg/ml
konzentrierte
n Stocklsg.
800 µg/ml
a
: Bei Verwendung von T3-Medium
b
: Zur Herstellung des Selektionsmediums
Das Medium wurde mit HCl auf einen pH von 7,1- 7,4 abgepuffert.

Abbildungsverzeichnis
11. Abbildungsverzeichnis
- 195 -
Abbildung 1: Aktive Warteliste und Nierentransplantation. ..................................... - 1 -
Abbildung 2: Übersicht über den Verlauf der Komplementkaskade........................ - 8 -
Abbildung 3: AVR in der xenogenen Situation...................................................... - 12 -
Abbildung 4: Zusammenspiel von Thrombomodulin und Thrombin in der
physiologischen Situation. ............................................................................. - 13 -
Abbildung 5: Generierung transgener Schweine durch Mikroinjektion. ................ - 17 -
Abbildung 6: Generierung transgener Schweine durch somatischen
Kerntransfer................................................................................................... - 23 -
Abbildung 7: Erstellung transgener Tiere durch spermienvermittelten
Gentransfer. .................................................................................................. - 29 -
Abbildung 8: Enzymatische Aktivität der α1,3-Galaktosyltransferase. .................. - 40 -
Abbildung 9: siRNA-vermittelte Gen-Inaktivierung................................................ - 48 -
Abbildung 10: 25 Tage alter Schweinefoetus. ...................................................... - 54 -
Abbildung 11: Aus einem Explantat auswachsende Fibroblasten. ....................... - 54 -
Abbildung 12: Auswachsende Kumuluszellen am Tag 2 ...................................... - 55 -
Abbildung 13: Kumuluszelllayer am Tag 8 mit abgelöster Oozyte........................ - 56 -
Abbildung 14: Aufbau einer Neubauer- Zählkammer............................................ - 59 -
Abbildung 15: Schematische Darstellung der gewählten Zeitpunkte für die FACS-
Analyse während der Zellzyklussynchronisation. .......................................... - 61 -
Abbildung 16: Darstellung der Spenderzellpräparation. ....................................... - 65 -
Abbildung 17: Darstellung der Schritte beim somatischen Kerntransfer............... - 66 -
Abbildung 18: Elektroporationseinheit Gene Pulser II ( Biorad)............................ - 74 -
Abbildung 19: Plasmidkarte von pEGFP- N1........................................................ - 75 -
Abbildung 20: Darstellung des Aufbaus von PMW8- Neo, eingefügt sind bekannte
Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen. ............................................... - 78 -

- 196 -
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 21: Darstellung der wichtigsten Primer zur Charakterisierung G418-
resistenter Klone. .......................................................................................... - 81 -
Abbildung 22: Darstellung der Lage der Primer zur Charakterisierung G418-
resistenter Klone. .......................................................................................... - 81 -
Abbildung 23: Darstellung von homologen Sequenzen und der homologen
Rekombination von PMW8-Neo in den GGTA-1 Locus................................. - 90 -
Abbildung 24: Übersicht über die durchgeführten Versuchen. ............................. - 92 -
Abbildung 25: Wachstumskurve porziner foetaler Fibroblasten für zwei verschiedene
Zellkulturmedien. ........................................................................................... - 95 -
Abbildung 26: Wachstumskurve adulter hCD59- transgener porziner Fibroblasten
(Tier 179) in Abhängigkeit vom Kulturmedium............................................... - 97 -
Abbildung 27: Wachstumskurven porziner adulter Fibroblasten (Kontrolle nicht
transgen) in Abhängigkeit vom Kulturmedium. .............................................. - 97 -
Abbildung 28: Populationsverdopplungen porziner Kumuluszellen in Abhängigkeit
zum Zellkulturmedium. .................................................................................. - 98 -
Abbildung 29: Wachstumskurve aller eingesetzter Zelllinien in T3-Medium. ........ - 99 -
Abbildung 30: FACS- Analyse foetaler Fibroblasten kultiviert für 20 Passagen in
T3- Medium, verglichen mit Zellen aus D10-Medium (Passage 2). ............. - 100 -
Abbildung 31: Wachstumskurven in D10- Medium für alle eingesetzten Zelllinien im
Vergleich. .................................................................................................... - 101 -
Abbildung 32 Verteilung der Zellen auf die Phasen des Zellzyklus nach
unterschiedlichen Protokollen zur Zellzyklussynchronisation. .................... - 103 -
Abbildung 33: Kernzahlen in Blastozysten nach somatischem Kerntransfer in
Relation zur Spenderzellpräparation. ......................................................... - 108 -
Abbildung 34: Kernzahlen von Blastozysten nach somatischem Kerntransfer in
Abhängigkeit zur Spenderzellpräparation bei 40h maturierten Oozyten als
Empfängerzellen ........................................................................................ - 109 -
Abbildung 35: Abtrypsinisierte EGFP-transgene foetale Fibroblasten. ............... - 111 -
Abbildung 36: EGFP-positive Blastozyste nach somatischen Kerntransfer mit
transgenen Spenderzellen........................................................................... - 113 -
Abbildung 37: Restriktionsverdau von PMW8- Neo............................................ - 114 -

