Untersuchungen zur Biochemie, Molekularbiologie - Uft - Universität ...

Studiengang Biologie 

Diplomarbeit 

Untersuchungen zur Biochemie, Molekularbiologie 

und Strukturaufklärung der Pigmente des 

1. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Fischer 

Bakterienstammes T4 

2. Gutachter: Prof. Dr. Karl-Heinz Blotevogel 

Vorgelegt von Jan Erik Rau 

Bremen, im Oktober 2006

Für meinen Sohn 

„Die Wissenschaft fängt eigentlich erst da an 

interessant zu werden, wo sie aufhört.“ 

Justus von Liebig

Danksagung 

An dieser Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ulrich Fischer für die 

Bereitstellung meines Arbeitsplatzes, seine stete Hilfs- und Diskussionsbereitschaft 

bei der Anfertigung dieser Diplomarbeit sowie für die Bereitstellung eines 

interessanten Diplomarbeits-Themas bedanken. 

Herrn Prof. Dr. Karl-Heinz Blotevogel danke ich für sein Interesse und seine 

Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit als auch für seine Bereitschaft die 

vorliegende Arbeit zu begutachten. 

Mein Dank gilt außerdem allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern der 

Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie für die freundliche Arbeitsatmosphäre, 

Aufmerksamkeit und Hilfsbereitschaft. Besonders möchte ich mich bei Clemens 

Borkenstein, Annina Hube, Oliver Kelbratowski, Birgit Lübben, Helge Mühl, Jan 

Schrübbers und Wilbert Serrano für die stete Diskussions- und Hilfsbereitschaft 

bedanken. 

Besonderer Dank gilt auch Dr. Birgit Heyduck-Söller für ihre Hilfe bei der 

Durchführung der HPLC-Messungen und für ihre stete Hilfsbereitschaft. 

Großer Dank gilt auch Dr. Touraj Shokati (AG Prof. Dr. Montforts) für die Hilfe bei der 

Durchführung der Chromatographie sowie der NMR-Messungen. Mein Dank gilt auch 

allen anderen Mitgliedern der AG für die freundliche Arbeitsatmosphäre. 

Dorit Kemken (AG Prof. Dr. Leibfritz) gilt besonderer Dank für die Durchführung der 

MS-Messungen sowie für ihre Hilfe bei der Auswertung der MS-Spektren. 

Meiner Freundin Claudia Kolbeck danke ich für ihre Unterstützung und ihr großes 

Verständnis.

Inhaltsverzeichnis _____________________________ _ _ 

Inhaltsverzeichnis 

Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................................i 

1. Einleitung..............................................................................................................1 

1.1 Phylogenie ..............................................................................................................1 

1.2 Theoretische Grundlagen .......................................................................................2 

1.2.1 Kolonie- und Zellmorphologie ..............................................................................2 

1.2.2 Beweglichkeit ..................................................................................................... 2 

1.2.3 Wachstum............................................................................................................3 

1.2.4 Sauerstoffbedarf, Gärung und Nitratatmung .......................................................3 

1.2.5 Temperatur, pH-Wert und Salinität ......................................................................4 

1.2.6 Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor ................................................................. 5 

1.2.7 Wachstumsfaktoren und Spurenelemente...........................................................6 

1.2.8 Enzyme ...............................................................................................................6 

1.2.9 Carotinoide ..........................................................................................................7 

1.2.10 GC-Gehalt der DNA und 16S-rDNA-Sequenz ................................................... 8 

1.3 Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides-Gruppe (CFB-Gruppe)...............................9 

1.4 Ziel der Arbeit ..................................................................................................... 11 

2. Material und Methoden ................................................................................. 12 

2.1 Kulturmedien ...................................................................................................... 12 

2.1.1 PS/2-Medium ................................................................................................... 12 

2.1.2 MSM und MSM + ................................................................................................ 12 

2.1.3 LB (Luria-Bertani)-Medium ............................................................................... 13 

2.1.4 Kulturmedium für den API 50 CH-Test ............................................................ 13 

2.1.5 MacConkey-Agar.............................................................................................. 13 

2.1.6 Nährmedien für den Nachweis von extrazellulären Enzymen........................... 14 

2.1.6.1 Feste Nährmedien für den Nachweis von extrazellulären Enzymen ............. 14 

2.1.6.2 Flüssigmedium für den Urease-Nachweis ..................................................... 16 

2.2 Lösungen und Puffer ........................................................................................... 16 

2.2.1 Lösungen.......................................................................................................... 16 

2.2.1.1 SL 8-Lösung ................................................................................................. 16 

2.2.1.2 7-Vitamine-Lösung......................................................................................... 17 

2.2.1.3 DNA-Stammlösung ....................................................................................... 17 

2.2.2 Puffer................................................................................................................ 17 

2.2.2.1 Clark und Labs Pufferlösungen, pH 8,0 - 10,2............................................... 17 

2.2.2.2 Clark und Labs Pufferlösungen, pH 5,8 - 8,0 ................................................ 18 

2.2.2.3 Zitronensäure/Natriumcitrat-Pufferlösung, pH 3,0 - 6,0 ................................. 18 

2.2.2.4 Tris-HCl-Pufferlösung, pH 6,4 - 8,3 ............................................................... 18 

2.3 Herkunft der Probe............................................................................................... 19 

2.4 Konservierung der Reinkulturen........................................................................... 19 

2.5 Bearbeitung der Proben....................................................................................... 19 

2.6 Anlegung eines Bakterienmaterialdepots ............................................................ 19


2.7 Anzucht der Vorkulturen ...................................................................................... 20 

2.8 Kultivierung der Bakterien.................................................................................... 20 

2.8.1 Anzucht der Versuchskulturen in Flüssigmedium ............................................ 20 

2.8.2 Anzucht der Versuchskulturen auf festen Nährböden ...................................... 20 

2.9 Morphologische Untersuchungen ........................................................................ 21 

2.9.1 Koloniemorphologie.......................................................................................... 21 

2.9.2 Lichtmikroskopische Untersuchungen .............................................................. 21 

2.9.2.1 Ermittlung der Zellmorphologie .................................................................... 21 

2.9.2.2 Nachweis der Beweglichkeit der Zellen ......................................................... 22 

2.9.2.2.1 Überprüfung des Vorhandenseins von schwimmender Fortbewegung....... 22 

2.9.2.2.2 Überprüfung des Vorhandenseins von gleitender Fortbewegung............... 22 

2.9.2.3 Bestimmung der Gesamtzellzahl ................................................................... 22 

2.9.3 Färbetechniken................................................................................................. 23 

2.9.3.1 Schleimkapsel-Färbetechniken...................................................................... 23 

2.9.3.1.1 Schleimkapsel-Färbung mit Tinte .............................................................. 23 

2.9.3.1.2 Schleimkapsel-Färbung mit Nigrosin .......................................................... 24 

2.9.3.1.3 Schleimkapsel-Färbung mit Kongorot und Methylenblau............................ 24 

2.9.3.1.4 Schleimkapsel-Färbung mit Kristallviolett und Kupfersulfat ........................ 24 

2.9.3.2 Gram-Färbung ............................................................................................... 25 

2.9.4 KOH-Test ......................................................................................................... 26 

2.10 Physiologische Untersuchungen ....................................................................... 26 

2.10.1 Wachstumsversuch in PS/2-Flüssigmedium................................................... 26 

2.10.2 Wachstum auf MacConkey-Agar .................................................................... 27 

2.10.3 Sauerstoffbedarf, Gärverhalten und Nitratatmung .......................................... 27 

2.10.3.1 Zelluläre Farbänderung bei Wachstum mit unterschiedlicher 

Sauerstoffversorgung .................................................................................. 28 

2.10.4 Temperaturoptimum ........................................................................................29 

2.10.5 pH-Wert-Optimum........................................................................................... 30 

2.10.5.1 pH-Optimum in gepuffertem, modifiziertem MSM + -Flüssigmedium ............. 30 

2.10.5.2 pH-Wert-Verschiebung in ungepuffertem PS/2-Flüssigmedium .................. 30 

2.10.6 Salinitäts-Optimum ......................................................................................... 31 

2.10.7 Substratverwertung......................................................................................... 31 

2.10.7.1 Verwertung unterschiedlicher C-Quellen ..................................................... 31 

2.10.7.2 GN2 Microplate TM -Testsystem..................................................................... 33 

2.10.7.3 API 50 CH-Testsystem ................................................................................ 34 

2.10.8 Verwertung unterschiedlicher Aminosäuren als einzige C- und N-Quelle....... 34 

2.10.9 Verwertung unterschiedlicher N-Quellen ........................................................ 34 

2.10.10 Verwertung unterschiedlicher Phosphatkonzentrationen.............................. 35 

2.10.10.1 Zelluläre Farbänderung bei Wachstum mit unterschiedlichen 

Phosphatkonzentrationen ...........................................................................35 

2.10.11 Vitaminbedürftigkeit ...................................................................................... 36 

2.10.12 Spurenelementabhängigkeit ......................................................................... 36 

2.11 Biochemische Untersuchungen ......................................................................... 37 

2.11.1 Antibiotika-Resistenzen .................................................................................. 37


2.11.2 Enzymnachweise............................................................................................ 38 

2.11.2.1 Katalase-Nachweis ...................................................................................... 38 

2.11.2.2 Oxidase-Nachweis....................................................................................... 38 

2.11.2.3 Agarase-Nachweis....................................................................................... 39 

2.11.2.4 Amylase-Nachweis ...................................................................................... 39 

2.11.2.5 Cellulase A-Nachweis.................................................................................. 39 

2.11.2.6 Cellulase B-Nachweis.................................................................................. 39 

2.11.2.7 DNAse-Nachweise....................................................................................... 39 

2.11.2.7.1 DNAse-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agarplatten ............................... 40 

2.11.2.7.2 DNAse-Nachweis auf DNA-Agarplatten.................................................... 40 

2.11.2.8 Esterase-Nachweis...................................................................................... 40 

2.11.2.9 Gelatinase-Nachweis................................................................................... 40 

2.11.2.10 Lecithinase-Nachweis................................................................................ 41 

2.11.2.11 Lipase-Nachweis ....................................................................................... 41 

2.11.2.12 Peptidase-Nachweis .................................................................................. 41 

2.11.2.13 RNAse-Nachweis....................................................................................... 41 

2.11.2.14 Urease-Nachweise .................................................................................... 41 

2.11.2.14.1 Urease-Nachweis auf festem Nährboden ............................................... 42 

2.11.2.14.2 Urease-Nachweis in flüssigem Nährmedium .......................................... 42 

2.11.2.15 Xylanase-Nachweis ................................................................................... 42 

2.11.3 API 10S-Testsystem....................................................................................... 43 

2.11.4 Säurebildung aus Kohlenhydraten.................................................................. 43 

2.12 Chemotaxonomische Untersuchungen.............................................................. 44 

2.12.1 Untersuchungen zur Bestimmung von Pigmenten aus Bakterienstamm T4... 44 

2.12.1.1 Flexirubin-Test............................................................................................. 44 

2.12.1.2 Methanolextraktion der Pigmente ................................................................ 44 

2.12.1.3 Dünnschichtchromatographie (DC).............................................................. 45 

2.12.1.4 Säulenchromatographie (SC) ...................................................................... 46 

2.12.1.5 Umkehrphasen-Hoch-Leistungs-Flüssig-Chromatographie (Reversed- 

phase-HPLC)............................................................................................... 47 

2.12.1.6 UV/VIS-Spektralphotometrie........................................................................ 49 

2.12.1.7 Massenspektrometrie (MS).......................................................................... 49 

2.12.1.8 Kernresonanzspektroskopie (NMR)............................................................. 50 

2.13 Molekularbiologische Untersuchungen.............................................................. 51 

2.13.1 Bestimmung des GC-Gehalts der DNA .......................................................... 51 

2.13.1.1 Isolierung der chromosomalen DNA ............................................................ 52 

2.13.1.2 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Qualität ..................................... 52 

2.13.1.3 Bestimmung des Schmelzpunktes (Tm) der DNA......................................... 54 

2.13.2 Bestimmung der 16S-rDNA-Sequenz............................................................. 55 

2.13.2.1 Isolierung der chromosomalen DNA ............................................................ 55 

2.13.2.2 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Qualität ..................................... 55 

2.13.2.3 Durchführung einer Standard-PCR.............................................................. 56 

2.13.2.4 Aufreinigung der chromosomalen DNA ....................................................... 57 

2.13.2.5 Sequenzierung der 16S-rDNA ..................................................................... 57


2.13.2.6 Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz mit Datenbanken................................... 57 

2.13.2.7 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen........................................ 58 

2.14 Bezugsquellen der verwendeten Chemikalien................................................... 58 

3. Ergebnisse.......................................................................................................... 59 

3.1 Morphologische Untersuchungen ........................................................................ 59 

3.1.1 Koloniemorphologie.......................................................................................... 59 

3.1.2 Lichtmikroskopische Untersuchungen .............................................................. 60 

3.1.2.1 Ermittlung der Zellmorphologie...................................................................... 60 

3.1.2.1.1 Pleomorphismus......................................................................................... 62 

3.1.2.2 Nachweis der Beweglichkeit der Zellen ......................................................... 64 

3.1.2.2.1 Überprüfung des Vorhandenseins von schwimmender Fortbewegung....... 64 

3.1.2.2.2 Überprüfung des Vorhandenseins von gleitender Fortbewegung............... 64 

3.1.2.3 Bestimmung der Gesamtzellzahl ................................................................... 66 

3.1.2.4 Färbetechniken.............................................................................................. 67 

3.1.2.4.1 Schleimkapsel-Färbetechniken................................................................... 67 

3.1.2.4.2 Gram-Färbung ............................................................................................ 68 

3.1.2.5 KOH-Test....................................................................................................... 68 

3.2 Physiologische Untersuchungen ......................................................................... 69 

3.2.1 Wachstumsversuch in PS/2-Flüssigmedium..................................................... 69 

3.2.2 Wachstum auf MacConkey-Agar ...................................................................... 71 

3.2.3 Sauerstoffbedarf, Gärverhalten und Nitratatmung ............................................ 71 


Sauerstoffversorgung .................................................................................... 72 

3.2.4 Temperaturoptimum ......................................................................................... 75 

3.2.5 pH-Wert-Optimum............................................................................................. 77 

3.2.5.1 pH-Optimum in gepuffertem, modifiziertem MSM + -Flüssigmedium ............... 77 

3.2.5.2 pH-Optimum in ungepuffertem PS/2-Flüssigmedium..................................... 78 

3.2.6 Salinitäts-Optimum ........................................................................................... 79 

3.2.7 Substratverwertung........................................................................................... 81 

3.2.7.1 Verwertung unterschiedlicher C-Quellen ....................................................... 81 

3.2.7.2 GN2 Microplate TM -Testsystem...................................................................... 83 

3.2.7.3 API 50 CH-Testsystem .................................................................................. 86 

3.2.8 Verwertung unterschiedlicher Aminosäuren als einzige C- und N-Quelle......... 88 

3.2.9 Verwertung unterschiedlicher N-Quellen .......................................................... 88 

3.2.10 Verwertung unterschiedlicher Phosphatkonzentrationen................................ 92 


Phosphatkonzentrationen ............................................................................. 93 

3.2.11 Vitaminbedürftigkeit ........................................................................................ 95 

3.2.12 Spurenelementabhängigkeit ........................................................................... 96 

3.3 Biochemische Untersuchungen ........................................................................... 97 

3.3.1 Antibiotika-Resistenzen .................................................................................... 97 

3.3.2 Enzymnachweise.............................................................................................. 99 

3.3.2.1 Urease-Nachweis in flüssigem Nährmedium ............................................... 102


3.3.3 API 10S-Testsystem....................................................................................... 102 

3.3.4 Säurebildung aus Kohlenhydraten.................................................................. 104 

3.4 Chemotaxonomische Untersuchungen.............................................................. 105 

3.4.1 Untersuchungen zur Bestimmung von Pigmenten aus Bakterienstamm T4... 105 

3.4.1.1 Flexirubin-Test............................................................................................. 105 

3.4.1.2 Dünnschichtchromatographie (DC).............................................................. 105 

3.4.1.3 Säulenchromatographie (SC) ...................................................................... 105 


phase-HPLC)............................................................................................... 106 

3.4.1.5 UV/VIS-Spektralphotometrie........................................................................ 107 

3.4.1.6 Massenspektrometrie (MS).......................................................................... 110 

3.4.1.7 Kernresonanzspektroskopie (NMR)............................................................. 117 

3.5 Molekularbiologische Untersuchungen.............................................................. 117 

3.5.1 Bestimmung des GC-Gehalts der DNA .......................................................... 117 

3.5.2 Bestimmung der 16S-rDNA-Sequenz............................................................. 118 

3.5.3 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen........................................... 122 

4. Diskussion ........................................................................................................ 124 

4.1 Morphologie....................................................................................................... 124 

4.1.1 Vergleich der Morphologie von Bakterienstamm T4 mit anderen Genera .......124 

4.2 Physiologie ........................................................................................................ 126 

4.2.1 Vergleich der Physiologie von Bakterienstamm T4 mit anderen Genera........ 126 

4.3 Biochemie.......................................................................................................... 131 

4.3.1 Vergleich der Biochemie von Bakterienstamm T4 mit anderen Genera ......... 131 

4.4 Chemotaxonomie ............................................................................................... 134 

4.4.1 Pigmentausstattung von Bakterienstamm T4 im Vergleich mit anderen 

Genera............................................................................................................ 134 

4.5 Molekularbiologie................................................................................................ 137 

4.5.1 Vergleich des GC-Gehalts der DNA sowie der 16S-rDNA-Sequenz von 

Bakterienstamm T4 mit anderen Genera........................................................ 137 

4.6 Merkmalsvergleich mit naheverwandten Genera und phylogenetische 

Einordnung von Bakterienstamm T4 .................................................................. 140 

4.7 Ausblick .............................................................................................................. 144 

5. Zusammenfassung ......................................................................................... 146 

6. Anhang .............................................................................................................. 148 

7. Literatur ............................................................................................................. 149

Abkürzungsverzeichnis_______________________________ i 

Abkürzungsverzeichnis 

Abb. Abbildung 

Aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser 

BLAST basic local alignment search tool 

bp Basenpaare 

CFB Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides 

d Tag 

DAD Dioden-Array-Detektor 

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) 

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat 

dsDNA double strain desoxyribonucleic acid (doppelsträngige 

Desoxyribonukleinsäure) 

DSMZ Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und 

Zellkulturen 

EDTA Ethylendiamintetraacetat 

EI Elektronenstoß-Ionisation 

ERG Eppendorfreaktionsgefäß 

ESI Elektrospray-Ionisation 

FISH Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung 

g Gramm 

g Erdbeschleunigung 

GC Guanosin und Cytosin 

h Stunde 

HPLC high performance liquid chromatography 

(Hoch-Leistungs-Flüssig-Chromatographie) 

i.d.R. in der Regel 

l Liter 

M molar 

min Minute 

mg Milligramm 

mM Millimolar 

mol Mole 

MSM Mineralsalzmedium 

µg Mikrogramm 

µl Mikroliter 

µm Mikrometer 

ml Milliliter 

nm Nanometer 

OD Optische Dichte 

OT Objektträger 

p. a. zur Analyse 

PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) 

rDNA ribosomal desoxyribonucleic acid (ribosomale 

Desoxyribonucleinsäure) 

Rf-Wert retention factor (Retentionsfaktor) 

RNA ribonucleic acid (Ribonucleinsäure) 

rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) 

sec Sekunde 

Tab. Tabelle 

Tween-20 Polyethylenglykol-sorbitan-monolaurat

Abkürzungsverzeichnis_______________________________ i 

U Unit (µmol/min) 

UFT Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie 

UV/VIS ultraviolet/visible (Ultraviolett/sichtbar) 

V Volt 

v/v volume per volume (Volumen pro Volumen) 

w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen) 

λmax Wellenlänge des Absorptionsmaximums

Einleitung ___________________________ 1 

1. Einleitung 

1.1 Phylogenie 

Die Phylogenie beschäftigt sich mit der evolutionären Stammesgeschichte von 

Mikroorganismen und versucht, deren evolutionären Verwandtschaftsgrad in 

Erfahrung zu bringen (STEINBÜCHEL und OPPERMANN-SANIO, 2003). 

Die phylogenetischen Beziehungen zwischen Bakterien werden heute immer 

häufiger durch Vergleiche der 16S-rDNA-Sequenzen von Bakterienstämmen und 

darauf basierenden Stammbäumen dargestellt. Diese lassen i.d.R. bereits 

weitreichende Rückschlüsse auf den Verwandtschaftsgrad von zwei Bakterien zu, 

reichen jedoch alleine nicht für eine vollständige Beschreibung aus. Daher wird 

mittels der polyphasischen Taxonomie versucht möglichst viele Zellkomponenten für 

eine umfassende Charakterisierung und Bewertung einzubringen. Die Analyse 

umfasst phänotypische Eigenschaften (z.B. Morphologie, Gram-Verhalten, 

Physiologie, Enzymologie, Serologie), chemotaxonomische Marker (z.B. 

Fettsäurezusammensetzung, Mykolsäuren, polare Lipide, Chinone, Polyamine, 

Zellwandzusammensetzung, Exopolysaccharide) sowie Daten von der Gesamt-DNA 

(z.B. Genomgröße, Verhältnis von G+C zu A+T, Restriktionsmuster, DNA-DNA- 

Hybridisierung), DNA-Fragmenten (z.B. PCR-basierte Fingerabdrucksmethoden, 

Hybridisierung mit spezifischen Sonden, Sequenzierung), RNA (z.B. 16S-rDNA- 

Sequenzen, Profile kleiner RNA Moleküle) und Proteinen (z.B. Elektropherogramme 

von Gesamtprotein oder subzellulären Fraktionen, Enzymmuster) (STEINBÜCHEL 

und OPPERMANN-SANIO, 2003). 

Die wichtigste taxonomische Einheit ist dabei die Art oder Spezies, worunter eine 

distinkte Gruppe von Stämmen verstanden wird, die sich in wichtigen 

phänotypischen Eigenschaften sehr ähnlich sind, aber durchaus geringfügige 

Unterschiede in anderen, als weniger wichtig eingestuften Merkmalen aufweisen 

können. (STEINBÜCHEL und OPPERMANN-SANIO, 2003). 

Eine solche Identifizierung eines unbekannten Bakteriums führt nur dann zum Erfolg, 

wenn die Merkmale der zu untersuchenden Art weitgehend mit denen einer schon 

beschriebenen Art übereinstimmen. Ist dies nicht der Fall, kann davon ausgegangen 

werden, dass es sich möglicherweise um eine neue Art oder Gattung handelt 

(SÜßMUTH et al., 1999).

Einleitung ___________________________ 2 

1.2 Theoretische Grundlagen 

In diesem Kapitel wird auf die theoretischen Grundlagen einiger, in der vorliegenden 

Diplomarbeit realisierter, morphologischer, physiologischer, chemotaxonomischer 

und molekularbiologischer Versuche eingegangen. 

1.2.1 Kolonie- und Zellmorphologie 

Kolonien sind die sichtbare Menge von Bakterienzellen, die sich durch aufeinander 

folgende Teilungen aus einer oder wenigen Zellen gebildet haben. Größe, Form, 

Konsistenz, Farbe sowie einige andere Merkmale hängen von der Art des 

Organismus ab; folglich ist die Koloniemorphologie artspezifisch und eignet sich 

somit zur Klassifizierung von Bakterien (MADIGAN et al., 2001). 

Auch die Morphologie der Bakterienzellen ist weit gefächert, wobei die meisten im 

Labor kultivierbaren Bakterien entweder eine gerade oder gewundene 

stäbchenförmige Zellform besitzen (Stäbchen, Vibrionen, Spirillen) oder kugelrund 

sind (Kokken). Die Zelldimensionen betragen bei den meisten Bakterien 0,5 bis 3 

µm. Es gibt aber auch Abweichungen von den genannten Zellformen, z.B. gestielte 

oder mit Fortsätzen versehene oder hyphenbildende Bakterien. Weiterhin gibt es 

viele Bakterien, die sehr unterschiedlich beschaffene Zellaggregate, wie Zellfäden, 

-pakete oder -flocken ausbilden können. Auch bezüglich der Zellgröße können sich 

Prokaryonten stark voneinander unterscheiden. Die Zellmorphologie einer 

Bakterienart ist folglich ein für sie charakteristisches Merkmal (STEINBÜCHEL und 

OPPERMANN-SANIO, 2003). 

1.2.2 Beweglichkeit 

Viele Mikroorganismen bilden fädige Strukturen auf der Zelloberfläche aus, die der 

Fortbewegung oder der Kommunikation dienen. Pili (Singular Pilus) oder Fimbrien 

(Singular Fimbrium) sind unbeweglich, meist gerade und dienen z.B. dem Transfer 

von Nukleinsäuren (CYPIONKA, 2003) oder der Fortbewegung (BURCHARD et al., 

1990). Die ebenfalls der Fortbewegung dienenden Geißeln oder Flagellen sind nach 

dem 9 + 2 -Muster aus Mikrofibrillen aufgebaut (CYPIONKA, 2003). 

Die Art der Bewegung kann erste Hinweise auf die Anordnung der Geißeln geben. 

Eine langsame, taumelnde Fortbewegung deutet auf peritriche Begeißelung hin, 

während eine schnelle, geradlinige Bewegung mit raschem Wechsel zwischen vorund 

rückwärts für polar monotrich begeißelte Bakterien typisch ist (RÜGER, 1993).

Einleitung ___________________________ 3 

Allerdings sind nicht alle schwimmenden Bakterien begeißelt. Schwimmende 

Fortbewegung ist nur für die Mikroorganismen vorteilhaft, die in wässrigen Habitaten 

leben. Viele Mikroorganismen leben jedoch in einer Umwelt mit einem niedrigen 

Wassergehalt oder einem sich ständig ändernden Feuchtigkeitsniveau. Diese 

Biotope schließen auch Biofilme, mikrobielle Matten und Böden mit ein, wo die 

Erschließung einer neuen Nahrungsressource mittels schwimmender Fortbewegung 

unausführbar ist. Viele Prokaryoten haben daher eine andere Methode der aktiven 

Bewegung über feste Oberflächen entwickelt, das Gleiten (SPORMANN, 1999). 

1.2.3 Wachstum 

In der Mikrobiologie wird das Wort Wachstum als Zunahme der Zellzahl definiert. 

Mikroorganismen wachsen exponentiell, wobei sich die Zellzahl in regelmäßigen 

Abständen verdoppelt. So entstehen in kurzer Zeit sehr große Zellpopulationen. In 

einem geschlossenen System zeigt ein Einzeller verschiedene Wachstumsphasen. 

Bevor das Wachstum beginnen kann, müssen sich die Bakterien zunächst an das 

neue Milieu gewöhnen; dies geschieht in der Anlaufphase (lag-Phase). Nach einer 

sich anschließenden exponentiellen Phase des Wachstums haben die Organismen 

entweder kein Substrat mehr zur Verfügung oder sie werden durch ihre eigenen 

Abfallstoffe blockiert, was den Beginn der stationären Phase auslöst. Wenn die 

Inkubation fortgeführt wird, nachdem eine Population die stationäre Phase erreicht 

hat, fangen die Bakterien nach einer bestimmten Zeit an abzusterben. Diese 

Absterbephase verläuft wieder exponentiell, allerdings ist die Geschwindigkeit des 

Zelltodes in den meisten Fällen viel niedriger als die des exponentiellen Wachstums 

(MADIGAN et al., 2001). 

1.2.4 Sauerstoffbedarf, Gärung und Nitratatmung 

Mikroorganismen unterscheiden sich in ihrem Bedarf an bzw. ihrer Toleranz für 

Sauerstoff. Entsprechend lassen sie sich verschiedene Gruppen einteilen (siehe 

Tab. 1.1), was zu ihrer Charakterisierung eingesetzt wird (MADIGAN et al., 2001).

Einleitung ___________________________ 4 

Tab. 1.1: Sauerstoffbeziehungen von Mikroorganismen (modifiziert nach MADIGAN et al., 

2001) 

Gruppe 

Beziehung zu Sauerstoff Stoffwechseltyp 

Aerobier 

obligat erforderlich aerobe Atmung 

fakultativ nicht erforderlich, wachsen Aerobe, anaerobe Atmung, 

aber besser mit Sauerstoff Gärung 

mikroaerophil erforderlich, aber in 

niedrigerer Konzentration als 

in der Atmosphäre 

aerobe Atmung 

Anaerobier 

obligat schädlich oder letal Gärung oder anaerobe 

Atmung 

fakultativ nicht erforderlich, wachsen 

aber besser ohne Sauerstoff 

Gärung 

Die Fähigkeit zur Durchführung einer dissimilatorischen Nitrat-Reduktion wird 

ebenfalls zur Charakterisierung von Bakterien eingesetzt, da sie spezifisch für einen 

Stamm ist. Bei der dissimilatorischen Nitrat-Reduktion wird Nitrat als 

Elektronenakzeptor für einen Atmungsprozess genutzt (CYPIONKA, 2003). Es 

werden je nach den Endprodukten zwei Wege unterschieden, die Denitrifinkation, 

welche zur Bildung von Stickstoff führt sowie die Nitratammonifikation, die i.d.R. zur 

Bildung von Ammonium-Ionen führt (SCHLEGEL, 1992). 

1.2.5 Temperatur, pH-Wert und Salinität 

Die Temperatur ist einer der wichtigsten Umweltfaktoren, welcher das Wachstum 

und das Überleben von Mikroorganismen beeinflusst (MADIGAN et al., 2001). Sie 

wachsen nur innerhalb eines bestimmten Temperaturbereichs, dessen Lage je nach 

Organismus sehr unterschiedlich sein kann und der für die gegebene Art meist eine 

Spanne von etwa 30 - 35 °C umfasst; folglich lässt sich dieses Merkmal zur 

Klassifizierung von Mikroorganismen einsetzen (BAST, 1999). Dabei stellt die untere 

Wachstumsgrenze das Temperaturminimum, die obere das Temperaturmaximum 

dar (MADIGAN et al., 2001). Der für die Bebrütung geeignete Bereich ist jedoch viel 

kleiner. Das Temperaturoptimum für das Wachstum eines Mikroorganismus, d.h. die 

Temperatur, bei welcher der Organismus mit maximaler Rate wächst, liegt oft nur 

wenige Grad unter dem Temperaturmaximum, bei der die Bakterienzellen bereits 

geschädigt werden, und das Wachstum zum Stillstand kommt (BAST, 1999). Obwohl 

die Übergänge von Mikroorganismen mit sehr niedrigen Temperaturoptima zu denen

Einleitung ___________________________ 5 

mit hohen fließend sind, lassen sich hinsichtlich des Temperaturoptimums grob vier 

Gruppen unterscheiden. Psychrophile besitzen niedrige Temperaturoptima (5 - 15 

°C), Mesophile mittlere (15 - 45 °C), Thermophile hohe (45 - 80 °C) und 

Hyperthermophile sehr hohe (80 - 113 °C) (MADIGAN et al., 2001). 

Auch die Azidität oder Alkalität eines Lebensraums kann das mikrobielle Wachstum 

stark beeinflussen. Einige Mikroorganismen haben sich so entwickelt, dass sie am 

besten bei niedrigen pH-Werten zwischen 0 und 6 (Azidophile) oder hohen zwischen 

8 und 14 (Alkaliphile) wachsen können, die meisten wachsen jedoch am besten bei 

pH-Werten zwischen 6 und 8 (Neutrophile). Das pH-Wert-Optimum ist häufig 

spezifisch und lässt sich somit zu Charakterisierung von Mikroorganismen einsetzen 

(MADIGAN et al., 2001). 

Ebenso wie die richtige Temperatur sowie der richtige pH-Wert ist auch die 

Verfügbarkeit von Wasser essentiell für das Überleben von Mikroorganismen. Da 

diese Verfügbarkeit u.a. von in dem Wasser gelösten Salzen abhängt, ist auch der 

Salzgehalt des umgebenden Milieus von großer Wichtigkeit. Je mehr Salze im 

Wasser gelöst sind, desto größer ist die Tendenz zur Dehydrierung der 

Bakterienzelle. Es gibt allerdings Mikroorganismen, die hohe Salzgehalte von bis zu 

30 % tolerieren können. Diese werden je nach ihren NaCl-Anforderungen als 

schwach (1 - 6 % NaCl), moderat (6 - 15 % NaCl) bzw. extrem halophil (15 - 30 % 

NaCl) bezeichnet. Mikroorganismen, die eine Salzkonzentration von bis zu 15 % in 

ihrer Umwelt tolerieren, aber besser ohne zusätzlich gelöstes NaCl wachsen 

können, werden als halotolerant bezeichnet, wohingegen solche, die nur bis zu einer 

NaCl-Konzentration von 1 % wachsen können, als nicht halophil bezeichnet werden. 

Da dieses Merkmal von Art zu Art variiert, lässt es sich zur Klassifizierung von 

Bakterien einsetzen (MADIGAN et a., 2001). 

1.2.6 Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor 

Die meisten Prokaryoten benötigen eine organische Verbindung als 

Kohlenstoffquelle (C-Quelle), sie werden daher als chemoorganotroph bezeichnet. 

Chemolithotrophe Prokaryoten können hingegen anorganische Verbindungen als C- 

Quelle nutzen (MADIGAN et al., 2001). 

Ernährungsstudien haben gezeigt, dass Bakterien verschiedene organische 

Kohlenstoffverbindungen assimilieren und zum Aufbau neuen Zellmaterials 

verwenden können. Aminosäuren, Fettsäuren, organische Säuren, Zucker, Alkohole, 

Stickstoffbasen, aromatische sowie zahlreiche andere organische Verbindungen

Einleitung ___________________________ 6 

können von dem ein oder anderen Bakterium verwertet werden, wobei das jeweilige 

Substratverwertungsspektrum ein wichtiges Merkmal bei der Charakterisierung von 

Bakterien ist (MADIGAN et al., 2001). 

Der Großteil des in der Natur vorhandenen Stickstoffs liegt, im Gegensatz zum 

Kohlenstoff, in anorganischer Form vor, entweder als Ammoniak (NH3), Nitrat (NO3 - ) 

oder als elementarer Stickstoff (N2). Die meisten Bakterien können Ammoniak als 

einzige Stickstoffquelle nutzen, viele aber auch Nitrat oder Nitrit. Da die Fähigkeit zur 

Verwertung unterschiedlicher N-Quellen von Bakterienart zu Bakterienart variiert, 

lässt sie sich zu deren Klassifizierung einsetzen (MADIGAN et al., 2001). 

Phosphor (P) kommt in der Natur in Form von organischen und anorganischen 

Phosphaten vor. Bakterien, wie auch viele andere Lebewesen, nutzen ihn 

hauptsächlich für die Synthese von Nukleinsäuren und Phospholipiden. Allerdings 

wird dieses Element auch zur Synthese komplexer Strukturen, wie Carotinoide, 

benötigt (MADIGAN et al., 2001). 

1.2.7 Wachstumsfaktoren und Spurenelemente 

Vitamine werden ebenso wie Purine, Pyrimidine und Aminosäuren zu den 

Wachstumsfaktoren gezählt, wobei Vitamine die am häufigsten benötigten sind. Die 

meisten Vitamine sind Bestandteil von Coenzymen. Viele Mikroorganismen können 

alle Bestandteile der Coenzyme synthetisieren, einige sind hierzu aber nicht in der 

Lage und müssen mit bestimmten Komponenten dieser Coenzyme in Form von 

Vitaminen versorgt werden. Die Vitaminbedürftigkeit eines Mikroorganismus ist 

folglich ein für ihn charakteristisches Merkmal (MADIGAN et al., 2001). 

Obwohl von Spurenelementen nur sehr kleine Mengen benötigt werden, sind sie für 

die Zellfunktion genauso wichtig wie Makronährstoffe und Wachstumsfaktoren. Alle 

Spurenelemente sind Metalle. Viele von ihnen haben eine strukturelle Rolle in 

diversen Enzymen. Ob ein Mikroorganismus Spurenelemente zum Wachstum 

braucht oder nicht ist, ebenso wie die Vitaminbedürftigkeit, ein für ihn 

charakteristisches Merkmal (MADIGAN et al., 2001). 

1.2.8 Enzyme 

Jeder Organismus produziert eine große Vielfalt an Enzymen, von denen die 

meisten nur in kleinen Mengen hergestellt werden und an zellulären Prozessen 

beteiligt sind. Jedoch werden auch Enzyme von einigen Mikroorganismen in viel

Einleitung ___________________________ 7 

größeren Mengen produziert, und anstatt sie in der Zelle zurückzuhalten, gibt sie der 

Mikroorganismus ins umgebende Milieu ab. Diese extrazellulären Enzyme sind in 

der Lage, unlösliche bzw. hochmolekulare Nährstoffe wie Cellulose, Proteine oder 

Stärke zu verdauen. Die Verdauungsprodukte (Aminosäuren, Peptide, Zucker usw.) 

werden anschließend in die Zelle transportiert, wo sie als Nährstoffe für das 

Wachstum verwendet werden. Einige dieser extrazellulären Enzyme werden in der 

Lebensmittel-, Molkerei-, Pharma- und Textilindustrie verwendet und in großen 

Mengen durch mikrobielle Synthese hergestellt. Sie sind besonders nützlich, weil sie 

oft auf bestimmte chemische funktionelle Gruppen wirken, leicht zwischen ähnlichen 

funktionellen Gruppen auf einem einzigen Molekül unterscheiden können und in 

vielen Fällen Reaktionen in einer stereospezifischen Weise katalysieren, also nur 

eines von zwei möglichen Enantiomeren produzieren (zum Beispiel einen n-Zucker 

oder eine L-Aminosäure). Die Fähigkeit zur Produktion von extrazellulären Enzyme 

ist von Organismus zu Organismus verschieden und wird daher zur 

Charakterisierung von Mikroorganismen eingesetzt (MADIGAN et al., 2001). 

1.2.9 Carotinoide 

Wie verschiedene Untersuchungen gezeigt haben, handelt es sich bei den 

Pigmenten von Bakterienstamm T4 sehr wahrscheinlich um Carotinoide. Diese 

umfassen eine große Gruppe von Pigmenten, die in lebenden Organismen stark 

verbreitet sind. Sie werden von allen photosynthetisch aktiven Organismen, über 

Bakterien zu Pflanzen, synthetisiert. In diesen Organismen spielen sie drei wichtige 

Rollen. Zunächst fungieren sie als Lichtsammelpigmente in den Antennen der 

Photosysteme I und II, indem sie Licht im Wellenlängenbereich von 450 - 570 nm 

absorbieren. Zweitens sind sie wichtig für die Anordnung sowie Stabilität einiger 

dieser Lichtsammelkomplexe. Schließlich operieren sie als Photoprotektoren, indem 

sie direkt Triplett-angeregtes (Bakterio)-Chlorophyll als auch Singulett-Sauerstoff 

quenchen (GIRAUD et al., 2004). 

Carotinoide werden auch von einer großen Bandbreite nicht photosynthetisch aktiver 

Bakterien synthetisiert. Über ihre präzise Funktion in diesen Bakterien ist wenig 

bekannt, allerdings geht man davon aus, dass ihr starker antioxidativer Charakter 

diese Organismen vor übermäßigen oxidativen Schäden bewahrt, indem starke 

oxidative Agentien wie reaktive Sauerstoffspezies (Superoxid- sowie 

Hydroxylradikale, ebenso wie hochreaktive Sauerstoffformen, wie

Einleitung ___________________________ 8 

Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff) unschädlich gemacht werden 

(GIRAUD et al., 2004). 

Carotinoide werden in zwei Gruppen unterteilt, in die der Carotine und Xanthophylle. 

Carotine sind mehrfach ungesättigte Kohlenwasserstoffverbindungen, die linear oder 

zyklisch mit ein oder zwei endständigen Ringstrukturen angeordnet sind. Als 

Xanthophylle werden deren oxigenierte Derivate bezeichnet (HIRSCHBERG und 

CHAMOVITZ, 1994). 

1.2.10 GC-Gehalt der DNA und 16S-rDNA-Sequenz 

Zur ersten Charakterisierung der Bakterien-DNA wird der prozentuale Anteil von 

Guanin (G) und Cytosin (C) an den Gesamtbasen angegeben (SÜßMUTH et al., 

1999). Dies ist praktikabel, da zwei Stämme derselben Art normalerweise weniger 

als 5 % Unterschied im GC-Gehalt aufweisen; mehr als 10 % wären charakteristisch 

für verschiedene Gattungen (CYPIONKA, 2003). 

Die phylogenetische Verwandtschaft zwischen Mikroorganismen kann genauer 

anhand vergleichender Gensequenzierungen bestimmt werden (MADIGAN et al., 

2001). Eine besonders nützliche rDNA-Sequenz ist in diesem Kontext das Gen für 

die 16S- (1500 bp; prokaryotisch) oder 18S- (1800 bp; eukaryotisch) ribosomale 

RNA (rRNA), also die strukturelle RNA des Ribosoms, der entscheidenden 

Zellstruktur für die Proteinsynthese (CYPIONKA, 2003). Die rRNA wird folglich von 

der rDNA codiert. Aus diesem Grund handelt es sich bei den 16S-rRNA-Sequenz- 

Vergleichen in der Literatur um Untersuchungen der 16S-rDNA-Sequenz 

(MADIGAN et al., 2001). Letztere Bezeichnung fand in der vorliegenden 

Diplomarbeit Anwendung. 

Phylogenetische Untersuchungen der rDNA-Sequenz haben die evolutionäre 

Verwandtschaft verschiedener mikrobieller Gruppen belegt (MADIGAN et al., 2001), 

wobei die 16S-rDNA-Sequenzen von Stämmen einer Art mindestens 97 % 

Ähnlichkeit zueinander aufweisen sollten (STACKEBRANDT und GOEBEL, 1994; 

ROSSELLÓ-MORA und AMANN, 2001; STEINBÜCHEL und OPPERMANN-SANIO, 

2003). Als Grenze zu einer anderen Gattung werden 93 - 95 % Übereinstimmung 

der 16S-rDNA-Sequenzen angesehen (DEVEREUX et al., 1990; FRY et al., 1991; 

STEINBÜCHEL und OPPERMANN-SANIO, 2003). 

Aufgrund solcher Untersuchungen kann man phylogenetische Stammbäume 

erstellen, welche die evolutionären Verbindungen unter den Mikroorganismenarten 

darstellen (MADIGAN et al., 2001).

Einleitung ___________________________ 9 

1.3 Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides-Gruppe (CFB-Gruppe) 

Wie eine 16S-rDNA-Sequenzanalyse gezeigt hat, handelt es sich bei dem in dieser 

Arbeit untersuchten Bakterienstamm T4 um ein Mitglied der CFB-Gruppe, genauer 

um einen Vertreter aus der Familie der Flexibacteraceae (siehe Tab. 1.2). 

