Abgeben am 23.12 - German Weber

Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe /Jahrgang ... 2009/2011
Memmingen Leistungskurs: .................. Biologie
Bewertung:
Facharbeit
Kollegiatin: ............... Vlora Murseli
Versuch einer Sphagnum-Klassifikation
durch Sequenzierung
Abgeben am 23.12.2010
Facharbeit: Note: _________ Punkte: _________
Mündliche Prüfung: Note: _________ Punkte: _________
Datum und Unterschrift des Kursleiters: ____________________________________

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ......................................................................................................... 3
2. Handwerk für die Artdifferenzierung ........................................................... 3
2.1 DNA-Extraktion ......................................................................................... 3
2.1.1 Vorbereitung ........................................................................................... 3
2.1.1.1 Sicherheitvorkehrungen .................................................................... 4
2.1.1.2 Gerätschaften .................................................................................... 4
2.1.1.3 Materialien. ...................................................................................... 4
2.1.2 Arbeitsschritte ......................................................................................... 5
2.2 Restriktionsverdau ..................................................................................... 7
2.3 Gelelektrophorese ....................................................................................... 7
2.3.1 Das Agarose-Gel .................................................................................... 7
2.3.2 Beladen und Laufen des Gels ................................................................. 8
2.3.3 Färben und Auswertung des Gels ........................................................... 9
3. Fehleranalyse ................................................................................................. 10
4. Sequenzierung nach SANGER ........................................................................ 11
4.1 Materialien und Durchführung .............................................................. 11
4.2 Auswertung ............................................................................................... 12
5. Mögliche Ansätze für eine Klassifikation ................................................... 13
6. Quellenverzeichnis ........................................................................................ 14
6.1 Literaturverzeichnis ................................................................................. 14
6.2 Internetquellen .......................................................................................... 15
6.3 Abbildungsverzeichnis ............................................................................. 15
7. Selbstständigkeitserklärung des Kollegiaten .............................................. 16

1. Einleitung
-3-
Das ehrgeizige Projekt Sphagnum AG setzte sich aus sieben Schülern des Leistungskurses
Biologie zusammen. Unser übergeordnetes Ziel war die morphologische und genetische
Kartierung des Sphagnummooses. Alle Facharbeiten bauen auf einander und versuchen sich
diesem übergeordnetem Ziel zu nähern.
Die Themenfindung zu meiner Facharbeit erfolgte im Rahmen eines
Biotechnologiepraktikums im hauseigenen Labor. Die dort erlernten mikrobiologischen
Arbeitsweisen und Techniken ermöglichten es mir mich mit der Differenzierung der Gattung
Sphagnum auseinanderzusetzen.
Weiterhin soll die vorliegende wissenschaftliche Arbeit als Leitfaden und eine Art Handbuch
zur mikrobiologischen Beschäftigung mit Sphagnum dienen.
Die Sequenzierung der Sphagnum DNA konnte leider aufgrund von zeitlichen Problemen
nicht durchgeführt werden und somit habe ich lediglich die weiteren Arbeitsschritte ,die bei
der DNA -Sequenzierung von Bedeutung sind, genauer erläutert und aufgeführt, sodass einer
zukünftigen Sphagnum Arbeitsgruppe die genetische Klassifikation durch die Sequenzierung
von Torfmoosen auch in der Praxis gelingt.
2. Handwerk für die Artdifferenzierung
2.1 DNA-Extraktion
Die Extraktion der Sphagnum-DNA ist einer der elementarsten Schritte in der
mikrobiologischen Untersuchung von Torfmoosen, da die Effizienz mit der Sphagnum DNA
extrahiert wurde von großer Bedeutung für die weiteren Arbeitsschritte ist.
Deshalb müssen vorab wichtige Vorkehrungen getroffen werden um eine möglichst saubere
und qualitativ hochwertige Menge an Sphagnum-DNA extrahieren zu können.
2.1.1 Vorbereitung
Bevor man sich an die Durchführung der einzelnen Arbeitsschritte macht, sollte man vorab
sich mit dem DNeasy Plant Mini Kit beschäftigen und sich das Handbuch sorgfältig
durchlesen, denn dieses liefert wichtige Hinweise auf eine sichere und effektive Arbeit mit
DNA. Zusätzlich werden in dem Mini Kit die benötigten Materialien aufgelistet.

