Clinical and Technical Review - Tecomedical
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<strong>Clinical</strong> <strong>and</strong><br />
<strong>Technical</strong> <strong>Review</strong><br />
Komplementdiagnostik<br />
Hämokompatibilitätstestung<br />
von Medizinprodukten, Pharmaka<br />
und Blutprodukten
2<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
Komplementdiagnostik –<br />
Hämokompatibilitätstestung von Medizinprodukten, Pharmaka und Blutprodukten<br />
1 Das Komplementsystem . ....................................................................... 3<br />
2 Diagnostik des Komplementsystems . ............................................................. 4<br />
3 Biokompatibilitätstestung unterschiedlicher Materialien . .............................................. 7<br />
4 Komplementmessung zur Prüfung der Biokompatibilität . ............................................. 11<br />
5 In-vitro-Untersuchung zur Biokompatibilität . ....................................................... 15<br />
5.1 Experimentelles Design . .................................................................. 17<br />
5.2 Versuchsanordnung . ..................................................................... 18<br />
6 Messung der Komplementaktivierung in Seren von Nicht-Primaten mittels hämolytischem Assay – CxH50 . ..... 22<br />
6.1 Experimentelles Design CxH50 . ............................................................ 24<br />
7 Literaturhinweise . ............................................................................ 26<br />
8 Komplement- und Biokompatibilität Produkte . ..................................................... 27<br />
8.1 Komplement ELISA Kits . ................................................................. 27<br />
8.1.1 Kreuzreaktionen von Komplementfragmenten im ELISA mit Proben von Primaten . ............... 38<br />
9 Komplement-Antikörper und Reagenzien . ......................................................... 40<br />
10 Komplement-spezifische Antiseren: Applikationen . .................................................. 42<br />
10.1 Produktinformation zu monoklonalen Antikörpern . ............................................. 44<br />
10.2 Kreuzreaktionen Tierspezies – Monoklonale . .................................................. 46<br />
10.3 Kreuzreaktionen Tierspezies – Polyklonale Antikörper . .......................................... 47<br />
11 Appendix .............................................................................. 49<br />
11.1 Assay Protokolle (Beispiele) . ............................................................. 49<br />
11.1.1 Prüfung auf Aktivierung des Komplementsystems am Beispiel von Liposomenpräparationen . ....... 50<br />
11.1.2 Messung der Komplementaktivierung in Seren von Nicht Primaten (CxH50) . .................... 54<br />
11.2 Technische Daten Blätter und Analyse Zertifikate (Beispiele) . ................................. 59<br />
Normal Human Serum Complement (A113) . .................................................. 59<br />
Guinea Pig Serum Complement (A119) . ...................................................... 60<br />
HAGG Activator (A114) . .................................................................. 61<br />
Activator Cobra Venom Factor (A600) . ....................................................... 62<br />
Specimen stabilizer (A9576) . .............................................................. 63<br />
Normal human complement St<strong>and</strong>ards (A100) . ................................................ 64<br />
04/2011
1. Das Komplementsystem<br />
Das Komplementsystem als Teil des angeborenen Immunsystems<br />
dient primär der Eliminierung pathogener<br />
Organismen. Durch proteolytische Spaltung von inaktiven<br />
Komplementproteinen werden reaktive Effektoren gebildet,<br />
die sich zu enzymatisch aktiven Proteinkomplexen zusammenfügen.<br />
Die Haupteffekte des aktivierten Komplementsystems<br />
bestehen<br />
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eine Vasodilatation bewirken, die Ausschüttung von Histamin<br />
induzieren und chemotaktische Aktivität auf Effektorzellen<br />
der Entzündungsreaktion ausüben.<br />
��������������������������������������������������������<br />
Organismen (Opsonisierung) um diese den Phagozyten<br />
zu präsentieren sowie<br />
�����������������������������������������������������<br />
C5b-9 (Membran-Attack-Complex-MAC) [1], der zur Bildung<br />
von Zellmembran-Poren und letztlich zur Lyse der<br />
Zelle führt.<br />
Aufgrund der starken zell- und gewebszerstörenden Effekte<br />
des aktivierten Komplementsystems besteht eine<br />
strenge Kontrolle durch Regulatorproteine/Inhibitoren.<br />
Überschießende Aktivierung kann zu lebensbedrohlichen<br />
Entzündungszuständen führen. Mängel oder Defekte der<br />
Komplementproteine oder der Regulatoren haben zahlreiche<br />
Krankheitsbilder zur Folge.<br />
Eine überschießende Komplementaktivierung kann ebenso<br />
durch den intra- oder extrakorporalen Kontakt mit hämoinkompatiblen,<br />
synthetischen Medizinprodukten, Blutprodukten<br />
und Pharmaka ausgelöst werden.<br />
Quidel ® bietet Enzymimmunoassays zur quantitativen Bestimmung<br />
von Komplement-Aktivierungsprodukten, zirkulierenden<br />
Immunkomplexen sowie zur Bestimmung der<br />
Gesamthämolytischen Aktivität des klassischen bzw. alternativen<br />
Aktivierungsweges an. Daneben steht ein zuverlässiger<br />
ELISA zur Erfassung funktionell aktiven C1-Inhibitors<br />
zur Verfügung.<br />
Eine breite Palette monoklonaler und polyklonaler Komplementantikörper,<br />
Mangelplasmen und Reagenzien (z.<br />
B. Cobra venom faktor) für die Komplementanalytik vervollständigen<br />
das Portfolio. Quidel ® Komplementprodukte<br />
werden sowohl bei klinischen Fragestellungen als auch zur<br />
Prüfung der Hämokompatibilität von Medical Devices und<br />
Pharmaka eingesetzt.<br />
Classical<br />
Pathway<br />
C1-<br />
INH<br />
C1C<br />
C1q<br />
C1r<br />
C1s<br />
Aktivierung und Regulierung des Komplementsystems<br />
Proteases C4<br />
Komplementproteine liegen im Plasma in inaktiver Form vor. Man bezeichnet sie als Komplementfaktoren C1-C9. Nach<br />
Aktivierung des Systems werden die Komplementfaktoren gespalten; z.B. C3 in C3a und C3b. Die Spaltprodukte reagieren<br />
mitein<strong>and</strong>er und bilden Komplementkomplexe z.B. den C4b2a-Komplex.<br />
MASP2<br />
MASP1<br />
MBL<br />
Aufgrund unterschiedlicher Aktivierung unterscheiden wir drei Wege (Pathways):<br />
1. Klassischer Weg (Classical Pathway)<br />
2. Lektin-Weg (Lectin Pathway)<br />
3. Alternativer Weg (Alternative Pathway)<br />
-CHO<br />
C3aR C5aR C1qR<br />
CR1<br />
Lectin<br />
Pathway<br />
Complement Receptors<br />
CR2<br />
CR3<br />
C3c<br />
C3d.g<br />
Complement System<br />
SC5b-9<br />
(TCC)<br />
C3f<br />
iC3b<br />
C4BP<br />
C4b<br />
C2<br />
Factor<br />
I<br />
C4a C4c C4d C2b<br />
C3a<br />
C5a<br />
C2a<br />
C3<br />
C5<br />
Factor<br />
P<br />
Bb<br />
C3<br />
Convertase<br />
Factor<br />
H<br />
C5<br />
Convertase<br />
C5b<br />
C6<br />
C7<br />
C8<br />
C9<br />
C3b<br />
SProtein<br />
Clusterin<br />
Factor<br />
I<br />
Factor<br />
D<br />
Factor<br />
B<br />
Ba<br />
Surface<br />
C3i<br />
Amplification<br />
Loop<br />
Terminal<br />
Pathway<br />
C3<br />
Tickover<br />
CR4<br />
MAC Assembly<br />
(TCC)<br />
Quidel Corporation • Specialty Products Group • 2981 Copper Road, Santa Clara, CA 95051 • www.quidel.com<br />
Abbildung 1:<br />
Stark vereinfachte Darstellung des Komplementsystems.<br />
C3b<br />
Alternative<br />
Pathway<br />
Regulatory Proteins<br />
CRI DAF<br />
MCP<br />
CD59<br />
LPS<br />
= Regulatory Proteins<br />
= Activators<br />
*MicroVue Products<br />
are indicated in green<br />
3
4<br />
Der klassische Aktivierungsweg startet durch die Bindung der Untereinheit C1q vom C1 an einen Antigen-Antikörper-<br />
Komplex. Die Untereinheit C1s wird aktiv und spaltet seinerseits C4 und C2 in C4a und C4b sowie C2 in C2a und C2b.<br />
Die neuen Spaltprodukte bilden nun den C4bC2a Komplex, der als C3 Konvertase bezeichnet wird und nun seinerseits<br />
C3 in C3a und C3b spaltet. Bei der Aktivierung des Lektinwegs erkennt Mannose-bindendes Lektin (MBL) spezifische<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������dung<br />
der C3 Konvertase C4bC2a und somit zur Spaltung von C3 in C3a und C3b führt. Die Aktivierung des alternativen<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
C3a diffundiert und besitzt eine chemotaktische und entzündungsauslösende Wirkung als Anaphylatoxin. C3b kann an<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
alternative Komplementweg zwischen „Selbst“ und „Fremd“ unterscheiden. Weitere Reaktionsschritte führen zur Anlagerung<br />
von Faktor B, wobei durch proteolytische Spaltung von Faktor D das Fragment Ba freigesetzt wird, während das<br />
Fragment Bb assoziiert bleibt. Die gebildete C3-Konvertase des alternativen Wegs (C3bBb) besitzt enzymatische Aktivität<br />
und verstärkt durch eine Amplifikationsschleife die Bildung von weiteren C3b-Molekülen. Die biologische Halbwertszeit<br />
von C3bBb wird durch Anlagerung von Properdin (P) verlängert. Die C3-Konvertasen (C3bBb und C4bC2b) aller Aktiverungswege,<br />
spalten nun mit hoher Aktivität weitere C3Moleküle in C3b und C3a. Dies führt zur Beladung der Zielstruktur<br />
mit vielen C3b Molekülen (Opsonisierung) und zur Phagozytose der Zelle. Andere C3b Moleküle binden an die C3 Konvertasen<br />
und es entstehen die C5- Konvertasen (C4b2b3b bzw. C3bBb3b). Freies C3b wird durch Faktor H und Faktor I<br />
inaktiviert. C5 wird durch die C5- Konvertasen in C5a (Anaphylatoxin) und C5b gespalten, das als Anker an der Zielzelle<br />