Im Jahre 1889 wurde die CFB-Gruppe das erste mal von FRANKLAND erwähnt 

(VAN TRAPPEN et al., 2004). Die Einordnung dieser Gruppe in den 

phylogenetischen Stammbaum der Archaea und Bacteria ist in Abbildung 1.1 

dargestellt. 

Abb. 1.1: Phylogenetischer Stammbaum der Archaea und Bacteria basierend auf einem 

Datensatz von ungefähr 1800 16S-rDNA´s. Rotes Quadrat kennzeichnet die CFB-Gruppe. 

(modifiziert nach AMANN et al., 1995).

Einleitung ___________________________ 10 

Tab. 1.2: Taxonomische Einordnung der Familie Flexibacteraceae 

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 

Taxon 

Domäne Eubacteria 

Überstamm CFB-Gruppe 1 

Stamm Bacteroidetes 

Klasse Sphingobacteria 

Ordnung Sphingobacteriales 

Familie Flexibacteraceae 

1 Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides-Gruppe 

Einordnung der Familie Flexibacteraceae 

Je nach Autor finden sich auch noch andere Bezeichnungen für die Cytophaga- 

Flavobacteria-Bacteroides-Gruppe, wie rRNA-Superfamilie V oder das Flavobacter- 

Bacteroides-Phylum (BERNARDET et al., 1996). 

Zu der CFB-Gruppe werden u.a. die Gattungen Cytophaga, Flavobacteria, 

Bacteroides, Hongiella, Algoriphagus, und Chimaereicella gezählt. Wie 23S rRNA- 

Untersuchungen gezeigt haben, sind die nächsten Verwandten der Bakterien, die 

zur CFB-Gruppe gezählt werden, die grünen Schwefelbakterien (BERNARDET et 

al., 1996). 

Die Mitglieder der CFB-Gruppe gehören zu den am häufigsten vorkommenden 

Bakterien. Sie sind ubiquitär und kommen in Süß- und Meerwasser, im Boden, in 

Sedimenten, auf Pflanzen, verrottenden Pflanzenteilen, in Lebensmitteln, in 

Kläranlagen, auf klinischem Besteck, in mikrobiellen Matten sowie in oder auf 

Fischen vor (HOLMES, 2002; VAN TRAPPEN et al., 2004). Am verbreitetsten sind 

sie allerdings im Süßwasser sowie in marinen Ökosystemen. Dort spielen sie eine 

wichtige Rolle bei der Aufnahme sowie dem Abbau von organischen Substraten. So 

sind viele Arten, die zur CFB-Gruppe gezählt werden, in der Lage, organische 

Polymere wie komplexe Polysaccharide zu hydrolysieren (VAN TRAPPEN et al., 

2004). 

Einige Arten sind pathogen für Tiere und Menschen (BERNARDET und BOWMAN, 

2002).

Einleitung ___________________________ 11 

1.4 Ziel der Arbeit 

Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren es, einen unbekannten Bakterienstamm 

möglichst umfassend zu charakterisieren, um letztendlich eine Aussage über seine 

Verwandtschaftsverhältnisse treffen zu können sowie eine strukturchemische 

Charakterisierung der in dem Bakterienstamm enthaltenen Pigmente vorzunehmen.

Material und Methoden_______________________________ _12 

2. Material und Methoden 

2.1 Kulturmedien 

2.1.1 PS/2-Medium (modifiziert nach DSMZ, 1998) 

Tab. 2.1: Zusammensetzung des PS/2-Flüssigmediums (modifiziert nach DSMZ, 1998). 

Substanz 

Konzentration 

Pepton 2,5 g 

Fleischextrakt 1,5 g 

Aqua bidest. ad 1000 ml 

Die Substanzen wurden getrennt in Aqua bidest. gelöst, der pH-Wert mittels Zugabe 

von 1 M NaOH bzw. 1 M HCl auf 8,0 eingestellt (Beckman Φ 40 pH Meter; wie bei 

allen weiteren pH-Wert-Messvorgängen) und autoklaviert (Systec 2540 EL; wie bei 

allen weiteren Autoklaviervorgängen). 

PS/2-Medium-Agarplatten enthalten als zusätzliche Komponente 1,5 % Agar. Nach 

dem Autoklavieren und Abkühlen auf ca. 55 °C wurde das Medium in sterile 

Petrischalen gegossen. 

2.1.2 MSM und MSM + (modifiziert nach BAST, 1999) 

Tab. 2.2: Zusammensetzung des MSM (modifiziert nach BAST, 1999). 

Substanz 

Konzentration 

NH4Cl 1,0 g 

MgSO4 x 7 H2O 0,2 g 

CaCl2 x 2 H2O 0,01 g 

K2HPO4 

0,5 g 

SL 8 1,0 ml 

7-Vitamine-Lösung 3,0 ml 


Um Ausfällungen zu vermeiden, wurden von jeder Substanz Stammlösungen 

hergestellt, deren pH-Wert mittels Zugabe von 1 M NaOH bzw. 1 M HCl auf 8,0 

eingestellt, autoklaviert und später in der erforderlichen Menge (siehe Tabelle 2.3) 

dem Minaralsalzmedium zugesetzt. Die SL 8 (Zusammensetzung siehe Tab. 2.6) 

sowie die 7-Vitamine-Lösung (Zusammensetzung siehe Tab. 2.7) wurden getrennt 

hergestellt, über 0,2 µm Cellulose-Acetat-Filter (Schleicher & Schuell) sterilfiltriert 

und später ebenfalls in der erforderlichen Menge dem MSM zugesetzt.


MSM + - Flüssigmedium enthält als zusätzliche Komponente 2 % Fleischextrakt, 

MSM + -Agar enthält des weiteren 1,5 % Agar. Er wurde nach dem Abkühlen auf ca. 

55 °C in sterile Petrischalen gegossen. 

2.1.3 LB (Luria-Bertani)-Medium (SAMBROOK et al., 1989) 

Tab. 2.3: Zusammensetzung des LB-Flüssigmediums (SAMBROOK et al., 1989). 

Substanz 

Konzentration 

Tryptone 10,0 g 

Hefeextrakt 5,0 g 

NaCl 10,0 g 


Die Substanzen wurden getrennt in Aqua bidest. gelöst, der pH-Wert mittels Zugabe 

von 1 M NaOH bzw. 1 M HCl auf 7,0 eingestellt und autoklaviert. 

LB-Medium-Agar enthält zusätzlich 1,5 % Agar, welcher nach dem Abkühlen auf ca. 

55 °C in sterile Petrischalen gegossen wurde. 

2.1.4 Kulturmedium für den API 50 CH-Test (modifiziert nach LABRENZ, 1999) 

Bei dem Kulturmedium für den API 50 CH-Test handelt es sich um ein modifiziertes 

MSM (siehe Kap. 2.1.2). Dem Medium wurden zusätzlich HEPES (1g/l) und 

Phenolrot (0,18 g / l in 50%igem Ethanol) beigefügt. Der pH-Wert des Mediums 

wurde mittels Zugabe von 1 M NaOH bzw. 1 M HCl auf 8,0 eingestellt. 

2.1.5 MacConkey-Agar (Becton, Dickinson and Company) 

Tab. 2.4: Zusammensetzung des MacConkey-Agars (Becton, Dickinson and Company 

Difco TM ). 

Substanz 

Konzentration 

Pepton 17,0 g 

Proteose-Pepton 3,0 g 

Lactose 10,0 g 

Gallensalze Nr.3 1,5 g 

NaCl 5,0 g 

Neutralrot 0,03 g 

Kristallviolett 0,001 g 

Agar 13,5 g 

Aqua bidest. 1000 ml


Für die Herstellung des MacConkey-Agars wurden 50 g des Basispulvers in 1 l Aqua 

bidest. unter ständigem Schütteln erhitzt und gelöst. Zur vollständigen Lösung des 

Pulvers wurde das Medium für 1 min aufgekocht. Nach dem Autoklavieren (121 °C 

für 15 min) und Abkühlen auf ca. 55 °C wurde der Agar in sterile Petrischalen 

gegossen. 

2.1.6 Nährmedien für den Nachweis von extrazellulären Enzymen 

2.1.6.1 Feste Nährmedien für den Nachweis von extrazellulären Enzymen 

Für die Untersuchung der Ausstattung von Bakterienstamm T4 mit extrazellulären 

Enzymen wurden die in Tabelle 2.5 dargestellten festen Nährmedien verwendet. 

Tab. 2.5: Verwendete Nährmedien zur Untersuchung der Ausstattung von Bakterienstamm 

T4 mit extrazellulären Enzymen. 

Enzymtest 

Agarase 1 

Amylase 2 

Substrat 

Konzentration 

(g/l) 

Zusammensetzung und Herstellung 

der Medien 

Agar 15 - MSM + -Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.2) 

Stärke 2 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 

- Substrat wurde vor dem Autoklavieren 

hinzugefügt 

Cellulase A 3 Cellulose 10 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 


hinzugefügt 

Cellulase B 3 Carboxymethylcellulose 

DNAse 

3, 5 

DNA aus 

Fischsperma 

5 - MSM + -Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.2) 


hinzugefügt 

0,5 - MSM + -Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.2) 

- DNA-Agarplatten 3 : Substrat wurde nach 

dem Autoklavieren und Erkalten (60 °C) 

aus Stammlösung (siehe Kap. 2.2.4) 

hinzugefügt 

- für den DNAse-Nachweis auf DNA- 

Toluidinblau-Agarplatten 5 wurde vor dem 

Autoklavieren zusätzlich noch 

Toluidinblau O (100 mg / l) hinzugegeben


Esterase 3 

Tween 20; 1; 0,1 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 

CaCl2 

- CaCl2 wurde vor dem Autoklavieren 

hinzugefügt 

- Steriles Tween 20 wurde nach dem 

Autoklavieren und Erkalten (60 °C) 

hinzugefügt 

Gelatinase 2 

Fortsetzung von Tabelle 2.5 

Gelatine 4 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 


hinzugefügt 

Lecithinase 3 

Lipase 4 

Peptidase 3 

RNAse 3 

Urease 2 

Xylanase 6 

Eigelb- 

Emulsion 

Speise- 

Olivenöl 

(Aldi) 

Magermilchpulver 

(Heirler) 

50 - MSM + -Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.2) 

- Substrat wurde nach dem Autoklavieren 

und Erkalten (60 °C) aus Stammlösung 

(Oxoid-Eigelb-Emulsion) hinzugefügt 

25 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 


und Erkalten (60 °C) hinzugefügt 

- Des weiteren wurde das Medium mit 

0,001 % (v / v) Rhodamin B aus 

wässriger Stammlösung (1 mg / ml) 

versetzt 

1 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 

- Pasteurisiertes (4 h bei 80 °C) Substrat 

wurde nach dem Autoklavieren und 

Erkalten (60 °C) hinzugefügt 

RNA 2,5 - PS/2-Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.1) 


hinzugefügt 

Harnstoff 2 - modifizierter MSM + -Medium-Agar 

(vergleiche Kap. 2.1.2); Änderung: 2 mM 

Ammoniumchlorid anstatt 20 mM 

- sterilfiltriertes Substrat wurde nach dem 

Autoklavieren und Erkalten (60 °C) 

hinzugefügt 

- Zusätzlich wurde das Medium mit 0,01% 

(v / v) Phenolrot aus einer Stammlösung 

versetzt (1 mg / ml in 50%igem Ethanol; 

pH-Wert 8) 

Xylan 3 - MSM + -Medium-Agar (siehe Kap. 2.1.2) 


und Erkalten (60 °C) aus wässriger, 

1%iger Stammlösung hinzugefügt 

1 modifiziert nach NEDASHKOVSKAYA et al., 2004 

2 modifiziert nach SÜßMUTH et al., 1999 

3 modifiziert nach GERHARDT et al., 1994 

4 modifiziert nach KOUKER und JAEGER, 1987 

5 modifiziert nach SCHREIER et al., 1969 

6 modifiziert nach YOON et al., 2004


2.1.6.2 Flüssigmedium für den Urease-Nachweis (modifiziert nach SÜßMUTH, et al., 

1999) 

Bei dem Medium für den Urease-Nachweis handelt es sich um ein modifiziertes 

MSM + -Flüssigmedium (Vergleiche Kap. 2.1.2). Zum einen wurde es auf eine 

Endkonzentration von 2 mM Ammoniumchlorid anstatt 20 mM eingestellt, um einer 

Alkalisierung des Mediums vorzubeugen. Zum anderen wurden 5 mM di- 

Kaliumhydrogenphosphat anstatt 2 mM hinzugeben, um das Wachstum der 

Bakterien zu stimulieren. Des weiteren wurden dem Medium 10 mg / l Phenolrot aus 

50%iger ethanolischer Stammlösung und 5 g / l sterilfiltrierter Harnstoff hinzugefügt. 

2.2 Lösungen und Puffer 

2.2.1 Lösungen 

2.2.1.1 SL 8-Lösung (Spurenelement-Lösung 8) 

Tab. 2.6: Zusammensetzung der SL 8- Lösung (nach BAST, 1999). 

Substanz 

Konzentration 

EDTA 5,2 g 

FeSO4 x 7 H2O 2,0 g 

ZnSO4 x 7 H2O 150 mg 

MnCl2 x 4 H2O 100 mg 

H3BO3 

62 mg 

CoCl2 x 6 H2O 190 mg 

CuCl2 x 2 H2O 17 mg 

NiCl2 x 6 H2O 24 mg 

NaMoO4 x 2 H2O 36 mg 


Die Substanzen wurden getrennt in Aqua bidest. gelöst, in der angegebenen 

Reihenfolge zur EDTA-Lösung (pH-Wert 8) gegeben sowie mit Aqua bidest. auf 1 l 

aufgefüllt. Anschließend wurde die SL 8-Lösung mittels Zugabe von 1 M NaOH bzw. 

1 M HCl auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und über einen 0,2 µm Cellulose- 

Acetat-Filter (Schleicher & Schuell) sterilfiltriert sowie in 100 ml Serumflaschen 

abgefüllt, mit Alufolie umwickelt und in einem Kühlschrank bei ca. 8°C aufbewahrt.


2.2.1.2 7-Vitamine-Lösung 

Tab. 2.7: Zusammensetzung der 7-Vitamine-Lösung (nach DSMZ, 1998). 

Substanz 

Konzentration 

Vitamin B12 

100 mg 

p-Aminobenzoat 80 mg 

D(+)-Biotin 20 mg 

Nikotinsäure 200 mg 

Ca-Pantothenat 100 mg 

Pyridoxin-HCl 300 mg 

Thiamin-HCl 200 mg 


Die aufgeführten Vitamine wurden einzeln der Reihe nach in Aqua bidest. gelöst. 

Die Lösung wurde mittels Zugabe von 1 M NaOH bzw. 1 M HCl auf einen pH-Wert 

von 8,0 eingestellt, über 0,2 µm Cellulose-Acetat-Filter (Schleicher & Schuell) 

sterilfiltriert, in 100 ml Serumflaschen abgefüllt und mit Alufolie umwickelt in einem 

Kühlschrank aufbewahrt. 

2.2.1.3 DNA-Stammlösung (modifiziert nach SCHREIER et al., 1969) 

Zur Herstellung der DNA-Stammlösung wurden 0,5 g DNA aus Fischsperma in 10 

ml Tris-HCl-Pufferlösung (siehe Kap. 2.2.2.4) über Nacht bei 5 °C und mäßigem 

Rühren gelöst. Zur Sterilisation und Konservierung wurde ein Tropfen Chloroform 

hinzugegeben. 

2.2.2 Puffer 

2.2.2.1 Clark und Labs Pufferlösungen, pH 8,0 - 10,2 (DAWSON et al., 1986) 

Zunächst wurde eine je 0,1 M Lösung aus Kaliumchlorid und Borsäure hergestellt. 

Danach wurden 50 ml davon mit einer bestimmten Menge 0,1 M Natronlauge und 

einer davon abhängigen Menge Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt (siehe Tab. 2.8). 

Tab. 2.8: Pipettierschema für Clark und Labs Pufferlösungen, pH 8,5, 9,0 und 10 (DAWSON 

et al., 1986). 

pH, 25 °C 

Je 0,1 M Kaliumchlorid- und 

Borsäure-Lösung (ml) 

0,1 M Natronlauge 

(ml) 

Aqua bidest. 

(ml) 

8,5 50 10,1 39,9 

9,0 50 20,8 29,2 

10,0 50 43,7 6,3


2.2.2.2 Clark und Labs Pufferlösungen, pH 5,8 - 8,0 (DAWSON et al., 1986) 

Zunächst wurde eine 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung hergestellt. Danach 

wurden 50 ml davon mit einer bestimmten Menge 0,1 M Natronlauge und einer 

davon abhängigen Menge Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt (siehe Tab. 2.9). 

Tab. 2.9: Pipettierschema für Clark und Labs Pufferlösungen, pH 7,0, 7,5 und 8,0 

(DAWSON et al., 1986). 

pH, 25 °C 

0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung 

(ml) 

0,1 M Natronlauge 

(ml) 

Aqua bidest. 

(ml) 

7,0 50,0 29,1 20,9 

7,5 50,0 40,9 9,1 

8,0 50,0 46,1 3,9 

2.2.2.3 Zitronensäure/Natriumcitrat-Pufferlösung, pH 3,0 - 6,0 (DAWSON et al., 

1986) 

Zunächst wurden eine 0,1 M Zitronensäure-Lösung sowie eine 0,1 M tri- 

Natriumcitrat-Lösung hergestellt. Bei einem Endvolumen von 100 ml wurden danach 

beide Lösungen in einem bestimmten Verhältnis gemischt (siehe Tab. 2.10). 

Tab. 2.10: Pipettierschema für Zitronensäure/Natriumcitrat-Pufferlösung, pH 5,0 und 6,0 

(DAWSON et al., 1986). 

pH, 25 °C 

0,1 M Zitronensäure-Lösung (ml) 

0,1 M tri-Natriumcitrat-Lösung (ml) 

5,0 35,0 65,0 

6,0 11,5 88,5 

2.2.2.4 Tris-HCl-Pufferlösung, pH 6,4 - 8,3 (DAWSON et al., 1986) 

Zunächst wurden eine 0,2 M 2,4,6-Trimethylpyridin-Lösung sowie eine 0,2 M 

Salzsäure-Lösung hergestellt. Danach wurden 25 ml der Trimethylpyridin-Lösung 

mit einer bestimmten Menge Salzsäure-Lösung und einer davon abhängigen Menge 

Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt (siehe Tab. 2.11). 

Tab. 2.11: Pipettierschema für Tris-HCl-Pufferlösung, pH 8,0 (DAWSON et al., 1986). 

pH, 23 °C 

0,2 M 2,4,6-Trimethylpyridin- 

Lösung (ml) 

0,2 M Salzsäure- 

Lösung (ml) 

Aqua bidest. 

(ml) 

8,0 25,0 5,0 70,0


2.3 Herkunft der Probe 

Der Bakterienstamm T4 wurde von der Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie (UFT 

Bremen) zur Verfügung gestellt. Es handelt sich dabei um ein rot pigmentiertes, 

stäbchenförmiges Bakterium (RAU, 2005). 

Ursprünglich stammt das Isolat aus einer Wasserprobe, die von einer 

Warmwasserleitung eines Hotels auf Teneriffa (Spanien) genommen wurde. Die 

Probennahme wurde von Frau Lübben, der technischen Assistenten der 

Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie, durchgeführt (RAU, 2005). 

2.4 Konservierung der Reinkulturen 

Die in einer früheren Projektarbeit (RAU, 2005) gewonnenen Reinkulturen von 

Bakterienstamm T4 waren in 20%igem Glycerin in 2 ml ERG´s konserviert worden. 

Dazu waren mittels einer Impföse jeweils mehrere Kulturen in die Gefäße überführt 

worden. Diese waren anschließend gevortext (Heidolph Instruments REAX top) 

worden, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten. Schließlich waren sie bei 

- 80 °C eingefroren worden. 

2.5 Bearbeitung der Proben 

Zu Beginn der vorliegenden Diplomarbeit wurde eine dieser bei - 80 °C 

eingefrorenen Reinkulturen vom 3.11.2004 aufgetaut. Damit wurden mehrere PS/2- 

Agarplatten (siehe Kap. 2.1.1) mittels Drei-Ösen-Ausstrich beimpft. Die Platten 

wurden jeweils für 6 - 8 d bei 30 °C im Brutschrank (Heraeus Instruments) inkubiert. 

2.6 Anlegung eines Bakterienmaterialdepots 

Von den Agarplatten (siehe Kap. 2.5) wurde mittels einer Impföse etwas 

Bakterienmaterial entnommen und auf PS/2- oder MSM + -Agarplatten (siehe Kap. 

2.1.1 und 2.1.2) ausgebracht. Diese wurden nach 4 - 8 d Inkubation im Brutschrank 

(Heraeus Instruments) bei 30 °C in einen Kühlschrank bei ca. 8 °C gelegt, um 

weiteres Wachstum einzuschränken und bildeten das Bakterienmaterialdepot für die 

weiteren Untersuchungen. Nach zwei Wochen wurden sie jeweils durch neue 

ersetzt, die aus den konservierten Reinkulturen beimpft wurden. So war 

gewährleistet, dass stets frisches, unkontaminiertes Bakterienmaterial zur Verfügung 

stand.


2.7 Anzucht der Vorkulturen 

Zur Anzucht der Vorkulturen unter sterilen Bedingungen wurde ein mit 10 ml PS/2- 

oder MSM + -Flüssigmedium (siehe Kap. 2.1.1 und 2.1.2) gefüllter 100 ml 

Erlenmeyerkolben durch Abnahme von 2 - 3 Kolonien mittels einer Impföse von einer 

der Depotplatten inokuliert, mit einem luftdurchlässigen Stopfen aus gepresster 

Watte verschlossen und für ca. 24 h bei 30 °C und 200 rpm auf einem 

Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 4000 Incubator Shaker) 

inkubiert. 

Zur Anzucht der Vorkulturen auf PS/2- oder MSM + -Agarplatten, wurden diese unter 

sterilen Bedingungen mittels Drei-Ösen-Ausstrich jeweils mit einer Kolonie von einer 

der Depotplatten beimpft, mit einem Paraffinstreifen verschlossen und für 4 - 8 d bei 

30 °C in einem Brutschrank (Heraeus Instruments) inkubiert. 

2.8 Kultivierung der Bakterien 

2.8.1 Anzucht der Versuchskulturen in Flüssigmedium 

Zur Anzucht der Versuchskulturen unter sterilen Bedingungen wurde ein mit 10ml 

Flüssigmedium (je nach Versuch unterschiedlich) gefüllter 100 ml Erlenmeyerkolben 

mit einer eingestellten Start-OD600 nm von 0,1 aus einer der Vorkulturen angeimpft 

und mit einem luftdurchlässigen Stopfen aus gepresster Watte verschlossen. Die 

Inkubation erfolgte i.d.R. für ca. 24 h bei 30 °C und 200 rpm auf einem 

Rotationsschüttler (wenn nicht anderes angegeben handelte es sich dabei um einen 

New Brunswick Scientific innova 4000 Incubator Shaker). 

Falls größere Startvolumina der Versuchskulturen benötigt wurden, wurde nach 

gleichem Schema ebenfalls eine Start-OD600 nm von ca. 0,1 in den jeweiligen 

Kulturansätzen eingestellt. 

2.8.2 Anzucht der Versuchskulturen auf festen Nährböden 

Zur Anzucht der Versuchskulturen unter sterilen Bedingungen wurden feste 

Nährböden (je nach Versuch unterschiedlich) mittels Drei-Ösen-Ausstrich jeweils mit 

einer Kolonie von einer der Depotplatten beimpft, mit einem Paraffinstreifen 

verschlossen und für 4 - 8 d bei 30 °C in einem Brutschrank inkubiert (wenn nicht 

anderes angegeben handelte es sich dabei um ein Gerät von Heraeus Instruments).


Die als Referenzstämme eingesetzten Spezies E. coli Stamm K12 (DSMZ-Nr.: 2840) 

und B. subtilis Typenstamm Marburg 168 wurden nach den gleichen Schemata in 

LB-Flüssigmedium sowie auf LB-Medium-Agarplatten (siehe Kap. 2.1.3) angezogen. 

2.9 Morphologische Untersuchungen 

2.9.1 Koloniemorphologie 

Zur Untersuchung der Koloniemorphologie wurden Ausstriche des untersuchten 

Bakterienstammes auf MSM + -Agarplatten (siehe Kap. 2.1.2) verwendet und unter 

einem Stereomikroskop (Zeiss Stemi SV 6) ausgewertet. 

2.9.2 Lichtmikroskopische Untersuchungen 

Die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden mittels des 

Phasenkontrastverfahrens vorgenommen, wobei ein Lichtmikroskop von Zeiss 

(Axiolab) zum Einsatz kam. Dieses Verfahren, welches von F. Zernicke im Jahre 

1934 entwickelt wurde, ermöglicht durch Eingriffe in den Strahlengang des 

Mikroskops eine kontrastreiche Darstellung durchsichtiger, kontrastarmer Objekte, 

z.B. lebender Bakterien, ohne dass die Objekte durch die Kontrastierung abgetötet 

und in ihren Strukturen verändert werden, wie das bei Färbemethoden meist der Fall 

ist. Das Phasenkontrastmikroskop wandelt die an solchen Objekten auftretenden, für 

das Auge nicht wahrnehmbaren Phasenunterschiede in deutlich sichtbare 

Helligkeitsunterschiede um (BAST, 1999). 

Untersucht wurden Bakterien aus Flüssig- sowie Plattenkulturen unter 

verschiedenen Kultivierungsbedingungen. 

2.9.2.1 Ermittlung der Zellmorphologie 

Zur Untersuchung der Zellmorphologie von Bakterienstamm T4, wurden Kulturen, 

welche unter verschiedenen Inkubations- bzw. Kulturbedingungen (Temperatur, 

Sauerstoffgehalt, Salzgehalt, pH-Wert) angezogen worden waren, verwendet. Zur 

Bestimmung der Zellgröße kamen ein Okularmikrometer (Zeiss) sowie ein geeichtes 

Objektmikrometer (Zeiss) zum Einsatz. Das Okularmikrometer wurde mittels des 

geeichten Objektmikrometers geeicht.


2.9.2.2 Nachweis der Beweglichkeit der Zellen 

Es wurde mit Hilfe eines Lichtmikroskops (Zeiss Axiolab) sowie makroskopisch 

mittels Schwärmagarversuchen überprüft, ob die Bakterienzellen sich schwimmend 

bzw. gleitend fortbewegen können. 

2.9.2.2.1 Überprüfung des Vorhandenseins von schwimmender Fortbewegung 

Es wurde mit Hilfe eines Lichtmikroskopes (Zeiss Axiolab) untersucht, ob 

Bakterienstamm T4 sich schwimmend fortbewegen kann. Eine spezielle 

Geißelfärbung wurde nicht durchgeführt. 

2.9.2.2.2 Überprüfung des Vorhandenseins von gleitender Fortbewegung 

(SÜßMUTH et al., 1999) 

Um zu überprüfen, ob Bakterienstamm T4 sind gleitend fortbewegen kann, wurden 

Wasseragarplatten mit unterschiedlichen Agarkonzentrationen (0,3; 0,7; 1,0 und 1,5 

% in Leitungswasser) hergestellt und in der Mitte punktförmig mit Bakterienmaterial 

von einer Vorkultur auf festem Nährboden (siehe Kap. 2.7) beimpft. Die Inkubation 

erfolgte bei 30 °C für 7 d im Brutschrank. 

Bakterien, die sich gleitend fortbewegen können, verteilen sich auf dem Wasseragar, 

und erzeugen dabei eine Trübung des Mediums. 

2.9.2.3 Bestimmung der Gesamtzellzahl 

Zur Anwendung kommt die direkte Zählung unter dem Mikroskop mit Hilfe einer 

Zählkammer. In dieser ist auf einem Glasplättchen ein Gitternetz aufgezeichnet, 

welches in kleine Quadrate eingeteilt ist, wobei die Fläche der einzelnen Quadrate 

bekannt ist. Über jedem Quadrat des Gitternetzes befindet sich ein sehr kleines, aber 

genau ausgemessenes Volumen. Wenn die Zellzahl pro Einheit des Gitternetzes 

unter dem Mikroskop ausgezählt wird, wird so ein Maß für die Zellzahl pro 

Kammervolumen erhalten. Von diesem Wert wird anschließend auf die Zellzahl pro 

Milliliter Suspensionslösung hochgerechnet, indem der Wert mit einem 

Umrechnungsfaktor multipliziert wird, welcher auf dem Volumen der Kammerprobe 

basiert (MADIGAN et al., 2001). 

Für die Bestimmung der Gesamtzellzahl wurde Bakterienstamm T4 unter 

Standardbedingungen angezogen (siehe Kap. 2.8.1). Es wurde eine Zählkammer


(Assistent Thoma) verwendet, wobei die Kantenlänge eines Kleinstquadrates 0,0025 

mm betrug und die Tiefe der Kammer 0,02 mm entsprach. 

2.9.3 Färbetechniken 

2.9.3.1 Schleimkapsel-Färbetechniken 

Bei Bakterienkapseln, einem charakteristischen Merkmal von Bakterien, handelt es 

sich nicht um eine harte Schale, sondern um eine Schleimhülle, welche zu mehr als 

90 % aus Wasser und aus Polysacchariden besteht. Selbst unter dem Mikroskop ist 

die Hülle daher meist nur erkennbar, wenn man spezielle Präparationsmethoden 

anwendet, da sie selbst farblos ist (CYPIONKA, 2003). 

Durch solche Methoden wurde versucht, eventuell vorhandene Schleimkapseln 

sichtbar machen. Bei der Einfachfärbung wird durch einheitliches, unspezifisches 

Anfärben der Bakterienzellen mit einem einzigen basischen Farbstoff, wie 

Kristallviolett, eine Erhöhung des Kontrasts bewirkt, um sie besser sichtbar zu 

machen, ohne dabei die Auflösung zu verringern. Bei der Negativfärbung wird ein 

saurer Farbstoff wie Kongorot oder Nigrosin eingesetzt, um den Hintergrund zu 

färben, wodurch bestimmte farblose Zellstrukturen, z.B. Schleimkapseln, sichtbar 

gemacht werden können. Beide Methoden können auch kombiniert werden, um 

Hintergrund und Bakterienzellen anzufärben, wodurch ein noch besserer Kontrast 

entsteht (ALEXANDER und STRETE, 2006). 

Zum Einsatz kamen sowohl Negativfärbetechniken sowie Kombinationen aus 

Negativfärbung und Einfachfärbung. Die eingesetzten Versuchskulturen wurden, wie 

in Kapitel 2.8.2 beschrieben, auf MSM + -Agarplatten (siehe Kap. 2.1.2) angezogen. 

2.9.3.1.1 Schleimkapsel-Färbung mit Tinte (modifiziert nach ALEXANDER und 

STRETE, 2006) 

Bei dieser Färbetechnik handelt es sich um eine Negativfärbung. Mittels einer 

Impföse wurde etwas Bakterienmaterial von einer Versuchskultur entnommen, auf 

einem Objektträger (OT) mit einem Tropfen Tinte (Pelikan) gemischt und mit einem 

Deckgläschen abgedeckt. Anschließend wurde der OT mittels eines Lichtmikroskops 

(Zeiss Axiolab) ausgewertet. 

Durch die Färbemethode mit Tinte wird der Hintergrund dunkelblau angefärbt, die 

Kapseln oder Schleimhüllen bleiben ungefärbt.


2.9.3.1.2 Schleimkapsel-Färbung mit Nigrosin (modifiziert nach SÜßMUTH, 1999) 

Bei dieser Färbetechnik handelt es sich um eine Negativfärbung. Mittels einer 

Impföse wurde etwas Bakterienmaterial von einer Versuchskultur entnommen, auf 

einem OT mit einem Tropfen 10%iger Nigrosinlösung gemischt und mit einem 

Deckgläschen abgedeckt. Danach wurde die Probe mittels eines Lichtmikroskops 

(Zeiss Axiolab) analysiert. 

Durch die Kapselfärbung nach SÜßMUTH (1999) wird der Hintergrund dunkelblau 

angefärbt, die Kapseln oder Schleimhüllen bleiben ungefärbt. 

2.9.3.1.3 Schleimkapsel-Färbung mit Kongorot und Methylenblau (modifiziert nach 

DUGUID, 1951) 

Bei dieser Färbetechnik handelt es sich um eine Kombination aus Einfach- und 

Negativfärbung. Mittels einer Impföse wurde etwas Bakterienmaterial von einer 

Versuchskultur entnommen, auf einem OT in einem Tropfen 0,5%iger 

Kongorotlösung suspendiert und auf einen zweiten OT ausgestrichen. Nach 

anschließender Lufttrocknung wurde der Ausstrich vorsichtig hitzefixiert, dann kurz in 

1%ige HCL-Lösung getaucht, mit Leitungswasser (LW) abgespült, für 3 min mit 

1%iger Methylenblau-Lösung gegengefärbt und wiederum mit LW abgespült. Nach 

abschließender Lufttrocknung folgte die Auswertung der Probe mittels eines 

Lichtmikroskops (Zeiss Axiolab). 

Durch die Kapselfärbung nach DUGUID (1951) werden Bakterienzellen hellblau 

angefärbt, der Hintergrund violett, die Kapseln oder Schleimhüllen bleiben ungefärbt. 

2.9.3.1.4 Schleimkapsel-Färbung mit Kristallviolett und Kupfersulfat (modifiziert nach 

GERHARDT et al., 1994) 

Bei dieser Färbetechnik handelt es sich um eine Kombination aus Einfach- und 

Negativfärbung. Mittels einer Impföse wurde etwas Bakterienmaterial von einer 

Versuchskultur entnommen und auf einem OT mit einem Tropfen 

Magermilchpulversuspension vermischt. Danach wurde der Bakterienfilm 

luftgetrocknet, vorsichtig hitzefixiert und mit 0,1%iger Kristallviolettlösung 

überschichtet. Anschließend wurde die Kristallviolettlösung mittels einer 20%igen 

Kupfersulfatlösung abgewaschen, der OT luftgetrocknet, mit einem Deckgläschen 

abgedeckt und mittels eines Lichtmikroskops (Zeiss Axiolab) untersucht.


Durch diese Kapselfärbung werden die Bakterienzellen dunkelviolett und der 

Hintergrund dunkelblau angefärbt. Die Kapseln oder Schleimhüllen erscheinen 

hellblau. 

2.9.3.2 Gram-Färbung (Merck) 

Bei der Gram-Färbung, die in der bakteriellen Klassifikation von großer Bedeutung 

ist, handelt es sich methodisch um eine Differentialfärbung, wobei mindestens zwei 

verschiedene Farbstoffe benötigt werden. Nach dem ersten Färbeschritt werden die 

Bakterienzellen mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Säure behandelt. 

Dabei werden bestimmte Bakterien wieder entfärbt, während andere ihre Färbung 

behalten. Die entfärbten Zellen werden durch eine Gegenfärbung mit einem zweiten 

Farbstoff andersfarbig angefärbt; es wird also eine Differenzierung vorgenommen. 

Mit dieser Methode lassen sich Bakterien aufgrund von Unterschieden ihres 

Zellwandaufbaus in zwei große Gruppen, die Gram-positiven und die Gram- 

negativen, unterteilen (BAST, 1999). 

Um das Gram-Färbeverhalten des untersuchten Bakterienstammes zu bestimmen 

wurde die Gram-Färbung modifiziert nach den Angaben des Herstellers (Merck) 

durchgeführt. Als Referenzstämme dienten E.coli Stamm K12 (DSMZ-Nr.: 2840) 

(Gram-negativ) und B.subtilis Typenstamm Marburg 168 (Gram-positiv). 

Von den auf MSM + - bzw. LB-Medium-Agarplatten (siehe Kap. 2.1.2 bzw. 2.1.3) 

angezogenen Versuchskulturen (siehe Kap. 2.8.2) wurde jeweils mittels einer sterilen 

Impföse etwas Bakterienmaterial auf einen OT überführt und verteilt. Im Anschluss 

an die vorsichtige Hitzefixierung des Präparates wurde der OT mit 

Karbolgentianaviolett-Lösung überschichtet. Nach einer Einwirkungszeit von zwei 

Minuten wurde dieser Farbstoff kurz mit Lugolscher Lösung abgespült, anschließend 

wurde der OT mit dieser Lösung überschichtet und nach ebenfalls zwei Minuten 

wurde sie abgegossen. Nun wurde mit 96%igem Ethanol so lange gespült, bis keine 

Farbstreifen mehr am OT herabliefen. Das Präparat wurde dann mit einer 

Safraninlösung gegengefärbt, nach kurzer Einwirkungszeit (ca. 15 sec) mit Aqua 

bidest. Gespült und mittels eines Lichtmikroskops (Zeiss Axiolab) ausgewertet: 

Gram-positive Bakterien erschienen blau-violett, Gram-negative Bakterien rot.


2.9.4 KOH-Test (SÜßMUTH et al., 1999) 

Ein Schnellverfahren zur Gram-Differenzierung ist der KOH-Test nach BUCK (1982), 

bei dem sich bereits ohne Färbung ein erster Überblick über die Gram-Reaktion 

unbekannter Bakterienstämme gewinnen lässt (RÜGER, 1993). 

Um das Gram-Färbeverhalten von Bakterienstamm T4 zu überprüfen, wurde ein 

KOH-Test durchgeführt. Als Referenzstämme dienten, wie bei der Gram-Färbung, 

E.coli (Gram-negativ) und B.subtilis (Gram-positiv). 

Zur Durchführung des Versuchs wurde jeweils eine kleine Menge Bakterienmaterial 

von den auf MSM + - bzw. LB-Medium-Agarplatten (siehe Kap. 2.1.2 bzw. 2.1.3) 

angezogenen Versuchskulturen (siehe Kap. 2.8.2) mittels einer sterilen Impföse auf 

einen OT überführt und in einem Tropfen 3%iger KOH-Lösung suspendiert. Bei 

Gram-positiven Bakterien führt die konzentrierte Lauge zu keiner Reaktion; zieht man 

die Impföse durch das Gemisch, verhält es sich wie eine Flüssigkeit mit einer 

Viskosität wie Wasser. 

Die Zellwand von Gram-negativen Bakterien ist dagegen zu dünn, um der Lauge 

Widerstand zu leisten. Die Zellen brechen auf, und die DNA wird freigesetzt. Wird 

nun durch diese Lösung eine Impföse gezogen, zeigt sich aufgrund einer erhöhten 

Viskosität, verursacht durch die freigesetzte DNA, die Bildung eines Schleimfadens. 

2.10 Physiologische Untersuchungen 

2.10.1 Wachstumsversuch in PS/2-Flüssigmedium 

Eine sehr häufig angewendete Methode zur Bestimmung des Zellgehalts von 

Mikroorganismuskulturen stellt die Trübungsmessung (Turbidimetrie) dar. Partikel, 

welche in Wasser suspendiert sind und sich in ihrem Brechungsindex von dem 

umgebenden Medium unterscheiden, verursachen eine Trübung bzw. Optische 

Dichte (OD). Diese ist durch eine Streuung der durchfallenden Lichtstrahlen an der 

Grenzfläche Wasser-Partikel bedingt. I.d.R wird die Intensitätsschwächung des 

eingestrahlten Lichts durch die Streuung in der Suspension (scheinbare Extinktion) 

bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen (STEINBÜCHEL und OPPERMANN- 

SANIO, 2003). 

In der vorliegenden Arbeit wurden die OD-Messungen als auch die Aufnahme von 

Absorptionsspektren, wenn nicht anders angegeben, mittels eines Beckman DU 640 

Spektralphotometers vorgenommen.


Zum Testen des Wachstums unter den Bedingungen eines Vollmediums wurde 

Bakterienstamm T4 nach dem generell angewendeten Schema (siehe Kapitel 2.8.1) 

in PS/2-Flüssigmedium angezogen. Es wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt, 

wobei anschließend die Berechnung der Mittelwerte erfolgte (RAU, 2005). 

Zu Beginn des Versuchs und danach stündlich wurde die OD600 nm gegen PS/2- 

Flüssigmedium als Blindwert in einem Photometer (Eppendorf Biophotometer) in 

einer Plastikküvette (Eppendorf Uvette) gemessen. Die Probenmenge betrug dabei 

jeweils 75 µl. Nach 12 h wurde der Versuch abgebrochen, da sich die Kulturen in der 

stationären Phase befanden (RAU, 2005). 

Zur Ermittlung der Verdopplungszeit sowie der Wachstumsrate für den unter den 

Bedingungen eines Vollmediums kultivierten Mikroorganismus wurden jeweils die 

Werte herangezogen, die im linearen Bereich der Wachstumskurve (exponentielle 

Wachstumsphase) lagen (RAU, 2005). 

2.10.2 Wachstum auf MacConkey-Agar (Becton, Dickinson and Company Difco TM ) 

Bei MacConkey-Agar handelt es sich um ein standardisiertes Fertigmedium. Die 

Fähigkeit von Mikroorganismen darauf zu wachsen, wird zum Nachweis eines 

möglichen Lactose-Gärungsstoffwechsels genutzt. 

Um zu Überprüfen, ob Bakterienstamm T4 auf MacConkey-Agar (siehe Kap. 2.1.5) 

wachsen kann, wurden die Agarplatten mittels Drei-Ösen-Ausstrich beimpft und für 

14 d bei 30 °C im Brutschrank inkubiert. 

2.10.3 Sauerstoffbedarf, Gärverhalten und Nitratatmung 

In diesem Versuch wurde der Sauerstoffbedarf des Bakterienstammes T4 ermittelt 

und ob er eventuell eine Gärung oder Nitratatmung durchführen kann. Dazu wurde 

ein Versuch mit vier verschiedenen Ansätzen (siehe Tab. 2.12) in 100 ml Anaerob- 

Flaschen durchgeführt. Als Kulturmedium diente MSM (siehe Kap. 2.1.2), als 

Kohlenstoffquelle Glucose [5 mM]. 

Tab. 2.12: Versuchsansätze zur Überprüfung des Sauerstoffbedarfs, Gärverhaltens und der 

Fähigkeit zur Nitratatmung von Bakterienstamm T4. 

Ansatz-Nr. Ansatz 

1 unbegast, mit WS 1 

2 unbegast, mit GS 2 

3 begast mit N2, mit GS 

4 begast mit N2, mit GS + Nitrat 

1 WS = Wattestopfen 

2 GS = Gummistopfen


Bakterienstamm T4 wurde unter Standardbedingungen angezogen (siehe Kap. 2.7). 