2.1.1.1 Sicherheitvorkehrungen
-4-
Bezüglich der Sicherheit muss einiges beachtet werden vor allem was die Arbeit mit
flüssigem Stickstoff betrifft. Bei der Behandlung der getrockneten Shagnumpflanze mit
flüssigem Stickstoff sollte auf eine Schutzbrille und Sicherheitshandschuhe, um unter
anderem auch Kontaminationen mit RNAsen zu vermeiden, geachtet werden. Ein Schutzkittel
ist auch unerlässlich bei der Arbeit, denn dieser dient zusätzlich einer sauberen Arbeitsweise,
die bei der Extraktion von entscheidender Bedeutung ist.
2.1.1.2 Gerätschaften
Um längere Wartezeiten oder gar Unterbrechungen während der Extraktion zu vermeiden ist
es ratsam vorab einige Vorbereitungen bezüglich der notwendigen Geräte zu treffen.
Folgende Gerätschaften werden für die DNA-Extraktion benötigt:
Mörser und Stößel sollten gereinigt vorliegen
Heizblock sollte für die Inkubation bereits auf 65°C vorgeheizt werden
Styroporbox mit Eiswürfeln für die Inkubation auf Eis bereit stellen
Vortexer sollte für den Gebrauch bereit liegen
1x Zentrifuge auf 8000rpm einstellen (eventuell für das Tangieren Gegengewichte )
1xZentrifuge auf 14000rpm einstellen ( auf das Tangieren achten )
automatische Pipette mit geeigneten Spitzen
Entsorgungsmöglichkeit für gebrauchte Spitzen und Eppendorf-Gefäße
DNeasy Plant Mini Kit
2.1.1.3 Materialien
Die erforderlichen Materialien zur Isolierung der DNA sind meist in einem kommerziellen
Kit, wir verwenden hier das Quiagen DNeasy Plant Mini Kit, vollständig enthalten. Unsere
Arbeitsgruppe musste lediglich den flüssigen Stickstoff vorher bei unserer Lehrkraft
anfordern. Dennoch sollte die Vollständigkeit des Kits überprüft werden und hierbei sollte
auch beachtet werden, ob den einzelnen Puffern AW und AP3 96-100 prozentiger Ethanol
hinzugefügt wurde, da diese als Konzentrate in dem Mini Kit geliefert werden. Sollten sich
Niederschläge im Puffer ohne Zugabe von Ethanol gebildet haben genügt ein kurzes
Aufwärmen auf 65° C um die Niederschlagsprodukte aufzulösen. Es ist nicht zu empfehlen
Puffer mit Ethanol aufzuwärmen, da dabei der Alkohol entweicht.