durch Bindung der weiteren Komplementfaktoren den lytischen Komplex C5b-9 (TCC=terminaler ComplementComplex)<br />
bildet, was zu einer Porenbildung in der Zellmembran und letztlich zur Lyse führt.<br />
Nach der Initiierung der Komplementkaskade ist die Aktivierung nicht spezifisch, d. h. Moleküle können auf jeder in der<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Einige sezernierte Regulatoren wie der C1-Inhibitor (inaktiviert den C1-Komplex), das C4-Bindungsprotein (C4BP), Faktor<br />
I und Faktor H beschleunigen die Dissoziation der beiden C3-Konvertasen und inaktivieren die C4b- und C3b-Moleküle.<br />
Membrangebundene Komplementregulatoren wie MCP (Membran-Cofaktor-Protein, CD46), DAF (Decay Accelerating<br />
Factor, CD55) und Protektin (CD59) können den Zerfall der C3-Konvertasen beschleunigen bzw. die Integration des C5b-<br />
9-Komplexes verhindern.<br />
Wechselwirkungen des Komplementsystems<br />
Das Komplementsystem ist nicht nur ein humorales Abwehrsystem, sondern kann zusätzlich als Vermittler der zellulären<br />
Abwehrkaskade wirken. So führt die Aktivierung der Leukozyten auch zur Aktivierung des Gerinnungs-, Fibrinolyse-und<br />
Kontaktphasensystems (Kininogen-Kinin-System) und die Leukozyten ihrerseits aktivieren wieder in positiver Rückkopplung<br />
das Komplementsystem. Dieser stark ausgeprägte positive Feedback-Mechanismus kann insbesondere durch eine fehlende<br />
Rückkopplung des Komplementsystems mit dessen terminalem Endprodukt eintreten und zu pathophysiologischen<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
den Initialphasen der klassischen Komplementaktivierung (C1) und dem Kontaktphasensystem sowie dem Schlüsselenzym<br />
der Fibrinolyse (Plasmin) sind sowohl in vitro als auch in vivo beschrieben worden. Eine Plasminaktivierung kann sowohl<br />
über endothelialen t-PA-Release als auch über kallikreinaktivierte Urokinase stattfinden. Plasmin kann den ersten Faktor<br />
der Komplementkaskade (C1) direkt oder über die Freisetzung des F-XII-Spaltprodukts ß-F XIIa aktivieren. Beim Kontakt<br />
von Blut mit nicht körpereigenen Materialien (Medizinprodukten) muss daher mit einer Komplementaktivierung gerechnet<br />
werden.<br />
2. Diagnostik des Komplementsystems<br />
Das Komplementsystem ist ein streng reguliertes System und ein Defekt kann gewaltige Auswirkungen mit verschiedenartigen<br />
pathologischen Folgezuständen haben.<br />
Indikationen für Komplementdiagnostik sind:<br />
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Komplementdefekte können primär (hereditär) oder sekundär (erworben) sein. Die angeborenen Fälle machen ca. 10 %<br />
aller primären humoralen Immundefekte aus und werden in der Regel autosomal rezessiv vererbt. Demzufolge bleiben<br />
heterozygote Träger klinisch meist unauffällig. Sekundäre Defizienzen werden durch Komplementverbrauch, verminderte<br />
Synthese und/oder gesteigerten Katabolismus verursacht. Während ein Fehlen der Komponenten der klassischen Aktivierungssequenz<br />
(C1, C4, C2) oftmals mit Autoimmunprozessen assoziiert ist (SLE und Lupus-ähnliche Krankheitsbilder),<br />
prägen rezidivierende bakterielle Infektionen das klinische Bild bei Defekten der Komponenten C3 bis C8. Insbesondere<br />
bei Defizienz der späten Komponenten herrschen Infektionen mit Neisserien vor. Defekte wurden für nahezu alle Komplement-<br />
und Regulatorproteine mit Ausnahme des Faktors B beschrieben.
Die Erforschung der funktionalen Wirkung der einzelnen Komplementfaktoren wurde durch das Auftreten von Krankheiten,<br />
bei denen ein Mangel einzelner Faktoren oder Regulatoren vorliegt, wesentlich erleichtert. Komplement-assoziierte<br />
Krankheitsbilder können einerseits auf Komplementdefekte zurückgeführt werden, <strong>and</strong>ererseits kann die Komplementaktivierung,<br />
insbesondere bei falsch pathophysiologischen Reaktionen, stark zellzerstörende Eigenschaften entwickeln und<br />
für massive Gewebeschäden verantwortlich sein. Für die Diagnostik werden sowohl erhöhte als auch verminderte Werte<br />
der unterschiedlichen Komplementfaktoren oder ihrer Metaboliten genutzt:<br />
Krankheitsbilder Assoziierte Komplementfaktoren<br />
systemischer Lupus erythema-todes (SLE) und<br />
Lupusnephritis CP: C4d Nachweis<br />
CH50, C3, C4 ↑<br />
C1, C4, C2 <strong>and</strong> C3, Factor B ↓<br />
Herzinfarkt und Schlaganfall terminaler Weg [SC5b-9] und Anaphylatoxine, ↑<br />
insbesondere C5a<br />
Vaskulitis, Glomerulonephritis Verbrauch von C3, C4<br />
Angioödeme, Capillary-Leak-Syndrom C1-INH<br />
hämolytisch-urämisches Syndrom Faktor H<br />
rheumatoide Arthritis Faktor H, C3d, C1q<br />
Transfusionsreaktionen, Transplantation/<br />
Allotransplantat-abstoßung<br />
klassischer Weg C4d<br />
altersbedingte Makuladegeneration (AMD) Faktor H, C3, C5<br />
Alzheimer C3, C5, SC5b-9, Faktor H, E100<br />
Polytrauma, Verbrennung, Sepsis C5a<br />
akutes respiratorisches Distress-Syndrom (ARDS),<br />
Multiorganversagen<br />
C5a<br />
diabetische Ketoazidose (DKA) C3a <strong>and</strong> sC5b-9<br />
Abbildung 2<br />
Aufstellung der Komplementfaktoren und damit assoziierten Krankheitsbildern<br />
Komplement Mangel assoziierte Krankheitsbilder<br />
Komplementfaktoren<br />
C1, C4, C2<br />
SLE, Lupus-ähnliches Syndrom<br />
(rezidivierende Infektionen)<br />
C3 rezidivierende schwere bakterielle Infektionen<br />
C5 – C8, MBL<br />
rezidivierende bakterielle Infektionen<br />
(vor allem Neisserien)<br />
C9 überwiegend keine<br />
Regulatoren<br />
C1 Inhibitor hereditäres Angioödem<br />
Faktor I, Properdin rezidivierende Infektionen<br />
Faktor H hämorrhagisch-urämisches Syndrom (HUS), MPGN<br />
DAF, C8bp, CD59 paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie<br />
Rezeptoren<br />
CR 1 SLE<br />
CR 3, CR 4 rezidivierende Infektionen<br />
(CD11b/c, CD18) (Leukozyten-Adhäsions-Defekt, LAD)<br />
Abbildung 3:<br />
Darstellung der Komplementfaktoren und damit assoziierten Krankheitsbildern<br />
5
6<br />
Methoden für die Komplementanalytik<br />
Gesuchter Parameter Methoden der Komplementanalytik<br />
Gesamtfunktion<br />
Klassischer Weg CH50: ELISA, hämolytische Titration<br />
Alternativweg APH50: ELISA, hämolytische Titration<br />
Lektin-Weg hämolytische Titration, ELISA<br />
Einzelfaktoren<br />
Proteinbestimmung: C1q, C2 – C9 hämolytische Titration, ELISA<br />
Funktionale Bestimmung: C1 – C9 hämolytische Titration (Mangelserum)<br />
Aktivierungsprodukte – alle Wege<br />
C3a, iC3b, C5a, SC5b-9 ELISA<br />
C3d ELISA, Rocketelektrophorese<br />
Aktivierungsprodukte – klassischer Weg<br />
C1rs C1- Inhibitor ELISA<br />
C4a, C4d ELISA<br />
Aktivierungsprodukte – Alternativweg<br />
C3b (Bb) P ELISA<br />
Ba, Bb ELISA<br />
Aktivierung der terminalen Sequenz<br />
C5a, SC5b-9 ELISA<br />
Regulatoren<br />
C1-Inhibitor-Protein (C1-Esterase-Inhibitor) (C1-INH) Nephelometrie, RID, ELISA<br />
C1-Inhibitor-Funktion Enzyminhibitionstest, ELISA<br />
Faktor-H- und Faktor-I-Protein ELISA, Rocketelektrophorese<br />
Faktor-H- und Faktor-I-Funktion hämolytischer Test<br />
Carbopeptidase N Enzymtest mit chromogenem Substrat<br />
DAF, C8bp, CD59 Protein ���������������<br />
DAF, C8bp, CD59 Funktion Säure-Hämolyse-Test<br />
C3-Nephritisfaktor Immunfixation, hämolytischer Test<br />
Faktor P – Properdin ELISA<br />
Faktor B – C3-Proaktivator ELISA, RID<br />
Zirkulierende Immunkomplexe<br />
Zirkulierende Immunkomplexe – C1q-Fragmente CIC-C1q ELISA<br />
Zirkulierende Immunkomplexe – C3-Fragmente CIC-RCR ELISA<br />
Abbildung 4
3. Biokompatibilitätstestung unterschiedlicher Materialien<br />
Der Begriff Biokompatibilität (gr. bios = Leben, kompatibel = verträglich) beschreibt im weitesten Sinne die Verträglichkeit<br />
von Werkstoffen mit lebendem Körpergewebe (Knochen, Weichgewebe, Blut). Eine exakte Definition in physikalischen<br />
und chemischen Einheiten ist bisher noch nicht gelungen. Die heute eingesetzten Materialien sollten sich im Körper inert<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
wird intensiv daran geforscht, Biokompatibilität zu verstehen und Werkstoffe zu entwickeln, die im Körper physiologisch<br />
adaptiert werden und eine funktionelle Gewebeintegration ermöglichen.<br />
Streng genommen muss der Begriff Biokompatibilität in die Bereiche Zytokompatibilität (Zell- und Gewebeverträglichkeit)<br />
und Hämokompatibilität (Blutverträglichkeit) gegliedert werden. Die Frage der Zytokompatibilität ist für Langzeitimplantate<br />
von primärer Bedeutung. Implantat ist eine zusammenfassende Bezeichnung für alle Materialien, die zur Erfüllung einer<br />
bestimmten Ersatzfunktion für einen begrenzten Zeitraum oder auf Lebenszeit in den Körper eingebracht werden. Im Gegensatz<br />
zum Transplantat besteht ein Implantat üblicherweise aus unbelebter Materie (Ausnahmen sind z. B. endothelialisierte<br />
Stents oder biologische Herzklappen). Da viele Implantate nicht nur mit Gewebe sondern auch mit Blut (zumindest für eine<br />
gewisse Zeit während der operativen Phase der Implantation) in Kontakt kommen, spielt außerdem die Hämokompatibilität<br />
eine bedeutende Rolle. Für den Bereich „extrakorporale Zirkulation“ ist aufgrund der kurzen einmaligen Einsatzdauer nur<br />
die Hämokompatibilität von Relevanz.<br />
Medizinprodukte können für sehr unterschiedliche Blutkontaktzeiten konzipiert sein:<br />
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������������������������������������������������������<br />
Blutkontaktierendes Produkt Blutkontaktierendes Material Anzahl<br />
Katheter �������������������������������� 200 Mio.<br />
Stents Edelstahl, Styren-Isobutylen-Polymer, Magnesium 4 Mio.<br />
Führungsdrähte Edelstahl, Nitinol mehrere Millionen<br />
Dialysatoren Polyacrylonitril, Polysulfon, Zellulose 1.2 Mio.<br />
Oxygenatoren (HLM) Hohlfasern (PP etc.) ~1 Mio.<br />