Die OD600 nm der Vorkultur wurde mittels eines Photometers bestimmt. Anschließend 

wurde jeweils soviel dieser Vorkultur in ERG´s überführt, dass später in den 10 ml- 

Versuchsansätzen jeweils eine OD600 nm von ca. 0,1 vorlag. Die ERG´s wurden dazu 

bei 6000 rpm für 5 min zentrifugiert (Heraeus Instruments Biofuge pico) und die 

Überstände verworfen. Nun wurden die Pellets jeweils in 0,5 ml des jeweiligen 

Ansatzes resuspendiert und in diesen überführt. Danach wurden die Anaerob- 

Flaschen entsprechend des jeweiligen Ansatzes weiterbehandelt, wobei die 

Begasung mit Stickstoff für 10 min durchgeführt wurde. Dabei kam jeweils ein Filter 

(Sartorius Disposable Filter; 0,2 µm) zum Einsatz, um aseptisches Arbeiten zu 

gewährleisten. In den vierten Ansatz wurde Natriumnitrat als Elektronenakzeptor und 

N-Quelle (Endkonzentration 10 mM) hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte für 4 d 

bei 30 °C im Brutschrank. Täglich alle 24 h wurde in allen Ansätzen die OD600 nm 

mittels eines Photometers bestimmt, als Blindwert diente MSM. Es wurden dabei 

jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt, wobei anschließend die Berechnung der 

Mittelwerte erfolgte. 


Sauerstoffversorgung (RAU, 2005) 

Der Bakterienstamm T4 wurde nach dem generell angewendeten Verfahren (siehe 

Kapitel 2.8.1) in Erlenmeyerkolben eingebracht. Die Gefäße wurden anschließend 

bei 30 °C mit unterschiedlich viel Sauerstoff versorgt, indem sie auf verschiedenen 

Rotationsschüttlern (Julabo SW21; Heidolph Unimax 2010 in New Brunswick 

Scientific Brutschrank) mit 0, 40, 80 sowie 200 rpm bewegt wurden (RAU, 2005). 

Nach 48 h wurde in allen Ansätzen die OD600 nm mittels eines Photometers 

(Eppendorf Biophotometer) bestimmt. Weiterhin wurden mit Hilfe eines Oximeters 

(WTW Microprocessor Oximeter Oxi 96) in allen Ansätzen die Sauerstoffsättigung 

sowie der Sauerstoffgehalt gemessen. Außerdem wurden von allen Ansätzen 

Absorptionsspektren, in Methanol als Lösungsmittel, aufgenommen. Dies geschah, 

indem je 1,5 ml der vier Ansätze in 2 ml ERG´s pipettiert wurden. Es folgte eine 

Zentrifugation (Beckman GS-15 R) der Gefäße bei 4 °C und 14000 rpm für 5 min. 

Der Überstand wurde verworfen und die erhaltenen Pellets in je 1,3 ml eiskaltem 

Methanol resuspendiert. Um eine ausreichende Extraktion der Carotinoide zu 

gewährleisten, wurden die ERG´s für 20 sec gevortext (Heidolph Instruments Reax


top). Danach folgte eine weitere Zentrifugation (s.o.), um die vorhandenen 

Schwebeteilchen zu sedimentieren und aus dem Überstand zu entfernen. Nun 

wurde einer der Ansätze als 100 % gesetzt und die anderen entsprechend verdünnt, 

um die Unterschiede in der OD600 nm auszugleichen. Danach wurde je 1 ml der 

Ansätze in eine 1 ml Quarzküvette (Hellma) überführt. Absorptionsspektren von 200- 

1000 nm gegen Methanol als Blindwert wurden mit Hilfe eines Photometers 

aufgenommen. Es wurden dabei jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt, wobei 

anschließend die Berechnung der Mittelwerte erfolgte (RAU, 2005). 

2.10.4 Temperaturoptimum 

Zur Ermittlung des Temperaturtoleranzbereichs und der optimalen 

Wachstumstemperatur von Bakterienstamm T4, wurde zunächst eine Vorkultur unter 

Standardbedingungen in PS/2-Flüssigmedium (siehe Kap. 2.7) angesetzt, die 

Versuchsansätze daraus angeimpft (siehe Kap. 2.8.1) und ungeschüttelt bei 5 - 

45 °C (in Abstufungen von ca. 5 °C) inkubiert (siehe Tab. 2.13). 

Tab. 2.13: Inkubationstemperaturen und deren jeweilige Inkubationsorte. 

Inkubationstemperatur (°C) 

Inkubationsort 

5 (± 1) Kühlraum 

10 (± 1) Kühlschrank (Stufe 1; Gemüsefach) 

15 (± 1) Wasserbad 1 im Kühlraum 

21 (± 1) temperiertes Labor 

25 (± 1) Brutschrank 

30 (± 1) Brutschrank 

35 (± 1) Brutschrank bzw. Schüttelwasserbad 2 

40 (± 1) Schüttelwasserbad 2 

42 (± 1) Wasserbad 1 

45 (± 1) Wasserbad 1 

1 

Gesellschaft für Labortechnik (GFL) 

2 

Julabo SW21 

Nach 24, 48, 72 und 96 h wurde in allen Ansätzen die OD600 nm mittels eines 

Photometers bestimmt, als Blindwert diente PS/2-Flüssigmedium. Es wurden dabei 

jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt, wobei anschließend die Berechnung der 

Mittelwerte erfolgte.


2.10.5 pH-Wert-Optimum 

Um das pH-Wert-Optimum von Bakterienstamm T4 zu bestimmen wurden zwei 

verschiedene Versuche durchgeführt. Eine Versuchsreihe fand in gepuffertem, 

modifiziertem MSM + -Flüssigmedium statt, die andere in ungepuffertem PS/2- 

Flüssigmedium. 

2.10.5.1 pH-Optimum in gepuffertem, modifiziertem MSM + -Flüssigmedium 

Es wurde das Wachstum von Bakterienstamm T4 bei pH-Werten von 5 - 10 getestet; 

in den Bereichen 5 - 7 und 9 - 10 in Schritten von einer Einheit sowie von 7 - 9 in 

Schritten von 0,5 Einheiten. 

Für die pH-Werte 5 und 6 kamen Zitronensäure/Natriumcitrat-Pufferlösungen (siehe 

Kap. 2.2.2.3) sowie für die pH-Werte von 7 - 10 Clark und Labs Pufferlösungen 

(siehe Kap. 2.2.2.1 und 2.2.2.2) zum Einsatz. Als Kulturmedium wurde modifiziertes 

MSM + -Flüssigmedium (vergleiche Kap. 2.1.2) verwendet. Anstatt die Mineralsalze, 

Vitamine und Spurenelemente in Aqua bidest. zu lösen, wurden die Komponenten 

direkt in die jeweiligen Pufferlösungen gegeben. Des weiteren wurde die 

Ammoniumkonzentration im Medium von 20 mM auf 2 mM gesenkt, um eine 

mögliche Alkalisierung des Mediums durch Ammonium-Ionen zu verringern. Als 

Kohlenstoffquelle diente Saccharose [5 mM]. 

Bakterienstamm T4 wurde unter Standardbedingungen angezogen (siehe Kap. 2.7). 

Die OD600 nm der Vorkultur wurde mittels eines Photometers bestimmt. Es wurde 

jeweils soviel dieser Vorkultur in ERG´s überführt, dass in den 10 ml - 

Versuchsansätzen jeweils eine Ausgangs-OD600 nm von ca. 0,1 eingestellte. Die 

ERG´s wurden dazu bei 6000 rpm für 5 min zentrifugiert (Heraeus Instruments 

Biofuge pico) und die Überstände verworfen. Die Pellets wurden jeweils in 0,5 ml des 

jeweiligen Ansatzes resuspendiert und in diesen überführt. Die Inkubation erfolgte für 

7 d bei 200 rpm und 30 °C auf einem Rotationsschüttler. Nach jeweils 24 h wurde in 

allen Ansätzen die OD600 nm mittels eines Photometers bestimmt, als Blindwert diente 

MSM + . Es wurden dabei jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt, wobei 

anschließend die Berechnung der Mittelwerte erfolgte. 

2.10.5.2 pH-Wert-Verschiebung in ungepuffertem PS/2-Flüssigmedium 

Um festzustellen, ob Bakterienstamm T4 den pH-Wert des Kulturmediums verändern 

kann, wurde der Stamm bei pH-Werten von 5 - 10 kultiviert; von 5 - 7 und 9 - 10 in 

Schritten von einer Einheit sowie von 7 - 8,4 in Schritten von 0,2 Einheiten.


Die Bakterien wurden nach dem generell angewendeten Verfahren (siehe Kapitel 

2.8.1) in Erlenmeyerkolben eingebracht. Das PS/2-Flüssigmedium wurde vor dem 

Autoklavieren mittels Zugabe von 1 M NaOH bzw. 1 M HCl auf die verschiedenen 

pH-Werte eingestellt. Die Inkubation erfolgte für 24 h bei 30 °C und 200 rpm auf 

einem Rotationsschüttler. Anschließend erfolgte eine Überprüfung der pH-Werte in 

den jeweiligen Kulturansätzen. 

2.10.6 Salinitäts-Optimum 

Zur Ermittlung des Salinitäts-Optimums von Bakterienstamm T4 wurde zunächst eine 

Vorkultur unter Standardbedingungen in PS/2-Flüssigmedium (siehe Kap. 2.7) 

angesetzt, die Versuchsansätze daraus angeimpft (siehe Kap. 2.8.1) und bei 200rpm 

und 30 °C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Nach 24 und 48 h wurde in allen 

Ansätzen die OD600nm mittels eines Photometers bestimmt, als Blindwert diente PS/2- 

Flüssigmedium. Es wurden dabei jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt, wobei 

anschließend die Berechnung der Mittelwerte erfolgte. 

2.10.7 Substratverwertung 

Um das Substratverwertungsspektrum des Bakterienstammes T4 zu bestimmen, 

wurden einzelne Kohlenstoffquellen in verschiedenen Konzentrationen auf klassische 

Weise getestet. Außerdem kamen zwei kommerziell erwerbliche Testsysteme (Biolog 

GN2 Microplate TM und bioMérieux API 50 CH) zum Einsatz. 

2.10.7.1 Verwertung unterschiedlicher C-Quelle 

Um das Substratverwertungsspektrum von Bakterienstamm T4 zu ermitteln, wurden 

dem MSM (siehe Kap. 2.1.2) 45 ausgewählte Substrate in bestimmten 

Konzentrationen (siehe Tab. 2.14) als jeweils einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt.


Tab. 2.14: Verwertung von ausgewählten Kohlenstoffquellen durch Bakterienstamm T4 und 

deren eingesetzte Konzentrationen bzw. Mengen. 

Substrat 

Konzentration 

Monosaccharide 

D-Glucose 5 mM 

D-Fructose 5 mM 

D-Mannose 5 mM 

D-Rhamnose 5 mM 

D-Arabinose 5 mM 

D-Xylose 5 mM 

D-Ribose 5 mM 

Disaccharide 

D-Cellobiose 5 mM 

D-Lactose 5 mM 

D-Maltose 5 mM 

D-Saccharose 5 mM 

Alkohole 

Glycerin 5 mM 

Methanol 2 mM 

Ethanol 5 mM 

1-Propanol 5 mM 

1- Butanol 5 mM 

Mannitol 5 mM 

Carboxylsäuren 

Acetat 5 mM 

Citrat 5 mM 

Succinat 5 mM 

Benzoat 5 mM 

Fumarat 5 mM 

Malat 5 mM 

Pyruvat 5 mM 

Substrat 

Konzentration 

Polysaccharide 

Stärke 0,5 % (w / v) 

Cellulose 0,05 % (w / v) 

Xylan 0,05 % (w / v) 

Amide 

Harnstoff 5 mM 

Aminosäuren 

L-Asparagin 2 mM 5 mM 

L-Phenylalanin 2 mM 5 mM 

L-Valin 2 mM 5 mM 

L-Glycin 2 mM 5 mM 

L-Leucin 2 mM 5 mM 

L-Isoleucin 2 mM 5 mM 

L-Tryptophan 2 mM 5 mM 

L-Threonin 2 mM 5 mM 

L-Serin 2 mM 5 mM 

L-Alanin 5 mM 

L-Glutamin 5 mM 

L-Cystein 5 mM 

Undefinierte 

Gemische 

Casamino acids 0,5 % (w / v) 

Malzextrakt 0,5 % (w / v) 

Hefeextrakt 0,5 % (w / v) 

Pepton 0,5 % (w / v) 2 % (w / v) 

Fleischextrakt 0,5 % (w / v) 2 % (w / v) 

Zunächst wurde Bakterienstamm T4 unter Standardbedingungen auf festen 

Nährböden angezogen (siehe Kap. 2.7). Wenn die Bakterien nach 4 - 8 d 

ausreichend gewachsen waren, wurden sie mittels einer Impföse in 2 ml ERG´s, 

gefüllt mit je 0,75 ml MSM, überführt. Mit Hilfe einer Pipette (Eppendorf; 1000 µl) 

wurde die Suspension homogenisiert. Aus dieser Bakteriensuspension und MSM 

wurde anschließend ein Inokulum hergestellt, welches eine OD600 nm von ca. 0,1 

hatte. Die OD600 nm wurde mittels eines Photometers überprüft. Nun wurden je 10 ml 

dieses Inokulums in 100 ml Erlenmeyerkolben gefüllt und die C-Quelle in jeweiliger


Konzentration aus einer hochkonzentrierten Stammlösung hinzugegeben. Als 

Negativkontrolle diente ein Versuchsansatz ohne Testsubstrat. Die Inkubation 

erfolgte für 7 d bei 200 rpm und 30 °C auf einem Rotationsschüttler (Gesellschaft für 

Labortechnik; GFL). Nach jeweils 24 h wurde in allen Ansätzen die OD600 nm mittels 

eines Photometers bestimmt, wobei MSM als Blank diente. Es wurden dabei jeweils 

Doppelbestimmungen durchgeführt, wobei anschließend die Berechnung der 

Mittelwerte erfolgte. 

2.10.7.2 GN2 Microplate TM -Testsystem (Biolog) 

Die BIOLOG-Mikrotiterplatten (Biolog GN2 Microplate TM ) erlauben es, 95 

verschiedene Kohlenstoffquellen parallel für einen Organismus zu testen. Als 

Substrate werden Kohlenhydrate, Carbonsäuren, Amide, Ester, Aminosäuren, 

Peptide, Amine, Alkohole, Aromaten, halogenierte, phosphor- und schwefelhaltige 

Substanzen sowie Polymere angeboten, die in dehydrierter Form zusammen mit 

einem gering konzentrierten Nährmedium und einem Redoxindikator (Tetrazolium) in 

den Brunnen der Platten (Wells) vorliegen. Der zunächst farblose Redoxindikator 

nimmt durch die Respiration der Bakterien beim Abbau der jeweiligen 

Kohlenstoffquelle eine violette Farbe an. 

Um die Substratverwertung von Bakterienstamm T4 mittels des Biolog-Systems zu 

testen, wurden die Bakterien in einem definierten MSM (siehe Kap. 2.1.2) sowie in 

NaCl-Lösung (2,5g NaCl / l Aqua bidest.) auf Substrattestplatten für Gram-negative 

Bakterien (GN2 Microplate TM ; Biolog) aufgebracht. Diese Platten besitzen 96 

Vertiefungen, 95 davon enthalten je ein zu testendes Substrat. Als Kontrolle dient 

eine Vertiefung, welche nur Aqua bidest. enthält (RAU, 2005). 

Für die Versuche wurden je 5 ml einer Vorkultur (siehe Kap. 2.7) bei 4 °C und 5000 g 

für 5 min zentrifugiert (Beckman GS-15 R) und in 25 ml NaCl-Lösung bzw. 24,9 ml 

MSM, 75 µl 7-Vitamine-Lösung und 25 µl SL-8 resuspendiert, um in beiden Fällen 

eine Start-OD600 nm von ungefähr 0,15 einzustellen. Anschließend wurde in jede der 

Vertiefungen 150 µl des jeweiligen Ansatzes eingebracht. Die Platten wurden in eine 

feuchte Kammer gelegt und kamen für 8 d zur Inkubation bei 30 °C in einen 

Brutschrank (New Brunswick Scientific) (RAU, 2005).


2.10.7.3 API 50 CH-Testsystem (bioMérieux) 

Das API 50 CH-Testsystem ist ein standardisiertes System zur Überprüfung des 

Kohlenhydratstoffwechsels von Mikroorganismen anhand von 49 miniaturisierten 

biochemischen Reaktionen. Die Anwendung erfolgte nach den Angaben in der 

Herstellervorschrift (bioMérieux). 

Um die Substratverwertung von Bakterienstamm T4 mittels des API 50 CH- 

Testsystems zu untersuchen, wurden die Bakterien in modifiziertem MSM (siehe 

Kap. 2.1.2) auf die fünf Substratteststreifen des Testsystems aufgebracht. Die 

Streifen besitzen insgesamt 50 minituarisierte Reaktionskammern, 49 davon 

enthalten je ein zu testendes Substrat. Als Kontrolle dient eine Kammer, welche 

Aqua bidest. enthält. 

Für den Versuch wurde eine Vorkultur (siehe Kap. 2.7) bei 6000 rpm für 5 min 

zentrifugiert (Heraeus Instruments Biofuge pico) und in dem modifizierten MSM 

resuspendiert, wobei eine Start-OD600 nm von ungefähr 0,1 eingestellt wurde. Mit 

einer sterilen Pasteurpipette wurde die Suspension in die Röhrchen und Becher der 

Substratteststreifen gefüllt und diese in der Inkubationswanne bei 30 °C in einem 

Brutschrank inkubiert. Eine positive Reaktion (Verwertung der C-Quelle) wurde durch 

den Umschlag des pH-Indikators (Phenolrot) von rot bis hin zu gelb angezeigt. Die 

Ansätze wurden täglich kontrolliert. Sobald sich die Blindkontrolle orange verfärbte, 

wurde der Versuch beendet. 

2.10.8 Verwertung unterschiedlicher Aminosäuren als einzige C- und N-Quelle 

Um die Verwertung unterschiedlicher Aminosäuren als einzige Kohlenstoff- und 

Stickstoffquelle durch Bakterienstamm T4 zu untersuchen, wurde der Versuch wie in 

Kapitel 2.10.7.1 beschrieben durchgeführt, außer dass dem MSM kein 

Ammoniumchlorid zugesetzt wurde und nur eine Substratkonzentration der 

verwendeten Aminosäuren (siehe Kap. 2.10.7.1) von 5 mM zum Einsatz kam. Als 

Negativkontrolle kam ein Ansatz ohne Zusatz einer Aminosäure zum Einsatz. 

2.10.9 Verwertung unterschiedlicher N-Quellen 

Um die Verwertung unterschiedlicher Stickstoffquellen durch Bakterienstamm T4 zu 

testen, wurden dem MSM jeweils verschiedene Konzentrationen an 

Ammoniumchlorid, Natriumnitrat und Kaliumnitrit beigefügt (siehe Tab. 2.15).


Tab. 2.15: Eingesetzte Stickstoffquellen und deren Konzentrationen in den jeweiligen 

Kulturansätzen. 

Stickstoffquellen 

Eingesetzte Konzentrationen [mM] 

Ammoniumchlorid 1, 2, 5, 10, 20, 40 

Natriumnitrat 5, 10, 20, 40 

Kaliumnitrit 0,5; 1, 2, 5, 10 

In den Ansätzen mit Nitrat und denen mit Nitrit als einzige Stickstoffquelle wurde dem 

MSM kein Ammoniumchlorid zugesetzt. Als Kohlenstoffquelle diente Saccharose [5 

mM]. Als erste Negativkontrolle diente je ein Ansatz ohne Ammonium, Nitrat bzw. 

Nitrit, als zweite ein Ansatz ohne Kohlenstoffquelle. Ansonsten wurde das 

Experiment wie in Kapitel 2.10.7.1 beschrieben durchgeführt. 

2.10.10 Verwertung unterschiedlicher Phosphatkonzentrationen 

Um zu überprüfen, wie sich verschiedene Phosphatkonzentrationen im MSM auf das 

Wachstum von Bakterienstamm T4 auswirken, wurden dem Medium 

unterschiedliche Konzentrationen (siehe Tab. 2.16) an di-Kaliumhydrogenphosphat 

zugesetzt. 

Tab. 2.16: Eingesetzte di-Kaliumhydrogenphosphat-Konzentrationen in den jeweiligen 

Kulturansätzen. 

Substrat 


di-Kaliumhydrogenphosphat 1, 2, 5, 10, 15, 20, 40 

Als Kohlenstoffquelle diente Saccharose [5 mM]. Als erste Negativkontrolle diente 

ein Ansatz ohne Phosphat, als zweite ein Ansatz ohne Kohlenstoffquelle. Im Übrigen 

wurde der Versuch wie in Kapitel 2.10.7.1 beschrieben durchgeführt. 


Phosphatkonzentrationen 

Der Einfluss unterschiedlicher Phosphatkonzentrationen auf den Carotinoidgehalt 

von Bakterienstamm T4 und damit auf deren Synthese wurde untersucht, indem 

verschiedene Konzentrationen (siehe Tab. 2.17) an di-Kaliumhydrogenphosphat 

dem MSM beigefügt wurden.


Tab. 2.17: In den jeweiligen Kulturansätzen eingesetzte di-Kaliumhydrogenphosphat- 

Konzentrationen. 

Substrat 


di-Kaliumhydrogenphosphat 1, 5, 10, 15 

Als Kohlenstoffquelle diente Saccharose [5 mM]. Als erste Negativkontrolle diente 

ein Ansatz ohne Phosphat, als zweite ein Ansatz ohne Kohlenstoffquelle. Des 

weiteren wurde das Experiment, wie in Kap 2.10.7.1 beschrieben, durchgeführt, 

außer dass die Inkubationsdauer nur 4 d betrug. 

Nach 4 d wurde in allen Kulturansätzen die OD600 nm zur Kontrolle des Wachstums 

mittels eines Photometers bestimmt. Absorptionsspektren der Carotinoide in 

Methanol als Lösungsmittel wurden nach der in Kapitel 2.10.3.1 beschrieben 

Methode aufgenommen, außer dass je 1 ml der Ansätze in 2 ml ERG´s pipettiert 

und die nach der Zentrifugation erhaltenen Pellets in je 1 ml eiskaltem Methanol 

resuspendiert wurden. Weiterhin wurde eine 0,25 ml Quarzküvette (Hellma) 

verwendet. 

2.10.11 Vitaminbedürftigkeit 

Um zu testen, ob Bakterienstamm T4 bestimmte Vitamine zum Wachstum benötigt, 

wurde das MSM (siehe Kap. 2.1.2) sowohl mit als auch ohne Zusatz einer 7- 

Vitamine-Lösung (siehe Kap. 2.2.1.2) angesetzt. Als Kohlenstoffquelle wurde 

Saccharose [5 mM] eingesetzt. Als Negativkontrolle diente ein Ansatz ohne 

Kohlenstoffquelle. 

Im Übrigen wurde der Versuch, wie in Kapitel 2.10.7.1 beschrieben, durchgeführt, 

außer dass die Inkubationsdauer nur 2 d betrug. 

2.10.12 Spurenelementabhängigkeit 

Um festzustellen, welche Rolle Spurenelemente für das Wachstum von 

Bakterienstamm T4 spielen, wurde das MSM (siehe Kap. 2.1.2) sowohl mit als auch 

ohne Zusatz von SL 8-Lösung (siehe Kap. 2.2.1.1) angesetzt. Als Kohlenstoffquelle 

kam Saccharose [5 mM] zum Einsatz. Ein Ansatz ohne Kohlenstoffquelle diente als 

Negativkontrolle. 

Das Experiment wurde, wie in Kapitel 2.10.7.1 beschrieben, durchgeführt, mit 

Änderung der Inkubationsdauer auf 2 d.


2.11 Biochemische Untersuchungen 

2.11.1 Antibiotika-Resistenzen (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Um zu überprüfen, ob beim Bakterienstamm T4 Resistenzen gegen bestimmte 

Antibiotika vorliegen, wurde ein Agardiffusionstest durchgeführt. Dabei diffundiert die 

zu testende Substanz vom dem Auftragepunkt (Filterpapierscheibchen) aus in den 

Agar, welcher zuvor mit dem zu testenden Mikroorganismus beimpft wurde. Die im 

Laufe der Inkubation eventuell auftretenden Hemmhöfe und deren Größe sind ein 

Maß für die Empfindlichkeit des untersuchten Bakteriums gegen die getesteten 

Antibiotika, wobei der Testorganismus als Indikator eingesetzt wird. Da das 

Resistenzspektrum artspezifisch ist, lässt es sich zur Klassifizierung von Bakterien 

einsetzen (SÜßMUTH et al., 1999). 

Als Nährböden dienten PS/2-Medium-Agarplatten (siehe Kap. 2.1.1), die 0,3 % Agar 

enthielten. In diesen Agar wurde Bakterienstamm T4 mit einer Start-OD600 nm von ca. 

0,1 eingegossen. Dazu wurde der im Wasserbad (Gesellschaft für Labortechnik; 

GFL) auf 45 °C temperierte Agar mit einer entsprechenden Menge PS/2- 

Flüssigmedium-Vorkultur (siehe Kap 2.7) beimpft und gut durchmischt. 

Anschließend wurde er sofort in Petrischalen gegossen. 

Nach Erkalten der Agarplatten wurden unter sterilen Bedingungen je 4 sterile 

Filterpapierplättchen, welche mittels eines handelsüblichen Papierlochers 

ausgestanzt worden waren, gleichmäßig auf den Agarplatten verteilt. Pro Agarplatte 

wurden je 2 Antibiotika in je 2 Konzentrationen (siehe Tab. 2.18) aus 

hochkonzentrierten Stammlösungen eingesetzt. 

Tab. 2.18: Eingesetzte Antibiotika für die Resistenzüberprüfung von Bakterienstamm T4 

sowie deren Mengen. 

Antibiotikum 

Konzentrationen 

(µg / Filterplättchen) 

Ampicilin 10, 100 

Chloramphenicol 25, 250 

Carbenicillin 25, 250 

Kanamycin 30, 300 

Lincomycin 15, 150 

Neomycin 15, 150 

Penicillin-G 15, 150 

Polymycin B 30, 300 

Rifampecin 20, 200 

Streptomycin 30, 300 

Tetracyclin 20, 200 

Novobiocin 20, 200


Als Negativkontrolle diente ein Ansatz ohne Zugabe eines Antibiotikums. Die 

Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C im Brutschrank. Es wurden dabei jeweils 

Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Auswertung erfolgte makroskopisch mittels 

eines Stereomikroskops (Zeiss Stemi SV 6) sowie mit Hilfe einer Durchlicht- 

Einrichtung (Schütt Labortechnik Kolonien-Zähler). Es wurde nur das Auftreten eines 

Hemmhofs gewertet, nicht aber der jeweilige Durchmesser miteinbezogen. Wenn 

kein Hemmhof auftrat, wurde dies als Wachstum gewertet. 

2.11.2 Enzymnachweise 

2.11.2.1 Katalase-Nachweis (modifiziert nach SÜßMUTH et al., 1999) 

Katalase, ein Eisenporphyrin-haltiges Enzym, ermöglicht es den Bakterien, im 

Stoffwechsel entstehendes und für die Zelle toxisches Wasserstoffperoxid (H2O2) 

abzufangen (SÜßMUTH et al., 1999). 

2 H O 

2 

2 

Katalase 

⎯⎯⎯→2HO+ O ↑ 

2 

2 

(SÜßMUTH et al., 1999) 

Um zu testen, ob der Bakterienstamm T4 dieses Enzym besitzt, wurden auf eine gut 

gewachsene Bakterienkultur (siehe Kap. 2.8.2) einige Tropfen einer 10%igen 

Wasserstoffperoxid-Lösung gegeben. An der Entwicklung von Sauerstoff 

(Gasbläschen) nach der Reaktion sind Katalase-positive Kulturen erkennbar. 

2.11.2.2 Oxidase-Nachweis (Merck) 

Die Cytochromoxidase, das terminale Enzym der Atmungskette, ist in den 

Membranen vieler Bakterien enthalten und katalysiert die Reaktion (SCHLEGEL, 

1992): 

O 

2 

+ 

4 e 

(SCHLEGEL, 1992) 

− 

Oxidase 

⎯⎯⎯→ 

2O 

2− 

Zum Nachweis von Cytochromoxidase wurden kommerzielle Teststreifen (Merck 

Bactident ® Oxidase-Teststreifen) verwendet. Mit einer Impföse wurde etwas


Bakterienmaterial von einer Vorkultur (siehe Kap. 2.8.2) auf das Reaktionsfeld des 

Teststreifens aufgetragen. Eine Blaufärbung des Reaktionsfeldes zeigt eine positive 

Reaktion an. 

2.11.2.3 Agarase-Nachweis (modifiziert nach NEDASHKOVSKAYA et al., 2004) 

MSM + -Agarplatten (siehe Kap. 2.1.2) wurden punktförmig in der Mitte beimpft und im 

Brutschrank bei 30 °C für 7 d inkubiert. Die Hydrolyse des Agars zeigt sich darin, 

dass die Kolonien, welche Agar hydrolysieren können, mehr oder weniger in ihm 

versinken, da sie ihn verflüssigen. 

2.11.2.4 Amylase-Nachweis (modifiziert nach SÜßMUTH et al., 1999) 

Stärkehaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte beimpft 

und im Brutschrank bei 30 °C für 7 d inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien 

vorsichtig von den Agarplatten abgelöst und diese mit Lugolscher Lösung 

überschichtet. Amylase-positive Kolonien sind durch die Bildung eines ungefärbten 

Hofs in dem dunkelblau gefärbten Agar zu erkennen. 

2.11.2.5 Cellulase A-Nachweis (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Cellulosehaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte 

beimpft und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Cellulase A-positive Kolonien 

sind durch die Bildung eines klaren Hofs in dem vorher trüben Agar zu erkennen. 

2.11.2.6 Cellulase B-Nachweis (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Carboxymethylcellulosehaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in 

der Mitte beimpft und im Brutschrank bei 30 °C für 7 d inkubiert. Anschließend 

wurden die Bakterien vorsichtig von den Agarplatten abgelöst und diese für 30 min 

mit Kongorotlösung (0,5 g / 100 ml Aqua bidest.) überschichtet. Danach wurden sie 

für 15 min mit 1 M NaCl-Lösung entfärbt. Cellulase B-positive Kolonien sind durch 

die Bildung eines ungefärbten Hofs in dem rot gefärbten Agar zu erkennen. 

2.11.2.7 DNAse-Nachweise 

Um zu Überprüfen, ob Bakterienstamm T4 eine DNAse besitzt, kamen zwei 

verschiedene Methoden zum Einsatz.


2.11.2.7.1 DNAse-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agarplatten (modifiziert nach 

SCHREIER et al., 1969) 

DNA-haltige, mit Toluidinblau O versetzte Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden 

punktförmig in der Mitte beimpft und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Als 

Kontrollen dienten Agarplatten, die keine DNA enthielten, aber sonst dem 

Testmedium entsprachen. DNAse-positive Kolonien sind durch die Bildung eines 

rosafarbenen Hofs in dem blau gefärbten Agar zu erkennen. 

2.11.2.7.2 DNAse-Nachweis auf DNA-Agarplatten (modifiziert nach GERHARDT et 

al., 1994) 

DNA-haltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte beimpft 

und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien 

vorsichtig von den Agarplatten abgelöst und diese wurden mit 10%iger HCL-Lösung 

überschichtet, um vorhandene DNA-Moleküle zu denaturieren, was durch eine 

Trübung sichtbar wird. DNAse-positive Kolonien sind durch das Vorhandensein eines 

klaren Hofs in dem getrübten Agar zu erkennen. 

2.11.2.8 Esterase-Nachweis (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Tween 20-haltige, mit Calciumchlorid versetzte Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) 

wurden punktförmig in der Mitte beimpft und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank 

inkubiert. Esterase-positive Kolonien sind durch die Bildung eines kristallinen Hofs zu 

erkennen. Dieser lässt sich, wie im Falle des Lipase-Tests, durch die Bildung von 

Calcium-Seifen erklären. 

2.11.2.9 Gelatinase-Nachweis (modifiziert nach SÜßMUTH et al., 1999) 

Die gelatinehaltigen Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte 

beimpft und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die 

Bakterien vorsichtig von den Agarplatten abgelöst und diese wurden mit einer 

gesättigten Pikrinsäurelösung in 50%igem Ethanol überschichtet. Bei Hydrolyse der 

Gelatine, ist um den Animpfpunkt eine klare Zone erkennbar. Vorhandene Gelatine 

bildet mit der Pikrinsäure einen gelben Farbkomplex (Niederschlag).


2.11.2.10 Lecithinase-Nachweis (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Eigelbhaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte beimpft 

und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Lecithinase-positive Kolonien sind 

durch das Vorhandensein eines trüben Hofs in dem leicht trüben Agar zu erkennen. 

2.11.2.11 Lipase-Nachweis (modifiziert nach KOUKER und JAEGER, 1987) 

Olivenölhaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte 

beimpft und im Brutschrank bei 30 °C für 7 d inkubiert. Lipase-positive Kolonien sind 

durch die Bildung eines kristallinen Hofs zu erkennen. Dieser lässt sich durch die 

Bildung von Calcium-Seifen erklären. 

Lipase-Aktivität kann außerdem mittels UV-Strahlung der Wellenlängen 254 sowie 

366 nm anhand der Fluoreszenz des freiwerdenden und sich im Wasseranteil der 

Agarplatten lösenden Rhodamin B´s sichtbar gemacht werden, wofür in der 

vorliegenden Arbeit eine Benda N-4 K UV-Lampe eingesetzt wurde. 

2.11.2.12 Peptidase-Nachweis (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Caseinhaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte beimpft 

und im Brutschrank bei 30 °C für 7 d inkubiert. Peptidase-positive Kolonien sind 

durch die Bildung eines klaren Hofs in dem vorher trüben Agar zu erkennen. 

2.11.2.13 RNAse-Nachweis (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

RNA-haltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden mittels Drei-Ösen-Ausstrich 

beimpft und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die 

Agarplatten mit 10%iger HCL-Lösung überschichtet, um die unverdauten RNA- 

Moleküle zu denaturieren. RNAse-positive Kolonien sind dann durch das 

Vorhandensein eines klaren Hofs in dem durch die Denaturierung getrübten Agar zu 

erkennen. 

2.11.2.14 Urease-Nachweise 

Zur Überprüfung einer eventuellen Urease-Aktivität bei Bakterienstamm T4 wurden 

drei unterschiedliche Methoden eingesetzt.


2.11.2.14.1 Urease-Nachweis auf festem Nährboden (modifiziert nach SÜßMUTH et 

al., 1999) 

Harnstoffhaltige, mit Phenolrot versetzte Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden 

punktförmig in der Mitte beimpft und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Als 

Kontrollen dienten Agarplatten, die keinen Harnstoff enthielten, aber sonst dem 

Testmedium entsprachen. Urease-positive Kolonien sind durch die Bildung eines 

dunkelvioletten Hofs in dem rot gefärbten Agar zu erkennen. Dieser lässt sich durch 

die Hydrolyse des anwesenden Harnstoffs erklären. Die dabei freiwerdenden 

Ammonium-Ionen sowie das ebenfalls entstehende Kohlendioxid, verursachen eine 

Alkalisierung des Kulturmediums, was sich wiederum in einer Verfärbung des pH- 

Indikators Phenolrot ins Dunkelrote bis Violette zeigt. 

2.11.2.14.2 Urease-Nachweis in flüssigem Nährmedium (modifiziert nach SÜßMUTH 

et al., 1999) 

Harnstoffhaltiges, mit Phenolrot versetztes Flüssigmedium (siehe Kap. 2.1.6.2) 

wurde aus einer Vorkultur angeimpft und unter Standardbedingungen kultiviert 

(siehe Kap. 2.7 sowie 2.8.1). Als Kontrollen dienten Flüssigkulturen, die keinen 

Harnstoff enthielten, aber sonst dem Testmedium entsprachen. Nach zweitägigem 

Wachstum erfolgte die makroskopische Auswertung. Urease-positive Kulturansätze 

verfärben sich dunkelviolett, wohingegen Urease-negative rot bleiben (vergleiche 

Kap. 2.11.2.14.1). 

Ein weiterer Urease-Nachweis wurde mittels des API 10S-Testsystems durchgeführt 

(siehe Kap. 2.11.3). 

2.11.2.15 Xylanase-Nachweis (modifiziert nach YOON et al., 2004) 

Xylanhaltige Agarplatten (siehe Kap. 2.1.6) wurden punktförmig in der Mitte beimpft 

und bei 30 °C für 7 d im Brutschrank inkubiert. Xylanase-positive Kolonien sind durch 

die Bildung eines klaren Hofs in dem vorher trüben Agar zu erkennen. 

Alle Enzymnachweise, mit Ausnahme des Katalase- sowie des Oxidase-Nachweises, 

wurden jeweils dreimal durchgeführt.


2.11.3 API 10S-Testsystem (bioMérieux) 

API 10S ist ein standardisiertes System zur Identifizierung von Enterobacteriaceae 

und anderen Gram-negativen Stäbchen anhand von 11 miniaturisierten 

biochemischen Reaktionen. 

Das API 10S-Testsystem besteht aus 10 Mikroröhrchen, die dehydrierte Substrate 

enthalten. Die Röhrchen werden mit einer Bakteriensuspension beimpft, welche die 

Substrate löst. Bestimmte Stoffwechselprodukte, die eventuell während der 

Inkubation entstehen, bewirken entweder direkt oder nach Zugabe von Reagenzien 

Farbumschläge. Die Interpretation der Ergebnisse erfolgt mit der Hilfe einer 

Ablesetabelle und einer Profilliste. 

Es wurden zwei API 10S-Teststreifen vorbereitet. Beim ersten Ansatz wurde MSM 

(siehe Kap. 2.1.2) als Medium gewählt, beim zweiten eine NaCl-Lösung (2,5 g NaCl / 

l Aqua bidest.). Die Vorkulturen wurden, wie in Kapitel 2.7 beschrieben, angezogen. 

Die weitere Durchführung und Auswertung der Tests geschah nach den Angaben 

des Herstellers (bioMérieux). 

2.11.4 Säurebildung aus Kohlenhydraten (modifiziert nach LEIFSON, 1963) 

In dieser Versuchsreihe wurde geprüft, ob der Bakterienstamm T4 bei der 

Verstoffwechselung unterschiedlicher C-Quellen Säuren bildet und diese ins 

Umgebungsmedium ausschleust, was durch eine Ansäuerung des Mediums 

nachgewiesen werden kann. 

Als Kulturmedium wurde modifiziertes MSM-Flüssigmedium (vergleiche Kap. 2.1.2) 

verwendet. Die Ammoniumchlorid-Konzentration im Medium wurde von 20 mM auf 2 

mM gesenkt, um eine mögliche Alkalisierung des Mediums durch Ammonium-Ionen 

zu verringern, welche eine leichte Ansäuerung des Kulturmediums maskieren 

könnte. Als zu testende Kohlenstoffquellen dienten Glucose, Glycerin, Saccharose, 

Mannose und Maltose. Die Substrate wurden in einer Konzentration von 5 mM 

eingesetzt. Als Indikatorfarbstoff wurde Lackmus ausgewählt, da dieser einen 

geeigneten pH-Wert-Umschlagsbereich besitzt. Bei einem pH-Wert von 8 ist 

Lackmus blau, bei einem von 5 rot. Da Bakterienstamm T4 bei pH 8 am besten 

wächst, ist Lackmus gut geeignet, um eine eventuelle Ansäuerung der Kulturmedien 

anzuzeigen. 

Die Durchführung des Versuchs wurde, wie in Kapitel 2.10.7.1 beschrieben, 

umgesetzt. Allerdings wurden die Versuchsansätze nur 4 d bei 30 °C und 200 rpm 

auf einem Rotationschüttler inkubiert. Alle 24 h wurde jeweils 1 ml der Kulturansätze


und der Negativkontrolle entnommen, in 2 ml ERG´s überführt und je 100 µl 

Lackmus-Lösung (5 mg / ml in 50%igem Ethanol) hinzupipettiert. Die 

Versuchsansätze wurden makroskopisch mit der Negativkontrolle verglichen. Wenn 

Säuren in den Kulturansätzen anwesend waren, nahm das Medium eine mehr oder 

weniger Starke rötliche Färbung an. 

Zusätzlich wurde nach Ablauf der 4 d in allen Kulturansätzen die OD600 nm mittels 

eines Photometers bestimmt. 

2.12 Chemotaxonomische Untersuchungen 

2.12.1 Untersuchungen zur Bestimmung von Pigmenten aus Bakterienstamm T4 

2.12.1.1 Flexirubin-Test (GÜDE, 1980) 

Es wurde mittel eines Flexirubin-Tests untersucht, ob Bakterienstamm T4 Flexirubine 

als Pigmente besitzt. Das Vorhandensein von Flexirubin wird dabei durch 

Überschichtung einer gut bewachsenen Agarplatte (siehe Kap. 2.8.2) mit 20%iger 

KOH-Lösung überprüft. Eine positive Reaktion zeigt sich durch einen Farbwechsel 

der Bakterienkolonien von gelb oder orange nach rot. 

2.12.1.2 Methanolextraktion der Pigmente 

Zum Schutz der in dem methanolischen Extrakt enthaltenen photosensitiven 

Pigmente, fanden alle folgenden Abläufe und Experimente (siehe Kap. 2.12.1.2-8) in 

gedämpftem Licht statt. Zusätzlich war der Extrakt durch eine Alufolie geschützt und 

wurde regelmäßig mit Helium begast, um einer Oxidation der Pigmente durch 

Sauerstoff vorzubeugen. 

Um genügend Material für die folgenden Untersuchungen zur Verfügung zu haben, 

wurde zunächst eine Vorkultur unter Standardbedingungen angesetzt, die 

Versuchsansätze (4 x 500 ml MSM + -Flüssigmedium; siehe Kap. 2.1.2) daraus 

angeimpft (siehe Kap. 2.8.1) und für 3 d bei 200 rpm und 30 °C auf einem 

Rotationsschüttler (Gesellschaft für Labortechnik; GFL) inkubiert. 

Nach Beendigung der Inkubation wurden die insgesamt 2 l Versuchskultur in vier je 

500 ml Zentrifugenbecher überführt und bei 4 °C und 5000 rpm in einer Zentrifuge 

(Beckman Avanti TM J-25) für 10 min zentrifugiert. Die Überstände wurden 

anschließend verworfen, die Pellets in sterilem Leitungswasser wieder aufgenommen 

und in einem 500 ml Zentrifugenbecher vereinigt. Die vereinigten und 

resuspendierten Pellets wurden nochmals zentrifugiert (s.o.) und die Überstände


danach verworfen. Das Feuchtgewicht des erhaltenen Pellets wurde bestimmt. 

Danach wurde es in 200 ml eiskaltem Methanol resuspendiert, für 10 min mit Helium 

begast und zur Extraktion der Pigmente bei 4 °C für 24 h in einen Kühlschrank 

gestellt. 