Abbildungsverzeichnis
- 197 -
Abbildung 38: Lage der Primer zum Nachweis von Vektorsequenzen am 5´-und
3´Ende......................................................................................................... - 116 -
Abbildung 39: Nachweis von Vektorsequenzen.................................................. - 117 -
Abbildung 40: Lage der Primer zur Amplifikation des 9kb- Fragments. .............. - 118 -
Abbildung 41 LR-PCR von Klon 24G5, deutlich ist die Bande bei 9 kb
zu erkennen................................................................................................. - 118 -
Abbildung 42: Darstellung der Lage der bei den Nested-PCRs
eingesetzten Primer..................................................................................... - 119 -
Abbildung 43: Ergebnisse der Nested-PCR hier als Beispiel an Klon 24G5
dargestellt.................................................................................................... - 119 -
Abbildung 44: PCR-Ergebnis Klon 24G5 (Spur 2) mit SRYP1/SRYP2............... - 123 -
Abbildung 45: Ultraschallbefund von Sau 18/15 an Tag 26 der Trächtigkeit. ..... - 125 -
Abbildung 46: Ultraschallbefund Sau 18/13 an Tag 42 der Trächtigkeit. ............ - 125 -
Abbildung 47: Klonferkel 1 und 3 im Alter von 18 Tagen.................................... - 127 -
Abbildung 48: Klonferkel 3 mit heterozygotem Knockout der α1,3-
Galaktosyltransferase.................................................................................. - 128 -
Abbildung 49: PCR Ergebnis mit der Primerkombination pMA1/pMA2. Alle 5
Klonferkel (Spur 3-7) weisen die erwartete Bande bei 325 bp auf............... - 130 -
Abbildung 50: LR-PCR Ergebnisse der Klonferkel 1-5. ...................................... - 131 -
Abbildung 51: Optimierte LR- PCR mit Ferkeln Nr. 2 und 3............................... - 132 -
Abbildung 52: Ergebnisse der Nested-PCR........................................................ - 133 -

- 198 -
12. Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Vergleichende Darstellung wichtiger renaler Parameter zwischen Mensch
und Schwein.................................................................................................... - 6 -
Tabelle 2: Übersicht über die bisher durch somatischen Kerntransfer generierten
Tiere und die dabei erzielten Effizienzen....................................................... - 21 -
Tabelle 3: Transgene Ferkel aus somatischem Kerntransfer mit genetisch
modifizierten Zellen ....................................................................................... - 25 -
Tabelle 4: Übersicht über die Effizienz zur Generierung transgener Schweine.... - 35 -
Tabelle 5: Überlebenszeiten xenotransplantierter Primaten ................................. - 38 -
Tabelle 6: Verschiedene Elektroporationsparameter, die für die Transfektion
eukaryontischer Zellen eingesetzt wurden .................................................... - 73 -
Tabelle 7: Übersicht über die verwendeten Primer............................................... - 84 -
Tabelle 8: Primer für die Geschlechtsdeterminierung eingesetzter
Spenderzellen ............................................................................................... - 84 -
Tabelle 9: Überblick über die zum Abstammungsnachweis
eingesetzten Mikrosatelliten .......................................................................... - 89 -
Tabelle 10: Verteilung der Zellen auf die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus
nach verschiedenen Kontaktinhibitionszeiten und nach Serumreduktion.... - 104 -
Tabelle 11: Darstellung der Reversibilität der Zellzyklussynchronisation nach Splitten
der Zellen, bzw. nach Überführung in Medium mit 10%FCS ....................... - 104 -
Tabelle 12: In-vitro-Entwicklung rekonstruierter porziner Kerntransfer-Embryonen in
Relation zur Reifungsdauer der Oozyten und der Kontaktinhibitionsdauer
foetaler Fibroblasten.................................................................................... - 106 -
Tabelle 13: Ergebnisse der in-vitro-Entwicklung rekonstruierter Embryonen in
Relation zur Spenderzellpräparation bei gleicher Oozytenmaturation......... - 107 -
Tabelle 14: Ergebnisse der Transfektionsexperimente mit einem
Reportergenkonstrukt.................................................................................. - 110 -
Tabelle 15: Übersicht zu Ergebnissen zum somatischen Kerntransfer mit EGFPtransgenen
Spenderzellen........................................................................... - 112 -