Schrittmacher Silikon, Polyurethan, Platin 300,000<br />
Gefäßprothesen ������������� 200,000<br />
Herzklappen Titan, Karbon, Dacron, fixiertes natürliches Gewebe 200,000<br />
Künstliche Lungen Silikon, PP etc. 20,000<br />
Herzunterstützungssysteme Polyurethan etc. 1,000<br />
Abbildung 5:<br />
Überblick über die Anzahl viel verwendeter Medizinprodukte mit Blutkontakt (modifiziert nach Rutner)<br />
Probleme der Hämokompatibilität<br />
Buddy Rutner [4] beschreibt in seinem etwas provokanten Übersichtsartikel „The Catastrophe Revisited: Blood Compatibility<br />
in the 21st Century“ äußerst treffend das Unvermögen der Forschungsgemeinde im Bereich Biomaterialien, sich trotz 50<br />
Jahren intensiver Forschung auf eine genaue Defintion des Begriffs „Blutkompatibilität“ zu einigen [5].<br />
Er stellt fünf Hypothesen auf, warum der Fortschritt zum klaren Verständnis der Blutkompatibilität so langsam verläuft:<br />
Hypothese 1: Es ist unmöglich, ein komplett blutkompatibles Material herzustellen.<br />
Hypothese 2: Wir verstehen die biologischen Vorgänge der Blutkompatibilität nicht.<br />
Hypothese 3: Wir wissen nicht, wie wir Blutkompatibilität testen sollen.<br />
Hypothese 4: Bestimmte Materialien natürlichen Ursprungs scheinen eine bessere Blutkompatibilität zu besitzen,<br />
aber wir wissen nicht warum.<br />
Hypothese 5: Mittlerweile stehen besser blutverträgliche Materialien zur Verfügung, aber die regulatorischen und<br />
ökonomischen Rahmenbedingungen verhindern eine Umsetzung in die klinische Praxis.<br />
7
8<br />
Strategien zur Verbesserung der Hämokompatibilität von Fremdoberflächen<br />
Die zur klinischen intra- oder extrakorporalen Applikation gehörigen „medizintechnischen Produkte“ umfassen ein weites<br />
Spektrum an Kunststoffen: Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid (PVC), Polyester, Polystyren, Polyurethan, Silikon,<br />
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viele metallische Werkstoffe wie Edelstahl, Titan und deren Legierungen verwendet. Obwohl diese Produkte ausgezeichnete<br />
mechanische und physikalische Eigenschaften besitzen, wurden sie doch ursprünglich für den industriellen Einsatz<br />
entwickelt und erst sekundär im biomedizinischen Bereich eingesetzt [9]. Da sich alle diese Werkstoffe durch den Nachteil<br />
einer mehr oder weniger starken Hämoinkompatibilität auszeichnen, kann dies bei Blutkontakt zu einer pathophysiologischen,<br />
dem traumatischen Schock ähnlichen Antwort des Organismus führen. Beispielsweise kommt bei kardiopulmonalen<br />
Bypass-Operationen unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine das gesamte Blut des Patienten über einen Zeitraum von<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������siven<br />
Aktivierung der humoralen und zellulären Abwehrmechanismen gegen den vermeintlich pathogenen „Eindringling“<br />
reagiert und somit der Ablauf der verschiedenen Kaskadensysteme in Gang gesetzt wird.<br />
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die unspezifische Adsorption von Proteinen (Fibrinogen, C3 etc.), die durch Konformationsänderungen zu Signalstoffen<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
eigentliche Matrix für die Adhäsion von Blut- und Gewebezellen sowie die Bakterienkolonisation darstellen.<br />
In den letzten Jahren wurde von den Medizingeräteherstellern vermehrt der Versuch unternommen, durch die Entwicklung<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
[10]. Mehr denn je besteht jedoch die dringende Notwendigkeit, die Anstrengungen zur Optimierung der präklinischen<br />
Evaluierungsstrategien von blutkontaktierenden Medizinprodukten zum Wohle des Patienten zu verstärken.<br />
Internationaler St<strong>and</strong>ard ISO 10993<br />
Der Aspekt der Hämokompatibilität von Medizinprodukten wird leider häufig noch etwas stiefmütterlich beh<strong>and</strong>elt. Weder<br />
die US-amerikanische „Food <strong>and</strong> Drug Administration“ (FDA) noch die europäischen Direktiven oder die deutsche „Zentralstelle<br />
der Länder für Gesundheitsschutz bei Arzneimitteln und Medizinprodukten“ (ZLG) haben bisher eindeutige qualitative<br />
und quantitative Richtlinien für die Blutverträglichkeit von Kunststoffen vorgegeben. Sogar die Durchführungsnorm ISO<br />
10993-4 (Prüfung zur Wechselwirkung mit Blut) ist relativ unkonkret und sehr offen verfasst.<br />
Die ISO 10993 beinhaltet nachfolgende Teilbereiche, die unter die Rubrik<br />
„Biologische Evaluierung von Medizingeräten“ fallen:<br />
Teil 1: Evaluierung und Prüfung<br />
Teil 2: Anforderungen für den Tierschutz<br />
Teil 3: Tests auf Genotoxizität, Karzinogenität und reproduktive Toxizität<br />
Teil 4: Auswahl von Tests für Wechselbeziehungen mit Blut<br />
Teil 5: Tests für In-vitro-Zytotoxizität<br />
Teil 6: Tests für lokale Auswirkungen nach der Implantation<br />
Teil 7: Ethylenoxid-Sterilisationsrückstände<br />
Teil 8: Auswahl und Eignung des Referenzmaterials für biologische Tests<br />
Teil 9: Rahmenbedingungen für die Identifizierung und Quantifizierung potenzieller Abbauprodukte<br />
Teil 10: Tests auf Reizung und Sensibilisierung<br />
Teil 11: Tests für systemische Toxizität<br />
Teil 12: Probenvorbereitung und Referenzmaterialien<br />
Teil 13: Identifizierung und Quantifizierung von Abbauprodukten aus polymerhaltigen Medizinprodukten<br />
Teil 14: Identifizierung und Quantifizierung von Abbauprodukten aus Keramik<br />
Teil 15: Identifizierung und Quantifizierung von Abbauprodukten aus Metallen und Legierungen<br />
Teil 16: Toxikokinetisches Studiendesign für Abbauprodukte und auswaschbare Substanzen<br />
Teil 17: Festlegung zulässiger Grenzen für auswaschbare Substanzen<br />
Teil 18: Chemische Charakterisierung von Materialien<br />
Note: Bitte beachten: Eine neue Fassung der ISO 10993-4 wird 2012 in Kraft treten.
Der Durchführungsst<strong>and</strong>ard ISO 10993-4, „Auswahl von Prüfungen zur Wechselwirkung mit Blut“, Version 2002 (zweite<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Er gilt für die folgenden Medizinprodukte:<br />
1. Externe Medizinprodukte, die nicht mit zirkulierendem Blut in Berührung kommen, sind u.a.:<br />
� ���������<br />
� ������������������<br />
� ��������������������<br />
� �� Geräte für die Lagerung und Verwaltung von Blut und Blutprodukten (z. B. Schläuche, Nadeln und Beutel)<br />
� ������������<br />
2. Externe Medizinprodukte, die mit zirkulierendem Blut in Berührung kommen, sind u. a.:<br />
� ��������������������<br />
� ��������������<br />
� ����������<br />
� ����������������<br />
� ��������������������������<br />
� �����������������������������<br />
� �����������������������������<br />
� ����������������������������������������<br />
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3. Implantate, die weitgehend oder vollständig in das Gefäßsystem eingebracht werden, sind u. a.:<br />
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Für die o. a. Medizinprodukte müssen entsprechend der ISO 10993-4 mindestens ein, mitunter auch mehrere Tests aus<br />
nachfolgender Liste durchgeführt werden:<br />
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9
10<br />
Als Testmethoden zur Evaluierung der Komplementaktivierung von Medizinprodukten werden in der ISO 10993-4 folgende<br />
Parameter vorgeschlagen: C3a, C5a, Bb, iC3b, C4b, SC5b-9, CH50, C3-Konvertase, C5-Konvertase.<br />
Zusätzlich wird auf die Empfehlungen der „American Society for Testing <strong>and</strong> Materials“ verwiesen:<br />
ASTM F1984-99, St<strong>and</strong>ard Practice for Testing for Whole Complement Activation in Serum by Solid Materials<br />
ASTM F2065-00, St<strong>and</strong>ard Practice for Testing for Alternative Pathway Complement Activation in Serum<br />
by Solid Materials<br />
Als Testsysteme sollen statische und dynamische Systeme eingesetzt werden (siehe Kapitel 4 und 5).<br />
Pharmaka, Blutprodukte, Infusionslösungen<br />
Prinzipiell sollten alle intravenös applizierten Pharmaka, wie z. B. Antikörper (passive und humanisierte), Oligonukleotide<br />
(Antisense-Therapie), Infusionslösungen und Blutprodukte (Plasma, Albumin, Gerinnungsfaktoren etc.) in Bezug auf eine<br />
direkte Komplementaktivierung getestet werden (Testung von C3a oder SC5b-9). Zudem ist die Erfolgsbeurteilung von<br />
immunsuppressiven Therapien, Plasmaaustauschbeh<strong>and</strong>lungen und von Immunglobulintransfusionen (IVIG) oft von einer<br />
wiedergewonnenen Homöostase des Komplementsystems abhängig (Testung von C3a oder C4d). Beim hereditären Angioödem<br />
(HAE) wird mit C1-Inhibitorkonzentrat oder aus Spenderblut isoliertem rekombinanten C1-Inhibitor erfolgreich<br />
therapiert.<br />
Auch die auf dem neuen Gebiet des Tissue Engineering entstehenden Produkte (natives Gewebe und Zellen; mit und<br />
ohne Polymer-Gerüst) bedürfen vor dem klinischen Einsatz einer eingehenden Prüfung in Bezug auf ihr komplementaktivierendes<br />
Potenzial.<br />
Bei der Therapie mit monoklonalen Antikörpern wird über die C1q-Bindungsstelle der schweren Kette des Maus-IgG eine<br />
Komplementaktivierung ausgelöst. Die Klasse der humanisierten Antikörper wurde eingeführt, da sich durch deren Einsatz<br />
diese Aktivierung verringert.<br />
In neuerer Zeit wurden unterschiedliche Therapeutika zur Aktivierung oder Inhibition des Komplementsystems entwickelt.<br />
Spezielle Komplementinhibitoren wie Eculizumab (ein monoklonaler Antikörper gegen C5) blockiert die terminale Aktivierung.<br />
Eculizumab wird gegen die paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) eingesetzt, eine seltene erworbene und<br />
lebensbedrohliche Erkrankung blutbildender Stammzellen (CD59-Defekt auf Erythrozytenmembran).<br />
Weitere peptidbasierte Komplementinhibitoren (C3, C5) werden derzeit intensiv erforscht.
