Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen ...

Material und Methoden 18
Nach der Auftrennung der Proteine durch die Elektrophorese wurde das Gel mit Aqua dest.
gespült und anschließend 3 x 15 min bei 21 °C und 70 rpm auf einem Rotationsschüttler (New
Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) mit Zitronensäure-Phosphatpuffer (siehe
Kap. 2.2.10.) gewaschen. Danach wurde dieser durch den Stärkepuffer (siehe Kap. 2.2.11.)
ersetzt und das Gel bei gleichen Bedingungen für 1 h inkubiert. Anschließend wurde der
Puffer abgegossen und das Gel gut mit Aqua dest. gespült, bis die anhaftende Stärke von der
Oberfläche des Gels entfernt war. Die Färbung erfolgte in Lugolscher Lösung (siehe Kap.
2.2.7.) für 2 min.
Die Amylaseaktivitäts-Zonen sollten als helle Bereiche im dunkelblau angefärbten Gel
erscheinen.
2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine
Die durch die SDS-PAGE aufgetrennten Proteine sollten nach der Amylase-Aktivitätsfärbung
mit 0,1 %igem Silbernitrat nach Wiechmann (1993) angefärbt und detektiert werden. Alle
Einzelschritte der Färbung erfolgten unter Schwenken des Gels auf einem Rotationsschüttler
(New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) bei 80 rpm und RT.
Zur Fixierung der Proteine wurde das Gel nacheinander für 30 min in Fixierer A (siehe Kap.
2.2.13.1.), für 20 min in Fixierer B (siehe Kap. 2.2.13.2.) sowie für 20 min in Fixierer C
(siehe Kap. 2.2.13.3.) inkubiert. Zum Waschen wurde das Gel mit 100 ml Aqua dest. mittels
eines Folienschweißgerätes (Petra Electrinic vacufix electron FS500A) in eine Folie
eingeschweißt und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde eine Ecke der Folie
aufgeschnitten, und es wurden 0,5 mg Dithiothreitol (DTT) in 1 ml Aqua dest.
(Endkonzentration 5µg DTT/ml) zugegeben. Die Folie wurde verschweißt und das Gel für 20
min mit DTT zur Reduktion der Proteine inkubiert. Erneut wurde eine Ecke der Folie
aufgeschnitten und die DTT-Lösung durch 100 ml 0,1 %ige Silbernitat-Lösung ausgetauscht.
Zur Anbindung der Silber-Ionen an die Proteine wurde das Gel für 20 min in der Silbernitrat-
Lösung inkubiert. Danach wurde das Gel aus der Folie entnommen, mit Aqua dest. gespült
und zweimal mit Entwickler (siehe Kap. 2.2.13.4.) überschichtet. Sobald eine gute Anfärbung
der Proteinbanden zu erkennen war, wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,3 M
Zitronensäure-Lösung gestoppt. Anschließend wurde das Gel mit Aqua dest. gewaschen und
in einer 0,03 %igen Na2CO3-Lösung für 10 min konserviert.