Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen ...

Material und Methoden 17
Für die Proteinbestimmung wurden 50 µl Probe, 50 µl 2 M NaOH und 1 ml Bradford-
Reagenz (siehe Kap. 2.2.8.) in ein Eppendorfcup gegeben und sofort auf einem Whirl-Mixer
gemischt. Nach 90 s wurde die Absorption bei 595 nm in einem Photometer (Novaspec II
Farmacia) in Kunststoff-Einmalküvetten gegen den Leerwert (entsprechendes Medium oder
0,1 M Natrium-Phosphatpuffer) gemessen. Eine Eichkurve wurde mit Rinderserumalbumin
(Stammlösung 0,1 mg/ml in 1 M NaOH) im Bereich von 0 bis 10 µg erstellt.
2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen
2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert nach Laemmli,
1970)
Zur Analyse der extrazellulären Amylase wurden die mit Ammoniumsulfat-gefällten Proteine
mittels der SDS-PAGE aufgetrennt. Bei dieser Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese
wird das anionische Detergenz SDS (sodium dodecyl sulfate) benutzt. SDS überdeckt die
Eigenladungen der Proteine, so dass Micellen mit konstanter negativer Ladung pro
Masseneinheit entstehen. Dadurch werden bei dieser Methode die Proteine im Wesentlichen
nach ihrer Größe aufgetrennt (Lottspeich & Zobras, 1998).
Die Ammoniumsulfat-gefällten Proben (siehe Kap. 2.3.3.4.) wurden im Verhältnis 1:2 mit
dem Probenpuffer (siehe Kap. 2.2.12.) versetzt. Auf die Zugabe von Disulfidbrücken-
reduzierenden Substanzen und auf die Hitzedenaturierung der Proben wurde verzichtet, da
dies zum Verlust der Enzymaktivität führen würde.
Die Auftrennung erfolgte in einer vertikalen XCell SureLock TM Novex Mini-Cell
Elektrophoresekammer (Invitrogen). Als Laufpuffer diente der 1:20 verdünnte NuPAGE
MOPS-SDS-Laufpuffer (Invitrogen). Als Proteinmarker wurde ein vorgefärbter PageRuler
Marker (Fermentas) mit Molekulargewichten von 10 bis 170 kDa eingesetzt. Die Geltaschen
des fertigen NuPAGE 12 % Bis-Tris Gels (Invitrogen) wurden mit 12 µl Probe bzw. 5µl
Proteinmarker beladen. Die Auftrennung wurde bei 4 °C mit 150 V, 70 mA und 10 W für ca.
90 min durchgeführt.
2.3.4.2. Amylase-Aktivitätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert nach Kim
et al., 1995; Lacks & Springhorn, 1980)
Mit der Amylase-Aktivitätsfärbung kann die Amylaseaktivität der Proteinbanden im Gel nach
der SDS-PAGE nachgewiesen werden.