4. Komplementmessung zur Prüfung der Biokompatibilität<br />
Wie in Kapitel 1 ausführlich beh<strong>and</strong>elt, dient das Komplementsystem der Klärung von Immunkomplexen und stellt ein<br />
lytisches System zur Beseitigung von pathogenen Mikroorganismen dar. Das zentrale Ereignis in der Komplementkaskade<br />
ist die enzymatische Spaltung von C3 in C3b und C3a, initiiert von zwei C3-Konvertasen (C4b,2a und C3b,Bb), welche<br />
durch alle drei Komplementwege aktiviert werden können.<br />
Klassischer Weg<br />
Antikörper C1-Komplexe<br />
Aktivierungsweg des Komplementsystems<br />
C4-Aktivierung<br />
Lektin-Weg<br />
MBL-MASP2-Komplexe<br />
C3-Aktivierung<br />
Terminaler Weg<br />
Alternativer Weg<br />
Aktive Oberflächen<br />
Abbildung 6:<br />
Schematische Darstellung der Komplementkaskade. Die Komplementaktivierung durch körperfremde Oberflächen kann über den klassischen, den<br />
Lektin- und alternativen Weg erfolgen. Auslösendes Moment für den klassischen und den Lektin-Aktivierungsweg ist ein Antigen-IgG-C1-Komplex bzw.<br />
Zucker-MBL-MASP2-Komplex, der eine enzymatische Aktivierung der Komplementproteine C4 und C2 bewirkt. Dies führt zur Bildung der C3-Konvertase,<br />
die C3 in die biologisch aktiven Komplementfaktoren C3a und C3b spaltet. Im alternativen Aktivierungsweg interagiert C3 direkt mit gebundenem C3b und<br />
erzeugt dadurch eine Amplifikationsschleife des klassischen und des Lektin-Wegs. Das Proteinfragment Bb (entst<strong>and</strong>en durch die enzymatische Spaltung<br />
des Faktors B) bindet an das gebundene C3b, um die C3-Konvertase des alternativen Aktivierungswegs zu generieren. C3b bildet einen Teil der C5-Konvertase,<br />
die C5 in C5a und C5b spaltet. C5b führt letztendlich zur Bildung des Terminalen Komplement-Komplexes (TCC). TCC ist der zusammenfassende<br />
Begriff für C5b-9 (Protein der Plasmamembran) und SC5b-9 (Protein in Phase).<br />
Nachweis einer Aktivierung des Systems und Überprüfung einer ausreichenden Funktion<br />
Verlaufsbeobachtungen der Komplementaktivierung sind zur Erkennung von Risikopatienten nach Polytrauma, Verbrennung,<br />
Sepsis, Transplantation etc. notwendig. Die wiederholte Kontrolle von Aktivierungsprodukten erleichtert die Einschätzung<br />
immunologisch-entzündlicher Aktivität, insbesondere bei der Überwachung einer immunsuppressiven Therapie. In die<br />
umfassende Komplementdiagnostik sollten alle Komponenten und Regulatoren, sowohl in Bezug auf ihre Plasmakonzentration<br />
als auch ihre Funktion innerhalb der Kaskadenreaktion, einbezogen werden.<br />
Die moderne Komplementdiagnostik, die einen Defekt oder eine Aktivierung des Systems sicher erfasst, verlangt ein<br />
stufenweises Vorgehen. Folgende Parameter können dabei analytisch eingesetzt werden:<br />
Als Eingangsuntersuchung wird die Gesamthämolyseaktivität des klassischen Weges (CH50) und des Alternativweges<br />
(APH50) sowie der Nachweis des Komplement-Aktivierungsproduktes C3d empfohlen.<br />
CH50: ELISA oder Titration der gesamthämolytischen Aktivität des Komplementsystems, klassischer Weg.<br />
APH50: ELISA oder Titration der gesamthämolytischen Aktivität des Komplementsystems, Alternativweg.<br />
C3d: ELISA oder Rocketimmunelektrophorese-Nachweis des C3-Spaltproduktes C3dg/C3d. Parameter für die<br />
Aktivierung des klassischen und alternativen Weges der C-Aktivierung.<br />
11
12<br />
Testsysteme zur Überprüfung der Komplementaktivierung<br />
Zur präklinischen Bewertung neuer Komponenten („artificial devices“) hinsichtlich ihrer klinischen Einsatzfähigkeit für den<br />
Blutkontakt können mehrere In-vitro- und Ex-vivo-Testmodelle zum Einsatz kommen. Für alle diese Modelle ist die Qualität<br />
der eingesetzten Blutkomponenten (Vollblut, plättchenreiches Plasma, Plasma, Serum) und die Wahl der geeigneten Antikoagulanzien<br />
(Citrat, EDTA, Heparin, Hirudin) von entscheidender Bedeutung. Deshalb müssen die folgenden Ausschlusskriterien<br />
für die Prob<strong>and</strong>enauswahl strikt eingehalten werden: keine Raucher, keine Einnahme von Medikamenten 14 Tage<br />
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nichtsteroidale Antiphlogistika u. a.). Ebenso wichtig sind die schonende Blutabnahme und die rasche Weiterbearbeitung.<br />
Zur Testung der gesamten Hämokompatibilität inklusive der Komplementaktivierung sollten dynamische Modelle unter<br />
Verwendung von frischem humanen Vollblut bevorzugt werden.<br />
Blut-, Plasma-, Serumgewinnung und Heparinisierung<br />
Zur Testung einer Herz-Lungen-Maschine etc. wird eine große Menge an Blut benötigt, bei <strong>and</strong>eren Untersuchungen sollte<br />
ein definiertes Serum, das entsprechend vorbereitet und getestet wurde, verwendet werden. Wenn kein frisches Vollblut<br />
zur Verfügung steht, bietet sich tiefgefrorenes NHS (Normal Human Serum, z. B. A113 oder A112) an, welches speziell<br />
präservierend für Komplementfaktoren gewonnen wurde und auf Infektionskrankheiten, Komplementaktivierung und CH50<br />
getestet ist. EDTA-Plasma oder rekalzifiziertes Plasma sind nicht geeignet.<br />
Bitte beachten: NHS muss vor der Aktivierung ununterbrochen auf Eis aufbewahrt werden.<br />
Für Plasma oder Vollblut sind Heparin (niedrig dosiert) oder Hirudin zu verwenden. Nach dem Test müssen die Plasma-/<br />
Blutproben mit EDTA versetzt werden, um weitere In-vitro-Aktivierungen zu vermeiden.<br />
Verwendung von Frischblut<br />
Wichtige Kriterien für die Blutspender:<br />
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����������������������������������������������������sende<br />
Pharmaka)<br />
Statische Modelle mit Serum<br />
Hierbei werden die zu testenden Prüfmaterialien für definierte Zeiten mit Serum (z. B. NHS = Normal Human Serum, definiertes<br />
und Komplement-getestetes St<strong>and</strong>ardserum) inkubiert. Mit der Bestimmung der einzelnen Komplementfaktoren<br />
können sowohl Rückschlüsse auf die gesamte Komplementaktivierung als auch auf den jeweiligen Komplementweg gezogen<br />
werden. Serum wird bevorzugt eingesetzt, nicht nur für die Testung von Biomaterialien, sondern auch von Pharmaka,<br />
Lösungen, Blutprodukten etc.<br />
Beispiel für einen statischen Test<br />
Prüfgegenst<strong>and</strong> sind hier runde Plättchen aus Metall, Keramik oder Polymerkunststoff.<br />
Wichtige Kriterien für die Blutentnahme:<br />
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mit einer Injektionskanüle<br />
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(Heparin niedrig dosiert, Hirudin etc.)<br />
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Abbildung 7:<br />
Schematische Darstellung einer 12-Kavitäten-Platte. Die vorderen Kavitäten beinhalten Plasma oder Serum. Die Wände der Kavitäten sind mit Silikonschlauchstücken<br />
ausgekleidet. Plasma oder Serum kommt nur mit dem Silikonschlauch und dem am Kavitätenboden liegenden Testmaterial in Kontakt.