Folgende Komponenten werden für die DNA-Extraktion benötigt:
Flüssiger Stickstoff
DNeasy Mini Spin Columns
QIAshredder Mini Spin Columns (lilac)
Collection Tubes ( 2ml)
Puffer AP1 ( 40 ml)
Puffer AP 2 (18 ml)
Puffer AP3/E (Konzentrat)
Puffer AW (Konzentrat)
Puffer AE
RNase A (100mg/ml)
autoklavierte Eppendorf-Gefäße
2.1.2 Arbeitsschritte
-5-
Die wesentlichen Schritte einer DNA-Extrakation beinhalten, dass aus Pflanzenzellen, in
diesem Fall Sphagnum, zunächst durch Lyse und anschließend durch Reinigung der DNA-
Lösung, erfolgreich DNA gewonnen wird.
Im Folgenden werden die Arbeitsschritte in chronologischer Reihenfolge wiedergegeben.
Vorab ist es wichtig dass die ausgewählte Probe frei von anderen pflanzlichen Komponenten
ist wie zum Beispiel Nadeln, anderen Sphagnumarten oder diversen Gräsern ist, denn die
Isolation ihrer DNA führt zu einer Qualitätsminderung unserer Ergebnisse.
1. 20 mg Trockenmasse der Probe unter Zugabe von flüssigem Stickstoff im Mörser zu
einem feinen Pulver zerstoßen.
2. Das Erzeugnis in ein Eppendorf-Gefäß geben.
3. Daraufhin 400 μl von dem Puffer AP1 und 4 μl RNase A zu dem Erzeugnis hinzufügen
4. Nun mit Hilfe des Vortexers die Suspension von Puffer, RNase und Sphagnum gut
miteinander vermengen. Hierbei ist zu beachten, dass sich keine Klümpchen bilden, da
dies die DNA-Menge verringert. Die Praxis hat bei unserer Arbeit gezeigt dass ein
Mischen mit der Pipette kaum ratsam ist.
5. Inkubation der Mixtur für 10 Minuten im bereits auf 65 °C vorgeheizten Heizblock.
Während der Inkubation sollten die Eppendorf-Gefäße leicht geschüttelt werden. Dieser
Schritt lysiert nun die Zellen.

-6-
6. Zugabe von Puffer AP2 (130 μl) zum Lysat. Daraufhin leicht schütteln und für 5 Minuten
auf Eis inkubieren.
7. Zentrifugieren des Lysats für 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute
8. Die Flüssigkeit in einen QIAshredder Mini spin column (lilac) mit Eppendorf-Gefäß
pipettieren und daraufhin erneutes Zentrifugieren für 2 Minuten bei 14,000 rpm.
9. Nun wird der Durchfluss aus Schritt 8 in ein Eppendorf-Gefäß übertragen. Hier darauf
achten das die Zellablagerungen in der Mini spin column nicht aufgewirbelt werden.
10. Nun folgt die zügige Zugabe des Puffers AP3/E. Hierzu einfach die 1,5 fache Menge des
Lysats an Puffer dazugeben (zum Beispiel 450 μl Lysat x 1.5 = 650 μl Puffer AP3/E )
11. Vermengung der beiden Komponenten durch pipettieren
12. Nun werden 650 μl der aus Schritt 11 gewonnenen Suspension in ein 2ml Sammelgefäß
mit eingesteckter DNeasy Mini spin column pipettiert.
Bitte nachdem Schritt darauf achten, dass weder die Reinigungssäule noch die restliche
Flüssigkeit aus Schritt 11 entsorgt werden.
13. Das Sammelgefäß mit Mini spin Column wird eine Minute lang bei 8000 rpm
zentrifugiert und der Durchfluss verworfen
14. Schritte 12 & 13 werden mit dem verbleibenden Rest der Probe aus Schritt 11 wiederholt.
15. Der Durchfluss und das die Collection Tube können nun entsorgt werden.
16. Die Mini Spin Column wird nun in ein neues Eppendorf-Gefäß gegeben. Zugabe von
500 μl Puffer AW und erneutes Zentrifugieren für 2 Minuten bei 14 000 rpm.
Beim Entfernen der Mini Spin Column darauf achten, dass die Reinigungssäule nicht in
Kontakt mit dem Durchfluss kommt.
17. Die Reinigungssäule wird in ein neues Eppendorf-Gefäß gegeben und es erfolgt die
Zugabe von 100 μl Puffer AE.
18. Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur (15-25 °C)
19. Für eine Minute bei 8000 rpm zentrifugieren
20. Die Schritte 17-19 wiederholen. Hierbei beachten dass man durchaus weniger Puffer AE
hinzufügen kann (ca.75 μl).Da vermieden werden muss, dass der Durchfluss mit der Mini
Spin column in Kontakt kommt.
Die vorliegende Elution beinhaltet die DNA der jeweiligen Sphagnum-Probe. Nun können
weitere Arbeitsschritte getätigt werden.