Danach folgte eine weitere Zentrifugation (s.o.). Der erhaltene Überstand wurde in 

einen 500 ml Rundkoben überführt, für 10 min mit Helium begast, mit einem Stopfen 

sowie einem Paraffinstreifen verschlossen und zur Aufbewahrung in einen 

Kühlschrank gestellt. 

Das verbliebene Pellet wurde anschließend erneut in 100 ml eiskaltem Methanol 

resuspendiert und eine weitere Zentrifugation (s.o.) wurde durchgeführt. Dieser 

Vorgang wurde noch zwei weitere Male wiederholt, bis das Pellet annähernd weiß 

aussah. Die erhaltenen Überstände wurden in dem 500 ml Rundkolben vereinigt, für 

10 min mit Helium begast und mit einem Stopfen sowie einem Paraffinstreifen 

verschlossen. Insgesamt ergab sich eine Ausbeute von ca. 500 ml an 

pigmenthaltigem Extrakt. Dieser wurde zur Aufbewahrung zusätzlich mit Alufolie 

umwickelt und bei 4 °C in einen Kühlschrank gestellt. 

2.12.1.3 Dünnschichtchromatographie (DC) 

Die DC ist ein klassisches flüssigchromatographisches Trennverfahren. Als 

stationäre Phase dient ein relativ polares (wasserlösliches, hydrophiles) Material mit 

hoher spezifischer Oberfläche, meistens Silicagel (Kieselgel), aber auch 

Aluminiumoxid oder Magnesiumoxid sind geeignet. Die mobile Phase hingegen ist 

relativ apolar (fettlöslich, lipophil; Pentan bis Tetrahydrofuran). Die Trennung erfolgt 

durch unterschiedliche Adsorptionen der verschiedenen Molekültypen im Gemisch 

an der stationären Phase, wobei ein apolares Lösungsmittel (z.B. Hexan) langsamer 

eluiert als ein stärker polares (z.B. Ether). Als Faustregel gilt dabei, dass polare 

Stoffe später eluiert werden als apolare (MEYER, 2004). 

Mit Hilfe der DC sollte sich ein erster Überblick über die Inhaltsstoffe des 

methanolischen Extrakts (siehe Kap. 2.12.1.2) verschafft als auch ein geeignetes 

Laufmittel für die folgende säulenchromatographische Aufreinigung gefunden 

werden. Weiterhin wurden zwei verschiedene stationäre Phasen getestet; zum einen 

Aluminiumoxidplatten (Fluka ALOX N / F254; Schichtdicke 0,2 mm) zum anderen 

Kieselgelplatten (Fluka Kieselgel 60 F254; Schichtdicke 0,2 mm). Die Platten wurden 

von 20 x 20 cm auf ca. 10 cm Höhe und ca. 3 cm Breite zurechtgeschnitten. Auf


eine, mit einem weichen Bleistift etwa 1,5 cm über dem unteren Rand der jeweiligen 

Platten gezogene Linie, wurde mit einer Glaskapillare etwas von dem 

methanolischen Extrakt aufgetragen und kurz trocknen gelassen. Anschließend 

wurden sie jeweils in mit ca. 10 ml Laufmittel gefüllte verschließbare Glasgefäße 

gestellt. Als mobile Phase wurden verschiedene Kombinationen und 

Mischungsverhältnisse an Lösungsmitteln getestet (siehe Tab. 2.19). Nach der 

Auftrennung konnten die einzelnen Fraktionen anhand ihrer Eigenfarbe im Tageslicht 

erkannt werden. Mittels UV-Licht (Heraeus Instruments UV-Lampe Typ 5301) wurde 

überprüft, ob eventuell farblose Fraktionen vorlagen. Anschließend wurde aus dem 

Verhältnis der Entfernung der Testsubstanz vom Start zur Entfernung der 

Fließmittelfront vom Start der Rf-Wert berechnet, um ein geeignetes Laufmittel zu 

ermitteln. 

Tab. 2.19: In der DC getestete Lösungsmittel und deren Mischungsverhältnisse zur 

Ermittlung einer optimalen mobilen Phase für die Säulenchromatographie. 

Lösungsmittel 

Mischungsverhältnis 

(v / v) 

Acetonitril - 

Chloroform : Aceton 9 : 1 

Chloroform : Essigsäureethylester 9 : 1 

Chloroform : Methanol 10 : 1 

Dichlormethan : Essigsäureethylester 1 : 2 

Dichlormethan : Essigsäureethylester 4 : 1 

Dichlormethan : Methanol 1 : 2 



2.12.1.4 Säulenchromatographie (SC) 

Die SC funktioniert im Prinzip wie die in Kapitel 2.12.1.3 beschriebene DC, allerdings 

können mit Hilfe dieser Methode viel größere Mengen an Untersuchungsmaterial 

verarbeitet werden (MEYER, 2004). 

Neben den zu untersuchenden Pigmenten enthielt der methanolische Extrakt (siehe 

Kap. 2.12.1.2) noch weitere Zellbestandteile (z. B. Proteine, Lipide), die 

säulenchromatographisch entfernt werden sollten. 

Der Extrakt wurde zunächst etappenweise über einen Rotationsverdampfer (Kika 

Labortechnik) eindestilliert und in dem als optimal ermittelten Laufmittel (siehe Kap. 

3.4.1.2) gelöst. Die Chromatographiesäule (Schott Duran; Ø 5 cm) wurde nach der 

Sedimentationsmethode gepackt. Dazu wurde ungefähr 1 l Lösungsmittel angesetzt


und in eine Säule gefüllt. Anschließend wurden ca. 400 g Aluminiumoxidpulver 

(Fluka ALOX N / F254) langsam in das Laufmittel gegeben. Dabei wurde darauf 

geachtet, dass sich keine Luftdepots in der stationären Phase bildeten. Die im 

Laufmittel gelöste Pigmentprobe (s. o.) wurde auf die Säule gegeben, um in das 

Aluminiumoxidpulver einziehen zu können. Danach wurde so viel Laufmittel auf die 

Säule gegeben, dass die einzelnen Pigmentfraktionen aus der Säule eluiert werden 

konnten. Sie wurden jeweils in kleinen Glasgefäßen aufgefangen, mit Alufolie 

umwickelt und zur Aufbewahrung bei ca. 8 °C in einen Kühlschrank gestellt. 


phase-HPLC; modifiziert nach RABENSTEIN, 1997) 

Die HPLC ist eine leistungsstarke chromatographische Trennmethode, welche vom 

Grundprinzip her genauso wie eine DC oder eine SC (vergleiche Kap. 2.12.1.3 und 

2.12.1.4) abläuft. Allerdings sind die Teilchen der stationären Phase sehr viel 

kleiner, wodurch ein dementsprechend höherer Druck zum Durchpressen der 

mobilen Phase notwendig ist. Aus diesen Gründen rührt der Name der Methode, 

Hoch-Druck-Flüssig-Chromatographie, her (MEYER, 2004). 

In vorliegender Diplomarbeit wurde eine Umkehrphasen-HPLC (Reversed-phase- 

HPLC) durchgeführt. Dabei ist die stationäre Phase sehr apolar. Die mobile Phase 

ist relativ polar (Wasser bis Tetrahydrofuran). Ein polares Lösungsmittel (z.B. 

Wasser) eluiert langsamer als ein weniger polares (z.B. Acetonitril). Als Faustregel 

gilt dabei, dass apolare Stoffe später eluiert werden als polare (vergleiche Kap. 

2.12.1.3) (MEYER, 2004). 

Mittels der beschriebenen HPLC-Methode sollte die Pigmentausstattung von 

Bakterienstamm T4 ermittelt werden. Dazu wurde eine Vorkultur unter 

Standardbedingungen in MSM + -Flüssigmedium (siehe Kap. 2.7) angesetzt, der 

Versuchsansatz (gleiches Medium) daraus angeimpft (siehe Kap. 2.8.1) und für 48 h 

bei 30 °C und 200 rpm auf einem Rotationschüttler inkubiert. 

Nach Ablauf der 48 h wurde eine Methanolextraktion durchgeführt. Dies geschah 

weitestgehend wie in Kapitel 2.10.3.1 beschrieben, außer dass je 1 ml der Ansätze 

in 2 ml ERG´s pipettiert und die nach der Zentrifugation erhaltenen Pellets in je 0,2 

ml eiskaltem Methanol resuspendiert wurden. 

Die gewünschte Auftrennung und Bestimmung der Pigmente aus dem 

methanolischen Extrakt erfolgte mit Hilfe eines Merck/Hitachi- HPLC-Systems. Dazu


wurden je 50 µl Extrakt in eine 0,25 ml Hamilton-Spritze (Bonaduz, Schweiz) 

aufgenommen und über ein Rheodyne-Ventil injiziert, wobei über eine 

Injektionsschleife je 20 µl Extrakt auf eine Trennsäule gegeben wurden. Die 

Auftrennung wurde über eine LiChrospher 100 RP 18-Säule (125-4; 5 µm) mit 

entsprechender Vorsäule (4-4) und einer mobilen Phase als binären 

Niederdruckgradienten durchgeführt. Die mobile Phase setzte sich aus Eluent A (75 

% Acetonitril, 15 % Methanol, 10 % Tetrahydrofuran) und Eluent B (Aqua bidest.; 

sterilfiltriert über 0,2 µm Cellulose-Acetat-Filter von Schleicher & Schuell) zusammen 

(Elutionsprotokoll siehe Tabelle 2.20). Eine konstante Säulentemperatur von 35 °C 

wurde durch einen L-7350 LaChrom-Säulenofen gewährleistet. Mit einer L-6220 

Intelligent Pump wurde die mobile Phase über einen Mixer an einen L-4250 UV/Vis- 

Detektor und einen L-7455 DAD weitergeleitet. Im L-7455 DAD wurden die 

verschiedenen Pigmente bei 450 nm detektiert sowie deren Absorptionsspektren 

parallel jede Sekunde im Wellenlängenbereich von 350 bis 600 nm aufgenommen. 

Die Detektorensignale wurden über ein D-6000 A Interface an einen D-2000 

Chromato-Integrator bzw. einen PC mit D-7000 HPLC System Manager-Software 

von Merck/Hitachi weitergeleitet, dort jeweils aufgezeichnet und berechnet. 

Tab. 2.20: Elutionsprotokoll zur Auftrennung von Pigmenten aus methanolischen, 

bakteriellen Zellextrakten mittels HPLC (modifiziert nach RABENSTEIN, 1997). 

Zeit [min] 

Eluent A [%] Eluent B [%] Flussrate [ml / min] 

0 - 1 85 15 1,5 

1 - 15 100 0 1,5 

15 - 25 100 0 1,5 

25 - 27 85 15 1,5 

27 - 28 85 15 1,5 

Die Identifizierung der verschiedenen Pigmente anhand ihrer Absorptionsmaxima 

sowie ihrer Absorptionsspektren wurde aufgrund käuflich erworbener Standards 

(siehe Tabelle 2.21) als auch anhand von Literaturdaten (HIRSCHBERG und 

CHAMOVITZ, 1994) vorgenommen. 

Tab. 2.21: Liste der zur Pigment-Identifikation verwendeten Standards, ihrer 

Retentionszeiten und Bezugsquellen. 

Pigment Rententionszeit 

[min] DAD 

Bezugsquelle 

Astaxanthin 4,04 DHI-Waters & Environment (Hørsholm, Dänemark) 

Canthaxanthin 7,90 DHI-Waters & Environment (Hørsholm, Dänemark)


Dazu wurde die zu untersuchende Probe je 1 : 2 mit den Standards gemischt und 

ebenfalls in das HPLC-System injiziert (s.o.) , um zu verifizieren, ob es sich bei 

einem der in der Probe enthaltenen Pigmente um Astaxanthin bzw. Canthaxanthin 

handelt, wobei die Daten für Canthaxanthin in einer früheren Projektarbeit (RAU, 

2005) erhoben worden sind. 

2.12.1.6 UV/VIS-Spektralphotometrie 

Die UV/VIS-Spektralphotometrie funktioniert im Prinzip wie eine einfache 

Trübungsmessung (vergleiche Kap. 2.10.1), nur dass nicht bei einer einzigen 

Wellenlänge, z.B. 600 nm, gemessen wird, sondern ein ganzer Wellenlängenbereich 

abdeckt wird. Die dabei entstehenden Absorptionsspektren sind charakteristisch für 

die untersuchte Substanz, so dass Rückschlüsse auf deren Identität möglich sind 

(BRITTON et al., 2004). 

Um einen ersten Überblick von den über die SC getrennten Pigmentfraktionen (siehe 

Kap. 2.12.1.4) zu erhalten und um deren Reinheit zu überprüfen, wurden von ihnen 

UV/VIS-Spektren mittels eines Photometers (Varian Cary 50-Spectrometer) 

aufgenommen. Dies geschah, indem jeweils ca. 1 ml der einzelnen 

Pigmentfraktionen in eine 1 ml Quarzküvette (Hellma) gefüllt und in o.a. Photometer 

deren Absorptionsspektren von 200 - 1000 nm gegen das Laufmittel (siehe Kap. 

3.4.1.2) als Blindwert aufgenommen wurden. 

2.12.1.7 Massenspektrometrie (MS) 

Bei der Massenspektrometrie handelt es sich um eine Methode zur Bestimmung der 

Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum. Dabei erzeugt eine Ionenquelle aus 

einer Substanzprobe einen Strahl gasförmiger Ionen, welche in einem 

Massenanalysator hinsichtlich ihres Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) aufgetrennt 

und letztendlich in einem Detektor als Massenspektrum dargestellt werden. Die zu 

analysierenden Moleküle werden durch Aufnahme oder Abgabe eines Elektrons 

ionisiert, was z. B. durch Elektronen- (Elektronenstoß-Ionisation, EI) erreicht wird. 

Durch Versprühen der Probe in einem elektrischen Feld (Elektrospray-Ionisation, 

ESI) können ebenfalls Ionen erzeugt werden. MS-Spektren sind daher durch das 

Auftreten von Quasi-Molekülionen gekennzeichnet, wie [M + H] + oder [M + Na] + (M = 

Masse) (LOTTSPEICH und ZORBAS, 1998). Im Folgenden sind die beiden 

angewandten Methoden kurz erläutert.


Die EI war die erste verfügbare Ionisationstechnik und ist immer noch die am 

häufigsten genutzte Methode zur Aufzeichnung von Massenspektren von 

Carotinoiden (ENZELL und BACK, 1995). Die in einen gasförmigen Zustand 

gebrachte Probe wird mit 70 eV Elektronen bombardiert, wobei häufig ein einfach 

positiv geladenes Molekülion zurückbleibt (LEHMANN, 1996). Im Allgemeinen ist ein 

EI-Spektrum für jede Substanz und deren chemische Struktur charakteristisch 

(CHAPMAN, 1985). 

Das Ionisierungsprinzip bei der ESI beruht auf einer Desolvatisierung, d. h. dem 

Transfer von Ionen aus der Lösung in die Gasphase (Zerfall des Flüssigkeitsstroms 

in winzige, aneinander gereihte Tröpfchen, „Elektrospray“), was unter 

Atmosphärendruck und durch Anlegung eines elektrischen Feldes geschieht. Die 

Analyse der freien Ionen findet im Hochvakuum (ca. 10 -5 torr) statt. Die 

Massenanalyse geschieht dann mit einem Quadrupolmassenspektrometer oder, wie 

in der vorliegenden Untersuchung, mit einer Ionenfalle (LOTTSPEICH und ZORBAS, 

1998). 

Um die zu untersuchenden Pigmentproben (siehe Kap. 2.12.1.3) für die folgende 

massenspektrometrische Analyse vorzubereiten, wurde zunächst mittels DC und der 

Aufnahme von UV/VIS-Spektren (vergleiche Kap. 2.12.1.3 und 2.12.1.5) überprüft, 

dass jeweils nur eine Pigmentfraktion in den Proben enthalten war. Anschließend 

wurde über einen Rotationsverdampfer (Kika Labortechnik) erneut das Lösungsmittel 

aus den Proben abgezogen. Zur vollständigen Eintrocknung wurden sie 

anschließend an eine Ölpumpe gehängt. Die massenspektrometrische Untersuchung 

der pigmenthaltigen Proben wurde freundlicherweise von Frau Dorit Kemken 

(Abteilung Instrumentelle Analytik, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität 

Bremen) mit Hilfe eines Finnigan MAT 95 (Thermo Finnigan MAT GmbH, Bremen) 

bzw. Bruker Esquire LC (Bruker Daltonics, Bremen) durchgeführt. Die ermittelten 

Spektren und einzelnen Massenzahlen wurden mittels NIST (National Institute of 

Standards and Technology) mit den gegenwärtig verfügbaren Daten aus den 

öffentlichen Datenbanken verglichen. Zusätzlich wurde ein Literaturvergleich 

(BRITTON et al., 2004) vorgenommen. 

2.12.1.8 Kernresonanzspektroskopie (engl. nuclear magnetic resonance NMR) 

NMR ist ein Phänomen, welches zu beobachten ist, wenn man Kerne bestimmter 

Atome in ein statisches Magnetfeld platziert und diese dann zusätzlich einem 

zweiten, oszillierenden Magnetfeld aussetzt (LOHNINGER et al., 2003).


Ob die Isotope der verschiedenen Elemente dieses Verhalten zeigen, hängt davon 

ab, ob die betrachteten Atomkerne eine Eigenschaft besitzen, die man Kernspin 

nennt. Ist dies der Fall, so können sich, einfach ausgedrückt, die Kernspins dieser 

Atomkerne (wie aus quantenchemischen Ableitungen gezeigt werden kann) im 

homogenen Magnetfeld in bestimmte und der Anzahl nach definierte Richtungen 

orientieren (Quantelung des Kernspins). Diesen Positionen sind unterschiedliche 

Energiewerte zugeordnet. Die Umorientierung der Kernspins zwischen diesen 

Niveaus, durch Aufnahme elektromagnetischer Energie, wird als Kernspinresonanz 

bezeichnet. Sie verknüpft Kernspin und Magnetfeldstärke mit der Energie (E), aus 

der direkt die Resonanzfrequenz (n) abgeleitet werden kann (LOHNINGER et al., 

2003): 

n 

H Magnetfeldstärke 

p Kernspin 

E Energie 

h Planck’sches Wirkungsquantum 

n Frequenz 

Somit können verschiedene Atomkerne über deren unterschiedliche 

Resonanzfrequenz detektiert werden (LOHNINGER et al., 2003). 

Um die eingetrockneten Pigmentproben (vergleiche Kap. 2.12.1.7) mittels NMR- 

Spektroskopie zu untersuchen, wurden sie in hochreinem Aceton oder Chloroform 

gelöst und anschließend in NMR-Messröhrchen pipettiert. Diese wurden 

verschlossen und in den supraleitenden Magnet eines NMR-Spektrometers (Bruker 

DPX-200 Avance) eingeführt. Die Messungen wurden bei RT in den angegebenen 

Lösungsmitteln vorgenommen. 

2.13 Molekularbiologische Untersuchungen 

2.13.1 Bestimmung des GC-Gehalts der DNA 

Zur Ermittlung des GC-Gehalts kommen mehrere Methoden in Frage. Zum einen, 

wie in vorliegender Diplomarbeit realisiert, über die Bestimmung der 

Schmelztemperatur (Tm) der DNA, zum anderen über die Sedimentation von DNA in 

der analytischen Ultrazentrifuge sowie die HPLC-Analyse von hydrolysierten DNA 

(SÜßMUTH et al., 1999).


Im folgenden wird kurz die GC-Bestimmung mittels der Tm -Analyse beschrieben. 

Dem „Schmelzen“ der DNA liegt u.a. ein durch Zufuhr thermischer Energie bewirktes 

Lösen der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den A-T- und G-C-Paaren der 

DNA-Doppelhelix zugrunde. Deren Stabilität und somit die Höhe der Tm wird erstens 

durch Wechselwirkungen zwischen einander zugewandten Basen der gepaarten 

Stränge bestimmt: GC-Paare besitzen 3 Wasserstoffbrücken, AT-Paare 2. Deshalb 

ist die Tm umso höher, je höher der Anteil an GC-Paaren in der DNA ist. Zweitens 

ganz wesentlich durch elektrostatische Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte 

zwischen den übereinander gestapelt liegenden Basen. Die durch die thermische 

Energie bewirkte Trennung der beiden Polynukleotidstränge führt zur Ausbildung 

eines ungeordneten DNA-Knäuels. Diese Denaturierung der Sekundärstruktur wirkt 

sich in einer Extinktionszunahme der DNA bei einer Wellenlänge von 260 nm aus 

(SÜßMUTH et al., 1999). 

Da der Tm-Wert, wie alle DNA-Präparationen, durch die Ionenkonzentration der 

verwendeten Puffer stark beeinflusst wird, ist es wichtig, dass sowohl Proben- als 

auch Referenz-DNA in einem Puffer mit gleichem Salzgehalt, in diesem Fall 

Elutionspuffer (EB-Puffer; Molzym), gemessen werden (OWEN, 1969). 

2.13.1.1 Isolierung der chromosomalen DNA (Molzym PrestoSpin D Universal-Kit 

Benutzerhandbuch) 

Die Anzucht der Versuchskulturen wurde nach dem generell angewendeten 

Verfahren in PS/2- (für Bakterienstamm T4) bzw. LB-Flüssigmedium (für E. coli 

Stamm K12) durchgeführt (siehe Kapitel 2.8.2). Die chromosomale Bakterien-DNA 

wurde mittels eines Fertigkits (PrestoSpin D Universal; Molzym) weitestgehend nach 

den Angaben des Herstellers isoliert. Dazu wurden 2 bzw. 4 ml von stationären 

Kulturen der Bakterienstämme T4 bzw. als Referenz E. coli verwendet. Um 

vorhandene RNA zu entfernen, wurde RNAse A, wie im Benutzerhandbuch erläutert, 

eingesetzt. Weiterhin wurde ein zweiter Waschschritt mit 70%igem Ethanol 

durchgeführt. Die Menge des EB-Puffers (Molzym) betrug 100 µl. 

2.13.1.2 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Qualität (modifiziert nach MOORE 

et al., 1999) 

Mittels eines Photometers wurde die Konzentration der isolierten DNA (siehe Kap. 

2.13.1.1) bestimmt. Dazu wurde die in EB-Puffer (Molzym) gelöste DNA 1 : 10 bei E.


coli (Stamm K12) bzw. 1 : 50 bei Bakterienstamm T4 mit hochreinem, 

demineralisiertem, nukleasefreiem Wasser (Ambion) auf 200 µl Endvolumen 

verdünnt und in eine 0,25 ml Quarzküvette (Hellma) pipettiert. Anschließend wurde 

die OD bei 230, 260, 280 und 320 nm photometrisch bestimmt. Als Blindwert kam 

jeweils eine entsprechende EB-Puffer-Verdünnung zum Einsatz. Die Konzentration 

der DNA wurde rechnerisch ermittelt (siehe folgende Formel): 

DNA-Konzentration (µg / ml) = (A260 nm – A320 nm) x DNA-Extinktionskoeffizient (50) x 

Verdünnungsfaktor 1 

1 PrestoSpin D Universal-Kit Benutzerhandbuch 

Eine Absorption von 1 (1 cm Schichtdicke der Küvette) bei 260 nm (A260 nm), korrigiert 

um den Hintergrund bei 320 nm (A320 nm), entspricht 50 µg dsDNA / ml. Der Wert für 

A320 nm sollte nicht mehr 0,1 betragen. Dies würde auf die Anwesenheit von 

partikulären Substanzen in der DNA-Lösung hindeuten. 

Um weitere Aussagen über die Qualität der DNA treffen zu können, wurden 

zusätzlich folgende Absorptionsquotienten näher betrachtet: 

1. 

Absorptionsquotient 

2. 

Absorptionsquotient 

1 MOORE et al., 1999 

(A 

= 

(A 

(A 

= 

(A 

260 nm 

280 nm 

230 nm 

260 nm 

- 

- 

- 

- 

A 

A 

A 

A 

320 nm 

320 nm 

320 nm 

320 nm 

) 

) 

) 

) 

Mit Hilfe des ersten Absorptionsquotienten, dem Verhältnis von A260 nm 

(Absorptionsmaximum von DNA) zu A280 nm (Absorptionsmaximum von aromatischen 

Aminosäuren in Proteinen) kann eine Aussage darüber gemacht werden, ob der 

DNA-Extrakt mit Proteinen oder RNA verunreinigt ist. Idealerweise sollte der Wert 

des ersten Absorptionsquotienten zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Ein kleinerer Wert 

zeigt eine Verunreinigung durch Proteine an und ein größerer Wert deutet auf die 

Gegenwart von RNA hin. Die Autoren schlagen außerdem einen weiteren 

Absorptionsquotienten, das Verhältnis von A230 nm (Absorptionsmaximum vieler 

Polysaccharide sowie Absorptionsminimum von DNA) zu A260 nm 

(Absorptionsmaximum von DNA) als weiteren Indikator einer Kontamination vor. Der 

1 

1


Wert des zweiten Absorptionsquotienten sollte zwischen 0,3 und 0,9 liegen, wobei 

größere Werte auf die Gegenwart von Polysacchariden hindeuten. 

2.13.1.3 Bestimmung des Schmelzpunktes (Tm) der DNA (modifiziert nach 

SÜßMUTH et al., 1999) 

Für die Bestimmung des Tm wurde eine Schmelzkurve der DNA in einem Photometer 

aufgenommen. Es wurden 10 µg / ml DNA für die thermische Denaturierung 

eingesetzt. Dazu wurde eine entsprechende Menge des jeweiligen DNA-Extraktes 

(siehe Kap. 2.13.1.1) mit EB-Puffer (Molzym) auf 200 µl Endvolumen verdünnt, in 

eine 0,25 ml Quarzküvette (Hellma) pipettiert und 30 min unter Vakuum in einem 

Exsikkator (Wertheim; Pumpe: Jürgens) entgast, um in den Küvetten das Entstehen 

von Luftbläschen während der Messung zu verhindern. Die Küvetten wurden in einen 

beheizbaren Küvettenhalter gestellt. Im Photometer wurden die sie nun langsam 

erhitzt, wobei folgende Programmeinstellungen verwendet wurden (siehe Tab. 2.22). 

Tab. 2.22: Programmeinstellungen des Photometers bei der Schmelzpunktbestimmung der 

DNA von Bakterienstamm T4. 

Programm 

Einstellung 

Temperaturbereich (°C): 50 - 85 

Temperaturerhöhung (°C / min): 1,0 

Verzögerung (min): 2,0 

Read intervall (°C): 0,5 

Die Extinktionsänderung bei 260 nm wurde gemessen, wobei die Berechnung des für 

die jeweilige DNA geltenden Tm durch das Photometer erfolgte. Als Blindwert kam 

EB-Puffer zum Einsatz. Die erhaltenen Ergebnisse wurden zusätzlich manuell 

überprüft. Dazu wurden die erhaltenen Extinktionswerte gegen die Temperatur 

aufgetragen und die Tm der DNA aus der Graphik bestimmt, welche ungefähr bei der 

halbmaximalen Extinktion (½ ∆ T) anzusetzen ist. 

Mit Hilfe der Tm der untersuchten DNA ist deren GC-Gehalt (mol%) berechenbar, 

wenn gleichzeitig bei jeder Messung E. coli (hier Stamm K12) als Vergleichswert 

gemessen wird (MARMUR und DOTY, 1961):


G + C 

- Gehalt 

{ T 

(mol%) = 

Tm: Schmelzpunkt der DNA 

m 

Probe + ( 90, 

5 − T 

0, 

41 

m 

E. 

coli )} − 

69, 

3 

Es wurde eine Vierfachbestimmung vorgenommen, wobei anschließend die 

Berechnung der Mittelwerte erfolgte. 

2.13.2 Bestimmung der 16S-rDNA-Sequenz 

Um den untersuchten Bakterienstamm in den phylogenetischen Stammbaum der 

Bakterien einordnen zu können, wurde eine Sequenzierung der 16S-rDNA 

vorgenommen (RAU, 2005). 

2.13.2.1 Isolierung der chromosomalen DNA (Molzym PrestoSpin D Universal-Kit 

Benutzerhandbuch) 

Die Anzucht der Versuchskulturen wurde nach dem generell angewendeten 

Verfahren (siehe Kap. 2.8.1) in PS/2-Flüssigmedium (siehe Kap. 2.1.1) durchgeführt. 

Die chromosomale Bakterien-DNA wurde mittels eines Fertigkits (Molzym 

PrestoSpin D Universal-Kit) nach den Angaben des Herstellers isoliert. Dazu wurden 

2 ml einer stationären Kultur von Bakterienstamm T4 verwendet. Die Menge des 

eingesetzten EB-Puffers (Molzym) betrug 100 µl (RAU, 2005). 

2.13.2.2 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Qualität (Molzym PrestoSpin D 

Universal-Kit Benutzerhandbuch) 

Die Überprüfung der Qualität sowie Quantität der DNA (siehe Kap. 2.13.2.1) wurde 

mittels einer Agarosegel-Elektrophorese (peqlab-Elektrophoresekammer) 

durchgeführt. Diese ist die einfachste und effektivste Methode, DNA-Fragemente von 

0,5 bis 25 kb Länge voneinander zu trennen und zu identifizieren. Dazu wird 

Agarose in Elektrophoresepuffer aufgekocht, bis sie gelöst ist. Mit Hilfe eines 

Gelschlittens und eines Kammes wird daraus ein Gel mit Taschen gegossen. 

Sobald die Agarose erstarrt ist, wird das Gel in eine Elektrophoresekammer 

gegeben und der Elektrophoresepuffer hinzugefügt, bis das Gel knapp bedeckt ist. 

Danach werden die DNA-Lösungen in die Taschen pipettiert und es wird eine 

Spannung angelegt (üblicherweise zwischen 50 und 150 Volt). Ist die DNA


ausreichend weit gelaufen, wird das Gel mit einem Farbstoff gefärbt und unter UV- 

Licht ausgewertet. Die Dokumentation erfolgt photographisch (MÜLHARDT, 2006). 

Es wurde eine Agarose-Konzentration von 0,8 % gewählt. Die 

Auftrenngeschwindigkeit betrug 120 V. Das Gel bzw. die enthaltene DNA wurde für 

30 min mit 1%iger Ethidiumbromid-Lösung angefärbt. Als Molekulargewichtsmarker 

wurde λ /Hind III verwendet. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Transilluminators 

(Herolab) (RAU, 2005). 

2.13.2.3 Durchführung einer Standard-PCR (modifiziert nach TICHY und SIMON, 

1994) 

Bei einer Standard-PCR werden DNA-Moleküle erst identisch vermehrt und dann 

wird die DNA-Quantität mittels eines Transilluminators bestimmt. Die PCR selbst 

geschieht in einem Cycler, mit einem definierten Programmablauf. Dabei wird die zu 

untersuchende DNA mit Desoxynukleosidtriphosphaten und der hitzestabilen Taq- 

DNA-Polymerase aus einem thermophilen Bakterium (z.B. Thermus aquaticus) 

zusammengebracht. Weiterhin wird ein Überschuss von zwei Startsequenzen 

(Primer) hinzugesetzt, welche an den Außenrändern des gewünschten DNA- 

Bereichs komplementär zu jeweils einem DNA-Strang sind (CYPIONKA, 2003). 

Um eine ausreichende Menge an DNA für die Sequenzierung der 16S-rDNA zu 

erhalten, wurde eine Standard-PCR durchgeführt. Dazu wurde ein Mastermix (siehe 

Tab. 2.23) angesetzt und dieser in einen Cycler (Eppendorf Mastercycler gradient) 

gestellt. Das angewendete Programm des Cyclers ist in Tabelle 2.24 aufgeführt 

sowie die Sequenzen der verwendeten Primer in Tabelle 2.25 (RAU, 2005). 

Tab. 2.23: Zusammensetzung des Mastermixes (Molzym Moltaq). 

Substanz 

Menge [µl] 

PCR-Puffer (10x) 5,0 

Primer Rn1 (Tichy und Simon, 1994) 0,5 

Primer U2 (Tichy und Simon, 1994) 0,5 

dNTP´s (2 mM) 1,2 

Template 0,2 

Taq-DNA-Polymerase (5 U / µl) 0,2 

Aqua bidest. 42,4


Tab. 2.24: Angewendetes Cyclerprogramm (modifiziert nach TICHY und SIMON, 1994). 

Programmphasen sowie 

Häufigkeit deren Anwendung 

Temperatur [°C] Dauer [min] 

1 x Anfangsdenaturierung 94,0 4 

Denaturierung 

35 x Annealing 

Polymerisation 

94,0 

44,0 

72,0 

1 

1,5 

2 

1 x Endamplifizierung 72,0 10 

1 x Kühlung 4,0 ∞ 

Tab. 2.25: Sequenzen der für die Standard-PCR verwendeten Primer (TICHY und SIMON, 

1994). 

Primer Sequenz (5´- 3´) 

Rn1 GCT CAG ATT GAA CGC TGG CG 

U2 ACA TTT CAC AAC ACG AGC TG 

Die Überprüfung der Qualität und Quantität der DNA erfolgte mittels einer 

Agarosegel-Elektrophorese sowie die Darstellung des Laufs mit Hilfe eines 

Transilluminators (siehe Kap. 2.13.2.2) (RAU, 2005). 

2.13.2.4 Aufreinigung der chromosomalen DNA (Qiagen QIAquick PCR Purification 

Kit 50) 

Die Entfernung der PCR-Rückstände (dNTP´s, Primer und Salze), die sich noch in 

der Probe befanden, erfolgte nach Anleitung eines Fertigkits (Qiagen QIAquick PCR 

Purification Kit 50) (RAU, 2005). 

2.13.2.5 Sequenzierung der 16S-rDNA 

Die erhaltene DNA wurde zur Sequenzierung der 16S-rDNA an die Firma GATC 

Biotech eingeschickt. Zur Amplifizierung wurde der Primer Rn1 (TICHY und SIMON, 

1994) verwendet (RAU, 2005). 

2.13.2.6 Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz mit Datenbanken 

Die 16S-rDNA-Sequenz von Bakterienstamm T4 wurde mittels BLAST 

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen aus 

den öffentlichen Datenbanken verglichen. Anhand der erlangten Ergebnisse wurde


letztendlich versucht, eine Einordnung des untersuchten Bakterienstammes in den 

phylogenetischen Stammbaum der Bakterien vorzunehmen. 

2.13.2.7 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen 

Die 16S-rDNA-Sequenz von Bakterienstamm T4 wurde mit Hilfe der Programme 

CLUSTAL X (Version 1.83) und BIOEDIT (Version 7.05) mit den gegenwärtig 

verfügbaren Sequenzen von naheverwandten Organismen, welche mittels BLAST 

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ermittelt wurden, abgeglichen. Für die Berechnung 

der evolutionären Distanzen wurde die Methode von JUKES und CANTOR (1969) 

verwendet. Unter zu Hilfenahme der Programme MEGA (Version 3.0) und BIOEDIT 

(Version 7.05) wurden die phylogenetischen Dendrogramme mit den Neighbor- 

Joining (NJ)-, Minimum-Evolution (ME)-, Maximum-Parsimony (MP)- und Maximum- 

Likelihood (ML)-Methoden konstruiert. Die Topologie der phylogenetischen 

Stammbäume wurde mittels Bootstrap-Analysen (1000 Wiederholungen) statistisch 

abgesichert. 

2.14 Bezugsquellen der verwendeten Chemikalien 

Alle verwendeten Chemikalien wiesen p.a.-Qualität oder HPLC-Grade auf und 

wurden von, in Tabelle 2.26 aufgeführten, Firmen bezogen. 

Tab. 2.26: Bezugsquellen der verwendeten Chemikalien. 

Bezugsquelle 

Acros Organics (Geel, Belgien) 

Fluka (Buchs, Schweiz) 

Jannsen Chimica (Geel, Belgien) 

Merck (Darmstadt, Deutschland) 

Molzym (Bremen, Deutschland) 

Riedel de Häen (Seelze, Deutschland) 

Roth (Karlsruhe, Deutschland) 

Serva (Heidelberg, Deutschland) 

Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)

Ergebnisse______________________________ _ 59 

3. Ergebnisse 

3.1 Morphologische Untersuchungen 

3.1.1 Koloniemorphologie 

Die Koloniemorphologie des untersuchten Bakterienstammes, angezogen unter 

Standardbedingungen auf MSM + -Agarplatten (siehe Kap. 2.8.2), ist in Tabelle 3.1 

zusammengefasst. Zur Verdeutlichung siehe auch Abbildung 3.1. 

Tab. 3.1: Koloniemorphologie des Bakterienstammes T4 auf MSM + -Agarplatten nach 7 d 

Inkubation bei 30 °C im Brutschrank. 

Form Rand Profil Oberfläche 

rund glatt spiegeleiförmig 

glatt, 

glänzend 

Merkmal 

Aussehen Farbe Konsistenz Ø 

1 mm 

opak orangerot 

weich 4 - 5 mm 

Abb. 3.1: Koloniemorphologie des Bakterienstammes T4 auf MSM + -Agarplatten nach 7 d 

Inkubation bei 30 °C im Brutschrank. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera 

(HewlettPackard photosmart 715) durch ein Stereomikroskop (Zeiss Stemi SV 6; 10 x 

Vergrößerung). Zu sehen sind zwei dicht nebeneinander liegende Kolonien.

Ergebnisse______________________________ _ 60 

Wie aus Tabelle 3.1 und Abbildung 3.1 hervorgeht, besitzen die Kolonien von 

Bakterienstamm T4 eine runde Form, einen glatten Rand und ihr Profil ist 

spiegeleiförmig. Weiterhin besitzen sie eine glatte, glänzende Oberfläche, ein opakes 

Aussehen, eine orange-rote Farbe und ihre Konsistenz ist weich. Nach 7 d 

Wachstum war bei den Kolonien ein Durchmesser von 4 - 5 mm zu verzeichnen. 

3.1.2 Lichtmikroskopische Untersuchungen 

3.1.2.1 Ermittlung der Zellmorphologie 

Die Zellmorphologie des untersuchten Bakterienstammes, angezogen unter 

Standardbedingungen in MSM + -Flüssigmedium (siehe Kap. 2.8.1), ist in Tabelle 3.2 

zusammengefasst. Zur Verdeutlichung siehe ebenfalls Abbildung 3.2. 

Tab. 3.2: Zellmorphologie des Bakterienstammes T4, angezogen in MSM + -Flüssigmedium 

nach 2 d Inkubation bei 30 °C und 200 rpm. Die Merkmalsbestimmung wurde mittels eines 

Lichtmikroskops (Zeiss Axiolab; 1000 x Vergrößerung) vorgenommen. 

Form Größe 

kurze und 

lange 

Stäbchen 

Merkmal 

Zellenden Erscheinungsform 

1,5 - 15,0 x 0,5 - 2,5 µm rund einzeln, doppelt, kurze Ketten, 

häufig agglomerisiert

Ergebnisse______________________________ _ 61 

C 

A 

B 

20 µm 

Abb. 3.2: Zellmorphologie des Bakterienstammes T4, angezogen in MSM + -Flüssigmedium 

nach 2 d Inkubation bei 30 °C und 200 rpm. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera 

(HewlettPackard photosmart 715) durch ein Lichtmikroskop (Zeiss Axiolab; 1000 x 

Vergrößerung). 

A = einzelne Zellen (kurze Stäbchen) 

B = zwei sich teilende Zellen (lange Stäbchen) 

C = Zellagglomerat (kurze und lange Stäbchen); häufigste Erscheinungsform 

Wie Tabelle 3.2 und Abbildung 3.2 zeigen, handelt es sich bei den Bakterienzellen 

um kurze bis lange Stäbchen, welche 1,5 - 15,0 µm lang und 0,5 - 2,5 µm breit sind 

und runde Zellenden besitzen. Sie liegen einzeln, doppelt, in Form von kurzen Ketten 

oder zu Zellhaufen agglomerisiert vor, wobei letztere die häufigste Erscheinungsform 

ist. 

Es konnte weiterhin lichtmikroskopisch beobachtet werden, dass einige der 

Bakterienzellen sich an den OT anhefteten. Dies war deutlich zu erkennen, da sie in 

der Flüssigkeitsströmung zwischen Deckgläschen und OT, welche durch

Ergebnisse______________________________ _ 62 

Austrocknungseffekte verursacht worden war, pendelten. Dabei war eines ihrer 

Zellenden mit der Oberfläche verbunden, während das andere frei hin und her 

schwang. 

3.1.2.1.1 Pleomorphismus 

Unter verschiedenen Inkubations- bzw. Kulturbedingungen konnte ein zum Teil stark 

ausgeprägter Pleomorphismus der Zellen von Bakterienstamm T4 beobachtet 

werden. Tabelle 3.3 gibt eine Übersicht der jeweiligen Bedingungen und daraus 

resultierenden Besonderheiten in der Morphologie der Zellen.

Ergebnisse______________________________ _ 63 

Tab. 3.3: Inkubations- bzw. Kulturbedingungen und daraus resultierende Morphologien der 

Zellen von Bakterienstamm T4. Die Beobachtungen wurden mittels eines Lichtmikroskops 

(Zeiss Axiolab) gemacht. 

Inkubations- bzw. 

Kulturbedingung 

Sauerstoffgehalt des Mediums [mg/ml] 

2,20 2 

4,90 2 

7,25 2 

8,25 2 

Zellmorphologische Besonderheiten 1 

keine 

keine 

keine 

keine 

Inkubationstemperatur (C°) 

5,0 keine 

10,0 fast nur Agglomerate 

15,0 viele Agglomerate 

21,0 keine 

25,0 keine 

30,0 keine 

35,0 keine 

40,0 keine 

42,0 wenige Agglomerate 

45,0 fast keine Agglomerate 

pH-Wert des Mediums 



7,0 keine 

7,5 keine 

8,0 keine 

8,5 viele Sphäroblasten 

9,0 viele Sphäroblasten und unzureichend 

voneinander getrennte Zellen mit Einschlüssen 

10,0 viele Sphäroblasten und unzureichend 

voneinander getrennte Zellen mit Einschlüssen 

Salzgehalt des Mediums [%] 

0,0 keine 

1,0 viele sehr kurze Zellen 

2,0 viele unzureichend voneinander getrennte 

Zellen mit Einschlüssen 

3,0 einige Sphäroblasten 




1 

Generelle Zellmorphologie entsprach der in Tab. 3.2 und Abb. 3.2 dargestellten 

2 

RAU, 2005; Werte entsprechen Inkubationsbedingungen unter 0, 40, 80 und 200rpm 

(vergleiche Kap. 3.2.3.1)

Ergebnisse______________________________ _ 64 

Wie aus Tabelle 3.3 hervorgeht, zeigte Bakterienstamm T4 unter allen vier 

angebotenen Sauerstoffkonzentrationen die Zellmorphologie, welche auch unter 

Standardbedingungen (siehe Tab. und Abb. 3.2) beobachtet wurde. 