Dynamische Modelle mit frischem Vollblut<br />
Ch<strong>and</strong>ler-Loop-Modell<br />
In einem In-vitro-„Closed-Loop”-Modell (modifizierter Ch<strong>and</strong>ler Loop) werden in kreisförmig geschlossenen Schlauchstücken<br />
30 ml heparinisiertes (1 IE/ml Heparin) frisches Humanblut rezirkuliert (20 U/min, 37 °C). Diese Versuchsanordnung<br />
kann durch unterschiedliche Modifikationen zur Testung von neuen Beschichtungen, neuen Pharmaka (Antikoagulanzien,<br />
Inhibitoren etc.), Stents usw. eingesetzt werden. Mit Hilfe dieses Modells können die Aktivierungsprodukte direkt über<br />
traditionelle ELISAs quantifiziert (C3a, C5a, SC5b-9) und die adsorbierten Plasmaproteine mittels einer neu entwickelten<br />
��������������������������������������������������������������������������������������������������������������chenden<br />
Schlauchstücke direkt nach der Beendigung der Ch<strong>and</strong>ler-Zirkulation gespült, fixiert (4 % Paraformaldehyd in<br />
PBS [w/v], pH 7,4), in 2 cm lange Stücke geschnitten und eingefroren. Die Schlauchstücke werden dann an einer Seite<br />
verschlossen und direkt als große „ELISA-Kavität“ eingesetzt. Mit Hilfe der entsprechenden Antikörper kann ein direkter<br />
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Inkubationszeiten im Ch<strong>and</strong>ler-Loop-Modell ist es möglich, eine Kinetik des Adsorptionsverhaltens von Plasmaproteinen<br />
zu bestimmen. Zudem können aus dem systemischen Blut die löslichen Komplementaktivierungsmarker C3a, C5a, SC5b-<br />
9 etc. gemessen werden.<br />
Herz-Lungen-Maschinen-Modell<br />
In diesem eher aufwändigen Modell wird frisches Humanblut in einem kurzgeschlossenen System rezirkuliert, und zwar<br />
unter Oxygenierung, definierter Schlauchlänge und Aufbau eines arteriellen Gegendrucks (d. h. unter denselben Bedingungen<br />
wie bei einem Patienten während einer kardiopulmonalen Bypass-Operation). Das Aktivierungspotenzial von<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
körpereigene Regulativa diese Effekte zu egalisieren versuchen [9]. Aus dem nach unterschiedlichen Zeiten entnommenen<br />
Blut können die Konzentrationen von C3a, C5a, SC5b-9 etc. bestimmt werden und auf diese Weise lässt sich die Kinetik<br />
der Komplementaktivierung quantifizieren.<br />
Durchflusszytometrische Untersuchungen<br />
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Menge der adhärenten Komplementproteine und deren Zusammensetzung nach unterschiedlichen Inkubationszeiten.<br />
13
14<br />
sC5b-9<br />
ALTERNATIVER WEG KLASSISCHER WEG<br />
C3c<br />
C3d<br />
C3<br />
B<br />
Faktor D<br />
Faktor I<br />
IC3b<br />
C5<br />
Bb<br />
C3b<br />
C5a<br />
C3<br />
Konvertase<br />
C5b<br />
C3b3bBb<br />
C5<br />
Konvertase<br />
C6, C7, C8, C9<br />
C5a<br />
C4b2a3b<br />
C5<br />
Konvertase<br />
MIKROPARTIKEL<br />
C5 C2 C3<br />
C3<br />
Konvertase<br />
C2a<br />
C4b<br />
C3a<br />
C4<br />
C4a<br />
CI-INH<br />
CIs CIr<br />
IgG<br />
Abbildung 8:<br />
Schematische Darstellung der Komplementkaskade an der Oberfläche eines Mikropartikels (modifiziert nach Gemmell). Die Komplementaktivierung<br />
durch artifizielle Oberflächen kann durch den alternativen oder klassischen Weg erfolgen. Auslösendes Moment des klassischen<br />
Aktivierungsweges ist ein Antigen-IgG-Komplex, der eine enzymatische Aktivierung der drei Komplementproteine C1, C4 und C2 bewirkt. Dies<br />
führt zur Bildung der C3-Konvertase, die C3 in die biologisch aktiven Komplementfaktoren C3a und C3b spaltet. C3b ist Best<strong>and</strong>teil der C5-<br />
Konvertase, die C5 in C5a und C5b spaltet. C5b führt letztendlich zur Formierung des Terminalen Komplement-Komplexes (TCC). TCC ist der<br />
zusammenfassende Terminus für C5b-9 (membranständiges Protein) und sC5b-9 (Protein in Phase).<br />
Beim alternativen Aktivierungsweg interagiert C3 mit der artifiziellen Oberfläche, um C3b zu adsorbieren. Das Proteinfragment Bb (entst<strong>and</strong>en<br />
durch enzymatische Spaltung des Faktors B) bindet an gebundenes C3b, um die C3-Konvertase des alternativen Aktivierungsweges zu generieren.<br />
Dies mündet, wie beim klassischen Aktivierungsweg, in die Bildung der C5-Konvertase und am Ende in die Bildung des TCC.<br />
Der C1-INH verhindert die Komplementaktivierung über seine hemmende Wirkung auf C1r und C1s.<br />
CIq
5. In-vitro-Untersuchung zur Biokompatibilität<br />
Das Komplementsystem wird über drei unterschiedliche Wege, den klassischen, den Lektin- und den alternativen Komplementweg<br />
aktiviert. Die Aktivierung einer dieser Wege führt zur Spaltung des C3-Proteins, einem äußerst wichtigen<br />
Molekül der Komplementkaskade. Der finale Schritt im Komplementsystem, der terminale Weg, wird anschließend durch<br />
C3-Aktivierung eingeleitet. Jeder Komplementweg kann durch einzelne Proteine, die in spezifische Komplementfragmente<br />
gespaltet werden können (siehe Abbildung 8), diskriminiert werden. Diese Fragmente exprimieren einzigartige Neoepitope,<br />
die durch spezifische monoklonale Antikörpern nachweisbar sind. Die Exposition von Serum (Komplementquelle) gegenüber<br />
einer Testprobe (Biomaterial oder Therapeutikum) führt zur Bildung dieser Fragmente, deren quantitative Charakterisierung<br />
unter St<strong>and</strong>ardbedingungen möglich ist. Die nachfolgenden Schritte vereinfachen die Untersuchung der Komplementaktivierung<br />
und die Identifizierung des genau zugrundeliegenden Aktivierungsweges.<br />
Schritt 1. Test für die C3-Spaltung<br />
Die Komplementkomponente 3 (C3) ist das Schlüsselprotein des Komplementsystems. Die beiden C3-Konvertasen,<br />
C4b2a (klassischer und Lektin-Weg) und C3bBb (alternativer Weg) spalten C3 in C3a und C3b. Dieser Schritt exponiert<br />
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����������������������������������������������������������������������������<br />
Daher ist es möglich, die C3-Aktivierung durch den Nachweis von oberflächengebundenem C3b und/oder<br />
Flüssigphasen-C3a zu testen.<br />
C3: Sonderfälle<br />
In einigen Fällen ist es möglich, dass C3-Spaltprodukte in der Komplementprobe maskiert sind. C3a kann beispielsweise<br />
auf spezifischen Biomaterialien wie Polyacrylonitril (PAN) adsorbiert werden und C3b haftet möglicherweise an der Ober-<br />
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C3a und C3b, sondern auch auf SC5b-9 und C5a zu testen (siehe Schritt 2).<br />
Schritt 2. SC5b-9 und C5a: Bestätigung der Ergebnisse<br />
Die C5-Spaltung und die darauf folgende Bildung des Terminalen Komplementkomplexes (TCC) beweist die Aktivierung<br />
des terminalen Wegs als Reaktion auf die Komplementaktivierung. Es gibt mehrere Gründe dafür, die Aktivierung des<br />
terminalen Weges zu prüfen:<br />
1. Bestätigung, dass Biomaterialien C3 nicht aktivieren (siehe C3: Sonderfälle)<br />
2. Überprüfung des Ausmaßes der Komplementaktivierung, wenn die C3-Spaltung (Schritt 1) positiv ist<br />
Bei SC5b-9 und C5a h<strong>and</strong>elt es sich um einzigartige Fragmente des terminalen Komplementweges. Nach der C3-Aktivierung<br />
spalten die zwei C5-Konvertasen, C4b3aC3b (klassischer und Lektin-Weg) und C3bBbC3b (alternativer Weg) C5 in C5a<br />
(das stärkste Anaphylatoxin) und C5b. C5b bindet die Komponenten C6 und C7, die wiederum C8 und C9 binden und<br />
dabei den lytischen C5b-9-Komplex bilden. Auch der lösliche, nicht-lytische Komplex SC5b-9 wird gebildet und kann in<br />
Flüssigphase zusammen mit C5a nachgewiesen werden.<br />
Schritt 3. Verstehen des Prozesses: Untersuchung auf C4d und Bb<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������chencharakterisierung),<br />
kann eine Testung auf C4d und Bb vorgenommen werden. C4d ist ein Fragment des C4b, das<br />
durch die Aktivierung des klassischen und des Lektin-Weges nach der Spaltung von C4 gebildet wird. C4b wird auf einer<br />
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ein Fragment des alternativen Weges, ist nachweisbar, wenn Faktor B in Bb und Ba gespalten wird. Bb wird indirekt über<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Modifikationen oder <strong>and</strong>ere biotechnologische Methoden zur Umgehung des Problems gewähren.<br />
Überblick<br />
3a.Test für den Nachweis des klassischen Weges<br />
(Aggregation) C4d<br />
Abbildung 9<br />
1. Test für den Nachweis der C3-Spaltung<br />
C3a und iC3b<br />
2. Test für den Nachweis des terminalen Weges<br />
SC5b-9 und C5a<br />
3b.Test für den Nachweis des alternativen Weges<br />
(bakteriell) Bb<br />
15
16<br />
Algorithmus für die Testung der Komplement-Biokompatibilität<br />
Für eine korrekte Versuchsplanung sind drei Komponenten zu berücksichtigen:<br />
1. Komplementquelle<br />
2. Kontrollen<br />
3. St<strong>and</strong>ardisierung<br />
1. Komplementquelle<br />
Humanserum ist als Komplementquelle am besten geeignet. Das Serum muss jedoch frisch sein, gefrorenes Serum mit<br />
geringen Konzentrationen an Aktivierungsfragmenten. EDTA-, heparinisiertes und rekalzifiziertes Plasma sind nicht geeignet.<br />
QUIDEL stellt st<strong>and</strong>ardisiertes Humanserum bereit, das mit einem speziellen Verfahren gewonnen wird, um aktives Komplement<br />
zu konservieren (Produkt-Nr. A113 5,0 ml oder A112 2,5 ml). Dieses Humanserum ist auf infektiöse Erkrankungen,<br />
Marker für Komplementaktivierung und CH50 getestet. Nach der Testung muss Probenstabilisator (QUIDEL A9576) zu den<br />
Plasma-/Blutproben zugegeben werden, um eine weitere Komplementaktivierung zu unterbinden.<br />
2. Kontrollen<br />
Es müssen immer ausreichend viele Kontrollen und Referenzmaterialien für das jeweilige experimentelle Testsystem mitgeführt<br />
werden. Die meisten Testkits enthalten interne Kontrollen und St<strong>and</strong>ardlösungen. Die Komplementaktivierung findet<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
dem eingesetzten Volumen (Serum, Plasma, Blut) eine sehr entscheidende Größe dar und ist zur St<strong>and</strong>ardisierung des<br />
Testsystems unabdingbar.<br />
Zusätzlich zu den Kontrollen, die mit dem Testkit zur Verfügung gestellt werden, sollten folgende Versuchskontrollen<br />
(KONTROLLE) in Betracht gezogen werden:<br />
KONTROLLE 1 Hintergrund: nur Serumquelle<br />
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KONTROLLE 2 Positivkontrolle: Serum + Aktivator im Versuchsprotokoll<br />
bestätigt die Komplementaktivität und weist starkes positives Signal nach<br />
KONTROLLE 3 Negativkontrolle: Serum + Inhibitor (EDTA)<br />
Negativkontrollen zeigen eine direkte Störung im Assay an<br />
KONTROLLE 4 Pufferkontrolle (NEG): Puffer, der die Therapeutika enthält<br />
bestätigt, dass Puffer nicht störend einwirkt<br />
Aktivator – Da das gesamte H<strong>and</strong>ling der Proben nie gänzlich ohne artifizielle Aktivierungen möglich ist, kann mit Hilfe der<br />
Kontrollproben die Hintergrundaktivierung quantifiziert und dann in Relation zu den Testproben gesetzt werden. Basierend<br />
auf den Versuchsbedingungen kann entschieden werden, welcher Aktivator als Positivkontrolle eingesetzt wird.<br />
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Kontrollproben die Hintergrundaktivierung quantifiziert und dann in Relation zu den Testproben gesetzt werden. Basierend<br />
auf den Versuchsbedingungen kann entschieden werden, welcher Aktivator als Positivkontrolle eingesetzt wird.<br />
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Aktivator des alternativen Komplementweges – iC3b - C3a - C5a - SC5b-9 - Bb<br />
������������������������������������������������������������������������<br />
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wirkt direkt auf C3 ein und ist ein außerordentlich potenter Aktivator, um das Komplementsystem vollständig zu<br />
aktivieren.<br />
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ähnlich ist.<br />
Es gilt zu beachten, dass es in Inhibitionsexperimenten bei dem Titrieren eines Aktivators schwierig ist, die richtige Balance<br />
zwischen Aktivierung und Inhibition zu finden, wenn CVF verwendet wird. In diesem Fall stellt HAGG die bessere<br />
Alternative dar.<br />
Die Temperatur�������������������������������������������������������������������������������������������������tem<br />
generiert werden (z. B. “nephritische” Faktoren), zu kontrollieren, ist eine Probe jeder Kontrolle (KONT 1-4) auf Eis zu<br />
lagern.<br />
3. Material oder Therapeutikum<br />
��������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Therapeutikums/Biomaterials sind von großer Bedeutung.