2.2 Restriktionsverdau
-7-
Wir benötigen den Restriktionsverdau um die DNA mit Hilfe von Nukleasen zu schneiden
und dadurch das „Wandern“ von kleinen DNA-Fragmenten zu ermöglichen. Denn nur durch
eindeutige Bandendifferenzierung auf dem Agarosegel können klare Aussagen über eine
bestimmte Probe getätigt werden. Ist ein klares Bandenmuster erkennbar so kann man von
einem erfolgreichen Restriktionsverdau sprechen.
Für das Schneiden von genetischer Information werden folgende Komponenten benötigt:
2 µl extrahierte DNA
1 μl Puffer „green“
7 μl steriles Wasser
Diese Materialien werden miteinander vermengt und im Anschluss darauf wird in unserem
Versuchsaufbau 0,5 μl EcoRI mit speziellen Spitzen mit einem Filteraufsatz zur Puffer-DNA-
Lösung gegeben. Das Schneiden der DNA findet nun bei einer Temperatur von 37 °C statt.
Diese Temperatur bietet optimale Milieueigenschaften für die enzymatische Arbeit. Der
Verdau dauert bis zu einer Stunde an. Nach dem Schneiden durch Nukleasen kann eine
Elektrophorese Aufschluss über die Länge der Fragmente geben zum Beispiel mit Hilfe eines
Größenstandards.
2.3 Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese ist eine Hilfestellung für uns um DNA in unserer Extraktion
nachzuweisen. Da die Phosphatreste der DNA negativ geladen sind wandert die DNA bei
richtiger Polung zum Positiven. Das entstandene Bandenmuster gibt auch Kenntnis über die
Größe der DNA-Fragmente.
2.3.1 Das Agarose-Gel
Für die Gelelektrophorese müssen wir zunächst ein Ein-prozentiges Agarose Gel herstellen.
Dafür werden folgende Materialien benötigt:
0,2 g Agarose-Gel
20 ml TAE-Puffer
Rührfisch und Glasflasche
Gelkammer mit Kamm
Sicherheitshandschuhe

-8-
Zunächst mischen wir die 0,2g der Agarose mit 20 ml TAE-Puffer, dadurch entsteht später ein
1% - Agarose-Gel. Im nächsten Schritt geben wir nun einen Rührfisch in die Flasche, der den
Siedeverzug vermeidet und unter ständiger Beobachtung lassen wir das Gel in der Mikrowelle
aufkochen.
2.3.2 Beladen und Laufen des Gels
Nachdem das Gel leicht abgekühlt ist und das Erscheinungsbild leicht milchig-trüb geworden
ist. Kann das Gel nun vorsichtig in die Gelkammer gegossen werden. Hierbei sollten
Handschuhe getragen werden. Danach wird der Kamm so positioniert dass 16 Taschen, in die
die DNA hinein pipettiert wird, entstehen. Ist das Gel geliert können nun folgende
Arbeitsschritte getätigt werden.
Zunächst fügt man die 5 μl extrahierte DNA mit den 2 μl des Gelladungspuffers in einem
sterilen Eppendorf-Gefäß zusammen und vermengt diese durch einen Short Spin gut
miteinander. Die Gelkammer wird nun mit dem TAE-Puffer angefüllt bis das Gel vollständig
bedeckt ist. Daraufhin kann der Kamm entfernt werden. Nun erfolgt die Anordnung der zu
untersuchenden Proben. In unserer Anordnung wurden Proben mit und ohne
Restriktionsverdau berücksichtigt.
Abbildung 1: Anordnung der DNA-Proben im Gel 1
Wir haben darauf hin die Spannungsquelle von 84 Volt angeschlossen. Beim Anschluss der
Spannung ist es wichtig die Polung zu beachten, da aufgrund des negativ geladenen
Sauerstoffs im Phosphatrest der DNA, wandert die somit negativ geladene DNA vom
Minuspol zum Pluspol. Wir lassen nun die Gelelektrophorese solange ablaufen bis die
mittlere Bande mit dem DNA-Ladder von 100bp ungefähr bis zur Hälfte gelaufen ist. Beim
Lauf im Spannungsfeld sollte auch darauf geachtet werden das der Marker nicht bis zum Ende
läuft, denn dadurch können sehr kurze DNA-Fragmente vom Gel „fallen“.