Es war weiterhin festzustellen, dass bei 10 und 15 °C Inkubationstemperatur viele bis 

sehr viele Zellen in agglomerisierter Form vorlagen, wohingegen bei 42 und 45 °C 

kaum Agglomerate gebildet wurden. 

Auch unterschiedliche pH-Werte verursachten Pleomorphismuserscheinungen. So 

lagen bei pH 5 und 6 die Zellen in agglomerisierter Form vor. Die pH-Werte 7, 7,5 

und 8 hingegen hatten keinen besonderen Einfluss auf die Zellmorphologie von 

Bakterienstamm T4. Bei pH 8,5, 9 und 10 konnte vermehrt das Auftreten von 

Sphäroblasten festgestellt werden. In Kulturen mit pH-Werten von 9 und 10 konnten 

zusätzlich einige unzureichend voneinander getrennte Zellen mit Einschlüssen 

beobachtet werden. 

Es konnte außerdem festgestellt werden, dass unterschiedliche Salzgehalte des 

Kulturmediums sich ebenfalls auf die Morphologie der Zellen auswirkten. Ohne NaCl 

im Medium konnten keine Besonderheiten in der Zellmorphologie festgestellt werden. 

Betrug die NaCl-Konzentration 1 %, konnte das Auftreten vieler sehr kurzer Zellen 

beobachtet werden. Bei Salzgehalten des Mediums von 3 - 6 % waren als 

Besonderheit einige Sphäroblasten zu erkennen. 

3.1.2.2 Nachweis der Beweglichkeit der Zellen 

3.1.2.2.1 Überprüfung des Vorhandenseins von schwimmender Fortbewegung 

Bei lichtmikroskopischen Untersuchungen des bearbeiteten Bakterienstammes T4 

konnten keine typischen taumelnden Schwimmbewegungen beobachtet werden, 

welche auf die Anwesenheit von Geißeln oder Flagellen hindeuten würden. 

3.1.2.2.2 Überprüfung des Vorhandenseins von gleitender Fortbewegung (modifiziert 

nach SÜßMUTH et al., 1999) 

Dazu wurden verschieden konzentrierte Wasseragarplatten punktförmig in der Mitte 

mit Bakterienstamm T4 beimpft (siehe Kap. 2.9.2.2.2). Während und nach 

Beendigung der Inkubation konnte nicht festgestellt werden, dass die Organismen 

sich auf dem Wasseragar gleitend fortbewegen können.

Ergebnisse______________________________ _ 65 

Wurden die Bakterien allerdings auf xylanhaltigen Agarplatten (siehe Kap. 2.11.2.15) 

angezogen, konnte beobachtet werden, wie die Organismen sich kontinuierlich auf 

dem Agar ausbreiteten. Dieses Verhalten ist beispielhaft in Abbildung 3.3 zu sehen. 

1 cm 

Abb. 3.3: Gleitende Fortbewegung von Bakterienstamm T4 auf xylanhaltiger Agarplatte. 

Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (HewlettPackard photosmart 715) durch ein 

Stereomikroskop (Zeiss Stemi SV 6; 8 x Vergrößerung). Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 

°C im Brutschrank. Unten im Bild ist der dunkelrote Animpfpunkt zu erkennen, an welchen 

sich nach oben eine hellrote Ausbreitungszone anschließt. Der Kreis markiert die Stelle an 

der die Fortbewegung nach 2 d Inkubation begann. Die Ausbreitungsrichtungen werden 

durch die Pfeile angedeutet. 

In einem weiteren Versuch wurden Bakterien, welche eine gleitende Fortbewegung 

gezeigt hatten, auf MSM + - (siehe Kap. 2.1.2) und Wasseragarplatten überimpft, um 

zu überprüfen, ob sie sich auch auf diesen Medien gleitend fortbewegen können. In 

Abbildung 3.4 ist beispielhaft einer der Versuchsansätze dargestellt.

Ergebnisse______________________________ _ 66 

Abb. 3.4: Gleitende Fortbewegung von Bakterienstamm T4 auf MSM + -Agarplatte. 

Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (HewlettPackard photosmart 715). Die Inkubation 

erfolgte für 7 d bei 30 °C im Brutschrank. In der Bildmitte ist der dunkelrote Animpfpunkt zu 

erkennen, an welchen sich rundherum eine hellrote Ausbreitungszone anschließt. Die 

Ausbreitungsrichtungen werden durch die Pfeile angedeutet. 

Wie in Abbildung 3.4 zu sehen, zeigten Bakterien, welche zuvor schon eine gleitende 

Fortbewegung erkennen ließen, auch auf MSM + -Agar dieses Phänomen. Auf 

Wasseragar konnte allerdings, selbst unter diesen Bedingungen, kein Schwärmen 

festgestellt werden (Daten nicht dargestellt). 

Bakterien, welche sich zuvor nicht gleitend fortbewegt hatten, konnten sich auch 

nicht auf MSM + -Agar auf diese Weise fortbewegen (Daten nicht dargestellt). 

3.1.2.3 Bestimmung der Gesamtzellzahl 

Die Gesamtzellzahl konnte nicht bestimmt werden, da große Teile der Zellen die 

Tendenz hatten sich zu agglomerisieren (siehe Abbildung 3.2). Selbst vortexen für 4 

min bei höchster Stufe (Heidolph Instruments REAX top) als auch ein Ultraschallbad 

bei höchsten Stufe für 30 min (Elma Transsonicdigital) konnte die Zellhaufen nicht 

auflösen.

Ergebnisse______________________________ _ 67 

3.1.2.4 Färbetechniken 

3.1.2.4.1 Schleimkapsel-Färbetechniken 

Es wurden verschiedene Färbetechniken durchgeführt, um eventuell vorhandene 

Schleimkapseln sichtbar machen (siehe Kap. 2.9.3.1.1-4). Mit allen vier 

angewandten Färbetechniken war es möglich zu zeigen, dass Bakterienstamm T4 

eine Schleimkapsel besitzt. 

Die besten Resultate konnten dabei über die Schleimkapsel-Färbung mit Kongorot 

und Methylenblau (modifiziert nach DUGUID, 1951) und die mit Kristallviolett und 

Kupfersulfat (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) erzielt werden. Die 

Ergebnisse dieser beiden Experimente sind beispielhaft in den Abbildungen 3.5 und 

3.6 dargestellt. 

Abb. 3.5: Schleimkapsel-Färbung mit Kongorot und Methylenblau (modifiziert nach 

DUGUID, 1951). Aufgenommen mittels einer stationären Kamera (Sony DXC-930 P). Durch 

diese Kapselfärbung werden Bakterienzellen hellblau angefärbt, der Hintergrund violett, die 

Kapseln oder Schleimhüllen bleiben ungefärbt. Die Pfeile markieren exemplarisch einige gut 

sichtbare Schleimkapseln. Das helle Fenster innerhalb der Maske entspricht 20 µm.

Ergebnisse______________________________ _ 68 

Abb. 3.6: Schleimkapsel-Färbung mit Kristallviolett und Kupfersulfat (modifiziert nach 

GERHARDT et al., 1994). Aufgenommen mittels einer stationären Kamera (Sony DXC-930 

P). Durch diese Kapselfärbung werden die Bakterienzellen dunkelviolett und der Hintergrund 

dunkelblau angefärbt. Die Kapseln oder Schleimhüllen erscheinen hellblau. Die Pfeile 

markieren exemplarisch einige gut sichtbare Schleimkapseln. Das Quadrat markiert 

beispielhaft ein Agglomerat von Bakterienzellen, welches durch den anwesenden Schleim 

einen deutlich helleren Hintergrund als die Umgebung besitzt. Das helle Fenster innerhalb 

der Maske entspricht 20 µm. 

3.1.2.4.2 Gram-Färbung (Merck) 

Die Zellen von Bakterienstamm T4 wurden durch die angewandte Gram-Färbung 

(siehe Kap. 2.9.3.2) rot angefärbt. Der eingesetzte Referenzstamm E.coli wurde 

ebenfalls rot angefärbt, wohingegen B.subtilis blau-violett angefärbt wurde. Daraus 

lässt sich schließen, dass es sich bei Bakterienstamm T4 um ein Gram-negatives 

Bakterium handelt. 

3.1.2.5 KOH-Test (SÜßMUTH et al., 1999) 

Bei dem verwendeten KOH-Test (siehe Kap. 2.9.4) ließen sich aus den Lauge- 

behandelten Zellsuspensionen von Bakterienstamm T4 und vom Referenzstamm 

E.coli Schleimfäden (DNA) herausziehen. Dies war bei dem zweiten Referenzstamm 

B.subtilis nicht der Fall. Daraus lässt sich folgern, dass es sich bei Bakterienstamm 

T4 um ein Gram-negatives Bakterium handelt.

Ergebnisse______________________________ _ 69 

3.2 Physiologische Untersuchungen 

3.2.1 Wachstumsversuch in PS/2-Flüssigmedium 

Um das Wachstumsverhalten in einem Vollmedium zu untersuchen, wurde 

Bakterienstamm T4 in PS/2-Flüssigmedium angezogen (siehe Kapitel 2.10.1) (RAU, 

2005). 

Zu Beginn des Versuchs und danach stündlich wurde die OD600 nm gegen PS/2- 

Flüssigmedium als Blindwert in einem Photometer gemessen. Nach 12 h wurde der 

Versuch abgebrochen, da sich die Kulturen in der stationären Phase befanden (siehe 

Tabelle 3.4). Die graphische Darstellung der Ergebnisse findet sich in Abbildung 3.7. 

Zusätzlich wurden die erhaltenen OD600 nm -Werte halblogarithmisch aufgetragen 

(siehe Abbildung 3.8) (RAU, 2005). 

Tab. 3.4: OD600 nm des Bakterienstammes T4 während eines Versuchszeitraums von 12 h. 

Die Inkubation erfolgte in PS/2-Flüssigmedium bei 30 °C und 200 rpm. Die Messungen 

wurden mit Hilfe eines Eppendorf Biophotometers durchgeführt. n = 2 (RAU, 2005). 

Zeit (h) 

OD600 nm 

1 0,120 

2 0,153 

3 0,186 

4 0,225 

5 0,305 

6 0,417 

7 0,516 

8 0,606 

9 0,693 

10 0,744 

11 0,777 

12 0,790

Ergebnisse______________________________ _ 70 

OD (600 nm) 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

Zeit (h) 

Abb. 3.7: Wachstumsverhalten (Zunahme in der OD600 nm) von Bakterienstamm T4. Die 

Inkubation erfolgte in PS/2-Flüssigmedium bei 30 °C und 200 rpm. Die Messungen wurden 

mit Hilfe eines Eppendorf Biophotometers durchgeführt. n = 2 (RAU, 2005). 

OD (600 nm) 

1 

0,1 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

Zeit (h) 

Abb. 3.8: Halblogarithmische Auftragung der OD600 nm- Werte aus Abb. 3.7 (RAU, 2005). 

Zur Ermittlung der Verdopplungszeit sowie der Wachstumsrate wurden jeweils die 

Werte herangezogen, die im linearen Bereich der Wachstumskurve (exponentielle 

Wachstumsphase) lagen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.5 dargestellt (RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 71 

Tab. 3.5: Wachstumsrate µ und Verdopplungszeit td des Bakterienstammes T4 unter den 

Bedingungen eines Vollmediums (PS/2-Flüssigmedium; 30 °C; 200 rpm). n = 2 (RAU, 2005). 

Wachstumsrate µ (h -1 ) 

µ = ln xt – ln x0 / (t – t0) 1 

Verdopplungszeit td (h) 

td = ln 2 / µ 1 

1 SCHLEGEL, 1992 

3.2.2 Wachstum auf MacConkey-Agar (Becton, Dickinson and Company Difco TM ) 

Es wurde überprüft, ob Bakterienstamm T4 auf MacConkey-Agar wachsen kann 

(siehe Kap. 2.10.2). 

Nach 14 d wurde der Versuch ausgewertet. Es stellte sich heraus, dass 

Bakterienstamm T4 nicht auf MacConkey-Agar wachsen und folglich auch keine 

Lactose vergären kann. 

3.2.3 Sauerstoffbedarf, Gärverhalten und Nitratatmung 

Es wurde getestet, wie viel Sauerstoff der untersuchte Bakterienstamm T4 zum 

Wachstum benötigt und ob er eventuell Glucose vergären oder eine Nitratatmung 

durchführen kann. Dazu wurde ein Versuch mit vier verschiedenen Ansätzen in 100 

ml Anaerob-Flaschen durchgeführt (siehe Kap. 2.10.3). Die Auswertung erfolgte 

nach 4 d Wachstum bei 30 °C. Die Ergebnisse der photometrischen Messungen sind 

in Tabelle 3.6 zusammengefasst. 

Tab. 3.6: Wachstumsverhalten (Zunahme in der OD600 nm) von Bakterienstamm T4 bei 

unterschiedlicher Sauerstoffversorgung (aerob, mikroaerophil und anaerob) in MSM. Die 

Inkubation erfolgte für 4 d bei 30 °C im Brutschrank. n = 2. 

Ansatz-Nr. Ansatz 

0,24 

2,85 

OD600 nm 

1 unbegast, mit WS 0,525 

2 unbegast, mit GS 0,317 

3 begast mit N2, mit GS 0,092 

4 begast mit N2, mit GS + Nitrat 0,245 

WS = Wattestopfen; GS = Gummistopfen 

In den ersten beiden (OD600 nm: 0,525 bzw. 0,317) sowie im vierten Ansatz (OD600 nm: 

0,245) war Bakterienstamm T4 in der Lage zu wachsen, wohingegen dies in Ansatz 

3 (OD600 nm: 0,092) nicht festgestellt werden konnte. Das stärkste Wachstum konnte 

dabei in Ansatz 1 gemessen werden, das schwächste in Ansatz 4. Demnach ist es

Ergebnisse______________________________ _ 72 

Bakterienstamm T4 möglich, unter aeroben (Ansatz 1) und mikroaerophilen (Ansatz 

2) Bedingungen zu wachsen. 

Im anaeroben Milieu mit Ammonium als Stickstoffquelle (Ansatz 3) konnten die 

Bakterien hingegen nicht wachsen. Demnach kann Bakterienstamm T4 keine 

Vergärung von Glucose durchführen. 

Wenn allerdings Nitrat anstatt Ammonium als Stickstoffquelle (Ansatz 4) eingesetzt 

wurde, waren die Bakterien in der Lage zu wachsen. Diesem Ergebnis zufolge kann 

Bakterienstamm T4 eine Nitratatmung durchführen. 


Sauerstoffversorgung 

In Tabelle 3.7 sind die jeweiligen Werte für OD600 nm, Sauerstoffsättigung und 

Sauerstoffgehalt von Kulturen des Bakterienstammes T4 dargestellt. Die Ansätze 

wurden bei verschiedenen Umdrehungszahlen (0, 40, 80 und 200 rpm) auf 

Rotationsschüttlern angezogen. Die Auswertung erfolgte nach 48 h (siehe Kap. 

2.10.3.1) (RAU, 2005). 

Tab. 3.7: Wachstumsverhalten (Zunahme in der OD600 nm) von Bakterienstamm T4 in 

Abhängigkeit der Sauerstoffsättigung und des Sauerstoffgehalts bei verschiedenen 

Umdrehungszahlen (0, 40, 80 und 200 rpm) nach 48 h bei 30 °C (Julabo SW21 oder 

Heidolph Unimax 2010 in New Brunswick Scientific Brutschrank). Die Sauerstoffwerte 

wurden mit Hilfe eines Oximeters (WTW Microprocessor Oximeter Oxi 96) bestimmt. n = 2 

(RAU, 2005). 

Ansatz Nr. Umdrehungszahl 

(rpm) 

OD600 nm 

Sauerstoffsättigung 

[%] 

Sauerstoffgehalt 

[mg / ml] 

1 0 0,707 26,0 2,20 

2 40 0,589 62,0 4,90 

3 80 0,668 89,5 7,25 

4 200 0,664 100,0 8,25 

In Ansatz 1 wurde das stärkste Wachstum nach 48 h ermittelt (OD600 nm: 0,707). 

Ansatz 3 (OD600 nm: 0,668) und 4 (OD600 nm: 0,664) besaßen ähnlich hohe Werte wie 

der erste Ansatz. Der niedrigste OD600 nm-Wert wurde in Ansatz 2 gemessen (OD600 

nm: 0,589) (RAU, 2005). 

Die Erklärung dafür ist, dass die Kulturen in den Ansätzen 2 - 4 aufgrund der 

höheren Versorgung mit Sauerstoff schneller gewachsen waren als die in Ansatz 1 

(RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 73 

Zur Verdeutlichung ist in Abbildung 3.9 ein Vergleich der Sauerstoffsättigung der vier 

Ansätze graphisch dargestellt (RAU, 2005). 

Sauerstoffsättigung [%] 

110 

100 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

0 40 80 200 

Umdrehungszahlen [rpm] 

Abb. 3.9: Vergleich der Sauerstoffsättigung in Kulturen des Bakterienstammes T4 bei 

verschiedenen Umdrehungszahlen (0, 40, 80 und 200 rpm) nach 48 h bei 30 °C (Julabo 

SW21 oder Heidolph Unimax 2010 in New Brunswick Scientific Brutschrank). Die 

Messungen wurden mittels eines Oximeters (WTW Microprocessor Oximeter Oxi 96) 

vorgenommen. n = 2 (RAU, 2005). 

In Abbildung 3.10 ist ein Vergleich der Absorptionsspektren der vier Ansätze von 

Methanol-extrahierten Kulturen des Bakterienstammes T4 dargestellt. Die 

Absorptionsspektren wurden von 200 - 1000 nm gegen Methanol als Blindwert mit 

Hilfe eines Photometers aufgenommen (siehe Kapitel 2.10.3.1). Da allerdings im 

Bereich von 600 - 1000 nm keine Absorption auftrat und im Bereich von 200 - 350 

nm u.a. Proteine absorbieren, wurde nur der Bereich von 350 - 600 nm abgebildet, in 

welchem u.a. Carotinoide absorbieren (RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 74 

Absorption 

0,16 

0,14 

0,12 

0,1 

0,08 

0,06 

0,04 

0,02 

0 

350 400 450 500 550 600 

Wellenlänge (nm) 

0 rpm 40 rpm 80 rpm 200 rpm 

Abb. 3.10: Vergleich der Absorptionsspektren von Methanol-extrahierten Zellkulturen des 

Bakterienstammes T4, angezogen bei verschiedenen Umdrehungszahlen (0, 40, 80 und 200 

rpm) nach 48 h Wachstum bei 30 °C (Julabo SW21 oder Heidolph Unimax 2010 in New 

Brunswick Scientific Brutschrank). n = 2 (RAU, 2005). 

Wie aus Abbildung 3.10 hervorgeht, konnte in Ansatz 1 (0 rpm) eine schwache 

Absorption im Wellenlängenbereich von 350 - 600 nm gemessen werden. Der zweite 

Ansatz (40 rpm) besaß im gleichen Bereich ein geringfügig höheres Maß an 

Absorption. In den Ansätzen 3 (80 rpm) und 4 (200 rpm) wurde in diesem Bereich 

eine weitaus höhere Absorption gemessen, wobei Ansatz 4 die höchste Absorption 

aufwies. Auch ist deutlich zu sehen, dass die Absorptionsspektren der vier Ansätze 

umso klarere Schulterform aufwiesen, desto mehr Sauerstoff im Medium vorhanden 

war (RAU, 2005). 

Die Quantität an Carotinoiden nahm folglich umso mehr zu, desto höherer 

Sauerstoffsättigung die Kulturen ausgesetzt waren (RAU, 2005). 

In Abbildung 3.11 ist ein makroskopischer Vergleich der vier Ansätze von Kulturen 

des Bakterienstammes T4 zu sehen, welche bei verschiedenen Umdrehungszahlen 

(0, 40, 80 und 200 rpm) angezogen wurden (RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 75 

0 rpm 40 rpm 80 rpm 200 rpm 

Abb. 3.11: Makroskopischer Vergleich der vier Ansätze von Kulturen des Bakterienstammes 

T4, welche bei verschiedenen Umdrehungszahlen (0, 40, 80 und 200 rpm) angezogen 

wurden, nach 48 h Wachstum bei 30 °C (Julabo SW21 oder Heidolph Unimax 2010 in New 

Brunswick Scientific Brutschrank). Aufgenommen mittels einer Digitalkamera 

(HewlettPackard photosmart 715) (RAU, 2005). 

Wie in Abbildung 3.11 zu erkennen, sind die Ansätze 1 und 2 fast farblos, 

wohingegen die Ansätze 3 und 4 kräftig rot gefärbt sind (RAU, 2005). 

Auch der makroskopische Vergleich der vier Ansätze macht deutlich, dass die 

Kulturen umso stärker gefärbt waren, desto höherer Sauerstoffsättigung sie 

ausgesetzt waren. Die Ergebnisse unterstreichen damit die aus den 

Absorptionsspektren (siehe Abb. 3.10) erzielten Erkenntnisse (RAU, 2005). 

3.2.4 Temperaturoptimum 

Zur Ermittlung des Temperatur-Toleranzbereichs und der optimalen 

Wachstumstemperatur von Bakterienstamm T4, wurde dieser ungeschüttelt bei 

Temperaturen von 5 - 45 °C inkubiert (siehe Kap. 2.10.4). Die Ergebnisse sind in 

Tabelle 3.8 und Abbildung 3.12 dargestellt.

Ergebnisse______________________________ _ 76 

Tab. 3.8: Zusammenstellung der maximalen OD600 nm- Werte von Kulturen des 

Bakterienstammes T4 nach Wachstum bei unterschiedlichen Temperaturen in PS/2- 

Flüssigmedium. Die Inkubation erfolgte ungeschüttelt für 48 h bei 30 °C (Inkubationsorte 

siehe Kap. 2.10.4, Tabelle 2.13). n = 2. 

OD (600nm) 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

Temperatur (°C +/- 1) 

Maximale OD600 nm 

5,0 0,084 

10,0 0,127 

15,0 0,267 

21,0 0,449 

25,0 0,484 

30,0 0,496 

35,0 0,441 

40,0 0,413 

42,0 0,294 

45,0 0,036 

0 24 48 

Zeit (h) 

5°C 10°C 15°C 21°C 25°C 

30°C 35°C 40°C 42°C 45°C 

Abb. 3.12: Wachstum von Bakterienstamm T4 bei unterschiedlichen Temperaturen in PS/2- 

Flüssigmedium. Die Inkubation erfolgte ungeschüttelt für 48 h bei 30 °C (Inkubationsorte 

siehe Kap. 2.10.4, Tabelle 2.13). Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 2. 

Wie aus Tabelle 3.8 sowie Abbildung 3.12 hervorgeht, kann Bakterienstamm T4 bei 

Temperaturen von 15 - 42 °C wachsen, mit einem Optimum bei 25 - 30 °C (maximale 

OD600 nm: 0,484 bzw. 0,496). 

Eine verlängerte Inkubationsdauer von 4 d ergab die gleichen Resultate (Daten nicht 

dargestellt).

Ergebnisse______________________________ _ 77 

3.2.5 pH-Wert-Optimum 

3.2.5.1 pH-Optimum in gepuffertem, modifiziertem MSM + -Flüssigmedium 

Zur Ermittlung des pH-Wert-Toleranzbereichs und des pH-Wert-Optimums von 

Bakterienstamm T4 wurde dieser bei pH-Werten von 5 - 10 inkubiert (siehe Kap. 

2.10.5.1). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.9 sowie Abbildung 3.13 dargestellt. 


Bakterienstammes T4 bei verschiedenen pH-Werten in gepuffertem, modifiziertem MSM + - 

Flüssigmedium. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

OD (600 nm) 

1,6 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

pH-Wert 


5,0 0,113 

6,0 0,131 

7,0 0,875 

7,5 0,967 

8,0 1,401 

8,5 0,444 

9,0 0,397 

10,0 0,126 

0 24 48 72 96 120 144 

Zeit (h) 

pH 5 6 7 7,5 8 8,5 9 10 

Abb. 3.13: Wachstum von Bakterienstamm T4 bei unterschiedlichen pH-Werten in 

gepuffertem, modifiziertem MSM + -Flüssigmedium. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C 

und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 2.

Ergebnisse______________________________ _ 78 

Aus Tabelle 3.9 und Abbildung 3.13 geht hervor, dass Bakterienstamm T4 bei pH- 

Werten von 7 - 9 wachsen kann, mit einem klaren Optimum bei 8 (maximale OD600 

nm: 1,401). 

3.2.5.2 pH-Optimum in ungepuffertem PS/2-Flüssigmedium 

Um festzustellen, ob Bakterienstamm T4 den pH-Wert des Kulturmediums verändern 

kann, wurden die Bakterien bei pH-Werten von 5 - 10 inkubiert (siehe Kap. 2.10.5.2). 

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.10 und Abbildung 3.14 dargestellt. 

Tab. 3.10: pH-Werte von Kulturen des Bakterienstammes T4 vor und nach der 

Inkubationszeit. Als Medium diente ungepuffertes PS/2-Flüssigmedium. Die Inkubation 

erfolgte für 24 h bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

Ansatz Nr. 

pH-Wert vor 

Inkubation 

pH-Wert nach 

Inkubation 

1 5,0 8,4 

2 6,0 8,5 

3 7,0 8,5 

4 7,2 8,6 

5 7,4 8,6 

6 7,6 8,6 

7 7,8 8,6 

8 8,0 8,6 

9 8,2 8,6 

10 8,4 8,6 

11 9,0 8,7 

12 10,0 8,8

Ergebnisse______________________________ _ 79 

pH-Wert 

11 

10 

9 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

Ansatz-Nr. 

vor Inkubation nach Inkubation 

Abb. 3.14: pH-Werte der Kulturansätze von Bakterienstamm T4 vor und nach 24 h 

Inkubation bei unterschiedlichen pH-Werten in ungepuffertem PS/2-Flüssigmedium. Die 

Inkubation erfolgte bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

Tabelle 3.10 sowie Abbildung 3.14 zeigen deutlich, dass Bakterienstamm T4 in der 

Lage ist, den pH-Wert des Kulturmediums zu seinen Gunsten einzustellen. 

Unabhängig davon ob bei einem pH-Wert von 5 oder 10 gestartet wurde, verschob 

der pH sich auf Werte zwischen 8,41 (bei einem Start-pH-Wert von 5) und 8,8 (bei 

einem Start-pH-Wert von 10). 

3.2.6 Salinitäts-Optimum 

Zur Überprüfung des Salzgehalt-Toleranzbereichs und des Salzgehaltoptimums von 

Bakterienstamm T4 wurde dieser bei Salzgehalten von 0 - 15 % inkubiert (siehe Kap. 

2.10.4). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.11 und Abbildung 3.15 zusammengefasst.

Ergebnisse______________________________ _ 80 


Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit verschiedenen Salzgehalten in PS/2- 

Flüssigmedium. Die Inkubation erfolgte für 2 d bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

OD (600 nm) 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

Salzgehalt [%] 


0 0,486 

1 0,452 

2 0,444 

3 0,341 

4 0,235 

5 0,165 

6 0,167 

8 0,104 

10 0,082 

15 0,087 

0 24 48 

Zeit (h) 

0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 8% 10% 15% 

Abb. 3.15: Wachstum von Bakterienstamm T4 mit unterschiedlichen Salzgehalten in PS/2- 

Flüssigmedium. Die Inkubation erfolgte für 2 d bei 30 °C und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm 

≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 2. 

Wie aus Tabelle 3.11 und Abbildung 3.15 hervorgeht, kann Bakterienstamm T4 bei 

Salzgehalten von 0 - 4 % wachsen. Optimales Wachstum wurde ohne NaCl im 

Medium erzielt (maximale OD600 nm: 0,486).

Ergebnisse______________________________ _ 81 

3.2.7 Substratverwertung 

3.2.7.1 Verwertung unterschiedlicher C-Quelle 

Um die Verwertung unterschiedlicher C-Quellen durch Bakterienstamm T4 zu 

ermitteln, wurden dem MSM 45 ausgewählte Substrate in bestimmten 

Konzentrationen als jeweils einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt (siehe Kap. 

2.10.7.1). In Tabelle 3.12 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt. 

Tab. 3.12: Verwertung von ausgewählten Kohlenstoffquellen durch Bakterienstamm T4, in 

Abhängigkeit der eingesetzten Konzentrationen bzw. Mengen und erzielte maximale OD600 

nm- Werte in den Kulturansätzen. Basismedium: MSM. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 

°C und 200 rpm. n = 2. 

Kohlenstoffquelle Substratkonzentration Wachstum 1 Maximale OD600 nm 


D-Glucose 5 mM ++ 4 

0,537 

D-Fructose 5 mM ++ 0,542 

D-Mannose 5 mM ++ 0,578 

D-Rhamnose 5 mM (+) 2 

0,184 

D-Arabinose 5 mM - 7 

0,143 

D-Xylose 5 mM + 3 

0,340 

D-Ribose 5 mM - 0,094 

Disaccharide 

D-Cellobiose 5 mM +++ 5 

0,787 

D-Lactose 5 mM ++ 0,464 

D-Maltose 5 mM ++ 0,580 

D-Saccharose 5 mM +++ 

0,664 

Alkohole 

Glycerin 5 mM + 0,300 

Methanol 2 mM - 0,095 

Ethanol 5 mM - 0,097 

1-Propanol 5 mM - 0,096 

1- Butanol 5 mM - 0,096 

Mannitol 5 mM - 0,097 


Acetat 5 mM - 0,152 

Citrat 5 mM - 0,147 

Succinat 5 mM - 0,088 

Benzoat 5 mM - 0,084 

Fumarat 5 mM + 0,346 

Malat 5 mM - 0,086 

Pyruvat 5 mM - 0,089

Ergebnisse______________________________ _ 82 

Fortsetzung von Tab. 3.12 

Polysaccharide 

Stärke 0,5 % (w / v) + 0,399 

Cellulose 0,05 % (w / v) - 0,100 

Xylan 0,05 % (w / v) - 0,100 

Amide 

Harnstoff 5mM - 0,091 

Aminosäuren 

L-Asparagin 2 mM 5 mM - (+) 0,112 0,184 

L-Phenylalanin 2 mM 5 mM - - 0,089 0,076 

L-Valin 2 mM 5 mM - - 0,086 0,077 

L-Glycin 2 mM 5 mM - - 0,081 0,070 

L-Leucin 2 mM 5 mM - - 0,086 0,080 

L-Isoleucin 2 mM 5 mM - - 0,092 0,082 

L-Tryptophan 2 mM 5 mM - - 0,091 0,077 

L-Threonin 2 mM 5 mM - - 0,086 0,078 

L-Serin 2 mM 5 mM - - 0,094 0,077 

L-Alanin 5 mM - 0,154 

L-Glutamin 5 mM - 0,119 

L-Cystein 5 mM - 0,100 

Undefinierte 

Gemische 

Casamino acids 0,5 % (w / v) ++ 0,583 

Malzextrakt 0,5 % (w / v) +++ 0,682 

Hefeextrakt 0,5 % (w / v) ++++ 6 

1,186 

Pepton 0,5 % (w / v) 2 % (w / v) ++++ ++++ 1,460 2,999 

Fleischextrakt 0,5 % (w / v) 2 % (w / v) ++++ ++++ 1,394 5,460 

1 Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1) 

2 (+) = OD600 nm knapp unter 0,2; 

3 + = OD600 nm zwischen 0,2 und 0,4; 

4 ++ = OD600 nm zwischen 0,4 und 0,6; 

5 +++ = OD600 nm zwischen 0,6 und 0,8; 

6 ++++ = OD600 nm über 0,8; 

7 - = OD600 nm deutlich unter 0,2 

Wie aus Tabelle 3.12 ersichtlich, konnte Bakterienstamm T4 viele der angebotenen 

Mono- und Disaccharide als einzige Kohlenstoffquelle verwerten, wobei die 

getesteten Disaccharide ein durchschnittlich besseres Wachstum ermöglichten. 

Hervorzuheben sind D-Cellobiose (maximale OD600 nm: 0,787) und D-Saccharose 

(maximale OD600 nm: 0,664), welche in dieser Stoffgruppe das beste Wachstum 

ermöglichten. Auffällig ist, dass die beiden getesteten Zucker mit nur fünf C-Atomen, 

Arabinose (maximale OD600 nm: 0,143) und Ribose (maximale OD600 nm: 0,094), 

schlecht bzw. nicht verwertet werden konnten.

Ergebnisse______________________________ _ 83 

Von den angebotenen Alkoholen konnte nur Glycerin zum Wachstum genutzt werden 

(maximale OD600 nm: 0,3). Das getestete Polymer Stärke konnte leichtes Wachstum 

ermöglichen (maximale OD600 nm: 0,399), wohingegen Cellulose und Xylan nicht 

verwertet werden konnten. 

Bakterienstamm T4 war weiterhin in der Lage, nur die angebotene Aminosäure 

Asparagin zu einem leichten Wachstum zu nutzen (maximale OD600 nm: 0,184), 

allerdings nur bei einer Konzentration von 5 mM. 

Außerdem wurden einige undefinierte Gemische getestet, wobei Fleischextrakt in 

einer Konzentration von 2 % (w / v) das mit Abstand beste Wachstum ermöglichte 

(maximale OD600 nm: 5,46), gefolgt von Pepton in gleicher Konzentration (maximale 

OD600 nm: 2,999). Hefeextrakt (maximale OD600 nm: 1,186), Malzextrakt (maximale 

OD600 nm: 0,682) und Casamino acids (maximale OD600 nm: 0,787) in einer 

Konzentration von 0,5 % (w / v) ermöglichten Bakterienstamm T4 ein moderates 

Wachstum. 

Es konnte keine der getesteten Carboxylsäuren zum Wachstum genutzt werden. 

Auch der zu den Amiden zählende Harnstoff konnte nicht verwertet werden. 

3.2.7.2 GN2 Microplate TM -Testsystem (Biolog) 

Um die Substratverwertung von Bakterienstamm T4 mittels des Biolog-Systems zu 

testen, wurden die Bakterien in einem definierten MSM sowie in 0,25%iger NaCl- 

Lösung auf Substrattestplatten für Gram-negative Bakterien aufgebracht (siehe Kap. 

2.10.7.2). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.13 zusammengefasst (RAU, 2005). 

Tab. 3.13: Verwertung der 95 Kohlenstoffquellen des Biolog-Testsystem durch 

Bakterienstamm T4, kultiviert in MSM sowie in 0,25%iger NaCl-Lösung, nach 8 d Inkubation 

bei 30 °C im Brutschrank. Die Auswertung wurde makroskopisch vorgenommen. n = 1 (RAU, 

2005). 

Kohlenstoffquelle 

Wachstum 

MSM NaCl-Lösung 

Polymere 

α-Cyclodextrin P + 1 

- 3 

Dextrin P ++ 2 

+ 

Glycogen + - 

Tween 40 - - 

Tween 80 - - 

Kohlenwasserstoffe 

N-acetyl-D-galactosamin - - 

N-acetyl-D-glucosamin + -

Ergebnisse______________________________ _ 84 


Adonitol - - 

L-Arabinose - - 

D-Arabitol - - 

D-Cellobiose ++ ++ 

i-Erythritol - - 

D-Fructose ++ - 

L-Fucose - - 

D-Galactose ++ + 

Gentiobiose ++ - 

α-D-Glucose ++ ++ 

m-Inositol + - 

α-D-Lactose + - 

Lactulose + - 

Maltose ++ + 

D-Mannitol - - 

D-Mannose ++ ++ 

D-Melibiose - - 

β-Methyl-D-glucosid - - 

D-Psicose - - 

D-Raffinose - - 

L-Rhamnose - - 

D-Sorbitol - - 

Saccharose ++ ++ 

D-Trehalose ++ - 

Turanose ++ - 

Xylitol - - 


Essigsäure - - 

Cis-Aconitsäure - - 

Zitronensäure - - 

Ameisensäure - - 

D-Galactonsäurelacton - - 

D-Galacturonsäure - - 

D-Gluconsäure - - 

D-Glucosaminsäure - - 

D-Glucoronsäure - - 

α-Hydroxybuttersäure - - 

β-Hydroxybuttersäure - - 

γ-Hydroxybuttersäure - - 

p-Hydroxyphenylessigsäure - - 

Itaconsäure - - 

α-Ketobuttersäure - - 

α-Ketoglutarsäure - - 

α-Ketovaleriansäure - - 

D,L-Milchsäure - - 

Malonsäure - - 

Propionsäure - - 

Chinasäure - - 

D-Saccharinsäure - - 

Sebacinsäure - - 

Bernsteinsäure - -

Ergebnisse______________________________ _ 85 


Phosphorylierte, aromatische und bromierte Substrate 

Brombernsteinsäure - - 

Urocaninsäure - - 

Inosin - - 

Uridin - - 

Thymidin - - 

D,L-α-Glycerinphosphat - - 

Glucose-1-phosphat - - 

Glucose-6-phosphat - - 

Ester, Alkohole, Amide, Amine 

Methylpyruvat - - 

Monomethylsuccinat ++ ++ 

2,3-Butandiol - - 

Glycerin - - 

Bernsteinsäuremonoamid - - 

Glucuronamid - - 

L-Alaninamid - - 

Phenyethylamin - - 

Putrescin - - 

2-Aminoethanol - - 

Aminosäuren 

D-Alanin - - 

L-Alanin - - 

L-Alanylglycin - - 

L-Asparagin - - 

L-Aspartinsäure - - 

L-Glutaminsäure - - 

Glycyl-L-aspartinsäure - - 

Glycyl-L-alutaminsäure - - 

L-Histidin - - 

Hydroxy-L-prolin - - 

L-Leucin - - 

L-Ornithin - - 

L-Phenylalanin - - 

L-Prolin - - 

L-Pyroglutaminsäure - - 

D-Serin - - 

L-Serin - - 

L-Threonin - - 

D,L-Carnithin - - 

γ-Amino-Buttersäure - - 

1 + = schwaches Wachstum 

2 ++ = starkes Wachstum 

3 - = kein Wachstum 

Wie aus Tabelle 3.13 hervorgeht, konnte Bakterienstamm T4 je nach verwendetem 

Basismedium unterschiedlich viele der angebotenen Kohlenstoffquellen verwerten 

(RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 86 

War 0,25%ige NaCl-Lösung als Basismedium gegeben, konnten nur wenige 

Substrate zum Wachstum genutzt werden. Wurde allerdings MSM als Basismedium 

eingesetzt, war Bakterienstamm T4 in der Lage, sowohl die Substrate zu verwerten, 

die mit einer 0,25%igen NaCl-Lösung als Basismedium genutzt werden konnten, als 

auch zusätzlich einige andere. Demnach ist anzunehmen, dass bestimmte 

Mineralien, Spurenelemente oder Vitamine essentiell zur Verwertung dieser 

Substrate sind (RAU, 2005). 

Insgesamt konnte Bakterienstamm T4 viele der getesteten Kohlenwasserstoffe (vor 

allem Mono- und Disaccharide) als auch einige Polymere verwerten. Weiterhin war 

T4 in der Lage, die veresterte Verbindung Monomethylsuccinat zum Wachstum zu 

nutzen (RAU, 2005). 

Wurden allerdings bestimmte Carboxyl- oder Aminosäuren, Alkohole, Amide oder 

Amine als Kohlenstoffquellen angeboten, erfolgte kein Wachstum. Auch die 

angebotenen phosphorylierten, aromatischen und bromierten Substrate konnten 

nicht verwertet werden (RAU, 2005). 

3.2.7.3 API 50 CH-Testsystem (bioMérieux) 

Um die Substratverwertung von Bakterienstamm T4 mittels des API 50 CH- 

Testsystems zu untersuchen, wurden die Organismen in modifiziertem MSM auf die 

Substratteststreifen aufgebracht (siehe Kap. 2.10.7.3). Die Ergebnisse des Versuchs 

sind in Tabelle 3.14 zusammengefasst.

Ergebnisse______________________________ _ 87 

Tab. 3.14: Verwertung der 49 Kohlenstoffquellen des API 50 CH-Testsystems durch 

Bakterienstamm T4, kultiviert in modifiziertem MSM, nach 7 d Wachstum bei 30 °C im 

Brutschrank. Die Auswertung wurde makroskopisch vorgenommen. n = 1. 


Wachstum 


D-Arabinose ++ 2 

L-Arabinose ++ 

D-Ribose + 1 

D-Xylose ++ 

L-Xylose ++ 

D-Galactose +++ 3 

D-Glucose +++ 

D-Fructose ++ 

D-Mannose +++ 

L-Sorbose ++ 

D-Lyxose ++ 

D-Tagatose ++ 

Disaccharide 

D-Cellobiose +++ 

D-Maltose +++ 

D-Lactose +++ 

D-Melibiose +++ 

D-Saccharose +++ 

D-Trehalose +++ 

Gentiobiose +++ 

D-Turanose +++ 

Oligo- und Polysaccharide 

D-Melezitose +++ 

D-Raffinose +++ 

Amidon ++ 

Inulin ++ 

Glycogen +++ 


1 

+ = schwaches Wachstum (orange-rote Farbe des pH-Indikators) 

2 

++ = mittleres Wachstum (orange Farbe des pH-Indikators) 

3 

+++ = starkes Wachstum (gelbe Farbe des pH-Indikators) 

4 

- = kein Wachstum (rote Farbe des pH-Indikators) 

Wachstum 

Alkohole/Alditole 

Glycerin - 4 

Erythritol - 

D-Mannitol - 

D-Sorbitol - 

Xylitol - 

D-Arabitol - 

L-Arabitol - 

D-Adonitol - 

Dulcitol - 

Desoxyzucker, Amine, u. a. 

L-Rhamnose ++ 

D-Fucose ++ 

L-Fucose ++ 

Inositol - 

N-Acetylglucosamin +++ 

β-Methyl-D-xylosid ++ 

α-Methyl-D-mannosid +++ 

α-Methyl-D-glucosid +++ 

Amygdalin +++ 

Arbutin +++ 

Esculin +++ 

Salicin +++ 


Gluconat - 

2-Ketogluconat - 

5-Ketogluconat +++ 

Wie aus Tabelle 3.14 hervorgeht, zeigte Bakterienstamm T4 mit allen angebotenen 

Monosacchariden schwaches bis starkes Wachstum. Besonders gut konnten D- 

Galactose, D-Glucose und D-Mannose verwertet werden. 

Die getesteten Disaccharide resultierten alle in einem starken Wachstum der 

Bakterien. Auch die angebotenen Oligo- und Polysaccharide konnten mittelmäßig 

bis sehr gut verwertet werden.

Ergebnisse______________________________ _ 88 

Ebenso zeigten die Bakterien mit fast allen angebotenen Desoxyzuckern, Aminen, 

Glukosiden u.a. mittleres bis starkes Wachstum, nur Inositol konnte nicht verwertet 

werden. 