5.1 Experimentelles Design<br />
Versuchsanordnung nur mit Kontrollen<br />
bei 37 °C inkubieren<br />
Aliquote in 15-min-Intervallen auf Eis legen<br />
Abbildung 10<br />
1:2 mit Probenstabilisator<br />
verdünnen<br />
bei -80 °C einfrieren<br />
oder im Assay bestimmen<br />
Versuchsanordnung mit Testmaterial<br />
Therapeutikum<br />
unterschiedliche Konzentrationen<br />
Therapeutikum in<br />
unterschiedlichen<br />
Kozentrationen<br />
auf Eis<br />
1:2 mit Probenstabilisator<br />
verdünnen<br />
Bei -80 °C einfrieren<br />
oder im Assay<br />
bestimmen<br />
Abbildung 11<br />
Bei 37 °C inkubieren<br />
Aliquote in 15-min-<br />
Intervallen auf Eis<br />
legen<br />
1:2 mit Probenstabilisator<br />
verdünnen<br />
Bei -80 °C einfrieren<br />
oder im Assay<br />
bestimmen<br />
Normales humanes<br />
Komplementserum A113<br />
Kontrollen<br />
1 – 4<br />
Normales humanes<br />
Komplementserum A113<br />
Gegebenenfalls sind zusätzliche<br />
Kontrollen zu verwenden<br />
Kontrolle 1 – 4<br />
auf Eis<br />
1:2 mit Probenstabilisator<br />
verdünnen<br />
Option 1<br />
1 Aliquot jeder Kontrolle mit<br />
Probenstabilisator in 15-min-Intervallen<br />
verdünnen<br />
Option 2<br />
Kontrollen mit Probenstabilisator im<br />
letzten Zeitintervall verdünnen<br />
bei -80 °C einfrieren<br />
oder mit Assay bestimmen<br />
Bei 37 °C inkubieren<br />
Aliquote in 15-min-<br />
Intervallen auf Eis<br />
legen<br />
1:2 mit Probenstabilisator<br />
verdünnen<br />
Bei -80 °C einfrieren<br />
oder im Assay<br />
bestimmen<br />
Kontrollen 1–4<br />
Kontrolle 1–4<br />
auf Eis<br />
1:2 mit Probenstabilisator<br />
verdünnen<br />
Bei -80 °C einfrieren<br />
oder im Assay<br />
bestimmen<br />
17
18<br />
5.2 Versuchsanordnung<br />
Siehe auch Algorithmus für die Testung der Komplement-Biokompatibilität<br />
Seite 16<br />
Komplementquelle<br />
�����������������������������������������<br />
����������������������������������������������������������������<br />
������������<br />
Therapeutika<br />
���������������������������������������������<br />
Kontrollen<br />
Aktivator HAGG (A114) für Positivkontrolle 2:<br />
��������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Aktivator CVF (A600) für Positivkontrolle 2:<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
bei 37 °C<br />
Aktivator Zymosan für Positivkontrolle:<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Inhibitor für Negativkontrolle 3:<br />
�������������������������������<br />
Ein Aliquot von allen Kontrollen auf Eis legen = Hintergrundaktivierung<br />
Inkubation<br />
�����������<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
(um Komplementreaktion zu blockieren)<br />
Zeitpunkte<br />
��15 – 30 – 45 – 60 – 120 – 240 Minuten<br />
Assays (Testkits)<br />
Assay:<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������������������������������������������������<br />
�������������������������������������������������������<br />
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Optimierung des Protokolls<br />
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Auswertung der Ergebnisse – Kontrollen<br />
KONTROLLE 1 Hintergrund: nur Serumquelle<br />
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kontrollblatt angegeben<br />
KONTROLLE 2 Positive control: Serum + activator in the experimental protocol<br />
Bestätigt Komplementaktivität und zeigt starkes positives Signal auf<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
KONTROLLE 3 Negativkontrolle: Serum + Inhibitor (EDTA)<br />
Negativkontrollen zeigen direkte Beeinträchtigungen des Assays<br />
����������������������������������������������������������������������<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
KONTROLLE 4 Pufferkontrolle (NEG): Puffer, der die Therapeutika enthält<br />
Bestätigt, dass Puffer (Therapeutika) nicht störend einwirkt<br />
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�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Protokollbeispiele für die Versuchsanordnung zur Messung der Komplementaktivierung<br />
verschiedener Biomaterialien sind über erhältlich.<br />
19
20<br />
In-vivo- / In-vitro-Testung<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
�������������������������������������������������������������������<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
eine Komplementreaktion/-aktivierung stattfinden wird<br />
����������������������������������������������������������������������������<br />
· Blutentnahme (Patienten ohne Therapie)<br />
· Serum bei -80 °C lagern<br />
· Diese Seren als Komplementquelle für die Testung verwenden<br />
· Therapeutikum in unterschiedlichen Konzentrationen zu den Seren der einzelnen Patienten hinzugeben<br />
· Nach dem Protokoll Ablaufplan für Schnellbewertung Seite 17 vorgehen<br />
· Auf Komplementfaktoren C3a/iC3b/SC5b-9/C5a/C4d/Bb testen<br />
�����������������������������<br />
· Serumproben von Primaten gewinnen und auf Komplementfaktoren<br />
C3a/iC3b/SC5b-9/C5a/C4d/Bb testen<br />
· Therapeutikum Primaten verabreichen (möglicherweise in unterschiedlichen Konzentrationen) Serum<br />
an unterschiedlichen Zeitpunkten gewinnen und die Komplementaktivierung direkt im Serum messen –<br />
C3a/iC3b/SC5b-9/C5a/C4d/Bb<br />
Probentypen und Methoden für Präklinische/Klinische Testung<br />
Probentypen:<br />
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�����������������������������������������<br />
���������������������������������������������������<br />
Methoden:<br />
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- Western Blot<br />
- RID<br />
- FACS<br />
- IHC<br />
Beispiele für die Testung<br />
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�������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������<br />
������������������������������������<br />
Methylation of the phosphate oxygen moiety of phospholipid-methoxy (polyethylene glycol) conjugate prevents<br />
PEGylated liposome-mediated complement activation <strong>and</strong> anaphylatoxin production, Moghimi et al., The FASEB<br />
Journal, Vol. 20 December 2006<br />
��������������������������������������������<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Loop Model, Paul, Wendel et al., <strong>Clinical</strong> Application Thromb Hemost, December 2008
Beispiele für Komplementanalysen<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0<br />
C5a [μg/l]<br />
1 5 10 20 30 60 120<br />
Bioactive<br />
Biopassive<br />
Uncoated<br />
Abbildung 12:<br />
Zeitlicher Verlauf (0 bis 120 min) der Komplementaktivierung, quantifiziert mittels ELISA C5a in einem Herz-Lungen-Maschinen-Modell mit zwei unterschiedlichen<br />
Oberflächenmodifikationen von Oxygenatoren gegen eine unbeschichtete Kontrollgruppe [11].<br />
Abbildung 13:<br />
Aktivierungspotenzial (SC5b-9) unterschiedlicher Oberflächenbeschichtungen auf Edelstahl (Stentmaterial), getestet über eine Stunde in einem Ch<strong>and</strong>ler-<br />
Loop-Modell mit frischem Humanblut.<br />
21
22<br />
Beispiele für Komplementanalysen<br />
Abbildung 14:<br />
Aktivierungspotenzial (SC5b-9) unterschiedlicher Oberflächenstrukturen und –modifikationen auf Titan (Dentalimplantat) versus Referenz (PVC), getestet über<br />
eine Stunde in einem Ch<strong>and</strong>ler-Loop-Modell mit frischem Humanblut.<br />
Konzentration (ng/ml)<br />
Zeit (min)<br />
Abbildung 15:<br />
Komplementaktivierung C3a, C5a und SC5b-9 von Biomaterial in einem Ch<strong>and</strong>ler-Loop-Modell.
