Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen ...

Material und Methoden 16
Bedingungen für 30 min zentrifugiert. Zur Entfernung der restlichen Mikroorganismen aus
den Überständen wurden diese mit Hilfe einer Pumpe (Jürgens) über einen Cellulose-Acetat-
Filter (Sartorius) mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. Die sterilen Überstände wurden
bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Zur Herstellung eines zellfreien Überstandes der Bacillus subtilis-Übernachtkultur wurden
von dieser jeweils 1 ml in zwei 1,5 ml Eppendorfcups überführt und in einer Zentrifuge
(Heraeus Instruments) bei 12.000 rpm abzentrifugiert. Anschließend wurden die Aliquots
vereinigt und sterilfiltriert (Minisart®-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius).
2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung
Das Aussalzen der Proteine durch die Zugabe von Ammoniumsulfat ist die älteste und die am
häufigsten angewendete Methode zur Proteinfällung. Ammoniumsulfat vergrößert
hydrophobe Effekte in der Lösung und fördert Proteinaggregationen über hydrophobe
Wechselwirkungen (Lottspeich & Zobras, 1998). Zur Fällung der Proteine wurde den
Kulturüberständen (siehe Kap. 2.2.3.3.) unter Rühren in einem Eisbad Ammoniumsulfat bis
zu einer Sättigung von 80 % zugegeben. Als Kontrollen wurden 250 ml unbeimpftes M1-
Medium mit 0,5 % Stärke und 250 ml unbeimpftes M1-Medium mit 1 % Maltose eingesetzt
und der gleichen Behandlung unterzogen. Mit diesen Kontrollen wurden zuvor auch die in
den Kap. 2.3.3.1 und 2.3.3.2 beschriebenen Arbeitsschritte durchgeführt.
Nach der vollständigen Zugabe des Ammoniumsulfates zu den Ansätzen wurden diese für
weitere 30 min in einem Eisbad gerührt und anschließend bei 10.000 x g für 40 min und bei
4 °C zentrifugiert (Beckman Avanti TM J-25). Die Überstände wurden entfernt und die Pellets
in jeweils 3 ml 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert. Zur Entsalzung wurden
die Proben in Dialyseschläuche mit einer Porengröße von 12-14 kDa überführt und über
Nacht unter Rühren bei 4 °C gegen 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert.
2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976)
Bei der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) wird der Farbstoff Serva Blau G-250
(Coomassie Brillantblau G-250) eingesetzt. Dieser Farbstoff bindet recht unspezifisch an
kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten der Proteine. Die Komplexbildung
zwischen Farbstoff und Protein bewirkt die Stabilisierung des Farbstoffes in seiner
unprotonierten, anionischen Sulfonat-Form, wodurch sich das Absorptionsmaximum von
Coomassie Brillantblau G-250 von 465 zu 595 nm verschiebt (Lottspeich & Zobras, 1998).
Somit kann der Farbstoff-Proteinkomplex photometrisch bei 595 nm bestimmt werden.