Die getesteten Alkohole und Alditole konnten durch Bakterienstamm T4 nicht zum 

Wachstum genutzt werden. Auch konnte nur 5-Ketogluconat der drei angebotenen 

Carboxylsäuren durch die Bakterien verwertet werden. 

3.2.8 Verwertung unterschiedlicher Aminosäuren als einzige C- und N-Quelle 

Es wurde die Verwertung unterschiedlicher Aminosäuren als einzige Kohlenstoff- und 

Stickstoffquelle durch Bakterienstamm T4 untersucht (siehe Kap. 2.10.8). Die 

Ergebnisse sind in Tabelle 3.15 dargestellt. 

Tab. 3.15: Aminosäuren-Verwertung durch Bakterienstamm T4, kultiviert in MSM ohne 

Zusatz von Ammoniumchlorid. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

Substrat 

Substratkonzentration Wachstum 1 Maximale OD600 nm 

Aminosäuren: 

L-Asparagin 2mM 5mM (+) 2 

0,191 

L-Phenylalanin 2mM 5mM - 3 0,061 

L-Valin 2mM 5mM - 0,048 

L-Glycin 2mM 5mM - 0,047 

L-Leucin 2mM 5mM - 0,067 

L-Isoleucin 2mM 5mM - 0,084 

L-Tryptophan 2mM 5mM - 0,030 

L-Threonin 2mM 5mM - 0,042 

L-Serin 2mM 5mM - 0,039 

L-Alanin 2mM 5mM - 0,061 

1 Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1) 

2 (+) = OD600 nm knapp unter 0,2; 

3 - = OD600 nm deutlich unter 0,2 

Wie Tabelle 3.15 zeigt, konnte Bakterienstamm T4 nur Asparagin von den 

angebotenen Aminosäuren als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwerten. 

Schwaches Wachstum erfolgte aber nur mit einer Konzentration von 5 mM im 

Medium (maximale OD600 nm: 0,191). 

3.2.9 Verwertung unterschiedlicher N-Quellen 

Um die Verwertung unterschiedlicher Stickstoffquellen durch Bakterienstamm T4 zu 

untersuchen, wurden dem MSM jeweils verschiedene Konzentrationen an

Ergebnisse______________________________ _ 89 

Ammoniumchlorid, Natriumnitrat und Kaliumnitrit zugesetzt (siehe Kap. 2.10.9). Die 

Ergebnisse sind in den Tabellen 3.16-18 sowie den Abbildungen 3.16-18 dargestellt. 


Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit verschiedenen Ammoniumchlorid- 

Konzentrationen, kultiviert in MSM. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C und 200 rpm. n = 

2. 

OD (600nm) 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

Ammoniumchlorid- 

Konzentration [mM] 


0,0 0,112 

1,0 0,539 

2,0 0,601 

5,0 0,519 

10,0 0,447 

20,0 0,358 

40,0 0,287 

0 24 48 72 96 120 144 

Zeit (h) 

0mM 1mM 2mM 5mM 10mM 20mM 40mM 

Abb. 3.16: Ammonium-Verwertung durch Bakterienstamm T4 in Abhängigkeit der 

eingesetzten Konzentration bei Kultivierung in MSM. Die Inkubation erfolgte über 7 d bei 30 

°C und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 2. 

Aus Tabelle 3.16 und Abbildung 3.16 ist ersichtlich, dass Bakterienstamm T4 bei 

Ammoniumchlorid-Konzentrationen von 1 - 40 mM wachsen kann, mit einem 

Optimum bei 2 mM (maximale OD600 nm: 0,601). Wenn kein Ammoniumchlorid im 

Medium war, konnte Bakterienstamm T4 nicht wachsen.

Ergebnisse______________________________ _ 90 

In beiden Negativkontrollen, ohne Ammoniumzusatz bzw. ohne Zusatz von 

Saccharose als Kohlenstoffquelle, konnte Bakterienstamm T4 nicht wachsen (Daten 

nicht dargestellt). 


Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit verschiedenen Natriumnitrat-Konzentrationen, 

kultiviert in MSM ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 

°C und 200 rpm. n = 2. 

OD (600nm) 

0,5 

0,5 

0,4 

0,4 

0,3 

0,3 

0,2 

0,2 

0,1 

0,1 

0,0 

Natriumnitrat- 



0,0 0,112 

5,0 0,177 

10,0 0,286 

20,0 0,351 

40,0 0,387 

0 24 48 72 96 120 144 

Zeit (h) 

0mM 5mM 10mM 20mM 40mM 

Abb. 3.17: Nitrat-Verwertung durch Bakterienstamm T4 in Abhängigkeit der eingesetzten 

Konzentration bei Kultivierung in MSM ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Die Inkubation 

erfolgte über 7 d bei 30 °C und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 

2. 

Wie aus Tabelle 3.17 sowie Abbildung 3.17 hervorgeht, kann Bakterienstamm T4 bei 

Natriumnitrat-Konzentrationen von 5 - 40 mM wachsen, mit einem Optimum bei 20 - 

40 mM (maximale OD600 nm: 0,351 bzw. 0,387). Ohne Natriumnitrat im Medium 

konnte kein Wachstum stattfinden.

Ergebnisse______________________________ _ 91 

Sowohl in den Negativkontrollen ohne Nitratzusatz bzw. ohne Zusatz von 

Saccharose als Kohlenstoffquelle, konnte kein Wachstum festgestellt werden (Daten 



Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit verschiedenen Kaliumnitrit-Konzentrationen, 

kultiviert in MSM ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 

°C und 200 rpm. n = 2. 

OD (600nm) 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

Kaliumnitrit- 



0,0 0,112 

0,5 0,280 

1,0 0,356 

2,0 0,411 

5,0 0,413 

10,0 0,193 

0 24 48 72 96 120 144 

Zeit (h) 

0mM 0,5mM 1mM 2mM 5mM 10mM 

Abb. 3.18: Nitrit-Verwertung durch Bakterienstamm T4 in Abhängigkeit der eingesetzten 

Konzentration bei Kultivierung in MSM ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Die Inkubation 

erfolgte über 7 d bei 30 °C und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 

2. 

Aus Tabelle 3.18 und Abbildung 3.18 geht hervor, dass Bakterienstamm T4 mit 

Kaliumnitrit-Konzentrationen von 0,5 - 10 mM wachsen kann, mit einem Optimum bei 

2 - 5 mM (maximale OD600 nm: 0,411 bzw. 0,413). Wenn kein Kaliumnitrit im Medium 

vorhanden war, konnte kein Wachstum festgestellt werden.

Ergebnisse______________________________ _ 92 

In den Negativkontrollen ohne Zusatz von Nitrit bzw. ohne Zusatz von Saccharose 

als Kohlenstoffquelle, war Bakterienstamm T4 nicht in der Lage zu wachsen (Daten 


Von den drei getesteten N-Quellen ermöglichte Ammonium das beste Wachstum bei 

Bakterienstamm T4, gefolgt von Nitrit und Nitrat. 

3.2.10 Verwertung unterschiedlicher Phosphatkonzentrationen 

Es wurde überprüft, wie sich verschiedene Phosphatkonzentrationen im MSM auf 

das Wachstum von Bakterienstamm T4 auswirken (siehe Kap. 2.10.10). In Tabelle 

3.19 und Abbildung 3.19 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt. 


Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit verschiedenen di-Kaliumhydrogenphosphat- 

Konzentrationen, kultiviert in MSM. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C und 200 rpm. n = 

2. 

di-Kaliumhydrogenphosphat 

-Konzentration [mM] 


0,0 0,116 

1,0 0,295 

2,0 0,386 

5,0 0,636 

10,0 0,791 

15,0 0,609 

20,0 0,086 

40,0 0,048

Ergebnisse______________________________ _ 93 

OD (600nm) 

0,9 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

0 24 48 72 96 120 144 

Zeit (h) 

0mM 1mM 2mM 5mM 10mM 15mM 20mM 40mM 

Abb. 3.19: Phosphat-Verwertung durch Bakterienstamm T4 in Abhängigkeit der 

eingesetzten Konzentration bei Kultivierung in MSM. Die Inkubation erfolgte über 7 d bei 30 

°C und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 2. 

Aus Tabelle 3.19 sowie Abbildung 3.19 geht hervor, dass Bakterienstamm T4 mit di- 

Kaliumhydrogenphosphat-Konzentrationen von 1 - 15 mM wachsen kann, mit einem 

Optimum bei 10 mM (maximale OD600 nm: 0,791). Ohne Phosphat im Medium bzw. 

bei Konzentrationen von 20 und 40 mM fand kein Wachstum statt. 

Auch in der Negativkontrolle Zusatz von Saccharose als Kohlenstoffquelle konnte 

Bakterienstamm T4 nicht wachsen (Daten nicht dargestellt). 


Phosphatkonzentrationen 

Der Einfluss unterschiedlicher Phosphatkonzentrationen auf den Carotinoidgehalt 

von Bakterienstamm T4 wurde untersucht, indem verschiedene Konzentrationen an 

di-Kaliumhydrogenphosphat dem MSM beigefügt wurden (siehe Kap. 2.10.10.1). 

Abbildung 3.20 stellt einen Vergleich der Absorptionsspektren der vier Ansätze (1, 5, 

10 und 15mM Phosphat im Medium) von Methanol-extrahierten Zellkulturen des 

Bakterienstammes T4 dar. Die Absorptionsspektren wurden von 200 - 1000 nm

Ergebnisse______________________________ _ 94 

gegen Methanol registriert (Methanolextraktion und photometrische Messung siehe 

Kap. 2.10.3.1). Da aber im Bereich von 600 - 1000 nm keine Absorptionen auftraten 

und im Bereich von 200 - 350 nm u.a. Proteine absorbieren, wurde nur der Bereich 

von 350 - 600 nm, in welchem u.a. Carotinoide absorbieren, dargestellt. 

Absorption 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

350 400 450 500 550 600 


1mM 5mM 10mM 15mM 

Abb. 3.20: Vergleich der Absorptionsspektren von Methanol-extrahierten Zellkulturen des 

Bakterienstammes T4, angezogen mit verschiedenen Phosphat-Konzentrationen in MSM, 

nach 96 h Wachstum bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

Wie aus Abbildung 3.20 hervorgeht, konnte im Ansatz 1 mit 1 mM Phosphat eine 

schwache Absorption im Wellenlängenbereich von 350 - 600 nm gemessen werden. 

Der 5 mM Phosphat enthaltende Ansatz besaß im gleichen Bereich ein leicht 

höheres Maß an Absorption. In den Ansätzen mit 10 und 15 mM Phosphat wurde in 

diesem Wellenlängenbereich eine deutlich höhere Absorption gemessen. Auch ist 

deutlich zu sehen, dass die Absorptionsspektren der vier Ansätze umso klarere 

Schulterform aufwiesen, umso mehr Phosphat im Medium vorhanden war. 

Die Quantität an Carotinoiden nahm demnach umso mehr zu, desto höheren 

Phosphat-Konzentrationen die Bakterien ausgesetzt waren. Zur Verdeutlichung ist in 

Abbildung 3.21 ein makroskopischer Vergleich der vier beschriebenen Ansätze 

dargestellt.

Ergebnisse______________________________ _ 95 

1mM 5mM 10 mM 15 mM 

Abb. 3.21: Makroskopischer Vergleich von Kulturen des Bakterienstammes T4, angezogen 

mit verschiedenen Phosphat-Konzentrationen in MSM, nach 96 h Wachstum bei 30 °C und 

200 rpm. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (HewlettPackard photosmart 715). 

Wie in Abbildung 3.21 zu erkennen, ist Bakterienstamm T4 beim Wachstum mit nur 1 

mM Phosphat annähernd farblos. Wenn hingegen im Medium eine Phosphat- 

Konzentration von 5 mM vorlag, waren die Bakterien leicht rötlich gefärbt. Die beiden 

Ansätze mit 10 und 15 mM Phosphat waren noch stärker rot gefärbt. 

Auch der makroskopische Vergleich der vier Ansätze macht klar, dass die Kulturen 

umso stärker gefärbt waren, desto höhere Phosphat-Konzentration im Medium 

vorlag. Dieses visuell erfassbare Erscheinungsbild der Kulturen unterstreicht somit 

die Ergebnisse des Absorptionsspektrenvergleichs. 

3.2.11 Vitaminbedürftigkeit 

Um festzustellen, ob Bakterienstamm T4 zum Wachstum Vitamine benötigt, wurde 

das MSM sowohl mit als auch ohne Zusatz einer 7-Vitamine-Lösung angesetzt 

(siehe Kap. 2.10.7.1 und 2.10.11). 

In Tabelle 3.20 sind die verschiedenen Ansätze sowie deren maximal erreichte OD600 

nm- Werte im Verlauf des Experiments aufgelistet. In Abbildung 3.22 sind die 

Ergebnisse des Versuchs graphisch dargestellt.

Ergebnisse______________________________ _ 96 

Tab. 3.20: Zusammenstellung der maximale OD600 nm-Werte von Kulturen des 

Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit und ohne Zusatz von Vitaminen in MSM. Die 

Inkubation erfolgte für 48 h bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

OD (600 nm) 

0,9 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

Ansätze 


Mit 7-Vitamine-Lösung 0,765 

Ohne 7-Vitamine-Lösung 0,755 

0 24 48 

Zeit (h) 

Mit VIT Ohne VIT 

Abb. 3.22: Wachstum von Bakterienstamm T4 mit und ohne Vitamine, kultiviert in MSM. Die 

Inkubation erfolgte über 48 h bei 30 °C und 200 rpm. Wachstum = OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD 

ca. 0,1). n = 2. 

Wie aus Tabelle 3.20 und Abbildung 3.22 hervorgeht, besitzen beide Ansätze nach 

Beendigung der Inkubationszeit fast identische maximale OD600 nm-Werte. In der 

Negativkontrolle, die keine Saccharose als Kohlenstoffquelle enthielt, fand kein 

Wachstum statt (Daten nicht dargestellt). 

Der Bakterienstamm T4 benötigt folglich keine Vitamine zum Wachstum oder zur 

Stimulation des Wachstums. 

3.2.12 Spurenelementabhängigkeit 

Um zu überprüfen, welche Rolle Spurenelemente für das Wachstum von 

Bakterienstamm T4 spielen, wurde das MSM sowohl mit als auch ohne Zusatz einer 

Spurenelemente-Lösung angesetzt (siehe Kap. 2.10.7.1 und 2.10.12). Die 

Ergebnisse sind Tabelle 3.21 sowie Abbildung 3.23 zu entnehmen.

Ergebnisse______________________________ _ 97 

Tab. 3.21: Zusammenstellung der maximale OD600 nm-Werte von Kulturen des 

Bakterienstammes T4 nach Wachstum mit und ohne Zusatz von Spurenelementen in MSM. 

Die Inkubation erfolgte für 48 h bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 

OD (600 nm) 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

Ansätze 


Mit SL8-Lösung 0,700 

Ohne SL8-Lösung 0,288 

0 24 48 

Zeit (h) 

Mit SL Ohne SL 

Abb. 3.23: Wachstum von Bakterienstamm T4 mit und ohne Zusatz von Spurenelementen, 

kultiviert in MSM. Die Inkubation erfolgte über 48 h bei 30 °C und 200 rpm. Wachstum = 

OD600 nm ≤ 0,2 (Start-OD ca. 0,1). n = 2. 

Aus Tabelle 3.21 und Abbildung 3.23 ist ersichtlich, dass sowohl mit 

Spurenelementenzugabe als auch ohne Wachstum stattfand. Allerdings besitzt der 

Ansatz mit Spurenelementen mit 0,7 einen mehr als doppelt so hohe maximale 

OD600 nm-Wert wie der Ansatz ohne (maximale OD600 nm: 0,288). In der 

Negativkontrolle, die keine Saccharose als Kohlenstoffquelle enthielt, fand kein 

Wachstum statt (Daten nicht dargestellt). 

Der Bakterienstamm T4 benötigt demnach keine Spurenelemente zum Wachstum, 

das aber stark durch eine Zugabe stimuliert wird. 

3.3 Biochemische Untersuchungen 

3.3.1 Antibiotika-Resistenzen (modifiziert nach GERHARDT et al., 1994) 

Um zu überprüfen, ob beim Bakterienstamm T4 Resistenzen gegen bestimmte 

Antibiotika vorliegen, wurden die Bakterien einer Auswahl an Antibiotika in zwei

Ergebnisse______________________________ _ 98 

verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt. Die Organismen wurden dazu in PS/2- 

Medium-Agarplatten eingegossen und je 2 Antibiotika in 2 verschiedenen 

Konzentrationen pro Agarplatte aufgebracht (siehe Kap. 2.11.1). 

In Tabelle 3.22 sind die eingesetzten Antibiotika, Antibiotikakonzentrationen und 

deren Einfluss auf das Wachstum von Bakterienstamm T4 dargestellt. 

Tab. 3.22: Eingesetzte Antibiotika, Antibiotikakonzentrationen und Einfluss auf das 

Wachstum von Bakterienstamm T4 auf PS/2-Medium-Agarplatten. Die Inkubation erfolgte für 

7 d bei 30 °C im Brutschrank. Die Auswertung wurde makroskopisch vorgenommen. n = 2. 

Antibiotikum 

1 - = Hemmhofbildung 

2 + = keine Hemmhofbildung 

Konzentrationen 

(µg / 

Filterplättchen) 

Wachstum 

Ampicilin 10 100 - 1 - 

Carbenicillin 25 250 + 2 

- 

Chloramphenicol 25 250 - - 

Kanamycin 30 300 + - 

Lincomycin 15 150 - - 

Neomycin 15 150 - - 

Novobiocin 20 200 - - 

Penicillin-G 15 150 - - 

Polymycin B 30 300 - - 

Rifampecin 20 200 - - 

Streptomycin 30 300 - - 

Tetracyclin 20 200 - - 

In den Abbildungen 3.24 a und b sind beispielhaft vier Testansätze auf PS/2- 

Medium-Agarplatten dargestellt. Sie zeigen die Wirkung von Carbenicillin, 

Kanamycin, Penicillin-G und Polymycin auf das Wachstum von Bakterienstamm T4. 

Niedrige Konzentration 

a b 

Carbenicillin Kanamycin Penicillin G Polymycin B 

Hohe Konzentration 

3 

1 

2

Ergebnisse______________________________ _ 99 

Abb. 3.24 a,b: Wirkung von Carbenicillin und Kanamycin (a) sowie Penicillin-G und 

Polymycin (b) in Abhängigkeit der eingesetzten Konzentrationen (siehe Tab. 3.23) auf das 

Wachstum von Bakterienstamm T4, getestet auf PS/2-Medium-Agarplatten. Die Inkubation 

erfolgte für 7 d bei 30 °C im Brutschrank. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera 

(HewlettPackard photosmart 715). 

1 = Hemmhofrand 

2 = Filterpapierplättchen 

3 = Hemmhof, der photographisch nicht festzuhalten war 

Es stellte sich heraus, dass Bakterienstamm T4 je eine leichte Resistenz gegen 

Carbenicillin und Kanamycin besitzt. Bei den niedrigeren von beiden getesteten 

Antibiotika-Konzentrationen (Carbenicillin: 25 µg; Kanamycin: 30 µg) zeigten die 

Bakterien, trotz Anwesenheit der Hemmstoffe, Wachstum (siehe Abbildung 3.24 a). 

Alle anderen getesteten Antibiotika vermochten in beiden eingesetzten 

Konzentrationen das Wachstum von Bakterienstamm T4 zu hemmen. Dies ist 

beispielhaft in Abbildung 3.24 b zu sehen. 

3.3.2 Enzymnachweise 

Es wurden verschiedene Versuche zur Ermittlung der Enzymausstattung von 

Bakterienstamm T4 durchgeführt (siehe Kap. 2.11.2). Dabei wurde das 

Vorhandensein von 2 intrazellulär sowie 13 extrazellulär lokalisierten Enzymen 

überprüft. 

In Tabelle 3.23 sind die Resultate der Untersuchung der Ausstattung von 

Bakterienstamm T4 mit den intrazellulär lokalisierten Enzymen Katalase und 

Cytochromoxidase dargestellt. Die Durchführung dieser Tests ist in den Kapiteln 

2.11.2.1 und 2.11.2.2 beschrieben. 

Tab. 3.23: Auswertung der Enzymtests mit Bakterienstamm T4 für die intrazellulär 

lokalisierten Enzyme Katalase und Oxidase. Die Auswertung erfolgte mittels geeigneten 

Testsystemen (siehe Kap. 2.11.2.1 und 2.11.2.2). n = 1. 

1 + = positive Auswertung des Tests 

Enzymassay 

Auswertung 

Katalase + 1 

Oxidase + 

Es zeigte sich, dass Bakterienstamm T4 sowohl Katalase- als auch Oxidase-positiv 

ist. Beim Oxidase-Nachweis fand eine Blaufärbung des Teststreifens statt,

Ergebnisse______________________________ _ 100 

wohingegen beim Katalase-Nachweis eine starke Entwicklung von 

Sauerstoffbläschen auftrat. 

Demnach verfügt Bakterienstamm T4 über die beiden Enzyme Katalase und 

Cytochromoxidase. 

In Tabelle 3.24 sind die Ergebnisse der Überprüfung der Ausstattung von 

Bakterienstamm T4 mit einigen ausgewählten extrazellulären Enzymen dargestellt. 

Die Durchführung dieser Tests ist in den Kapiteln 2.11.2.3 bis 2.11.2.15 beschrieben. 

Tab. 3.24: Auswertung der Enzymtests mit Bakterienstamm T4 für ausgewählte 

extrazelluläre Enzyme. Die Inkubation erfolgte für 7 d bei 30 °C im Brutschrank. Die 

Auswertung wurde makroskopisch unter Zuhilfenahme eines Stereomikroskops (Zeiss Stemi 

SV 6) oder mittels einer Durchlicht-Einrichtung (Schütt Labortechnik Kolonien-Zähler) 

durchgeführt. n = 3. 

Enzymtest 

Auswertung 

Agarase - 1 

Amylase + 2 

Cellulase A - 

Cellulase B - 

DNase 

+ 3 

Esterase + 

Gelatinase + 

Lecithinase - 

Lipase - 

Peptidase + 

RNase + 

Urease - 

Xylanase - 

1 - = negative Auswertung des Tests 


3 = Ergebnis beider DNAse-Nachweise (siehe Kap. 2.11.2.7) 

Wie aus Tabelle 3.24 ersichtlich, ist Bakterienstamm T4 Amylase-, DNase-, 

Esterase-, Gelatinase-, Protease- und RNase-positiv. 

Für die anderen getesteten extrazellulären Enzyme, Agarase, Cellulase A und B, 

Lecithinase, Lipase, Urease und Xylanase, fiel die Auswertung hingegen negativ aus. 

In den Abbildungen 3.25 a-d sind exemplarisch die Enzymtestplatten für den 

Amylase-, Gelatinase-, RNAse- und einen der beiden angewandten DNAse-Tests 

dargestellt.

Ergebnisse______________________________ _ 101 

a b 

c d 

Abb. 3.25 a-d: Enzymtestplatten für den Nachweis von Amylase-, Gelatinase-, RNAse- und 

DNAse * -Aktivität nach 7 d Wachstum bei 30 °C im Brutschrank. Aufgenommen mittels einer 

Digitalkamera (HewlettPackard photosmart 715); bei a und d zusätzlich mit Hilfe einer 

Durchlicht-, bei b mit einer Drauflicht-Einrichtung (Schütt Labortechnik Kolonien-Zähler). * mit 

Toluidinblau 

In Abbildung 3.25 a ist der angewandte Amylase-Test (modifiziert nach SÜßMUTH et 

al., 1999) zu sehen. Der Kreis markiert die Zone, wo die Bakterien gewachsen 

waren. Deutlich ist um diese Zone ein nicht durch Lugolsche Lösung angefärbter 

Bereich zu erkennen, in welchem demnach keine Stärke mehr vorhanden war. Die 

durch Bakterienstamm T4 ausgeschiedene Amylase hatte diese hydrolysiert. 

Abbildung 3.25 b zeigt den durchgeführten Gelatinase-Test (modifiziert nach 

SÜßMUTH et al., 1999). Um die Bakterien ist deutlich ein nicht durch Pikrinsäure 

gelb angefärbter Bereich zu erkennen, in welchem folglich keine Gelatine mehr 

vorhanden war. Die Gelatinase, welche durch Bakterienstamm T4 ausgeschieden 

worden war, hatte diese hydrolytisch gespalten. 

In Abbildung 3.25 c ist der umgesetzte RNAse-Test (modifiziert nach GERHARDT et 

al., 1994) dargestellt. Um die Bakterien ist klar ein nicht durch HCL angetrübter 

Bereich zu erkennen, in welchem demnach keine RNA-Moleküle mehr vorhanden 

waren. Die durch Bakterienstamm T4 abgegebene RNAse hatte diese verdaut. 

In Abbildung 3.25 d ist der angewandte DNAse-Test (modifiziert nach SCHREIER et 

al., 1969) zu sehen. Um die Bakterien sind Bereiche zu erkennen, in welchen der

Ergebnisse______________________________ _ 102 

Indikatorfarbstoff Toluidinblau rosafarbend anstatt dunkelblau erscheint. In diesen 

Zonen wurde die DNA durch die Aktivität von DNAsen in kleine Einheiten zerlegt. 

Letztere bewirkten eine Konformationsänderung des Toluidinblaus, welches dadurch 

rosafarbend erschien. 

3.3.2.1 Urease-Nachweis in flüssigem Nährmedium (modifiziert nach SÜßMUTH et 

al., 1999) 

Für den Urease-Nachweis in flüssigem Nährmedium wurde Harnstoff-haltiges, mit 

Phenolrot versetztes Flüssigmedium aus einer Vorkultur angeimpft und unter 

Standardbedingungen kultiviert (siehe Kap. 2.11.2.14.2). Als Kontrollen dienten 

Flüssigkulturen, die keinen Harnstoff enthielten, aber sonst dem Testmedium 

entsprachen. 

Die makroskopische Auswertung wurde nach 2 d Wachstum vorgenommen. Es 

zeigte sich, dass sowohl die Test- als auch die Kontrollansätze die gleiche rötliche 

Färbung aufwiesen. 

Demnach konnte bei Bakterienstamm T4 keine Urease-Aktivität festgestellt werden. 

Denn dann wäre durch die Hydrolyse des Harnstoffs und den dadurch freiwerdenden 

Ammoniak eine Alkalisierung des Kulturmediums verursacht worden, was durch 

einen Farbumschlag des pH-Indikators Phenolrot nach Dunkelrot bis Violett 

angezeigt worden wäre. 

3.3.3 API 10S-Testsystem (bioMérieux) 

Zur weiteren biochemischen Charakterisierung von Bakterienstamm T4 wurde ein 

API 10S-Test durchgeführt. Als Kulturmedien dienten MSM sowie eine 0,25%iger 

NaCl-Lösung (siehe Kap. 2.11.3). 

Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 3.25 zusammengefasst.

Ergebnisse______________________________ _ 103 

Tab. 3.25: Auswertung des API 10S-Testsytems (bioMérieux), kultiviert in MSM bzw. einer 

0,25%iger NaCl-Lösung. Die Inkubation erfolgte für 24 h bei 30 °C im Brutschrank. Die 

Auswertung erfolgte nach Angaben des Herstellers. n = 1. 

Test 

Aktiver Bestandteil Reaktion / Enzym Auswertung 

(MSM und NaCl-Lösung) 

ONPG 2-Nitrophenyl-ß-D- 

Galaktopyranosid 

ß-Galaktosidase (Ortho- 

Nitrophenyl-ß-D- 

Galaktopyranosidase) 

GLU D-Glucose Fermentation Oxidation - 1 (F) + (O) 

ARA L-Arabinose Fermentation Oxidation - (F) - (O) 

LCD L-Lysin Lysin-Decarboxlyase - 

ODC L-Ornithin Ornithin-Decarboxlyase - 

CIT tri-Natriumcitrat Citrat-Verwertung + 

H2S Natriumthiosulfat H2S-Bildung - 

URE Harnstoff Urease - 

TDA L-Tryptophan Tryptophan-Desaminase - 

IND L-Tryptophan Indol-Bildung - 

OX - Cytochrom-Oxidase + 

NO2 (GLU-Röhrchen) NO2-Bildung - 



F = Fermentation 

O = Oxidation 

Den Ergebnissen der durchgeführten API 10S-Tests zufolge, machte es keinen 

Unterschied, ob MSM oder 0,25%ige NaCl-Lösung als Medium eingesetzt wurde. Die 

Ergebnisse der Auswertung sind in beiden Fällen die gleichen. 

Es zeigte sich, dass Bakterienstamm T4 eine ß-Galaktosidase (Ortho-Nitrophenyl-ß- 

D-Galaktopyranosidase) besitzt. Weiterhin wurde bestätigt, dass die untersuchten 

Bakterien eine Cytochrom-Oxidase besitzen. 

Des weiteren kann der Stamm T4 D-Glucose und tri-Natriumcitrat oxidativ zum 

Wachstum nutzen. Hingegen konnte nicht festgestellt werden, dass die untersuchten 

Bakterien D-Glucose oder L-Arabinose fermentativ zum Wachstum nutzen können. 

L-Arabinose konnte auch nicht auf oxidativem Wege verwertet werden. 

Die Auswertung des Tests für das Vorhandensein der Enzyme Lysin-Decarboxlyase, 

Ornithin-Decarboxlyase, Urease sowie Tryptophan-Desaminase fiel ebenfalls negativ 

aus. 

Ebenso konnte keine Schwefelwasserstoff-, Indol- oder Stickstoffdioxid-Bildung 

festgestellt werden. 

+ 2

Ergebnisse______________________________ _ 104 

3.3.4 Säurebildung aus Kohlenhydraten (modifiziert nach LEIFSON, 1963) 

Es wurde untersucht, ob auf oxidativem Wege Säuren gebildet werden, wenn 

Bakterienstamm T4 mit verschiedenen Kohlenhydraten als einzige Kohlenstoffquelle 

wächst (siehe Kap. 2.11.4). 

In Tabelle 3.26 sind die Resultate des Experiments dargestellt. 

Tab. 3.26: Eingesetzte Kohlenstoffquellen, deren Konzentrationen, durch sie verursachte 

Säureproduktion und maximal erreichte OD600 nm- Werte von Kulturen des Bakterienstammes 

T4, kultiviert in MSM. Die Inkubation erfolgte für 4 d bei 30 °C und 200 rpm. n = 2. 


Konzentration [mM] Induktion von 

Säureproduktion 



D-Glucose 5 + 2 0,523 

D-Mannose 5 + 0,547 

Disaccharide 

D-Maltose 5 + 0,571 

D-Saccharose 5 + 0,636 

Alkohole 

Glycerin 5 - 1 0,312 



Wie aus Tabelle 3.26 hervorgeht, konnte Bakterienstamm T4 mit allen angebotenen 

Kohlenstoffquellen wachsen, wobei das beste Wachstum mit D-Saccharose 

(maximale OD600 nm: 0,636) und das schlechteste mit Glycerin zu verzeichnen war 

(maximale OD600 nm: 0,312). 

Es zeigte sich weiterhin, dass Bakterienstamm T4 bei der Metabolisierung der beiden 

Monosaccharide D-Glucose und D-Mannose sowie der beiden Disaccharide D- 

Maltose und D-Saccharose Säuren produziert, welche in das Kulturmedium 

abgegeben werden. Dies konnte eindeutig durch den Umschlag des eingesetzten 

pH-Indikatorfarbstoffes Lackmus von blau nach rot nachgewiesen werden. 

Im Gegensatz dazu konnte ein solcher Farbumschlag nicht beobachtet werden, 

wenn Bakterienstamm T4 mit Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle wuchs. 

Demnach entstehen bei dessen Metabolisierung durch den Bakterienstamm T4 keine 

Säuren.

Ergebnisse______________________________ _ 105 

3.4 Chemotaxonomische Untersuchungen 

3.4.1 Untersuchungen zur Bestimmung von Pigmenten aus Bakterienstamm T4 

3.4.1.1 Flexirubin-Test (GÜDE, 1980) 

Es wurde mittel eines Flexirubin-Tests untersucht, ob Bakterienstamm T4 Flexirubine 

als Pigmente besitzt (siehe Kap. 2.12.1.1). 

Dabei stellte sich heraus, dass kein Farbwechsel der Kolonien zu beobachten war, 

wenn diese 20%iger KOH-Lösung ausgesetzt waren. Demnach besitzt 

Bakterienstamm T4 keine Flexirubine als Pigmente. 

3.4.1.2 Dünnschichtchromatographie (DC) 

Mittels der DC-Methode sollte sich ein erster Überblick über die Inhaltsstoffe des 

methanolischen Extrakts verschafft als auch ein geeignetes Laufmittel für die 

folgende säulenchromatographische Aufreinigung gefunden werden (siehe Kap. 

2.12.1.2 und 2.12.1.3). 

Es konnte dabei das Auftreten von vier sich verschiedenen schnell über die 

stationäre Phase bewegenden Pigmentfraktionen (PF 1 - 4) festgestellt werden. Die 

Fraktionen waren gelb (PF 1), orange (PF 2) oder rötlich (PF 3 und 4) gefärbt. Mittels 

UV-Licht konnten keine zusätzlichen Fraktionen sichtbar gemacht werden. 

Von den getesteten Laufmitteln (siehe Kap. 2.12.1.3, Tab. 2.19) war Dichlormethan : 

Essigsäureethylester im Verhältnis 4 : 1 am besten geeignet, d.h. hier lagen die 

höchsten Rf-Werte der vier auftretenden Pigmentfraktionen sowie die größten 

Unterschiede zwischen den jeweiligen Werten vor (Daten nicht dargestellt). 

Demnach war hiermit die Auftrennung der einzelnen Pigmentfraktionen am besten. 

Von den beiden erprobten stationären Phasen (siehe Kap. 2.12.1.3) waren diesen 

Kriterien zufolge die Aluminiumoxidplatten besser geeignet (Daten nicht dargestellt). 

3.4.1.3 Säulenchromatographie (SC) 

Zur Entfernung der im methanolischen Extrakt enthaltenen Zellbestandteile (z. B. 

Proteine, Lipide) wurde eine SC durchgeführt (siehe Kap. 2.12.1.2 und 2.12.1.4). 

Es konnte, wie bei der Anwendung der DC-Methode, das Auftreten von vier sich 

verschiedenen schnell durch die stationäre Phase bewegenden Pigmentfraktionen 

(PF 1 - 4) festgestellt werden. Diese waren ebenfalls gelb (PF 1), orange (PF 2)

Ergebnisse______________________________ _ 106 

sowie rötlich (PF 3 und 4) gefärbt. Es konnten auch mittels UV-Licht keine 

zusätzlichen Fraktionen sichtbar gemacht werden. 

3.4.1.4 Umkehrphasen-Hoch-Leistungs-Flüssig-Chromatographie (Reversed-phase- 

HPLC; modifiziert nach RABENSTEIN, 1997) 

Bei der Analyse der Pigmentausstattung von Bakterienstamm T4 mittels HPLC 

konnten fünf Substanzen in dem methanolischen Extrakt nachgewiesen werden. In 

Tabelle 3.27 sind deren Peak-Nummern (siehe auch Abb. 3.26), Absorptionsmaxima 

und Retentionszeiten zusammengefasst. Zu beachten ist, dass für die mittels HPLC 

untersuchten Proben eine andere Extraktionsmethode angewendet wurde (siehe 

Kap. 2.10.3.1 und 2.12.1.5) als für die anderen Untersuchungen zur Bestimmung der 

Pigmentausstattung von Bakterienstamm T4. 

Tab. 3.27: Absorptionsmaxima und Retentionszeiten der aus Bakterienstamm T4 isolierten 

Substanzen sowie eines Astaxanthin-Standards nach HPLC-Trennung. n = 1. 

Peak Nr. Substanz Absorptionsmaximum 

[nm] 

Retentionszeit [min] 

DAD 

Naturstoff 

2 ni 1 465, 479, 512 4,52 

4 ni 479, 495, 512 6,32 

5 ni ni 8,41 

6 ni ni 16,52 

7 ni ni 20,60 

Carotinoid-Standard 

3 Astaxanthin 479 4,95 

1 nicht identifiziert 

In Abbildung 3.26 ist das DAD-Chromatogramm einer Co-Chromatographie des 

methanolischen Extraktes (siehe Kap. 2.10.3.1 und 2.12.1.5) von Bakterienstamm T4 

mit einem Astaxanthin-Standard dargestellt. Zwischen den in Tabelle 3.27 

angegebenen Retentionszeiten und den in Abbildung 3.26 zu erkennenden Peaks 

gibt es einige Abweichungen. Diese sind auf die Empfindlichkeit der verwendeten 

Software zurückzuführen.

Ergebnisse______________________________ _ 107 

1 

2 3 4 

5 

Abb. 3.26: DAD-Chromatogramm einer Co-Chromatographie des methanolischen Extraktes 

von Bakterienstamm T4 mit einem Astaxanthin-Standard nach HPLC-Trennung. 

Peak 1: Injektionspeak 

Peak 2: nicht identifiziertes Carotinoid 

Peak 3: Astaxanthin-Standard 

Peak 4: nicht identifiziertes Carotinoid 

Peak 5-7: nicht identifizierbar, da die Substanzen in zu geringen Konzentrationen im 

methanolischen Extrakt vorlagen 

Es konnte keine der enthaltenen Substanzen anhand der eingesetzten Standards 

(siehe Kap. 2.12.1.5, Tab. 2.21) als auch anhand von Literaturdaten (HIRSCHBERG 

und CHAMOVITZ, 1994) identifiziert werden. 

Die den Peaks 2 und 4 entsprechenden Substanzen konnten anhand ihrer 

Absorptionsspektren den Carotinoiden zugewiesen werden (BRITTON et al., 2004), 

genauer war eine Identifizierung dieser beiden Stoffe allerdings nicht möglich (Daten 

nicht dargestellt). Die den Peaks 5 bis 7 entsprechenden Substanzen waren 

ebenfalls nicht zu identifizieren, da sie in zu geringer Konzentration im 

methanolischen Extrakt vorlagen. 

3.4.1.5 UV/VIS-Spektralphotometrie 

Um einen ersten Überblick von den mittels einer SC getrennten Pigmentfraktionen zu 

erhalten und um deren Reinheit zu überprüfen, wurden von diesen UV/VIS-Spektren 

registriert (siehe Kap. 2.12.1.4 und 2.12.1.6). 

6 

7

Ergebnisse______________________________ _ 108 

In den Abbildungen 3.27-30 sind die Absorptionsspektren der vier über die SC 

erhaltenen Pigmentfraktionen (PF 1 - 4) dargestellt (vergleiche Kap. 3.4.1.3). Die 

Absorptionsspektren wurden im Bereich von 200 - 1000 nm aufgenommen. Da 

allerdings im Bereich von 600 - 1000 nm keine Absorption auftrat und im Bereich von 

200 - 350 nm u.a. die Proteine absorbieren, wurde nur der Bereich von 350 - 600 nm, 

in welchem u.a. Carotinoide absorbieren, dargestellt. Zu beachten ist, dass die 

einzelnen Abbildungen zum Teil unterschiedliche Skalierungen aufweisen. 

Absorption 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

350 400 450 500 550 600 


Abb. 3.27: Absorptionsspektrum von PF 1 aus dem methanolischen Extrakt in 

Dichlormethan-Essigsäureethylester (4 : 1) als Lösungsmittel. Aufgenommen mittels eines 

Varian Cary 50-Spektralphotometers. Schultern sind durch rote Pfeile markiert. λmax: 476 nm. 

n = 1. 

Wie aus Abbildung 3.27 hervorgeht, besitzt das Absorptionsspektrum von PF 1 

Maxima bei 447, 476 und 507 nm. Dies ist ein typisches Muster für Carotinoide 

(BRITTON et al., 2004).

Ergebnisse______________________________ _ 109 

Absorption 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

350 400 450 500 550 600 





n = 1. 

Wie Abbildung 3.28 zeigt, besitzt das Absorptionsspektrum von PF 2 Maxima bei 

452, 478 und 512 nm. Auch hier zeigt sich ein für Carotinoide typisches 

Absorptionsspektrum (BRITTON et al., 2004). 

Absorption 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

350 400 450 500 550 600 





n = 1. 

Wie in Abbildung 3.29 dargestellt, besitzt das Absorptionsspektrum von PF 3 Maxima 

bei 447, 475 und 512 nm. Wie für PF 1 und 2 dokumentiert, weißt auch dieses 

Spektrum die für Carotinoide charakteristische Schulterform auf (BRITTON et al., 

2004).

Ergebnisse______________________________ _ 110 

Absorption 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

350 400 450 500 550 600 




Varian Cary 50-Spektralphotometers. λmax: 480 nm. n = 1. 

Wie aus Abbildung 3.30 hervorgeht, besitzt das Absorptionsspektrum von PF 4 ein 

Maximum bei 480 nm. Dies ist auch ein typisches Merkmal von Carotinoiden 

(BRITTON et al., 2004). Zusätzlich weißt das Spektrum noch ein Maximum bei 394 

nm auf. Allerdings wird dieser Peak durch den bei 480 nm maskiert, so dass sich 

keine Aussage über dessen Herkunft machen lässt. 

Die in PF 1-4 enthaltenen Substanzen konnten anhand ihrer Absorptionsspektren 

den Carotinoiden zugewiesen werden (BRITTON et al., 2004), genauer war eine 

Identifizierung dieser Stoffe allerdings nicht möglich. 

Beim Vergleich der vier Absorptionsspektren fällt auf, dass die Spektren von PF 1-3 

sich sehr ähneln. Allerdings weißt das Spektrum von PF 1 einen deutlich stärker 

ausgeprägten Verlauf der Schultern auf als die von PF 2 und 3. Das Spektrum von 

PF 4 besitzt zwei einzeln liegende Maxima, womit es sich von der Art der anderen 

Spektren abgrenzt. 

3.4.1.6 Massenspektrometrie (MS) 

Um die Pigmentausstattung von Bakterienstamm T4 zu untersuchen, wurden 

pigmenthaltige Proben massenspektrometrisch analysiert (siehe Kap. 2.12.1.7). Es 

konnten allerdings nur PF 1 und 4 näher untersucht werden, da PF 2 und 3 nach der 

Eintrocknung in zu geringen Konzentrationen vorlagen.

Ergebnisse______________________________ _ 111 

In Abbildung 3.31 ist das von PF 1 aufgenommene EI-Spektrum dargestellt. 

Allerdings ist nur der Ausschnitt von m/z 0 - 700 des gesamten Spektrums 

dargestellt, da nur in diesem Bereich relevante Peaks auftraten. 

SCAN GRAPH. 

Scan 43#2:22.12. Base M/z=225.1. 100% Int.=415,7294. Aux =199.1. 