2.3.3 Färben und Auswertung des Gels
-9-
Um die Effizienz ,mit der die DNA extrahiert wurde, optisch zu verdeutlichen muss das Gel
nun gefärbt werden.
,,Aufgrund des krebserregenden Potenzials von Ethidiumbromid werden die Färbung des Gels
mit Ethidiumbromidlösung und das Übertragen auf den UV-Leuchttisch durch die Lehrkraft
durchgeführt“ ( SCHMITT, o. J.: S. 25)
Im Falle einer erfolgreichen Gelelektrophorese sind unter UV-Bestrahlung und
Raumverdunkelung die verschiedenen Banden der DNA und des Ladders erkennbar.
Dadurch kann zunächst DNA nachgewiesen werden und Proben untereinander verglichen
werden. Das auf dem Gel entstandene Bandenmuster gibt auch Kenntnis über die Länge der
einzelnen DNA-Fragmente, da wir wissen das kurze DNA-Stücke schneller wandern und
längere DNA-Fragmente deutlich mehr Widerstand im Gel zu bewältigen haben und daher
mehr Zeit für den Lauf benötigen. Die von uns beschlossene Anordnung der DNA im Gel gibt
auch Kenntnis über den Erfolg des Restriktionsverdaus. Durch einen erfolgreichen
Restriktionsverdau entstehen zahlreiche kürzere Fragmente der genetischen Information und
das ermöglicht der DNA, dass sie im Agarose-Gel wandern kann. Ungeschnittene DNA ist zu
lang und zu sperrig um das Gel zu durchlaufen.
Abbildung 2: Gelelektrophorese des Gels 1