6. Messung der Komplementaktivierung in Seren von<br />
Nicht-Primaten mittels hämolytischem Assay – CxH50<br />
In der Komplementforschung wird die Verfügbarkeit von Methoden zur direkten Bewertung der Komplementaktivierung in<br />
nicht-humanen Modellen selten angesprochen. Um Komplement in nicht-humanen Modellen zu untersuchen, muss daher<br />
der Nachweis der Komplementaktivierung indirekt über einen hämolytischen Assay wie beispielsweise CH50 erfolgen. Der<br />
traditionelle CH50 misst die gesamthämolytische Komplementaktivität auf der Basis der Fähigkeit des Komplementsystems,<br />
sensibilisierte rote Blutkörperchen des Schafes zu lysieren. Der CH50-Assay spiegelt die Fähigkeit des Komplements in<br />
einer Probe zu aktivieren; je stärker die Aktivierung, desto höher das CH50-Signal. Dieses Signal steht jedoch nicht für<br />
eine direkte Messung der Komplementaktivierung.<br />
Nachteile des CH50 als Technik für die Messung der Komplementaktivierung:<br />
��������������������������������������������������������������<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
was zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann. Diese Empfindlichkeit tritt bei direkten Messungen seltener auf.<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Fluktuation manifestiert sich als niedriger CH50-Wert und schwacher Komplementaktivierung. Dies erschwert die Verwendung<br />
nicht-humaner Modelle, wo die Konzentrationen der Komplementproteine sich sehr von denen des Menschen<br />
unterscheiden können.<br />
CxH50<br />
Der traditionelle Hämolysetest kann durch die Fokussierung auf ein einziges Protein eine höhere Spezifität erhalten. Dieser<br />
Assay, der sogenannte CxH50, weist die funktionale Aktivität einer spezifischen Komplementkomponente (z. B. C3H50<br />
für die C3-Funktion) nach. Die Methode setzt spezifische Komplement depletierte Seren als Quelle von Komplementproteinen<br />
ein. Eine Testprobe kann das spezifisch depletierte Protein in der Testmatrix wieder einsetzen und dadurch die<br />
Komplementaktivierung wiederherstellen. Daher hängt die gesamte Lyse des Erythrozyten (minus Hintergrundlyse von<br />
depletiertem Serum und Erythrozyten) von dem spezifischen Komplementprotein aus der Testprobe ab. Studien haben<br />
gezeigt, dass nicht-humanes Serum dazu dienen kann, das depletierte Protein zu ersetzen und die Komplementfunktion<br />
wiederherzustellen.<br />
CXH50 steht in vielen Testsystemen wie den Folgenden zur Verfügung:<br />
������������<br />
������������<br />
������������<br />
������������<br />
���������������<br />
Abbildung 16:<br />
CxH50-Assay. Ein depletiertes Serum (z. B. C3) wird als Hauptkomplementquelle, der ein Komplementprotein fehlt, verwendet. Durch das Hinzufügen einer<br />
Testprobe wird das fehlende Protein bereitgestellt und dadurch die Komplementaktivität, die durch die Lyse der Erythrozyten gemessen werden kann, wiederhergestellt.<br />
Beispiel: C3H50-Assay<br />
Durch die Rekonstitution des lytischen Potenzials eines C3-depletierten Humanserums mit C3 einer nicht-humanen Spezies<br />
stellt der Test eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung der Komplementaktivität, durch C3-Verbrauch,<br />
in Nicht-Primaten-Spezies bereit, für die Direct-Capture-Assays nicht vorh<strong>and</strong>en sind. Diese Methode bietet eine Reihe<br />
von Vorteilen:<br />
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����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Quelle (der terminale Weg nicht-humaner Seren kann sehr unterschiedlich sein).<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Gegensatz zur nicht-humanen klassischen Aktivierung gut charakterisiert und dokumentiert ist. Beispielsweise weist<br />
besonders Komplement von Ratten und Mäusen eine äußerst niedrige Affinität für Erythrozyten auf.<br />
Die folgenden Experimente wurden von DeSautel et al. 1999 adaptiert und gemeinsam mit QUIDEL Corp. durchgeführt.<br />
23
24<br />
6.1 Experimentelles Design CxH50<br />
Beispiel C3H50 Assay<br />
BENÖTIGTE MATERIALIEN<br />
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������������������������������������<br />
�������������������������������������������������������<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
in Gelatine-Veronal-Puffer oder HEPES 20 mM mit 20 mM CaCl und 20 mM MgCl (GVB++)<br />
���������������������������������������������������<br />
�� 1. Schritt: Optimale Verdünnung von normalem Tierserum genau bestimmen<br />
· Verdünnung von normalem, nicht beh<strong>and</strong>eltem Tierserum 1:10 – 1:10 6<br />
· Verdünnung von normalen Human Complement St<strong>and</strong>ard 1:10 – 1:10 6<br />
· GVB++ in alle Röhrchen hinzugeben<br />
· Die verdünnten Proben in GVB++-Puffer pipettieren<br />
������������������������������������������������������������������������<br />
· Eine Probe von jeder Verdünnung ohne C3 Depleted Serum<br />
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���������������������������<br />
������������������������������������������������������������������������<br />
Serum sollte bis zur Verwendung bei -70 °C gelagert werden.<br />
Alle Teströhrchen während des Pipettierens auf Eis und alle<br />
Teströhrchen zusammen transferieren für die 37 °C Inkubation.<br />
Test: in 345 μl kaltes GVB++ 10 μl C3<br />
dpl, 120 μl Ea und 25 μl verdünntes<br />
NRS hinzugeben<br />
Positiv: 380 μl entionisiertes oder<br />
steriles Wasser zu 120 μl Ea zugeben<br />
Abbildung 17<br />
Ea in eiskaltem GVB++ zubereiten<br />
Verdünnungen des NRS von 1:10<br />
bis 1:1^06 zubereiten<br />
Referenz: Zu 345 μl kaltem GVB++<br />
10 μl C3 dpl, 120 μl Ea und 25 μl<br />
verdünnte Humansera (A100)<br />
hinzugeben<br />
Hintergrund: zu 355 μl kaltem<br />
GVB++ 120 μl Ea und 25 μl NRS<br />
(kein C3 dpl) hinzugeben<br />
Alle Teströhrchen mischen und bei<br />
37 °C 30 Minuten inkubieren. Mit<br />
2000 rpm bei 4 °C 10 Minuten<br />
zentrifugieren. Die Ergebnisse bei<br />
540 nm ablesen und eintragen
C3H50 Assay<br />
���2. Schritt: Serum von beh<strong>and</strong>elten Versuchstieren<br />
· Die optimale Verdünnung, die im 1. Schritt ermittelt wurde, verwenden<br />
· Kontrolle: Serum von nicht beh<strong>and</strong>elten Versuchstieren<br />
· Kontrolle: Serum von Versuchstieren, die mit CVF beh<strong>and</strong>elt wurden<br />
���������<br />
· Proben (verdünnt) vor und nach Beh<strong>and</strong>lung direkt vergleichen<br />
Bestimmung von C3H50<br />
��������������������������������������������������������������������<br />
normale unaktivierte Kontrolle (100 %) bei optimaler Verdünnung gemessen.<br />
��������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������������������������������������������������������<br />
der optimalen Verdünnung erstellt werden.<br />
Abbildung 18:<br />
Die Proben 1 und 3 weisen einen hohen Grad einer Komplementaktivierung auf.<br />
Schlussfolgerung<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������<br />
· Im Unterschied zum St<strong>and</strong>ard-CH50-Verfahren, das die gesamte Komplementaktivierung misst, ist C3H50 spezifisch<br />
für die Spaltung und Funktion von C3.<br />
� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
die Testergebnisse in keinem signifikanten Maß.<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
sich in zweifacher Weise:<br />
· Er ist spezifisch für ein einziges Schlüsselprotein, in diesem Fall C3, und ist daher ein sensitiver Assay für die Komplementaktivierung.<br />
· Er beruht auf einem charakterisierten und hoch funktionellen St<strong>and</strong>ardreagenz (C3 Depleted Serum) als Komplementquelle<br />
und nicht auf einem Serum mit unbekanntem lytischen Potenzial (Tierserum).<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
In ähnlicher Weise wurden <strong>and</strong>ere humane depletierte Seren (unter <strong>and</strong>erem C1q, C5, C4, C2 und Faktor B) eingesetzt,<br />
um eine spezifische Komplementaktivierung in <strong>and</strong>eren Spezies zu bestimmen. Eine Änderung der optimalen Verdünnung<br />
ist möglich.<br />
25
26<br />
7. Literaturhinweise<br />
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A flow cytometric immunoassay to quantify adsorption<br />
of complement activation products (iC3b, C3d, SC5b-9)<br />
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A soluble chimeric complement inhibitory protein that<br />
possesses both DAF <strong>and</strong> Factor I cofactor activities.<br />
J. Immunol. 158: 2872 – 2881
8. Komplement- und Biokompatibilität Produkte<br />
8.1 Komplement ELISA Kits<br />
CIC-C1q ��������� Quidel ®<br />
Quantifizierung zirkulierender Immunkomplexe<br />
Kat.-Nr.: A001<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich:�� ���������������<br />
Sensitivität:� ������������<br />
Inkubationszeit: 2 Stunden<br />
Probenmenge: � ����������������������<br />
Probentyp: Serum und Plasma<br />
Probenvorbereitung: Proben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und nicht hitzeinaktiviert werden.<br />
Probe kann über einen Zeitraum bis zu 7 Tagen gekühlt (2 – 8 °C) gelagert werden. Bei längerer<br />
Lagerung sollte die Probe bei mindestens -20 °C eingefroren werden.<br />
Referenzwerte: Seren von 106 normalen, asymptomatischen Prob<strong>and</strong>en wurden gesammelt. Der Mittelwert der<br />
���������������������������������������������������<br />
Spezifität: Komplement-CICs werden an immobilisierte C1q-Proteine gebunden.<br />
Spezies: Human<br />
/FDA<br />
Anwendung:<br />
Der CIC-C1q Assay dient dem Nachweis von Immunkomplexen (CIC) in menschlichem Serum oder Plasma. Zirkulierende<br />
Immunkomplexe werden bei unterschiedlichen Erkrankungen nachgewiesen: Infektionen, Autoimmunkrankheiten, Trauma<br />
und neoplastischen proliferativen Erkrankungen. Zudem kann die Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe bei<br />
der Bewertung bestimmter Formen der rheumatoiden Arthritis und bei der Überwachung der Therapiewirksamkeit eine<br />
wichtige Rolle spielen.<br />
CIC Kontrolle<br />
Kat.-Nr.: A013<br />
1 Set (2 verschiedene Konzentrationen)<br />
27
28<br />
CIC-C3d ��������� Quidel ®<br />
Raji-Cell-Replacement<br />
Quantifizierung zirkulierender Immunkomplexe mit C3-Aktivierungsfragmenten<br />
Kat.-Nr.: A002<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich:� ���������������<br />
Sensitivität:�� ����������<br />
Inkubationszeit: 2 Stunden<br />
Probenmenge: � ����������������������<br />
Probentyp: Serum und Plasma<br />
Probenvorbereitung: Proben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und nicht hitzeinaktiviert werden. Sie<br />
können bis zu 6 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei<br />
mindestens -70 °C eingefroren werden.<br />
Referenzwerte:�� ����������������������<br />
���������������������<br />
Spezifität: Immobilisierte monoklonale Humanantikörper gegen C3-Fragmente binden C3d-enthaltende<br />
Immunkomplexe.<br />
Spezies: Human<br />
/FDA<br />
Anwendung:<br />
Der CIC-RCR Assay dient dem Nachweis von Immunkomplexen (CIC) in menschlichem Serum oder Plasma. Zirkulierende<br />
Immunkomplexe werden bei unterschiedlichen Erkrankungen nachgewiesen: Infektionen, Autoimmunkrankheiten,<br />
Trauma und neoplastischen proliferativen Erkrankungen. Zudem kann die Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe bei<br />
der Bewertung bestimmter Formen der rheumatoiden Arthritis und bei der Überwachung der Therapiewirksamkeit eine<br />
wichtige Rolle spielen.