100 

225 

Intensity (%age) 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

69 

95 135 187 

265 307 

0 100 200 300 400 500 600 700 

Low Resolution m/z 

Abb. 3.31: EI-Spektrum von PF 1 aus dem methanolischen Extrakt in Dichlormethan- 

Essigsäureethylester (4 : 1) als Lösungsmittel. Aufgenommen mittels eines 

Massenspektrometers (Thermo Finnigan MAT 95). Probe wurde 1:10 mit 2-Propanol verdünnt. 

Temperatur auf der Schubstangenspitze: 209 °C. 

Wie aus Abbildung 3.31 hervorgeht, lag der Basispeak bei m/z 225 (m/z, 

Masse/Ladungsverhältnis). Der Peak höchster Masse konnte bei m/z 648 

verzeichnet werden. 

In Abbildung 3.32 ist ein Vergleich des EI-Spektrums von PF 1 mit den gegenwärtig 

verfügbaren Daten aus den öffentlichen Datenbanken (NIST) dargestellt. Es wurde 

nach einer Substanz mit einer Massenzahl von 648 gesucht. Die Spektren wurden im 

Bereich von m/z 0 - 1000 verglichen. 

648

Ergebnisse______________________________ _ 112 

NIST Search of scan from file E:\MSData\MAT 95 konvertiert\fm\5307fm01.ms2 

100 

90 

Scan 42#2:19. Aux =192.2. 

69 

225 


80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

100 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

81 

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 

NIST Scan 01. SI: 906. Name: 1,4-Naphthalenedione, 2-(3,7,11,15,19,23,27-heptamethyl-2,6,10,14,18,22,26-octacosaheptaenyl)-3-methyl-, (all-E)-. 

69 

81 

225 

239 

239 

307 

307 

410 

443 511 

511 579 

0 100 200 300 400 500 

Nominal m/z 

600 700 800 900 1000 

579 

648 

648 

720 962 

Abb. 3.32: Ergebnis eines Vergleichs des EI-Spektrums von PF 1 mit den gegenwärtig 

verfügbaren Daten aus den öffentlichen Datenbanken (NIST). Oben ist das EI-Spektrum von 

PF 1 zu sehen, unten das der mittels NIST ermittelten Substanz mit der höchsten 

Übereinstimmung des Spektrums. 

Das in Abbildung 3.32 dargestellte EI-Spektrum von PF 1 weißt einige Peaks mehr 

auf als das in Abbildung 3.31 dargestellte. Dies liegt daran, dass es für den NIST- 

Vergleich in ein anderes Dateiformat konvertiert werden musste. 

Bei der mit Hilfe von NIST ermittelten Substanz mit der höchsten Übereinstimmung 

des EI-Spektrums handelt es sich um Menaquinon 7 (1,4-Naphthoquinone,2-methyl- 

3-(3,7,11,15,19,23,27-heptamethyl-2,6,10,14,18,22,26octacosaheptaenyl)). MK-7 

besitzt die Summenformel C46H64O2. Die Strukturformel dieser Verbindung ist in 

Abbildung 3.33 dargestellt. 

O 

O 

Abb. 3.33: Strukturformel von MK-7 (NIST).

Ergebnisse______________________________ _ 113 

Die Übereinstimmung der beiden Spektren beträgt allerdings nur 90,6 %. Dies lässt 

sich auch anhand des Spektrenvergleichs nachvollziehen (siehe Abb. 3.32). An der 

Stelle, wo das EI-Spektrum von PF 1 einen Peak bei m/z 410 aufweißt, ist in dem 

Spektrum von MK-7 kein Peak zu verzeichnen. Andererseits existiert in diesem 

Spektrum ein Peak bei m/z 443, welcher sich nicht in dem von PF 1 finden lässt. 

Weiterhin weißt das Spektrum von PF 1 einige Peaks (m/z 720 und 962) auf, welche 

sich nicht in dem von MK-7 wiederfinden. 

In Abbildung 3.34 ist das negative ESI-Spektrum von PF 1 im Bereich von m/z 0 - 

1000 dargestellt. Auf das positive ESI-Spektrum wird hier nicht eingegangen, da die 

entsprechende Probe Verunreinigungen, vermutlich Polyethylenglykole aus 

Spülmitteln, enthielt. Dies zeigte sich durch typische 44er-Serien (Abstände von m/z 

44 zwischen den einzelnen Peaks). Die Peaks der Polyethylenglykole maskierten in 

diesem Spektrum die Signale der zu untersuchenden Substanzen. 

Intens. 

8000 

6000 

4000 

2000 

0 

96.9 138.9 

198.9 

265.1 

309.1 

353.1 

397.3 441.3 489.3 543.1 

601.3 645.3 

703.5 

730.5 

781.5 

All, 0.0-0.5min (#1-#42) 

867.3 933.4 

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 

Abb. 3.34: Negatives ESI-Spektrum von PF 1 aus dem methanolischen Extrakt in 


Massenspektrometers (Bruker Daltonics Esquire LC). Probe wurde 1:10 mit 2-Propanol 

verdünnt. 

982.5

Ergebnisse______________________________ _ 114 

Wie in Abbildung 3.34 dargestellt, lag der Basispeak bei m/z 703 [668 + Cl] - . Der 

Peak höchster Masse konnte bei m/z 933 verzeichnet werden. 

Ein Datenbankabgleich der Massenzahlen 668 und 933 mittels NIST als auch ein 

Literaturvergleich (BRITTON et al., 2004) kamen zu keinen Ergebnis. 

In PF 1 konnten den EI- und ESI-Spektren zufolge, drei verschiedene Massen 

festgestellt werden: m/z 648, 668 und 933. 

In Abbildung 3.35 ist das von PF 4 im Bereich von m/z 0 - 1000 aufgenommene EI- 

Spektrum dargestellt. 

SCAN GRAPH. 

Scan 46#2:31.58. Base M/z=44. 100% Int.=88,5376. Aux =209.1. 

100 

44 


90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

71 

127 

197 

225 

0 100 200 300 400 500 

Low Resolution m/z 

600 700 800 900 1000 

Abb. 3.35: EI-Spektrum von PF 4 aus dem methanolischen Extrakt in Dichlormethan- 

Methanol (20 : 1) als Lösungsmittel. Aufgenommen mittels eines Massenspektrometers 

(Thermo Finnigan MAT 95). Probe wurde 1:10 mit Lösungsmittel (s.o.) verdünnt. Temperatur 

auf der Schubstangenspitze: 209 °C. 

Wie Abbildung 3.35 zeigt, lag der Basispeak bei m/z 44. Der Peak höchster Masse 

konnte bei m/z 582 festgestellt werden. Auffällig ist, dass sich der Peak bei m/z 225 

auch in dem EI-Spektrum von PF 1 wiederfindet. 

582

Ergebnisse______________________________ _ 115 

Ein Datenbankabgleich der Massenzahl 582 mittels NIST erbrachte kein Ergebnis. 

Durch einen Literaturvergleich (BRITTON et al., 2004) konnten 19 verschiedene 

Carotinoide mit einer Massenzahl von 582 recherchiert werden. Eine genaue 

Zuordnung war allerdings nicht möglich. 

In Abbildung 3.36 ist das positive ESI-Spektrum von PF 4, aufgenommen im Bereich 

von m/z 0 - 1000, zu sehen. 

Intens. 

x105 

6 

4 

2 

0 

77.1 

169.1 

105.1 

134.1 

215.1 299.5 

393.4 

457.4 

473,4 

525.5 

605.6 

691.7 

745.6 

775.6 

832.6 

876.0 

All, 0.0-1.0min (#1-#82) 

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 

Abb. 3.36: Positives ESI-Spektrum von PF 4 aus dem methanolischen Extrakt in 

Dichlormethan-Methanol (20 : 1) als Lösungsmittel. Aufgenommen mittels eines 

Massenspektrometers (Bruker Daltonics Esquire LC). Probe wurde 1:10 mit Lösungsmittel 

(s.o.) verdünnt. 

Wie aus Abbildung 3.36 hervorgeht, lag der Basispeak bei m/z 557 [434 + Na] + . Die 

Massenzahl 434 findet sich ein weiteres mal in dem Peak bei m/z 473 [434 + K] + 

wieder. Der Peak höchster Masse konnte bei m/z 775 festgestellt werden. 

Außerdem konnte dreimal das Auftauchen der Massenzahl 582 festgestellt werden 

und zwar als Peaks bei m/z 583 [582 + H] + , 605 [582 + Na] + und 621 [582 + K] + . 

Diese Massenzahl lässt sich auch in dem EI-Spektrum von PF 4 wiederfinden. 

583,5 

621,6

Ergebnisse______________________________ _ 116 

Ein Datenbankabgleich der Massenzahlen 434, 582 und 775 mittels NIST kam zu 

keinen Ergebnis. Durch einen Literaturvergleich (BRITTON et al., 2004) konnten 2 

verschiedene Carotinoide mit einer Massenzahl von 434 ermittelt werden. Eine 

genaue Identifizierung war allerdings unmöglich. Für die Massenzahl 775 erbrachte 

der Literaturvergleich kein Ergebnis. 

In Abbildung 3.37 ist das negative ESI-Spektrum von PF 4, aufgenommen im Bereich 

von m/z 0 - 1000, dargestellt. 

Intens. 

x105 

1.2 

1.0 

0.8 

0.6 

0.4 

0.2 

0.0 

79.9 

96.9 

163.0 

265.1 

309.1 

353.3 397.3 

441.3 

485.3 529.4 

573.4 

637.4 

677.4 

703.5 

747.5 

All, 0.0-1.0min (#1-#83) 

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 

A 

M 

( 

bb. 3.37: Negatives ESI-Spektrum von PF 4 aus dem methanolischen Extrakt in 

Dichlormethan-Methanol (20 : 1) als Lösungsmittel. Aufgenommen mittels eines 

assenspektrometers (Bruker Daltonics Esquire LC). Probe wurde 1:10 mit Lösungsmittel 

s.o.) verdünnt. 

Wie aus Abbildung 3.37 hervorgeht, lag der Basispeak bei m/z 703 [668 + Cl] - . Die 

Massenzahl 668 findet sich ein weiteres mal in dem Peak bei m/z 667 [668 - H] - 

wieder. Diese Massenzahl lässt sich auch in dem negativen ESI-Spektrum von PF 1 

wiederfinden. Der Peak höchster Masse konnte bei m/z 747 festgestellt werden. 

Ein Datenbankabgleich der Massenzahl 747 mittels NIST als auch ein 

Literaturvergleich (BRITTON et al., 2004) erbrachte kein Ergebnis. 

667.0 

923.5

Ergebnisse______________________________ _ 117 

In PF 4 konnten den EI- und ESI-Spektren zufolge fünf verschiedene Massen 

festgestellt werden: m/z 434, 582, 668, 747 und 775. 

Da es sich, wie die MS-Untersuchungen zeigten, bei PF 1 und 4 um 

Substanzgemische handelte, wird hier nicht auf deren jeweiliges Trockengewicht / g 

Zellen Feuchtgewicht eingegangen. Dies wäre nicht aussagekräftig. 

3.4.1.7 Kernresonanzspektroskopie (NMR) 

Die eingetrockneten Pigmentproben von PF 1 und 4 (vergleiche Kap. 3.4.1.6) wurden 

mittels NMR-Spektroskopie untersucht (siehe Kap. 2.12.1.8). 

Allerdings konnten von beiden Pigmentfarktionen keine auswertbaren NMR-Spektren 

aufgenommen werden, da es sich in beiden Fällen um Substanzgemische handelte 

(vergleiche Kap. 3.4.1.6), so dass sich die Signale der enthaltenen Substanzen 

überlagerten (Daten nicht dargestellt). Eine Identifizierung der Inhaltsstoffe der 

beiden PF war daher nicht möglich. 

3.5 Molekularbiologische Untersuchungen 

3.5.1 Bestimmung des GC-Gehalts der DNA 

Für die Bestimmung des GC-Gehalts der DNA von Bakterienstamm T4 wurde 

photometrisch eine DNA-Schmelzkurve aufgenommen. Zuvor wurden die DNA 

isoliert und ihre Quantität und Qualität überprüft (siehe Kap. 2.13.1.1-3). 

In Tabelle 3.28 sind Quantität und Qualität der extrahierten DNA der 

Bakterienstämme T4 und E. coli K12 zusammengefasst. 

Tab. 3.28: Konzentration und Qualität der extrahierten DNA der Bakterienstämme T4 und E. 

coli K12. n = 1. 

Bakterienstamm 

DNA-Konzentration 

[µg / ml] 

DNA-Qualität 

1. AQ 1 

2. AQ 2 

T4 216,6 1,9 0,89 

E. coli K12 12,44 1,86 0,58 

1,2 AQ = Absorptionsquotient (siehe Kap. 2.13.1.2) 

Wie aus Tabelle 3.28 hervorgeht, betrug die Konzentration der isolierten DNA 216,6 

µg / ml für Bakterienstamm T4 und 12,44 µg / ml für E. coli K12.

Ergebnisse______________________________ _ 118 

In beiden Fällen lagen die Werte für den ersten sowie den zweiten 

Absorptionsquotienten in Bereichen, welche annähernd auch reine DNA-Lösungen 

aufweisen würden (1.AQ: 1,8 - 2,0; 2.AQ: 0,3 - 0,9). Ebenso lagen die Werte für A320 

nm jeweils unter 0,1 (MOORE et al., 1999). 

In Tabelle 3.29 ist die ermittelte Schmelztemperatur der DNA von Bakterienstamm 

T4 und E. coli K12 sowie der daraus errechnete GC-Gehalt (mol%) der DNA von 

Bakterienstamm T4 dargestellt. 

Tab. 3.29: Schmelztemperatur der DNA der Bakterienstämme T4 und E. coli K12 sowie der 

daraus errechnete GC-Gehalt (mol%) und dessen Standardabweichung. n = 4. 

Bakterienstamm Schmelztemperatur 

Tm (°C) 

GC-Gehalt 

(mol%) 1 

Standardabweichung 

T4 62,2 40,4 0,08 

E. coli K12 66,8 - - 

1 berechnet nach MARMUR und DOTY, 1961 (siehe Kap. 2.13.1.3) 

Wie aus Tabelle 3.29 hervorgeht, wurde für die DNA von Bakterienstamm T4 ein GC- 

Gehalt der DNA von 40,45 mol% ermittelt. Die berechnete Standardabweichung war 

mit 0,07 sehr gering. 

Der GC-Gehalt der DNA von E. coli K12 konnte mittels der angewandten Methode 

(modifiziert nach SÜßMUTH et al., 1999) sowie der verwendeten Formel zur 

Berechnung des GC-Gehalts (MARMUR und DOTY, 1961) nicht ermittelt werden. 

3.5.2 Bestimmung der 16S-rDNA-Sequenz 

Durch die angewandte DNA-Extraktionsmethode (siehe Kap. 2.13.2.1) konnte 

hochmolekulare, undegradierte, chromosomale DNA des Bakterienstammes T4 

gewonnen werden (siehe Abb. 3.38) (RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 119 

23130 bp 

9416 bp 

6557 bp 

4361 bp 

2322 bp 

2027 bp 

M 

Chromosomale DNA 

Degradierte RNA 

Abb. 3.38: Gelelektrophoretische Dokumentation der chromosomalen DNA (oben) sowie 

degradierter RNA (unten) des Bakterienstammes T4 mit Hilfe eines Transilluminators 

(Herolab). M = Molekulargewichtsmarker λ /Hind III (RAU, 2005). 

Durch eine Standard-PCR mit 16S-rDNA-spezifischen Primern (siehe Kap. 2.13.2.3) 

konnte ein ca. 1000 bp großes Fragment der 16S-rDNA des Bakterienstammes T4 

erfolgreich amplifiziert werden (siehe Abb. 3.39) (RAU, 2005).

Ergebnisse______________________________ _ 120 

23130 bp 

9416 bp 

6557 bp 

4361 bp 

2322 bp 

2027 bp 

M 

PCR-Amplifikat (ca. 1000 bp) 

Abb. 3.39: Gelelektrophoretische Dokumentation des PCR-Amplifikats (ca. 1000 bp) der 

16S-rDNA des Bakterienstammes T4 mit Hilfe eines Transilluminators (Herolab). M = 

Molekulargewichtsmarker λ /Hind III (RAU, 2005). 

Die Sequenzierung des Amplifikates (siehe Kap. 2.13.2.5) erbrachte eine 603 bp 

lange Sequenz (siehe Kap. 6.1) (RAU, 2005). 

In Tabelle 3.31 wird das Sequenzdaten-Ergebnis mit gegenwärtig verfügbaren 

Informationen aus öffentlichen Datenbanken verglichen.

Tab. 3.30: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des untersuchten Bakterienstammes T4 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen aus öffentlichen 

Datenbanken mit Hilfe von BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Nicht klassifizierte Organismen wurden nicht berücksichtigt. 

Ergebnisse______________________________ _ 121 

Referenz 

BLAST- 

Zugangsnr. 

Familienzugehörigkeit 

Länge der 

Sequenz 

(bp) 

Übereinstimmung 

(%) 

Übereinstimmung 

(bp; Organnism / T4) 

Organismus 

YI und CHUN, 

2004 

AY264838 

Flexibacteraceae 

1376 

96 

578 / 599 

Hongiella mannitolivorans 

(Flexibacteraceae bacterium IMSNU 

14012 16S ribosomal RNA gene, partial 

sequence) 

YOON et al., 

2006 

DQ178979 


1479 

96 

575 / 597 

Algoriphagus dokdonensis 

(strain DS-44 16S ribosomal RNA 

gene,partial sequence) 

TIAGO et al., 

2006 

AJ717393 


1489 

96 

578 / 600 

Chimaereicella alkaliphila 

(16S rRNA gene, type strain AC74) 

Nicht publiziert 

AY259502 


1423 

95 

572 / 596 

Cyclobacterium sp. BSB S2 03 

(16S ribosomal RNA gene, partial 

sequence) 

YI und CHUN, 

2004 

AY264839 


1427 

95 

570 / 596 

Algoriphagus halophilus 

(Flexibacteraceae bacterium IMSNU 

14013 16S ribosomal RNA gene, partial 

sequence) 

Nicht publiziert 

AY771735 


1485 

95 

569 / 596 

Algoriphagus ratkowskyi 

(isolate S5-5 16S ribosomal RNA gene, 

partial sequence) 

VAN 

TRAPPEN et 

al., 2004 

RAN577142 


1491 

95 

569 / 596 

Algoriphagus antarcticus 

(16S rRNA gene, strain LMG 21983)

Ergebnisse _______________________________ 122 

Wie ein Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz von Bakterienstamm T4 mit den 

gegenwärtig verfügbaren 16S-rDNA-Sequenzen anderer Bakterienarten aus 

öffentlichen Datenbanken mit Hilfe von BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 

zeigte, ist Bakterienstamm T4 am nächsten verwandt mit Organismen aus den 

Gattungen Hongiella, Algoriphagus, Chimaereicella und Cyclobacterium. Nicht 

klassifizierte Organismen wurden dabei nicht berücksichtigt. 

Der Stamm Hongiella mannitolivorans IMSNU 14012 (YI und CHUN, 2004) ist der 

nächste, schon näher klassifizierte Verwandte des Bakterienstammes T4 mit einer 

Übereinstimmung der 16S-rDNA-Sequenz von 96 %, gefolgt von Algoriphagus 

dokdonensis DS-44 (YOON et al., 2006) und Chimaereicella alkaliphila AC74 

(TIAGO et al., 2006) mit ebenfalls 96 % Übereinstimmung. 

Mit Cyclobacterium sp. BSB S2 03 (nicht publiziert), Algoriphagus halophilus (YI und 

CHUN, 2004), Algoriphagus ratkowskyi (nicht publiziert) und Algoriphagus 

antarcticus (VAN TRAPPEN et al., 2004) hatte Bakterienstamm T4 95 % der 

Basenpaare gemeinsam. 

Auffällig ist, dass alle mit Hilfe von BLAST ermittelten nächstverwandten Organismen 

von Bakterienstamm T4 taxonomisch in die Familie der Flexibacteraceae 

einzuordnen sind. 

3.5.3 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen 

Mittels verschiedener Methoden (siehe Kap. 2.13.2.7) wurden die phylogenetischen 

Verwandtschaftsverhältnisse von Bakterienstamm T4 graphisch dargestellt. Es 

konnte mit allen angewandten Methoden (NJ, ME, MP und ML) eine annähernd 

identische Topologie der phylogenetischen Dendrogramme ermittelt werden. 

Zu beachten ist, dass allerdings nur eine 603 bp lange 16S-rDNA-Sequenz von 

Bakterienstamm T4 vorlag (vergleiche Kap. 3.5.2). Phylogenetische Stammbäume 

werden i.d.R. auf der Basis von Sequenzen mit einer Länge von 1300 bp und mehr 

erstellt (ASHELFORD et al., 2002). 

In Abbildung 3.40 ist beispielhaft ein phylogenetischer Stammbaum dargestellt, 

welcher mittels der NJ-Methode konstruiert wurde.

Ergebnisse _______________________________ 123 

0.01 

100 

99 

57 

89 

36 

61 

62 

58 

95 

Algoriphagus winogradskyi LMG 21969 (AJ575263) 

73 

72 

68 

56 

97 33 

Algoriphagus yeomjeoni MSS-160 (AY699794) 

Algoriphagus locisalis MSS-170 (AY835922) 

Algoriphagus antarcticus LMG 21980 (AJ577141) 

Algoriphagus chordae LMG 21970 (AJ575265) 

Algoriphagus aquimarinus LMG 21971 (AJ575264) 

Algoriphagus ratkowskyi LMG 21435 (AJ608641) 

Algoriphagus halophilus IMSNU 14013 (AY264839) 

Chimaereicella alkaliphila AC74 (AJ717393) 

Algoriphagus dokdonensis DS-44 (DQ178979) 

Algoriphagus borotolerans (AB197852) 

Hongiella ornithinivorans IMSNU 14014 (AY264840) 

Hongiella marincola SW-2 (AY533663) 

Bakterienstamm T4 

Hongiella mannitolivorans IMSNU 14012 (AY264838) 

Cyclobacterium marinum LMG 13164 (AJ575266) 

Cytophaga hutchinsonii (M58768) 

Flavobacterium aquatile (M62797) 

Abb. 3.40: Phylogenetischer Stammbaum (NJ-Methode), basierend auf 16S-rDNA- 

Sequenzen von naheverwandten Organismen, der die Verwandtschaftsverhältnisse von 

Bakterienstamm T4 darstellt. An den Knotenpunkten der Stammbaumäste sind die 

Bootstrap-Werte in Prozent abgebildet (1000 Wiederholungen). Die Methode von JUKES 

und CANTOR (1969) wurde für die Berechnung der evolutionären Distanzen verwendet. Die 

Zugangsnummern der Referenz-Sequenzen sind in Klammern angegeben. Flavobacterium 

aquatile (Zugangsnummer: M62797) wurde als Outgroup gewählt. Skalierungsbalken: 0,01 

Substitutionen pro Nukleotid-Position. 

Wie in Abbildung 3.40 zu erkennen, ist der nächste Verwandte von Bakterienstamm 

T4 der Stamm Hongiella mannitolivorans IMSNU 14012 (Zugangsnummer: 

AY264838). Zusammen mit Hongiella ornithinivorans IMSNU 14014 

(Zugangsnummer: AY264840) und Hongiella marincola SW-2 (Zugangsnummer: 

AY533663) bilden die beiden erstgenannten eine Gruppe, die sich deutlich von den 

anderen Clustern abgrenzt.

Diskussion _______________________________ 124 

4. Diskussion 

Vorrangig wird in diesem Kapitel ein Vergleich der Merkmale des Bakterienstammes 

T4 mit denen nahe verwandter Genera (Algoriphagus, Chimaereicella, 

Cyclobacterium, Cytophaga und Hongiella) angestellt. Diese wurden ermittelt, indem 

die aus dem Stamm T4 isolierte 16S-rDNA-Sequenz mit den gegenwärtig 

verfügbaren Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken mit Hilfe von BLAST, 

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verglichen wurde (siehe Kapitel 3.5.2). 

Weiterhin wird ausführlich auf die Pigmente des Bakterienstammes T4 eingegangen. 

4.1 Morphologie 

4.1.1 Vergleich der Morphologie von Bakterienstamm T4 mit anderen Genera 

Die Kolonien des Bakterienstammes T4 sind rund, spiegeleiförmig, glänzend, 

besitzen einen glatten Rand und sind orange-rot gefärbt (siehe Kap. 3.1.1). Damit 

entsprechen sie der Koloniemorphologie der Genera Algoriphagus sowie Hongiella, 

bis auf die Tatsache, dass diese keine spiegeleiförmigen Kolonien besitzen 

(BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; VAN TRAPPEN et al., 

2004). Die Genera Cyclobacterium und Cytophaga besitzen mycelartige Kolonien, 

über die Kolonien von Chimaereicella alkaliphila, der einzigen Art der Gattung, ist nur 

bekannt, dass sie rot gefärbt sind (HOLT et al., 1994; BERNARDET et al., 1996; 

REICHENBACH, 2002; TIAGO et al., 2006), was einen Vergleich erschwert. 

Demnach wäre eine Einordnung des Bakterienstammes T4 zu den Genera 

Algoriphagus sowie Hongiella am wahrscheinlichsten. 

Bei den Zellen von Bakterienstamm T4 handelt es sich unter Standardbedingungen 

um kurze bis lange Stäbchen, welche die Tendenz besitzen, sich zu agglomerisieren 

(siehe Kapitel 3.1.2.1). Damit entsprechen sie der Zellmorphologie der Genera 

Chimaereicella, Cytophaga, und Hongiella nur dass diese keine Zellagglomerate 

bilden (HOLT et al., 1994; REICHENBACH, 2002; BOWMAN et al., 2003; YI und 

CHUN, 2004; TIAGO et al., 2006). Die Cyclobakterien besitzen ringartige oder 

hufeisenförmige Zellen (HOLT et al., 1994), wohingegen Algoriphagus-Arten 

Coccobacilli oder kurze Filamente bilden (BOWMAN et al., 2003). Folglich wäre eine 

Einordnung des Bakterienstammes T4 zu den Genera Chimaereicella, Cytophaga, 

und Hongiella naheliegend.

Diskussion _______________________________ 125 

Die Zellen von Bakterienstamm T4 können sich an bestimmte Oberflächen anheften 

(siehe Kap. 3.1.2.1). Da eine solche Fähigkeit zur Adhäsion häufig bei Bakterienarten 

vorkommt, die Pili oder auch Fimbrien genannte Zellstrukturen besitzen (IRVIN et al., 

1984; BURCHARD et al., 1990), ist anzunehmen, dass die Zellen von 

Bakterienstamm T4 sich ebenfalls mit Hilfe solcher Fortsätze an bestimmte 

Oberflächen anheften können. 

Ob die Genera Algoriphagus, Cyclobacterium, Chimaereicella, Cytophaga und 

Hongiella ebenfalls solche Zellstrukturen besitzen, ist nicht bekannt (HOLT et al., 

1994; REICHENBACH, 2002; BOWMAN et al., 2003; YI und CHUN, 2004; YOON et 

al., 2004; TIAGO et al., 2006; YOON et al., 2006). 

Das Bewegungsvermögen der Zellen von Bakterienstamm T4 wurde 

lichtmikroskopisch sowie makroskopisch überprüft (siehe Kapitel 3.1.2.2). Die dabei 

festgestellte Unfähigkeit zur schwimmenden Fortbewegung ließe eine Einordnung zu 

den Genera Algoriphagus, Cyclobacterium, Chimaereicella oder Hongiella vermuten, 

da unter ihnen nur unbewegliche Organismen bekannt sind (BOWMAN et al., 2003; 

YI und CHUN, 2004; YOON et al., 2004; TIAGO et al., 2006). 

Allerdings ist Bakterienstamm T4 in der Lage, sich auf bestimmten Oberflächen 

gleitend fortzubewegen. Die Induktion gleitender Fortbewegung konnte dabei nur auf 

xylanhaltigen Agarplatten beobachtet werden. War dieses Verhalten aber schon 

induziert worden, zeigten die Bakterien es auch auf MSM + -Agar, nicht aber auf 

Wasseragar (siehe Kap. 3.1.2.2.2). 

Diese Art der Fortbewegung findet sich nur im Genus Cytophaga (REICHENBACH, 

2002). Folglich wäre diesem Anhaltspunkt nach eine Einordnung des 

Bakterienstammes T4 zu diesem Genus am wahrscheinlichsten. 

Die Zellen von Bakterienstamm T4 sind von einer Schleimkapsel umgeben (siehe 

Kap. 3.1.2.4.1). Dieses Ergebnis steht im Einklang zu den Erkenntnissen aus den in 

den Kapiteln 3.1.2.1 und 3.1.2.2.2 beschriebenen Versuchen, da gleitende Bakterien 

zum einen häufig Schleimsubstanzen produzieren, auf denen sie sich dann 

fortbewegen (STAHL et al.,1983; JEON und DOBRYNIN, 2005), zum anderen 

besitzen solche Bakterien oft auch Pili sowie die Fähigkeit, sich damit adhäsiv an 

Oberflächen anheften zu können (IRVIN et al., 1984; BURCHARD et al., 1990) oder 

sie zur gleitenden Fortbewegung zu nutzen (SPORMANN, 1999; MCBRIDE; 2001). 

Es ist vorstellbar, dass die Bakterienzellen von Stamm T4 sich mit Hilfe ihrer Pili und 

der sie umgebenden Schleimsubstanzen agglomerisieren können. So ließe sich

Diskussion _______________________________ 126 

eventuell die hohe Stabilität der Zellhaufen von Bakterienstamm T4 erklären (siehe 

Kap. 3.1.2.3). 

Das Vorhandensein einer Schleimkapsel ist von den in Frage kommenden Genera 

nur für Cyclobacterium und Cytophaga beschrieben worden (HOLT et al., 1994; 

REICHENBACH, 2002), nicht aber für die Genera Algoriphagus, Chimaereicella oder 

Hongiella (BOWMAN et al., 2003; YI und CHUN, 2004; YOON et al., 2004; TIAGO et 

al., 2006). Demnach wäre eine Einordnung des Bakterienstammes T4 zu den 

Genera Cyclobacterium oder Cytophaga am naheliegendsten. 

Bei Bakterienstamm T4 handelt es sich um ein Gram-negatives Bakterium. Zu den 

Genera Algoriphagus, Cyclobacterium, Chimaereicella, Cytophaga und Hongiella 

zählen ebenfalls nur Gram-negative Bakterienarten (REICHENBACH, 2002; 

BOWMAN et al., 2003; YI und CHUN, 2004; YOON et al., 2004; TIAGO et al., 2006). 

Folglich wäre eine Zuordnung von Bakterienstamm T4 zu allen diesen Gattungen 

plausibel. 

4.2 Physiologie 

4.2.1 Vergleich der Physiologie von Bakterienstamm T4 mit anderen Genera 

Es handelt sich bei Bakterienstamm T4 um ein Bakterium, welches unter aeroben 

und mikroaerophilen Bedingungen wachsen kann. Es besitzt nicht die Fähigkeit zur 

Gärung, kann aber sehr wahrscheinlich eine Art Nitratatmung durchführen (siehe 

Kap. 3.2.3). 

Dabei könnte es sich um eine Denitrifikation oder eine Nitratammonifikation handeln. 

Bei einem ähnlichen Experiment in Schüttelagarröhrchen konnte im äquivalenten 

Ansatz nicht die Bildung von Gasbläschen beobachtet werden (Daten nicht 

dargestellt), was darauf hindeutet, dass Bakterienstamm T4 wahrscheinlich eine 

Nitratammonifikation durchführt. Hierbei wird das Nitrat nicht über Nitrit, Stickstoffoxid 

und Distickstoffoxid zu molekularem Stickstoff reduziert, sondern es wird zunächst 

als äußerer Wasserstoff-Elektronenakzeptor genutzt und zu Nitrit reduziert. Dieses 

kann weiter reduziert werden, aber nicht zu Stickstoff, sondern auf dem Wege der 

assimilatorischen Nitratreduktion zu Ammoniak bzw. Ammonium. Es wird dabei 

folglich kein Stickstoff freigesetzt (SCHLEGEL, 1992; MADIGAN et al., 2001). 

Die dabei auftretende Akkumulation von Nitrit in den entsprechenden Kulturen 

könnte auch erklären, dass die Bakterien unter den dort herrschenden Bedingungen

Diskussion _______________________________ 127 

nur schwach wachsen konnten und relativ schnell wieder abstarben (vergleiche Kap. 

3.2.9). 

Auch mittels des API 10S-Testsytems konnte gezeigt werden, dass kein 

Stickstoffdioxid bei der Nitratreduktion entstand (siehe Kap. 3.3.3). 

Die in der Literatur beschriebenen Gattungen Algoriphagus, Cyclobacterium, 

Chimaereicella und Hongiella sind alle strikt aerob. (HOLT et al., 1994; 

NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004; YOON et al., 2004; TIAGO et 

al., 2006). Nur unter den Cytophaga gibt es einige Arten, die auch mikroaerophil, 

manche sogar anaerob wachsen können (REICHENBACH, 2002). Einige Arten der 

Gattungen Algoriphagus, Cytophaga und Hongiella besitzen, wie Bakterienstamm 

T4, die Fähigkeit, eine Nitrat-Reduktion durchzuführen (REICHENBACH, 2002; 

NEDASHKOVSKAYA et al., 2004). Demnach wäre eine Einordnung des 

Bakterienstammes T4 in das Genus Cytophaga am wahrscheinlichsten. 

Wie in Kapitel 3.2.3.1 beschrieben, konnte je nach Sauerstoffversorgung eine 

unterschiedlich starke Färbung des Bakterienstammes T4 festgestellt werden. So 

zeigten die Ergebnisse, dass die Bakterien umso stärker gefärbt waren, desto höher 

die Sauerstoffsättigung des Mediums war. Wie weitere Untersuchungen (siehe Kap. 

3.4) zeigten, handelt es sich bei den Pigmenten, welche die Färbung verursachen, 

vermutlich um mehrere nicht genau zu identifizierende Carotinoide. 

In Bakterienstamm T4 spielen Carotinoide wahrscheinlich eine wichtige Rolle beim 

Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies (Superoxid- sowie Hydroxylradikale, ebenso 

wie hochreaktive Sauerstoffformen wie Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff). 

Je mehr Sauerstoff im Kulturmedium gesättigt war, desto größere Mengen an 

Carotinoiden konnten festgestellt werden. Demnach wurde die Synthese dieser 

Stoffgruppe wahrscheinlich durch die Anwesenheit von Sauerstoff, somit auch von 

reaktiven Sauerstoffspezies, angeregt. 

Diese Hypothese wird durch Untersuchungen an der Hefe Phaffia rhodozyma 

gestützt. Umso größer die Menge an Sauerstoff war, der dieser Organismus 

ausgesetzt wurde, desto höher war die Quantität des Carotinoids Astaxanthin. Es 

wurde gezeigt, dass bestimmte Sauerstoffspezies den Carotinoidlevel regulieren, 

indem sie die Carotinoidsynthese einleiten sowie existierende Astaxanthinpools 

oxidativ degradieren. Durch diese Degradation von Endprodukten des 

Astaxanthinsynthese-Stoffwechselweges verhindern sie eine negative Rückkopplung 

der Endprodukte auf die Synthese, wodurch diese angeregt wird (SCHROEDER und 

JOHNSON, 1995).

Diskussion _______________________________ 128 

Die Pigmentsynthese einiger Cytophagales-Arten wird ebenfalls durch physikalische 

Faktoren beeinflusst. So ist Cytophaga succinicans farblos, wenn der Organismus 

unter mikroaerophilen bis anaeroben Bedingungen angezogen wird, aber gelb- 

orange unter aeroben (REICHENBACH, 2002). Es ist demnach zu vermuten, dass 

die Carotinoidsynthese bei Bakterienstamm T4 ähnlichen Mechanismen unterliegt. 

Auch unterschiedliche Phosphatkonzentrationen des Kulturmediums besitzen, wie in 

Kapitel 3.2.10.1 beschrieben, einen Einfluss auf den Carotinoidgehalt von 

Bakterienstamm T4. So konnte gezeigt werden, dass die Bakterien umso mehr 

Carotinoide synthetisierten, wenn höhere Phosphat-Konzentrationen im 

Kulturmedium vorlagen. Demnach scheint das Phosphat eine wichtige Rolle bei der 

Carotinoidsynthese durch Bakterienstamm T4 zu spielen. Diese Hypothese wird 

durch die Tatsache gestützt, dass für die Initialisierung der Carotinoidsynthese zwei 

Substanzen benötigt werden, die jeweils zwei Phosphat-Atome beinhalten: 

Isopentenyldiphosphat sowie Dimethylallyldiphosphat (CUNNINGHAM, 2002). 

Bakterienstamm T4 kann bei Temperaturen von 15 - 42 °C wachsen, mit einem 

Optimum bei 25 - 30 °C (siehe Kap. 3.2.4). Demnach handelt es sich bei dem Stamm 

um ein mesophiles Bakterium (MADIGAN et al., 2001). Es war festzustellen, dass bei 

10 und 15 °C Inkubationstemperatur viele bis viele sehr Zellen in agglomerisierter 

Form vorlagen, wohingegen bei 42 und 45 °C kaum Agglomerate gebildet wurden. 

Die Inkubationstemperatur besitzt demnach eventuell einen Einfluss auf den 

Agglomerisationsgrad der Bakterienzellen. 

Algoriphagus-Arten können bei Temperaturen von - 2 bis 34 °C wachsen, mit Optima 

zwischen 17 und 35 °C (BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; 

YOON et al., 2006). Chimaereicella alkaliphila kann bei Temperaturen von 10 - 40 °C 

wachsen, mit einem Optimum bei 30 °C (TIAGO et al., 2006). Hongiella-Arten 

wachsen in einem Temperaturbereich von 5 - 45 °C, mit Optima von 35 - 40 °C (YI 

und CHUN, 2004; YOON et al., 2004). Cytophaga-Arten können bei Temperaturen 

von 10 bis 35 °C wachsen, mit Optima zwischen 20 und 30 °C (REICHENBACH, 

2002). Bakterienarten aus der Gattung Cyclobacterium wachsen bei Temperaturen 

von 4 - 40 C°, mit Optima zwischen 25 und 30 °C (HOLT et al., 1994; BRETTAR et 

al., 2004). 

Den Temperaturansprüchen nach wäre eine Einordnung des Bakterienstammes T4 

in das Genus Chimaereicella am wahrscheinlichsten.

Diskussion _______________________________ 129 

Bakterienstamm T4 ist es möglich, bei pH-Werten von 7 - 9 zu wachsen, mit einem 

Optimum bei 8 (siehe Kap. 3.2.5). Folglich lässt sich der Stamm den neutrophilen 

Bakterien zuordnen (MADIGAN et al., 2001). Es war zu beobachten, dass bei pH 5 

und 6 viele Zellen in agglomerisierter Form vorlagen, wohingegen bei pH 9 und 10 

kaum Agglomerate gebildet wurden. Der pH-Wert des Kulturmediums besitzt folglich 

genauso wie die Inkubationstemperatur eventuell einen Einfluss auf den 

Agglomerisationsgrad der Bakterienzellen. 

Algoriphagus-Arten können bei pH-Werten von 5,5 bis 7,5 wachsen, mit Optima 

zwischen 6,5 und 7,5 (BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; 

YOON et al., 2006). Chimaereicella alkaliphila kann bei pH-Werten von 7,2 bis 11 

wachsen, mit einem Optimum bei 8 (TIAGO et al., 2006). Hongiella-Arten wachsen in 

einem pH-Wertbereich von 5,5 bis 8, mit Optima zwischen 6,5 und 7,5 (YI und 

CHUN, 2004; YOON et al., 2004). Cytophaga-Arten besitzen pH-Wert-Optima 

zwischen 7 und 7,5 (HOLT et al., 1994). Bakterienarten aus der Gattung 

Cyclobacterium wachsen bei pH-Werten von 6 - 9 (BRETTAR et al., 2004). 

Den pH-Wert-Ansprüchen nach wäre eine Einordnung des Bakterienstammes T4 in 

das Genus Chimaereicella am plausibelsten. 

Bakterienstamm T4 kann bei Salzgehalten von 0 - 4 % NaCl wachsen, optimal 

allerdings ohne NaCl (siehe Kap. 3.2.6). Demnach handelt es sich bei dem Stamm 

um ein halotolerantes Bakterium (MADIGAN et al., 2001). 

Algoriphagus-Arten können bei Salzgehalten von 0 - 10 % NaCl wachsen 

(NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YOON et al., 2006). Chimaereicella alkaliphila 

kann bei Salzgehalten von 0 - 3 % wachsen, optimal aber ohne Salz (TIAGO et al., 

2006). Hongiella-Arten wachsen bei Salzgehalten von 0 - 9 % (YI und CHUN, 2004; 

YOON et al., 2004). Cytophaga-Arten können bei Salzgehalten von 0 - 6 % wachsen 

(HOLT et al., 1994). Bakterienarten aus der Gattung Cyclobacterium wachsen bei 

Salzgehalten 1,5 - 15 % (BRETTAR et al., 2004). 

Den Ansprüchen des Salzgehalts nach wäre eine Einordnung des Bakterienstammes 

T4 in das Genus Chimaereicella am wahrscheinlichsten. 

In Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology oder in Originalveröffentlichungen 

basiert bei der Neubeschreibung von Bakterien die Untersuchung der 

Verwertungsspektren meistens auf Wachstumsversuchen mit verschiedenen 

Substraten als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese klassische Methode

Diskussion _______________________________ 130 

wurde durch zwei zeitsparende Methoden, welche zur Identifizierung klinisch 

relevanter Bakterien entwickelt wurden, ergänzt (siehe Kap. 3.2.7.1-3). 

Mittels aller drei Methoden konnte festgestellt werden, dass Bakterienstamm T4 zu 

den chemoorganotrophen Bakterien zählt (MADIGAN et al., 2001). Es waren sowohl 

die klassische Methode als auch die standardisierten Testsysteme geeignet, um das 

Substratverwertungsspektrum von Bakterienstamm T4 zu ermitteln. So wurde mit 

den drei unterschiedlichen Methoden fast das gleiche Substratspektrum ermittelt. 

Es konnte gezeigt werden, dass Mono- und Disaccharide sehr gut sowie Oligo- und 

Polysaccharide gut verwertet werden können. Auch Desoxyzucker konnten zum 

Wachstum genutzt werden. Wurden hingegen Alkohole, Alditole, Amide, Amine, 

Carboxylsäuren und Aminosäuren als Kohlenstoffquelle angeboten, fand fast immer 

kein Wachstum statt. 

