Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen ...

Material und Methoden 15
Entstehung der klaren Höfe ist auf die Hydrolyse des im Magermilchpulver enthaltenen
Caseins zurückzuführen. Die Platten wurden alle 2-4 Tage auf das Vorhandensein von klaren
Höfen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert.
2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin-B-Agar (modifiziert nach Kouker &
Jaeger, 1987)
Bei diesem Test wurden die olivenölhaltigen Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.4.) punkförmig
beimpft. Lipase-Aktivität konnte mittels Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 360 nm
anhand der Fluoreszenz des feiwerdenden und sich im Wasser lösenden Rhodamin B
nachgewiesen werden. Die Platten wurden bis zu vier Wochen lang inkubiert und alle 5-7
Tage mittels UV-Bestrahlung auf das Vorhandensein der Lipase-Aktivität untersucht.
2.3.3. Methoden zur Anreicherung und Bestimmung von Proteinen
2.3.3.1 Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium
Für die Produktion der extrazellulären Amylasen wurden sechs 100 ml Erlenmeyerkolben mit
jeweils 50 ml M1-Medium mit 10 g/l Maltose und sechs weitere 100 ml Erlenmeyerkolben
mit jeweils 50 ml M1-Medium mit 5 g/l löslicher Stärke befüllt. Diese Medien wurden mit
Stamm Bo 10-09 (siehe Tab. 2.1.) von einer Stammplatte (siehe Kap. 2.3.1) beimpft und bei
21°C auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker)
bei 120 rpm 3 Wochen lang inkubiert. Die Aufteilung der 300 ml der jeweiligen Medien in 50
ml Fraktionen wurde vorgenommen, weil aus Vorversuchen bekannt war, dass Stamm
Bo 10-09 in dem M1-Medium mit Stärke in großem Mediumvolumen nicht anwächst.
2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis-Kultur
Ein 50 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 20 ml LB-Medium (siehe Kap. 2.2.3.) gefüllt.
Anschließend wurden dem Medium 2 g/l unsterile lösliche Stärke hinzugegeben und das
Medium beimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (New
Brunswick Scientific innova 4000 Incubator Shaker) bei 100 rpm herangezogen.
2.2.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände
Die Flüssigkulturen (siehe Kap. 2.3.3.1) wurden in Zentrifugenbecher überführt und für 30
min bei 4 °C und 10.000 x g in einer Zentrifuge (Beckman Avanti TM J-25) zentrifugiert. Die
Überstände wurden in neue Zentrifugenbecher überführt und erneut unter gleichen