3. Fehleranalyse
-10-
Nach der Auswertung des DNA Laufes im Agarose-Gel ist uns bewusst geworden ,dass es
notwendig ist sich mit manchen Arbeitsschritten kritisch auseinanderzusetzen um mögliche
Fehlerquellen ausfindig zu machen und dadurch für die nächsten Versuchsdurchgänge
bestimmte Handlungsschritte zu modifizieren und effizienter zu gestalten. Dennoch sollte
angemerkt werden, dass die hier aufgeführten Fehlerquellen nicht eindeutig auf ihre
Fehlerhaftigkeit überprüft wurden und wir somit lediglich hypothetische Ansätze über das
Ausmaß und den Einfluss dieser möglichen Fehlerquellen machen können.
Die DNA-Extraktion ist wohl der wichtigste Handlungsschritt, denn alle weiteren Schritte
bauen auf ihr. Es wurden in meiner Arbeit mit dem DNeasy Mini Kit aus drei morphologisch
unbestimmten Pflanzenproben, nämlich Probe 001 vom 11.6.2010,Probe 003b vom 11.6.2010
und Probe 006 vom 21.6.2010, DNA isoliert.
Bei dem Vorgehen am 11.6.2010 wurde die RNase A bei beiden Proben nicht hinzugefügt, da
aufgrund von mangelnder Vorbereitung das Mini Kit nicht auf Vollständigkeit überprüft
wurde und wir somit dazu gezwungen waren die Isolation ohne die RNase durchzuführen.
Dadurch konnten Ribonukleinsäuren nicht „verdaut“ werden.
Weiterhin sind mir in der Probe 006 vom 21.6.2010 nach der Behandlung mit Stickstoff und
dem Zerstoßen des Materials braune Strukturen aufgefallen. Hierbei könnte es sich um
Nadeln handeln, die nicht von dem Probematerial entfernt wurden. Dies beinhaltet natürlich
fremde DNA, und das wiederum führt zu ungenauen Ergebnissen. Ein weiteres Problem, dass
sich bei der Isolation von DNA aufgetan hat, ist in meinem Fall bei der Probe 003b vom
11.6.2010 aufgetreten. Bei dieser Durchführung habe ich womöglich zu viel Material nach
dem Zerstoßen im Mörser in das Eppendorf-Gefäß gegeben, denn trotz des Vortexens im
darauf folgenden Schritt sedimentierte eine braun-gräuliche Substanz in dem Eppendorf-
Gefäß und die Suspension war recht zähflüssig und konnte schlecht pipettiert werden. Hierzu
hat mir dann Herr Weber, die leitende Lehrkraft eine Hilfestellung geboten. Es wurde
Material entfernt und dann zusätzlich 75 µl von dem Puffer AP1 hinzugefügt. Anschließend
wurde die Suspension intensiv mit dem Vortexer behandelt bis keine Sedimente im
Eppendorf-Gefäß erkennbar waren. Natürlich lassen sich Fehler korrigieren, aber dennoch hat
die Korrektur zu einem immensen Materialverlust geführt und somit auch zu einem
deutlichen DNA-Verlust. Ein anderer leicht vermeidbarer Lapsus ereignete sich bei der
Extraktion der 001 Probe vom 11.6.2010. Hierbei wurden nach Schritt 12, der oben angeführt
wurde, sowohl Reinigungssäule als auch das Gemisch aus Lysat und Puffer AP3/E entsorgt.

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Dieser Materialverlust hat eine deutliche Minderung der DNA-Menge zur Folge. Natürlich
können auch unsauberes und unkonzentriertes Arbeiten die Qualität des Endresultats negativ
beeinflussen.
Die deutlich differenzierte Bandenordnung, die eine erfolgreiche und aussagekräftige
Gelelektrophorese bestätigt und uns mit Hilfe eines Größenstandards in Kenntnis über die
Länge einzelner DNA-Fragmente setzt, ist in unserer Photographie des Gels 1 kaum
erkennbar. Das bestätigt die Annahmen, dass die Isolation der DNA doch sehr fehlerreich war
und hier einige Arbeitsschritte modifiziert werden müssen.
4. Sequenzierung nach SANGER
Um genetische Information von Sphagnum Pflanzen genauer zu untersuchen, bieten sich
verschiedene Möglichkeiten an .Ich persönlich hielt das Kettenabbruchverfahren nach
SANGER als geeignet, da wir durch diese Methode genau differenzierte Basenabfolgen
erhalten und wir einzelne Sequenzen unter den Proben vergleichen können und somit
Rückschlüsse aus Gemeinsamkeiten oder Unterschiede innerhalb der isolierten DNA ziehen
können.
Weiterhin sollte erwähnt werden, dass kein Versuch bezüglich der Sequenzanalyse
durchgeführt wurde. Die hier angeführten Punkte sind lediglich theoretische Ansätze wie eine
Klassifikation des Sphagnummooses angesetzt werden könnte.
4.1 Materialien und Durchführung
Für die Sequenzierung von DNS werden folgende Utensilien benötigt:
einsträngige DNA
DNA-Polymerase
Nukleotidbausteine
universeller Primer
Didesoxynukleosidtriphosphat mit radioaktiver Markierung
Die DNA wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion, der sogenannten PCR, vermehrt,
sodass wir zahlreiche Kopien der genetischen Informationen vorliegen haben. Da sie aber
einsträngig sein muss, damit die Polymerase die zum codogenen Strang komplementären
Nukleotidbausteine an den Einzelstrang baut, werden die beiden Stränge durch Denaturierung
voneinander getrennt und mit Zugabe des universellen Primers für die weiteren Schritte der