Tabellenverzeichnis
- 199 -
Tabelle 16: Übersicht über die Ergebnisse der Transfektion foetaler Fibroblasten mit
dem Knockout-Vektor PMW8- Neo. ............................................................ - 120 -
Tabelle 17: Ergebnisse der ersten Transferversuche von porzinen Kerntransfer-
Embryonen auf synchronisierte Empfängertiere. ........................................ - 121 -
Tabelle 18: Übersicht über das Geschlecht und die Geburtsgewichte der aus
somatischem Kerntransfer erhaltenen Ferkel.............................................. - 122 -
Tabelle 19: Transfer geklonter Embryonen aus serumreduzierten (1.+2.ET) und
α1,3- Gal-Ko (3.+4.ET) Spenderzellen ........................................................ - 124 -
Tabelle 20: Übersicht über den Entwicklungszustand der Klonferkel
nach der Geburt. ......................................................................................... - 126 -
Tabelle 21: Übersicht über die Ergebnisse der Mikrosatelliten-Analyse der
5 geklonten Ferkel, der Zelllinie und des Empfängertieres.......................... - 129 -
Tabelle 22: Zusammensetzung des Luria-Bertani-Flüssigmediums ................... - 193 -
Tabelle 23: Zusammensetzung der Zellkulturmedien ......................................... - 194 -

Danksagung
• Ich danke besonders Herrn Prof.Dr. H. Niemann für die Überlassung des Themas
und die große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit.
• Dem Leiter des Instituts für Tierzucht der FAL (Mariensee), Herrn Prof. Dr. sc. agr.
Dr. habil. Dr. h. c. F. Ellendorf, danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
• Mein besonderer Dank gilt Dr. W.A. Kues für die Einarbeitung ins Zellkulturlabor,
sowie für viele hilfreiche Anregungen und Ratschläge.
• Herrn Dr. M. Hölker danke ich für die konstruktive Zusammenarbeit, der
Durchführung des Kerntransfers und für den Spaß während der Doktorarbeit .
• Für die Generierung des Knockout-Vektors PMW8-Neo und die gute
Zusammenarbeit, danke ich besonders Frau Dr. M. Winkler und PD Dr. U. Martin.
• Besonders bedanken möchte ich bei Frau Dr. A. Lucas-Hahn und E. Lemme für
die Hilfe während der Transfertage und dem steten Nachschub an Süssigkeiten.
• Frau Dr. habil. C. Wrenzicky danke ich für manche geteilte Zigarette, verbunden
mit den Gesprächen die dabei stattfanden.
• Frau W. Mysegades für ihre immer gewährte kompetente Hilfe und die netten
Gespräche.
• Allen Mitarbeitern im Schweinestall, danke ich für die gute Pflege und
Beobachtung der Schweine, sowie für ihre umsichtige Mitarbeit vor, während und
nach den Operationen.
• Ein Dank auch an P. Klinc, R. Grossfeld und A.-L. Queißer für ihre tatkräftige Hilfe
bei der Geburt der Klonferkel und Übernahme manch nötiger Injektion der
Schweine.
• Vielen Dank an alle Mitarbeiter des Forschungsbereiches Biotechnologie für die
freundliche Arbeitsatmosphäre und tatkräftige Unterstützung.
• Der Arbeitsgruppe von Dr. Steffen Weigend, insbesondere Frau Dr. K. Reese und
Maiky, danke ich für die Durchführung der Arbeiten zur Mikrosatellitenanalyse der
Klonferkel.
• Ganz besonders möchte ich meiner Frau für ihre Hilfe und Unterstützung danken.
• Mein besonderer Dank gilt der DFG für die finanzielle Unterstützung.