Es waren auch einige Unterschiede zwischen den Ergebnissen der drei 

Substratverwertungstestmethoden 

zusammengefasst sind. 

festzustellen, welche in Tabelle 4.1 

Tab. 4.1: Zusammenstellung der Unterschiede zwischen den Ergebnissen des klassischen 

Substratverwertungstests, denen des API 50 CH- sowie denen des GN2 Microplate TM - 

Testsystems. 


klassischer Substratverwertungstest 

Wachstum 

API 50 CH- 

Testsystem 

GN2 Microplate TM - 

Testsystem 

D-Arabinose - 1 

ND 3 

D-Ribose - ND + 

Glycerin + 3 

- - 

ß-Methyl-Dglucosid 

ND 4 

- + 

L-Asparagin (+) 2 

- - 

1 - = kein Wachstum 

2 (+) = schwaches Wachstum 

3 + = Wachstum 

4 ND = nicht determiniert 

In Tabelle 4.2 ist die Substratverwertung des Bakterienstammes T4 mit der von 

einigen nahen verwandten Genera verglichen. 

+ 2

Diskussion _______________________________ 131 

Tab. 4.2: Vergleich der Substratverwertung des Bakterienstammes T4 mit der von einigen 

nahen verwandten Genera. 

Substrate Bakterienstamm 

T4 

Algoriphagus 

1 

Cyclobacterium 

2 

Chimae- 

reicella 3 

Cyto- 

phaga 4 

Hongiella 5 

D-Glucose + 

+ + - v v 

D-Arabinose - v UB - v - 

D-Cellobiose + + UB + v + 

D-Lactose + + + - v + 

D-Mannitol - v UB - - - 

D-Raffinose - v UB UB v - 

D-Saccharose + + UB + v + 

D-Xylose + + UB - v + 

1 

NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YOON et al., 2006 

2 

HOLT et al., 1994 ; BOWMAN et al., 2003 

3 

Chimaereicella alkaliphila; TIAGO et al., 2006 

4 

HOLT et al., 1994; REICHENBACH, 2002 

5 

NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004 

+ = Wachstum 

- = kein Wachstum 

v = variiert innerhalb und / oder zwischen den Arten 

UB = unbekannt 

Wie aus Tabelle 4.2 hervorgeht, gibt es in Bezug auf deren 

Substratverwertungsspektren starke Parallelen zwischen Bakterienstamm T4 und 

den Gattungen Algoriphagus sowie Hongiella. Allerdings gibt es auch im Genus 

Cytophaga Arten, die eine fast identische Substratverwertung besitzen (HOLT et al., 

1994; Reichenbach, 2002). Über die Substratverwertung der Cyclobakterien ist erst 

wenig bekannt (HOLT et al., 1994; BERNARDET et al., 1996; BOWMAN et al., 

2003), was einen Vergleich erschwert. Die Substratverwertung von Chimaereicella 

alkaliphila (TIAGO et al., 2006) unterscheidet sich in einigen Punkten von der des 

Bakterienstammes T4. Demnach ist der Bakterienstamm T4 wahrscheinlich näher 

verwandt mit den Genera Algoriphagus sowie Hongiella, als mit Cytophaga-, 

Chimaereicella- oder Cyclobacterium-Arten. 

4.3 Biochemie 

4.3.1 Vergleich der Biochemie von Bakterienstamm T4 mit anderen Genera 

Bakterienstamm T4 besitzt eine leichte Resistenz gegen Carbenicillin und 

Kanamycin (siehe Kap. 3.3.1). 

In Tabelle 4.3 ist ein Vergleich einiger Antibiotika und deren Einfluss auf das 

Wachstum von Bakterienstamm T4 sowie einiger nahe verwandter Genera 

dargestellt.

Diskussion _______________________________ 132 

Tab. 4.3: Antibiotika und deren Einfluss auf das Wachstum von Bakterienstamm T4 sowie 

einiger nahe verwandter Genera. 

Antibiotikum Bakterienstamm 

T4 

Algoriphagus 

1 


2 

Chimae- 

reicella 3 

Cyto- 

phaga 4 

Hongiella 5 

Ampicilin - 

- UB UB UB v 

Carbenicillin + v UB - UB v 

Kanamycin + - UB + UB v 

Lincomycin - v UB UB UB v 

Penicillin-G - UB UB - UB v 

Streptomycin - - UB - UB v 

Tetracyclin - v UB - UB v 

1 


2 

HOLT et al., 1994; BOWMAN et al., 2003 

3 


4 


5 

BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004 

+ = Wachstum 




Wie aus Tabelle 4.3 ersichtlich, gibt es in Bezug auf deren 

Antibiotikaresistenzspektren die stärksten Parallelen zwischen Bakterienstamm T4 

und Chimaereicella alkaliphila (TIAGO et al., 2006). Über das 

Antibiotikaresistenzspektrum von Cyclobacterium- und Cytophaga-Arten ist erst 

wenig bekannt (HOLT et al., 1994; REICHENBACH, 2002; BOWMAN et al., 2003), 

daher kann kein aussagekräftiger Vergleich gemacht werden. Zu den beiden 

Gattungen Algoriphagus sowie Hongiella werden einige Arten gezählt, die ein 

ähnliches Antibiotikaresistenzspektrum besitzen wie Bakterienstamm T4 (BOWMAN 

et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YOON et al., 2006). Demnach ist der 

Bakterienstamm T4 wahrscheinlich näher verwandt mit den Genera Algoriphagus, 

Chimaereicella sowie Hongiella, als mit Cytophaga- oder Cyclobacterium-Arten. 

Es konnte gezeigt werden, dass Bakterienstamm T4 über eine Reihe von 

intrazellulären sowie extrazellulären Enzymen verfügt (siehe Kap. 3.3.2). 

Um eine eventuelle Urease-Aktivität festzustellen, wurden drei verschiedene 

Methoden angewandt, welche alle zu dem Ergebnis kamen, dass bei Stamm T4 

keine Urease-Aktivität zu verzeichnen ist (siehe Kap. 3.3.2, 3.3.2.1 und 3.3.3). 

Auch die Ergebnisse der beiden durchgeführten Nachweismethoden für 

Cytochromoxidase unterschieden sich nicht (siehe Kap. 3.3.2 und 3.3.3).

Diskussion _______________________________ 133 

In Tabelle 4.4 ist ein Vergleich der Enzymausstattung von Bakterienstamm T4 sowie 

der einiger nahe verwandter Genera dargestellt. 

Tab. 4.4: Enzymausstattung von Bakterienstamm T4 und einiger nahe verwandter Genera. 

Das Vorhandensein der Enzyme wurde aufgrund des Wachstums mit den entsprechenden 

Substraten ermittelt. 

Antibiotikum Bakterienstamm 

T4 

Algoriphagus 

1 


2 

Chimae- 

reicella 3 

Cyto- 

phaga 4 

Hongiella 5 

Oxidase + + + + v + 

Katalase + + + + v + 

Agarase - v - UB v - 

Amylase + v - + v v 

Cellulase A - - - UB v - 

Cellulase B - - UB UB v - 

DNase 

+ v - + v v 

Esterase + v - UB v v 

Gelatinase + v - + v + 

Lecithinase - 

UB UB UB UB UB 

Lipase - UB - UB v UB 

Peptidase + v - - v - 

RNase + UB UB UB UB UB 

Urease - - - - v - 

Xylanase - UB UB - UB UB 

1 


2 


3 


4 


5 

BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004 

+ = Wachstum 




Wie aus Tabelle 4.4 hervorgeht, können in Bezug auf deren Enzymausstattung die 

meisten Übereinstimmungen zwischen Bakterienstamm T4 und den Gattungen 

Algoriphagus, Hongiella und Chimaereicella festgestellt werden (BOWMAN et al., 

2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004; TIAGO et al., 2006; 

YOON et al., 2006). Allerdings gibt es auch in der Gattung Cytophaga Arten, die eine 

fast identische Enzymausstattung besitzen wie Stamm T4 (HOLT et al., 1994; 

REICHENBACH, 2002). Cyclobacterium-Arten hingegen verfügen über eine etwas 

anders gestaltete Enzymausstattung, z.B. konnte bei ihnen keine DNAse-, Esteraseoder 

Gelatinase-Aktivität nachgewiesen werden (HOLT et al., 1994; BOWMAN et al., 

2003).

Diskussion _______________________________ 134 

Der Ausstattung mit Enyzmen nach zu unterteilen, wäre eine Zugehörigkeit des 

Bakterienstammes T4 zu den Genera Algoriphagus, Chimaereicella, Hongiella sowie 

Cytophaga wahrscheinlich. 

Es wurde festgestellt, dass Bakterienstamm T4 bei der Verstoffwechselung von 

bestimmten Kohlenhydraten Säuren produziert und diese ins umgebende 

Kulturmedium abgibt was an einer Absenkung des pH-Wertes festgestellt wurde 

(siehe Kap. 3.3.4). 

Dieses Stoffwechselverhalten ist ebenfalls für die Gattungen Algoriphagus, 

Hongiella, Chimaereicella, Cytophaga sowie Cyclobacterium beschrieben worden 

(HOLT et al., 1994; REICHENBACH, 2002; BOWMAN et al., 2003; 

NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004; TIAGO et al., 2006; YOON et 

al., 2006). Demnach wäre eine Einordnung des Bakterienstammes T4 in alle fünf 

Genera plausibel. 

4.4 Chemotaxonomie 

4.4.1 Pigmentausstattung von Bakterienstamm T4 im Vergleich mit anderen Genera 

Es konnte gezeigt werden, dass Bakterienstamm T4 keine Flexirubine als Pigmente 

besitzt (siehe Kap. 3.4.1.1). 

Algoriphagus-, Hongiella- und Cyclobacterium-Arten sowie Chimaereicella alkaliphila 

besitzen ebenfalls keine Flexirubine als Pigmente (HOLT et al., 1994; 

NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004; YOON et al., 2004; TIAGO et 

al., 2006). Nur für Cytophaga-Arten ist das Vorhandensein von Flexirubinen 

beschrieben worden (HOLT et al., 1994; REICHENBACH, 2002). 

Demnach ist der Bakterienstamm T4 wahrscheinlich näher verwandt mit den Genera 

Algoriphagus, Chimaereicella, Cyclobacterium sowie Hongiella als mit Cytophaga- 

Arten. 

Sowohl mittels der DC als auch mit der SC konnte das Auftreten von vier sich 

verschiedenen schnell über die stationäre Phase bewegenden Pigmentfraktionen 

(PF 1 - 4) festgestellt werden (siehe Kap. 3.4.1.2 und 3.4.1.3). In beiden Fällen 

waren PF 1 gelb, PF 2 orange sowie PF 3 und 4 rötlich gefärbt und auch mittels UV- 

Licht konnten keine zusätzlichen Fraktionen sichtbar gemacht werden. Folglich 

waren beide Methoden gleich gut geeignet, um die in dem methanolischen Extrakt 

enthaltenen Substanzen aufzutrennen.

Diskussion _______________________________ 135 

Bei der qualitativen Bestimmung der bakteriellen Pigmente mittels HPLC wurden 

zwei Pigmente sowie drei weitere Substanzen im Bakterienstamm T4 nachgewiesen 

(siehe Kap. 3.4.1.4). Im Vergleich zur DC und SC ist dies eine Substanz mehr. Dies 

lässt sich dadurch erklären, dass die HPLC-Methode eine feinere Auftrennung der in 

der untersuchten Probe enthaltenen Substanzen ermöglicht als die DC oder die SC 

MEYER, 2004). 

Die den Peaks 2 und 4 (siehe Kap. 3.4.1.4, Tab. 3.27 und Abb. 3.26) 

entsprechenden Substanzen konnten mittels der angewandten HPLC-Methode 

anhand ihrer Absorptionsspektren den Carotinoiden zugewiesen werden (BRITTON 

et al., 2004), genauer war eine Identifizierung dieser beiden Stoffe aber nicht 

möglich. Die den Peaks 5 bis 7 (siehe Kap. 3.4.1.4, Tab. 3.27 und Abb. 3.26) 

entsprechenden Substanzen waren ebenfalls nicht zu identifizieren, da sie in zu 

geringer Konzentration im methanolischen Extrakt vorlagen. Es könnte allerdings 

sein, dass es sich bei der Substanz, welche sich hinter Peak 6 verbirgt, um 

Menaquinon 7 (MK-7) handelt (vergleiche Kap. 3.4.1.6). Die dem Peak 6 

entsprechende Substanz besaß eine Retentionszeit von 16,52 min. Für MK-7 ist eine 

Retentionszeit von 16,5 min in der Literatur beschrieben worden (siehe Abb. 4.1). 

Abb. 4.1: HPLC-Chromatogramm einer neutralen Lipidfraktion aus Thermoplasma 

acidophilum. Der durch MK-7 verursachte Peak ist durch einen roten Pfeil gekennzeichnet 

(modifiziert nach SHIMADA et al., 2001). 

Durch die von den Pigmentfraktionen 1 - 4 nach der säulenchromatographischen 

Auftrennung aufgenommenen UV/VIS-Spektren konnte gezeigt werden, dass in allen

Diskussion _______________________________ 136 

vier Pigmentfraktionen jeweils mindestens ein bestimmtes Carotinoid enthalten ist. 

Es konnte in allen Fällen jeweils ein für Carotinoide typisches Muster des 

Absorptionsspektrums festgestellt werden (BRITTON et al., 2004), genauer war eine 

Identifizierung der in den Pigmentfraktionen enthaltenen Stoffe allerdings nicht 

möglich. 

Beim Vergleich der vier Absorptionsspektren zeigt sich, dass sich die Spektren von 

PF 1 - 3 sehr ähneln. Allerdings weißt das Spektrum von PF 1 einen deutlich stärker 

ausgeprägten Verlauf der Schultern auf als das von PF 2 bzw. 3. Das Spektrum von 

PF 4 besitzt zwei einzeln liegende Maxima, womit es sich von der Art der anderen 

Spektren abgrenzt. Dies spricht dafür, dass mindestens drei verschiedene 

Carotinoide in dem methanolischen Extrakt vorlagen (siehe Kap. 2.12.1.2): Eins in 

PF1, ein weiteres in PF 2 und 3 sowie mindestens eins in PF 4. 

Im Gegensatz dazu konnten durch die angewandte HPLC-Methode nur zwei 

Substanzen anhand ihrer Absorptionsspektren als Carotinoide identifiziert werden 

(siehe Kap. 3.4.1.4). Die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der beiden 

Methoden lässt sich zum einen eventuell damit erklären, dass zwei verschiedene 

Extraktionsmethoden angewandt wurden (siehe Kap. 2.12.1.2 und 2.12.1.5). 

Andererseits könnte es auch sein, dass es sich bei einer der Substanzen, welche 

sich hinter den Peaks 5 und 7 (siehe Kap. 3.4.1.4, Tab. 3.27 und Abb. 3.26) 

verbergen, eventuell um ein weiteres Carotinoid handelt. 

Mittels einer massenspektrometrischen Analyse von PF 1 und 4 (PF 2 und 3 lagen in 

zu geringen Konzentrationen in dem methanolischen Extrakt vor) konnte 

nachgewiesen werden, dass in PF 1, den aufgenommenen EI- und ESI-Spektren 

zufolge, drei verschiedene Massen enthalten sind: m/z 648, 668 und 933 (siehe Kap. 

3.4.1.6). 

Von diesen drei Massenzahlen konnte nur m/z 648 mit einer Wahrscheinlichkeit von 

90,6 % mittels eines Datenbankabgleichs (NIST) als MK-7 identifiziert werden. Die 

festgestellten Unterschiede zwischen dem EI-Spektrum von MK-7 und dem von PF 1 

lassen vermuten, dass es geringfügige strukturelle Unterschiede im Molekülaufbau 

von MK-7 und der in PF 1 enthaltenen Substanz (m/z 648) gibt. 

In PF 4 konnten den aufgenommenen EI- und ESI-Spektren zufolge, fünf 

verschiedene Massen festgestellt werden: m/z 434, 582, 668, 747 und 775.

Diskussion _______________________________ 137 

Von diesen fünf Massenzahlen konnte keine mittels eines Datenbankabgleichs 

(NIST) als auch anhand von Literaturdaten (BRITTON et al., 2004) identifiziert 

werden. 

Die Tatsache, dass fünf verschiedene Massenzahlen in PF 4 festgestellt werden 

konnten, spricht wie im Falle von PF 1 (drei verschiedene Massenzahlen) dafür, dass 

die vorangegangene säulenchromatographische Auftrennung des methanolischen 

Extrakts in Reinstoffe nicht optimal funktioniert hat. Das Auffinden der Massenzahl 

668 in beiden Pigmentfraktionen untermauert diese Annahme. 

Weiterhin lässt sich daraus schließen, dass die für die Überprüfung der Reinheit der 

jeweiligen Pigmentfraktionen angewandten Methoden (DC und Aufnahme von 

UV/VIS-Spektren; siehe Kap. 2.12.1.7) in diesen Fällen nicht dafür geeignet waren. 

So konnte durch diese Methoden nicht festgestellt werden, dass es sich bei PF 1 und 

PF4 jeweils um Substanzgemische handelte. 

Dies war auch der Grund dafür, dass von PF 1 und PF 4 keine NMR-Spektren 

aufgenommen werden konnten (siehe Kap. 3.4.1.7), da sich die Signale der 

verschiedenen Substanzen, welche in den jeweiligen Pigmentfraktionen enthalten 

waren, überlagerten, so dass die NMR-Spektren nicht auswertbar waren. 

Da alle Angehörigen der Genera Algoriphagus, Chimaereicella, Cyclobacterium-, 

Hongiella und Cytophaga Carotinoide als Pigmente besitzen können, wäre demnach 

eine Zuordnung des Bakterienstammes T4 zu allen diesen Genera möglich (HOLT et 

al., 1994; REICHENBACH, 2002; BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 

2004; VAN TRAPPEN et al., 2004; YI und CHUN, 2004; YOON et al. 2004; TIAGO et 

al., 2006; YOON et al., 2006). 

Interessant ist, dass die nicht identifizierten Carotinoide mehrerer Hongiella-Arten 

Absorptionsmaxima bei 480 nm aufweisen (YI und CHUN, 2004), genauso wie das 

Absorptionsspektrum von PF 4, welches vermutlich ebenfalls durch ein in der 

Fraktion enthaltenes Carotinoid verursacht wird (siehe Kap. 3.4.1.5, Abb. 3.30). 

4.5 Molekularbiologie 

4.5.1 Vergleich des GC-Gehalts der DNA sowie der 16S-rDNA-Sequenz von 

Bakterienstamm T4 mit anderen Genera 

Für Bakterienstamm T4 konnte ein GC-Gehalt der DNA von 40,4 mol% festgestellt 

werden (siehe Kap. 3.5.1).

Diskussion _______________________________ 138 

Algoriphagus-Arten besitzen einen GC-Gehalt von 35 - 49 mol% (YOON et al., 

2006). Für Chimaereicella alkaliphila ist ein GC-Gehalt von 43,5 mol% beschrieben 

worden (TIAGO et al., 2006). Hongiella-Arten besitzen GC-Gehalte zwischen 37 und 

42 mol% (YI und CHUN, 2004; YOON et al., 2004). Cytophaga-Arten besitzen einen 

GC-Gehalt von 35 - 43 mol% (HOLT et al., 1994). Für Bakterienarten aus der 

Gattung Cyclobacterium sind GC-Gehalte von 38 - 42 mol% beschrieben worden 

(HOLT et al., 1994). 

Dem GC-Gehalt der DNA nach zu unterteilen, wäre eine Einordnung des 

Bakterienstammes T4 in die Genera Algoriphagus, Cytophaga, Cyclobacterium und 

Hongiella wahrscheinlich. 

Die aus dem Bakterienstamm T4 isolierte 16S-rDNA-Sequenz wurde mit den 

gegenwärtig verfügbaren Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken mit Hilfe von 

BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verglichen (siehe Kapitel 3.5.2). Einige 

naheverwandte Gattungen sind in Tabelle 4.5 zusammengefasst. 

Tab. 4.5: Auflistung von 5 naheverwandten Gattungen zum Bakterienstamm T4 

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Es wurden dabei die Daten der 250 nächstverwandten 

Gattungen berücksichtigt. 

Gattung 

Übereinstimmung [%] 

der 16S-rDNA-Sequenz 

mit Bakterienstamm T4 

Organismen / Gattung 

Algoriphagus 93 - 96 23 

Cyclobacterium 90 - 95 9 

Cytophaga 92 - 94 7 

Hongiella 94 - 96 6 

Chimaereicella 96 1 

Der Stamm Hongiella mannitolivorans IMSNU 14012 (YI und CHUN, 2004) ist der 

nächste, schon näher klassifizierte Verwandte des Bakterienstammes T4 mit einer 

Übereinstimmung der 16S-rDNA-Sequenz von 96 %, gefolgt von Algoriphagus 

dokdonensis DS-44 (YOON et al., 2006) und Chimaereicella alkaliphila AC74 

(TIAGO et al., 2006) mit ebenfalls 96 % Übereinstimmung. Der Bakterienstamm T4 

ist aber auch nahe verwandt mit Vertretern der Genera Cyclobacterium und 

Cytophaga. In Tabelle 4.6 ist eine Übersicht der Taxonomie der nächstverwandten 

Gattungen dargestellt (vergleiche Kap. 3.5.2, Tab. 3.30).

Diskussion _______________________________ 139 

Tab. 4.6: Taxonomie der nächstverwandten Gattungen zum Bakterienstamm T4 

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 

Taxonomie Algoriphagus Chimaereicella 

Cyclobacterium Hongiella 

Domäne Eubacteria Eubacteria Eubacteria Eubacteria 

Überstamm CFB-Gruppe CFB-Gruppe CFB-Gruppe CFB-Gruppe 

Stamm Bacteroidetes Bacteroidetes Bacteroidetes Bacteroidetes 

Klasse Sphingobacteria Sphingobacteria Sphingobacteria Sphingobacteria 

Ordnung Sphingobacteriales Sphingobacteriales Sphingobacteriales Sphingobacteriales 

Familie Flexibacteraceae Flexibacteraceae Flexibacteraceae Flexibacteraceae 

Gattung Algoriphagus Chimaereicella Cyclobacterium Hongiella 

Art z.B. 

Algoriphagus 

halophilus 1 

1 NEDASHKOVSKAYA et al., 2004 

2 TIAGO et al., 2006 

3 YI und CHUN, 2004 

Chimaereicella 

alkaliphila 2 

z.B. 


marinum 1 

z.B. 

Hongiella 

mannitolivorans 3 

Die Organismen, mit denen Bakterienstamm T4 demnach am nächsten verwandt ist, 

gehören alle der CFB-Gruppe an. Weiter lassen sich diese der Klasse 

Sphingobacteria, der Ordnung Sphingobacteriales sowie der Familie 

Flexibacteriaceae zuordnen. 

Auf Gattungsebene ergeben sich die nächsten Verwandtschaften für Stamm T4 mit 

den Genera Algoriphagus, Chimaereicella und Hongiella, da sie alle eine 96%ige 

Übereinstimmung in der 16S-rDNA-Sequenz aufweisen (vergleiche Kap. 3.5.2, Tab. 

3.30). 

Es konnte allerdings über die Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen 

mittels verschiedener Methoden (NJ, ME, MP und ML) gezeigt werden, dass der 

nächste Verwandte von Bakterienstamm T4 der Stamm Hongiella mannitolivorans 

IMSNU 14012 (Zugangsnummer: AY264838) ist (siehe Kap. 3.5.3). Zusammen mit 

Hongiella ornithinivorans IMSNU 14014 (Zugangsnummer: AY264840) und Hongiella 

marincola SW-2 (Zugangsnummer: AY533663) bilden die beiden erstgenannten 

einen phylogenetischen Cluster, der sich deutlich von den anderen Clustern 

abgrenzt. 

Diese Gruppierung lässt die Aussage zu, dass es sich beim Bakterienstamm T4 mit 

sehr hoher Wahrscheinlichkeit um einen Vertreter der Gattung Hongiella handelt.

Diskussion _______________________________ 140 

4.6 Merkmalsvergleich mit naheverwandten Genera und phylogenetische 

Einordnung von Bakterienstamm T4 

Der Bakterienstamm T4 wurde mit Hilfe von morphologischen, physiologischen, 

chemotaxonomischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Einige 

Ergebnisse sind in den Tabellen 4.7 a und b zusammengefasst und werden mit 

charakteristischen Merkmalen der Genera Algoriphagus, Chimaereicella, 

Cyclobacterium, Cytophaga und Hongiella verglichen.

Diskussion _______________________________ 141 

Tab. 4.7 a: Vergleich einiger Merkmale des Bakterienstammes T4 mit den Genera 

Algoriphagus, Chimaereicella und Cyclobacterium. 

Merkmal Bakterien- Algoriphagus Chimaereicella 

stamm T4 

1 

alkaliphila 2 


3 

Zellmorphologie 

Koloniemorphologie 

kurze und 

lange 

Stäbchen 

rund, konvex, 

glänzend mit 

glattem Rand 

Coccobacilli 

oder kurze 

Filamente 

rund, konvex, 

glänzend mit 

glattem Rand 

kurze Stäbchen 

UB 

ringartig oder 

hufeisenförimg 

mycelartig, 

konvex, opak, 

weich 

Schleimkapsel + - - - 

Nitratreduktion + v + v 

Geißeln/Flagellen - - - - 

Gleitende Bewegung + - - - 

Pigmentproduktion + (C) + (C) + + (C) 

Sauerstoffbedarf aerob bis 

mikroaerophil 

strikt aerob strikt aerob strikt aerob 

Capnophilischer 

Metabolismus 

- - UB - 

Menaquinon-Typ MK-7 MK-7 MK-7 UB 

Sphingophospholipide UB - UB - 

Temperaturtoleranz 

(C°) 

15 - 42 -2 - 34 10 - 40 4 - 40 

pH-Toleranz 7 - 9 5,5 - 7,5 7,2 - 11 6 - 9 

NaCl-Toleranz (%) 0 - 4 0 - 10 0 - 3 1,5 - 15 

Säureproduktion durch 

Glucose 

+ + + + 

Katalase + + + + 

Cellulase A - + UB - 

DNase + v + - 

Gelatinase + v + - 

Urease - v - - 

Abbau von Esculin + UB + UB 

Indolproduktion - - - - 

Fettsäuremuster CH3-C14 :0 4 

CH3-C14 :0 4 

OH-C12 :0 4 

15 :0 iso 15 :0 iso 

17 :0 iso 3-OH 17 :0 iso 3-OH UB 

iso 17 :1ω9c iso 17 :1ω9c 

GC-Gehalt (mol%) 

Übereinstimmung der 

40,4 35 - 49 43,5 38 - 43 

16S-rDNA-Sequenz 

mit Stamm T4 (%) 5 

93 - 96 

96 

90 - 95 

1 

BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; VAN TRAPPEN et al., 2004; 

YOON et al., 2006 

2 

TIAGO, 2006 

3 


4 

LIPPEK, 2002 

5 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 

C = Carotinoide 


MK-6, MK-7 = Menaquinon 6, Menaquinon 7 

- = negative Reaktion; + = positive Reaktion 

v = variiert innerhalb und / oder zwischen den Arten

Diskussion _______________________________ 142 

Tab. 4.7 b: Vergleich einiger Merkmale des Bakterienstammes T4 mit den Genera Hongiella 

sowie Cytophaga. 

Merkmal 

Bakterienstamm 

T4 

Zellmorphologie kurze und 

lange 

Stäbchen 

Koloniemorphologie rund, konvex, 

glänzend mit 

glattem Rand 

Cytophaga 1 

Stäbchen 

mycelartig, weich, 

sich ausbreitende 

Schwärme 

Hongiella 2 

Stäbchen 

rund, konvex, 

glänzend mit 

glattem Rand 

Schleimkapsel + v - 

Nitratreduktion + v v 

Geißeln/Flagellen - v - 

Gleitende Bewegung + v - 

Pigmentproduktion + (C) + (F und/oder C) + (C) 

Sauerstoffbedarf 

aerob bis 

mikroaerophil 

aerob bis 

mikroaerophil, 

manche anaerob 

strikt aerob 

Capnophilischer 

Metabolismus 

- - - 

Menaquinon-Typ MK-7 MK-7 MK-7 

Sphingophospholipide UB + - 

Temperaturtoleranz 

(C°) 

15 - 42 10 - 35 5 - 45 

pH-Toleranz 7 - 9 7 - 7,5 5,5 - 8 

NaCl-Toleranz (%) 0 -4 0 - 6 0 - 9 

Säureproduktion 

durch Glucose 

+ v + 

Katalase + v + 

Cellulase A - v v 

DNase + v v 

Gelatinase + v v 

Urease - v - 

Abbau von Esculin + UB UB 

Indolproduktion - - UB 

Fettsäuremuster CH3-C14 :0 3 

CH3-C14 :0 3 

OH-C12 :0 3 

15 :0 iso 

UB 

17 :0 iso 3-OH 

iso 17 :1ω9c 

GC-Gehalt (mol%) 

Übereinstimmung der 

40,4 35 - 43 37 - 42 

16S-rDNA-Sequenz 

mit Stamm T4 (%) 4 

? 

92 - 94 

94 - 96 

1 

HOLT et al., 1994; BERNARDET und NAKAGAWA, 2002; REICHENBACH, 2002; 

NEDASHKOVSKAYA et al,. 2004; YI und CHUN, 2004 

2 

BOWMAN et al., 2003; NEDASHKOVSKAYA et al., 2004; YI und CHUN, 2004 

3 

LIPPEK, 2002 

4 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 

C = Carotinoide, F = Flexirubine 


MK-6, MK-7 = Menaquinon 6, Menaquinon 7 

- = negative Reaktion; + = positive Reaktion 

v = variiert innerhalb und / oder zwischen den Arten

Diskussion _______________________________ 143 

Beim Vergleich der im Rahmen dieser Diplomarbeit untersuchten Merkmale des 

Bakterienstammes T4 mit denen der Genera Algoriphagus, Chimaereicella, 

Cyclobacterium, Cytophaga und Hongiella stellte sich heraus, dass die größte 

Übereinstimmung der dargestellten Charakteristika zwischen Bakterienstamm T4 mit 

den Gattungen Algoriphagus, Chimaereicella sowie Hongiella besteht. Allerdings ist 

das Vorhandensein einer Schleimkapsel sowie die Fähigkeit sich gleitend 

fortzubewegen, wie bei Stamm T4 festgestellt, für diese Gattungen nicht beschrieben 

worden. Auch das Fettsäuremuster von Bakterienstamm T4 (LIPPEK, 2002) passt 

nicht zu den Fettsäuremustern dieser Gattungen (BOWMAN et al., 2003; YI und 

CHUN, 2004; TIAGO et al., 2006; YOON et al., 2006). 

Auch unter den Cytophaga gibt es Bakterienarten, welche sehr ähnliche Merkmale 

aufweisen wie Bakterienstamm T4. Für diese Gattung sind viele Arten beschrieben 

worden, deren Zellen wie die von Bakterienstamm T4 über Schleimkapseln verfügen 

und sich gleitend fortbewegen können. Über das Fettsäuremuster von Cytophaga- 

Arten ist wenig bekannt, was einen Vergleich erschwert (HOLT et al., 1994; 

REICHENBACH, 2002). Es konnte allerdings durch den Vergleich der 16S-rDNA von 

Stamm T4 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen aus öffentlichen 

Datenbanken gezeigt werden, dass die Vertreter der Gattung Cytophaga mit 

Übereinstimmungen von 92 - 94 % nicht zu den sehr naheverwandten Organismen 

des untersuchten Stammes zählen (siehe Tab. 4.7 b). 

Es ist aufgrund der vorliegenden Ergebnisse anzunehmen, dass es sich beim 

Bakterienstamm T4 um eine noch nicht beschriebene Art handelt. Diese Hypothese 

wird durch die Ergebnisse des vorgenommenen Merkmalsvergleichs gestützt, im 

speziellen durch die des Vergleichs der 16S-rDNA-Sequenz des Bakterienstammes 

T4 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken 

mittels BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), da keine der naheverwandten 

Arten der Gattungen Algoriphagus, Chimaereicella, Cyclobacterium, Cytophaga und 

Hongiella mehr als 96 % Übereinstimmung der 16S-rDNA-Sequenz mit Stamm T4 

ausweißt (siehe Kap. 3.5.2). Die 16S-rDNA-Sequenzen von Stämmen einer Art 

sollten mindestens 97 % Ähnlichkeit zueinander aufweisen (STACKEBRANDT und 

GOEBEL, 1994; ROSSELLÓ-MORA und AMANN, 2001; STEINBÜCHEL und 

OPPERMANN-SANIO, 2003). 

Der Bakterienstamm T4 ist nach den in dieser Arbeit ermittelten Ergebnissen und 

angewandten Methoden der Gattung Hongiella zuzuordnen, mit der der untersuchte

Diskussion _______________________________ 144 

Stamm eindeutig einen gemeinsamen phylogenetischen Cluster bildet (siehe Kap. 

3.5.3). Daraus lässt sich schließen, dass es sich beim Stamm T4 sehr wahrscheinlich 

um eine neue Art der Gattung Hongiella handelt. 

Dass der Bakterienstamm T4 keine neue Gattung darstellt, ist durch die Vergleiche 

der 16S-rDNA-Sequenz des Stammes T4 mit denen naheverwandter Organismen 

abgesichert worden. Die 16S-rDNA-Sequenzen von Arten innerhalb einer Gattung 

sollten noch mindestens 93 - 95 % Ähnlichkeit zueinander aufweisen (DEVEREUX et 

al., 1990; FRY et al., 1991; STEINBÜCHEL und OPPERMANN-SANIO, 2003). Mit 96 

% liegen die drei nächstverwandten Arten von Stamm T4 leicht über diesem Bereich 

(siehe Kap. 3.5.2, Tab. 3.30). 

Auch mit Hilfe der Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen mittels 

verschiedener Methoden konnte gezeigt werden, dass Bakterienstamm T4 keinen 

isolierten Cluster bildet, was für eine neue Gattung sprechen würde, sondern in einer 

Gruppe mit Hongiella-Arten steht (siehe Kap. 3.5.3). 

4.7 Ausblick 

Bei der Charakterisierung des Bakterienstammes T4 konnten einige wichtige 

Merkmale im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit aus Zeitgründen noch nicht 

untersucht bzw. nicht eindeutig ermittelt werden. 

So wurde z.B. nicht nachgewiesen, ob Sphingophospholipide bei Stamm T4 

vorkommen. Auch der Menaquinon-Typ sowie der GC-Gehalt der DNA müssten 

mittels geeigneter HPLC-Untersuchungsmethoden (z.B. nach MESBAH et al., 1989) 

noch einmal reproduziert werden. Weiterhin wäre es interessant, EM-Aufnahmen von 

den Bakterienzellen von Stamm T4 vorzunehmen, um zu überprüfen, ob auch mittels 

dieser Methode die Schleimkapseln oder eventuell sogar Pili sichtbar gemacht 

werden können. Da bislang nur eine Teilsequenz der 16S-rDNA (603 bp) amplifiziert 

werden konnte, müsste außerdem versucht, werden eine möglichst vollständige 16SrDNA-Sequenz 

zu amplifizieren, um eine genauere Einordnung des 

Bakterienstammes T4 in den phylogenetischen Stammbaum der Bakterien 

vornehmen zu können. 

Bei der Untersuchung der Pigmente aus Bakterienstamm T4 sind ebenfalls noch 

einige Fragen offen geblieben. Es konnten zwar je nach Methode 2 - 3 verschiedene 

Carotinoide nachgewiesen werden, eine genaue Identifizierung der entsprechenden

Diskussion _______________________________ 145 

Substanzen war allerdings noch nicht möglich. Dies lag daran, dass die angewandte 

säulenchromatographische Methode eine unzureichende Auftrennung der 

Carotinoide und anderer Substanzen ergab, so dass für die nachfolgenden MS- 

sowie NMR-Untersuchungen keine Reinstoffe vorlagen. Um die im Bakterienstamm 

T4 enthaltenen Pigmente genau zu bestimmen, müssten andere Methoden 

angewandt werden, die eine bessere Auftrennung gewährleisten. So könnte mittels 

gekoppelter Analysensysteme wie HPLC-MS oder HPLC-NMR versucht werden, die 

in Stamm T4 enthaltenen Carotionide zu identifizieren. Diese Methoden kommen 

beide mit relativ kleinen Probenmengen aus, ermöglichen eine sehr gute 

Auftrennung und eine direkt gekoppelte Analyse durch MS- bzw. NMR- 

Untersuchungen (PUTZBACH, 2005). 

Des weiteren könnte die Biosynthese der Carotinoide näher untersucht werden. Dies 

könnte eventuell von pharmazeutischem sowie lebensmittelindustriellem Interesse 

sein, da zur Zeit nur wenige geeignete Stämme zur Produktion von Carotinoiden 

existieren (FRASER et al., 1997; ERNST, 2002).

Zusammenfassung ______________________ 146 

5. Zusammenfassung 

1. Stamm T4 stammt aus einer Warmwasserleitung eines Hotels auf Teneriffa. 

2. Die Kolonien von Bakterienstamm T4 besitzen eine runde Form, einen glatten 

Rand und ihr Profil ist spiegeleiförmig. Weiterhin besitzen sie eine glatte, 

glänzende Oberfläche, ein opakes Aussehen, eine orange-rote Farbe und 

ihre Konsistenz ist weich. 

3. Bei den Bakterienzellen von Stamm T4 handelt es sich um kurze bis lange 

Stäbchen, die runde Zellenden besitzen und von Schleimkapseln umgeben 

sind. Die Zellen liegen einzeln, doppelt, in Form von kurzen Ketten oder zu 

Zellhaufen agglomerisiert vor, wobei letztere die häufigste Erscheinungsform 

ist. Unter verschiedenen Inkubations- bzw. Kultivierunsbedingungen 

(Sauerstoffversorgung, Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt) war ein zum Teil 

stark ausgeprägter Pleomorphismus festzustellen. 

4. Die Zellen von Stamm T4 können sich nicht schwimmend fortbewegen, 

besitzen aber auf bestimmten Oberflächen die Eigenschaft zu gleiten. 

5. Es handelt sich bei Stamm T4 um ein Gram-negatives Bakterium, welches 

unter aeroben bis mikroaerophilen Bedingungen wachsen und keine Gärung 

durchführen kann sowie wahrscheinlich die Fähigkeit zur Nitrat-Reduktion 

besitzt. 

6. Stamm T4 ist mesophil (Wachstum bei 15 - 42 °C; Optimum bei 25 - 30 °C), 

neutrophil (Wachstum bei pH-Werten von 7 - 9; Optimum bei 8) und 

halotolerant (Wachstum bei Salzgehalten von 0 - 4 % NaCl; optimales 

Wachstum ohne NaCl). 

7. Bakterienstamm T4 konnte Mono- und Disaccharide sehr gut sowie Oligo- 

und Polysaccharide gut verwerten. Auch Desoxyzucker konnten zum 

Wachstum genutzt werden. Wurden hingegen Alkohole, Alditole, Amide, 

Amine, Carboxylsäuren und Aminosäuren als Kohlenstoffquelle angeboten, 

fand kein oder nur sehr geringes Wachstum statt. 

8. Stamm T4 konnte Ammonium, Nitrat und Nitrit als Stickstoffquelle nutzen, 

wobei Ammonium das beste Wachstum ermöglichte. 

9. Es wurden Phosphatkonzentrationen von 0 - 40 mM eingesetzt. Wachstum 

erfolgte bei Konzentrationen von 1 - 15 mM, wobei höhere

Zusammenfassung ______________________ 147 

Phosphatkonzentrationen ein durchschnittlich besseres Wachstum 

ermöglichten. 

10. Bakterienstamm T4 benötigte keinen Zusatz von Vitaminen oder 

Spurenelementen zum Wachstum. Letztere stimulierten es stark. 

11. Stamm T4 besitzt eine leichte Resistenz gegen Carbenicillin und Kanamycin. 

12. Stamm T4 verfügt über eine Reihe von intrazellulären sowie extrazellulären 

Enzymen (intrazellulär: ß-Galaktosidase, Katalase, Oxidase; extrazellulär: 

Amylase, DNase, Esterase, Gelatinase, Peptidase, RNase). 

13. Wachstum auf Kohlenhydraten war gleichzeitig verbunden mit der Bildung 

von Säuren. 

14. Bakterienstamm T4 ist ein pigmentiertes Bakterium, welchem ein oder 

mehrere Carotinoide seine Färbung verleihen. Flexirubine sind nicht 

vorhanden. Eine im methanolischen Extrakt enthaltene Substanz konnte mit 

einer Wahrscheinlichkeit von 90,6 % als Menaquinon 7 identifiziert werden. 

Steigende Sauerstoff- und Phosphatkonzentrationen beeinflussten die 

Carotinoidsynthese positiv. 

15. Stamm T4 besitzt einen GC-Gehalt der DNA von 40,45 mol%. 

16. Der Stamm Hongiella mannitolivorans IMSNU 14012 (YI und CHUN, 2004) ist 

der nächste, schon näher klassifizierte Verwandte des Bakterienstammes T4 

mit einer Übereinstimmung der 16S-rDNA-Sequenz von 96 %. Zusätzlich 

konnte gezeigt werden, dass der Stamm T4 mit Vertretern der Gattung 

Hongiella einen phylogenetischen Cluster bildet. 

17. Die Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass es sich beim 

Bakterienstamm T4 sehr wahrscheinlich um eine neue Art der Gattung 

Hongiella handelt.

Anhang _______________________________ 148 

6. Anhang 

Tab. 6.1: Ausschnitt aus der 16S-rDNA-Sequenz des Bakterienstammes T4. 

Ausschnitt der 16S-rDNA-Sequenz (603 bp) 

ATATGTTAAAGATTTATTGGTATGAGATGGGCATGCGTCTGATTAGCTAGTTGG 

CGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGGGGTTCTGAGAGGAAGG 

TCCCCCACACTGGCACTGAGATACGGGCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG 

TAGGGAATATTGGGCAATGGTCGGAAGACTGACCCAGCCATGCCGCGTGCAG 

GAAGACGGCCCTCTGGGTTGTAAACTGCTTTTATCTGGGAAGAAAAAGGCCA 

TGCGTGGCAAATTGCCGGTACCAGATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC 

AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGTTT 

AAAGGGTGCGTAGGCGGCTATTTAAGTCAGCGGTGAAAGACTCCGGCTTAAC 

CGGAGCAGTGCCATTGATACTGGATAGCTTGAGTGTTGGAGGGGTACATGGA 

ATTGATGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATACCATCAGGAACACCGATAGCGA 

AGGCATTGTACTGGCCAACAACTGACGCTGAGGCACGAAAGTGTGGGGATCG 

AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACAC

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Erklärung gemäß § 21, Absatz 6 der Diplomprüfungsordnung für den 

Studiengang Biologie (vom 7. Dezember 1994) 

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und dabei 

keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. 

Bremen, im Oktober 2006 ____________________________

Untersuchungen zur Biochemie, Molekularbiologie - Uft - Universität ...

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