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Sequenzierung vorbereitet. Nachdem wir nun identische codogene DNA-Stränge vorliegen
haben, kann der nächste Schritt erfolgen. In diesem Schritt werden in vier Reagenzgläsern
vier basenspezifische Ansätze vorbereitet. Der Inhalt jedes der vier Reagenzgläser besteht aus
vermehrter einsträngiger DNA mit universellen Primer, Polymerase, Nukleotidbausteinen,
den sogenannten dNTPs und ihren spezifischen Didesoxynukleosidtriphosphaten, den
Abbruchnukleotiden. Ein wichtiges sei hier vorweg genommen, um den Erfolg einer
Sequenzierung zu garantieren, sollte auf ein moderates Mischverhältnis von dNTPs und
ddNTPs geachtet werden. Hierbei eignet sich ein Verhältnis von 100 dNTPs zu einem
ddNTPs. In vitro baut die Polymerase die Nukleotiden an ihre komplementären Basen an die
einsträngige DNA, unter anderem auch das jeweilige Kettenabbruch - ddNTPs, dass keine 3'-
Hydroxygruppe besitzt und somit als „Synthesestopper“ hier wirkt. Das an die DNA
angebaute Kettenabbruch-ddNTP verbleibt immer als der letzte Nukleotidbaustein der DNA-
Fragmente, da aufgrund der veränderten Struktur kein weiteres Basenmolekül eine chemische
Bindung mit dem Abbruchmolekül herstellen kann. Somit entstehen zahlreiche DNA-
Fragmente, die immer mit dem radioaktiv markierten Didesoxynukleosidtriphosphat enden.
Abbildung 3 : Ablauf einer Sequenzierung
4.2 Auswertung
Nach dem in jedem der vier Reagenzgläser nun die Sequenzierung abgelaufen ist, erfolgt nun
die Sequenzanalyse mit Hilfe einer Gelelektrophorese. Hierbei werden vier Geltaschen (A, T,

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C, G) benötigt. In die Geltasche A wird nun der Ansatz mit dem ddATP-Abbruchnukleotid
hinein pipettiert das gilt Analog zum T-,C- und G-Ansatz und ihren spezifischen ddNTPs.
Nun durchläuft die DNA das Gel, dabei werden die Fragmente der Größe nach getrennt, da
kleinere DNA-Stücke schneller durch das Gel wandern. Nachdem Lauf werden die Banden,
die entstanden sind, zunächst einfach entgegengesetzt der Laufrichtung der
Gelelektrophorese, also vom 5' zum 3' Ende abgelesen, indem man die Bezeichnung ihrer
jeweiligen Geltasche, also A, T, C, G, den jeweiligen Banden zuordnet. Dadurch ergibt sich
eine Reihe von Basenabfolgen
5. Mögliche Ansätze für eine Klassifikation
Bei der Klassifikation gibt es zwei wesentlich unterschiedliche Methoden, zunächst hätten wir
die künstliche Klassifikation, die auf morphologischen und physiologischen Aspekten baut
und weiterhin die phylogenetische Klassifikation, bei dieser Methode ist uns die
Sequenzanalyse eine erhebliche Stütze. Nachdem man die Basenabfolge der sequenzierten
DNA durch die Gelelektrophorese ermittelt hat, kann man an die Klassifikation der Gattung
Sphagnum ansetzen.
Durch Vergleich der Proben und ihrer Sequenzanalyse lassen sich bereits einige Aussagen
treffen. Hierbei sollte bei den Proben auf Gemeinsamkeiten in der Basenabfolge geachtet
werden und vor allem auch auf Unterschiede. Ein möglicher Ansatz für eine Differenzierung
der verschiedenen Sphagnumarten ist der Vergleich mit bereits bekannten Genkarten. Durch
diesen Vergleich könnten Sequenzanalysen mit einer hohen Rate an Übereinstimmungen mit
der Genkarte der jeweiligen Sphagnumart, die verwendete DNA-Probe einer Gattung zu
ordnen. Zusätzlich können auch evolutive Veränderungen anhand einer Sequenzierung
aufgezeigt werden. Nachdem Sphagnumpflanzen morphologsich einer Gattung zugeordnet
wurden, kann mit Hilfe der Sequenzanalyse der morphologisch identischen Proben, die sich in
ihren Basenabfolgen unterscheiden, evolutiv veränderte DNA festgestellt werden. Diese
Veränderung kann zum Beispiel aufgrund von anderen Standortfaktoren oder
Milieuverhältnissen zu Stande gekommen sein.

