Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen ...

Material und Methoden 14
wurde von den Reinkulturen jeweils 200 µl in Eppendorfcups überführt und mit sterilem
87 %igen (w/v) Glycerin auf 1 ml aufgefüllt. Die auf diese Weise präparierten Stammkulturen
wurden bei -80 °C gelagert.
Zur Reaktivierung wurde aus den Eppendorfcups das aufgetaute Zellmaterial mit einer
Impföse entnommen und auf feste Nährböden (ASNIII/2 mit 10 g/l Fleischextrakt)
ausgestrichen. Die Platten wurden mit Parafilm gegen Austrocknen geschützt und bis zum
Anwachsen der Kulturen bei 21 °C inkubiert. Danach wurden diese Platten bei 4 °C gelagert
und dienten als Stammplatten zum Animpfen von flüssigen und festen Medien.
2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen
Im ersten Teil dieser Arbeit sollten zunächst die in Tab. 2.1 aufgeführten Stämme hinsichtlich
der Produktion von extrazellulären Enzymen untersucht werden.
2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994)
Bei diesem Test wurden die Stärke-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.1.) mit den zu
untersuchenden Stämmen von den Stammplatten (siehe Kap. 2.3.1.) punktförmig beimpft und
2-9 Tage bei 21 °C inkubiert. Danach wurden die Bakterien vorsichtig von den Agarplatten
entfernt und die Platten für 2 min mit Lugolscher Lösung (siehe Kap. 2.2.7.) überschichtet.
Das in dieser Lösung enthaltene Iod-Kaliumjodid färbt hochmolekulare Stärke dunkelblau an.
Amylase-positive Stämme spalten die Stärkepolymere in ihrer Umgebung. Dies führte dazu,
dass nach dem Abgießen der Lugolschen Lösung an den Stellen, wo sich diese Stämme
befanden, farblose Zonen auftraten.
2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach Schreier, 1969)
DNase-Toluidinblau-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.2.) wurden punktförmig beimpft und bei
21 °C inkubiert. DNase-positive Kolonien konnten durch die Bildung eines rosafarbenen Hofs
auf dem ansonsten blau gefärbten Agar identifiziert werden. Die Platten wurden alle 2-4 Tage
nach Farbveränderungen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert.
2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al.,
1994)
Magermilchpulverhaltige Agaplatten (siehe Kap. 2.2.4.3.) wurden punktförmig mit den zu
untersuchenden Stämmen beimpft und bei 21 °C inkubiert. Peptidase produzierende Kolonien
ließen sich durch die Entstehung eines klaren Hofes in dem trüben Agar identifizieren. Die