6. Quellenverzeichnis
6.1 Literaturverzeichnis
-14-
1) ANTRANIKIAN, Garabed (2005):Angewandte Mikrobiologie. Springer. ISBN 3-540-24083-
7
2) BÖCKENHAUER, Hans-Joachim; und BONGARTZ, Dirk (2003): Algorithmische Grundlagen
der Bioinformatik. Modele, Methoden und Komplexe. Wiesbaden: Vieweg & Teubner.
ISBN3-519-00398
3) DAUMER, Karl (1995): Biologie für die gymnasiale Oberstufe. Genetik. 7., unveränderte
Auflage. München: Bayerischer Schulbuch – Verlag. ISBN 3-7627-4230-8
4)GECKELER, Kurt, Hrsg. Eckstein, Heiner.(1998) : Bioanalytische und biochemische
Labormethoden. Braunschweig/Wiesbaden: Friedrich Vieweg & Sohn Verlagsgesellschaft
mbH.ISBN3-528-06418-8
5)LINDER, Herrmann, Hrsg. Bayrhuber/Kull.(2005): Linder Biologie. 22., neubearbeitete
Auflage. Braunschweig: Bildungshaus Schulbuchverlage Schroedel.
ISBN 978-3-507-10930-8
6)QIAGEN (2006): DNeasy Plant Handbook
7)SCHMITT, Patrick (o. J.): Einführung in die Grundarbeitstechniken der Molekularbiologie

6.2 Internetquellen
Sequenzierung des Genoms
-15-
http://zbi-www.bioinf.uni-sb.de/was-ist-bioinformatik/sequenzierung
[Stand:3.12.2010]
SCHRÖDEL,Andrea:Restriktionsverdau
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biuz.201090004/pdf
[Stand:13.11.2010]
TEMSCH, Eva: Klassifikation
http://www.botanik.univie.ac.at/~temsch/klassif.html
[Stand: 5.12.2010]
Genetik
http://www.botanik.univie.ac.at/~temsch/genetik.html
[Stand:6.12.2010]
6.3 Abbildungsverzeichnis
Titel: Sphagnum Squarrosum
[Stand:20.12.2010]
http://www.helsinki.fi/~korpela/sphagnum_squarrosum.html
Abbildung1:Annordnung der isolierten DNA in Gel 1
Quelle: Sphagnum AG
[Stand: 12.7.2010]
Abbildung 2: Gelelektrophorese des Gels 1
Quelle: Sphagnum AG
[Stand: 12.7.2010]
Abbildung 3: Ablauf einer Sequenzierung
[Stand: 3.12.2010]
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Didesoxy-Methode.svg&filetimestamp=20090921155059

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7. Selbstständigkeitserklärung des Kollegiaten
Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis
angefuhrten Quellen und Hilfsmittel benützt habe.
Memmingen, den 23.12.2010 .......................................................................
(Unterschrift des Kollegiaten)