C1-Inhibitor ��������� Quidel ®<br />
Funktionelle C1-Inhibitor-Proteine<br />
Kat.-Nr.: A003<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich: Konzentrationen des funktionellen C1-INH werden als Prozentsatz des Mittelwertes angegeben.<br />
Der Bereich des Tests ist 35 - 100 %.<br />
Sensitivität:�� ����������<br />
Inkubationszeit: 2 Stunden<br />
Probenmenge: � �����������������������<br />
Probentyp: Serum und Plasma<br />
Probenvorbereitung: Proben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen werden. Bei Raumtemperatur<br />
(15 – 30 °C) können Serumproben nicht länger als 6 Stunden, EDTA-Plasmaproben bis zu 24<br />
Stunden gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollten die Proben bei mindestens -20 °C<br />
eingefroren werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden.<br />
Referenzwerte: Werte ≥ 68 % des mittleren Normalwerts werden als normal betrachtet.<br />
Spezifität: C1-INH-Reaktant, bindet spezifisch an funktionell aktiven C1-INH.<br />
Spezies: Human<br />
/FDA<br />
Anwendung:<br />
Der C1-Inhibitor Assay dient der Bestimmung funktioneller C1-Inhibitor-Proteine (C1-INH) in menschlichem Plasma oder<br />
Serum. Dieser Proteaseinhibitor erfüllt enzymregulierende Aufgaben. Ein Mangel an funktionell aktivem C1-INH kann zu<br />
lebensbedrohlichen Angioödemen führen. Man unterscheidet zwei Hauptformen des C1-INH-Mangels: die angeborene<br />
Form, das hereditäre Angioödem (HAE), und die erworbene Form, die mit einer Vielzahl von Krankheiten, wie z. B. malignen<br />
Erkrankungen der Lymphozyten, in Zusammenhang steht. Hereditäre Angioödeme werden von transitorischen, aber<br />
rezividierenden, anfallartig ablaufenden nicht pruritischen Schwellungen begleitet, die verschiedene Gewebe des Körpers<br />
betreffen können.<br />
29
30<br />
iC3b ��������� Quidel ®<br />
Quantifizierung zirkulierender Immunkomplexe mit C3-Aktivierungsfragmenten<br />
Kat.-Nr.: A006<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich:� ���������������<br />
Inkubationszeit: 1,5 Stunden<br />
Probenmenge: � ����������������������������������������������������������������<br />
Probentyp: Serum und Plasma<br />
Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme und Lagerung ist unbedingt erforderlich, da C3 höchst empfindlich<br />
für Proteolyse und Hydrolyse ist. Serum oder EDTA-Plasmaproben sollten unter keimfreien<br />
Bedingungen entnommen und sofort getestet oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden.<br />
Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei mindestens -70 °C innerhalb von 2 Stunden nach<br />
Blutentnahme eingefroren werden.<br />
Spezifität: Anti-iC3b monoklonaler Antikörper, bindet spezifisch an iC3B und nicht an C3.<br />
Spezies: Human<br />
Anwendung:<br />
Der iC3b Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung der iC3b-Fragmente in menschlichem Plasma und<br />
Serum sowie in <strong>and</strong>eren biologischen Flüssigkeiten, experimentellen Proben oder Gemischen.<br />
Bei einigen Patienten mit immunkomplexbedingten Krankheiten wie beispielsweise rheumatoider Arthritis und systemischem<br />
Lupus erythematodes kann der iC3b-Spiegel signifikant erhöht sein. Erhöhte iC3b-Konzentrationen können auch<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
respiratorischen Distress-Syndrom auftreten.
Bb Plus ��������� Quidel ®<br />
Bb-Fragment des Faktors B des alternativen Komplementwegs<br />
/FDA<br />
Kat.-Nr.: A027<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich:�� �����������������<br />
Sensitivität:�� �����������<br />
Inkubationszeit: 1,5 Stunden<br />
Probenmenge: � �������������������������������������������������<br />
Probentyp: Serum und Plasma<br />
Probenvorbereitung: Proben sollten sofort getestet oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung<br />
sind die Proben bei -70 °C innerhalb von 2 Stunden nach Blutentnahme einzufrieren.<br />
Referenzwerte:�� ������������������������������+2 SD)<br />
� ����������������������������+2 SD)<br />
Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch an Bb.<br />
Spezies: Human, Cynomolgus-Makake, Pavian, Rhesusaffe<br />
Anwendung:<br />
Der Bb-Fragment Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung des Komplementfragments Bb, einem Aktivierungsfragment<br />
des Faktors B, in menschlichem Plasma und Serum sowie in <strong>and</strong>eren biologischen Flüssigkeiten, experimentellen<br />
Proben oder Gemischen. Die Messung erlaubt eine quantitative Beurteilung über das Ausmaß der Aktivierung<br />
des alternativen Komplementweges in der Probe und sie ist hilfreich für die Diagnose verschiedener Nierenerkrankungen<br />
(z. B. chronische Glomerulonephritis, Lupusnephritis) sowie mehrerer Hauterkrankungen (z. B. Dermatitis herpetiformis<br />
und Pemphigus vulgaris). Die Aktivierung des alternativen Komplementweges wurde auch bei rheumatoider Arthritis,<br />
Sichelzellanämie und Gram-negativen bakteriellen Infektionen beobachtet.<br />
31
32<br />
C4d ��������� Quidel ®<br />
Quantifizierung der C4d-enthaltenden Fragmente des aktivierten C4 des klassischen Komplementwegs<br />
Kat.-Nr.: A008<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich:�� ������������������<br />
Sensitivität:�� �����������<br />
Inkubationszeit: 1,5 Stunden<br />
Probenmenge: � �����������������������������������������<br />
Probentyp: Serum, EDTA-Plasma oder <strong>and</strong>ere biologische Flüssigkeiten<br />
Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme ist unbedingt erforderlich, da C4d höchst empfindlich für Proteolyse<br />
ist. Serum und Plasma sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und sofort<br />
getestet oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollte die Probe<br />
bei -70 °C innerhalb von 2 Stunden nach Probeentnahme eingefroren werden.<br />
Referenzwerte:�� ���������������������������������+2SD)<br />
� ��������������������������+2SD)<br />
Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch C4d.<br />
Spezies: Human, Cynomolgus-Makake, Pavian, Rhesusaffe<br />
/FDA<br />
Anwendung:<br />
Der C4d-Fragment Enzymimmunoassay dient der Konzentrationsbestimmung C4d-haltiger Aktivierungsfragmente von<br />
C4 (C4b, iC4b und C4d) in menschlichem Serum, EDTA-Plasma sowie in <strong>and</strong>eren biologischen Flüssigkeiten und experimentellen<br />
Proben.<br />
Die für endogenes C4 normalisierten C4d-Konzentrationen können in Plasmaproben von Patienten, die an rheumatoider<br />
Arthritis, hereditärem Angioödem, systemischem Lupus erythematodes und <strong>and</strong>eren Krankheiten leiden, deutlich erhöht<br />
��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
eine nach dem klassischen Weg ablaufende Aktivierung stattgefunden hat, z. B. bei Patienten mit unterschiedlichen humoralen<br />
Autoimmunerkrankungen, Septikämie, thermischer Verletzung, Multiorgantrauma, Myokardinfarkt, hereditärem<br />
Angioödem, Glomerulonephritis und akutem respiratorischen Distress-Syndrom.
SC5b-9 Plus ��������� Quidel ®<br />
Quantifizierung des SC5b-9-Komplexes<br />
Kat.-Nr.: A029<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich: 10 – 170 ng/ml<br />
Sensitivität: 8,8 ng/ml<br />
Inkubationszeit: 2 Stunden<br />
Probenmenge: � ����������������������������������������������������<br />
Probentyp:�� �������������������������������������������������������������������������������<br />
Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme und –lagerung ist unbedingt erforderlich, da sich SC5b-9 in unsachgemäß<br />
beh<strong>and</strong>elten Proben bilden kann.<br />
Serum und EDTA-Plasma sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und sofort getestet<br />
oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei<br />
-70 °C eingefroren werden. Plasmakonzentrationen spiegeln die In-vivo-Konzentrationen besser<br />
wider als Serumkonzentrationen.<br />
Referenzwerte: Serum 334 – 1672 ng/ml<br />
EDTA Plasma 127 – 303 ng/ml<br />
Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch SC5b-9<br />
Spezies: Human, Cynomolgus-Makake, Pavian, Rhesusaffe<br />
Anwendung:<br />
Der SC5b-9 Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung des SC5b-Komplexes in menschlichem Serum und<br />
Plasma sowie in <strong>and</strong>eren biologischen Flüssigkeiten und experimentellen Proben.<br />
Der terminale Komplementkomplex (TCC, SC5b-9) wird durch die Zusammenlagerung von C5 bis C9 infolge der Aktivierung<br />
des Komplementsystems entweder über den klassischen, Lektin- oder den alternativen Weg gebildet. Der Membranangriffskomplex<br />
(MAC), eine Form des TCC, ist ein stabiler Komplex, der den irreversiblen Schaden an Zielzellmembranen,<br />
der mit der Komplementaktivierung einhergeht, vermittelt.<br />
33
34<br />
C3a Plus ��������� Quidel ®<br />
Quantifizierung des C3a-Fragments<br />
Kat.-Nr.: A032<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich: 0,05 – 5 ng/ml<br />
Sensitivität: 0,023 ng/ml<br />
Inkubationszeit: 2 hours 15 minutes<br />
Probenmenge: � ����������������������������������������������������<br />
Probentyp:�� ������������������������������������������������������������������������������<br />
Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme ist unbedingt erforderlich, um eine C3a-Bildung in der Probe zu<br />
vermeiden. Für Plasma Dinatrium-EDTA als Antikoagulanz verwenden und bei 2000xg und<br />
2 – 8 °C zentrifugieren. Sofort testen oder bis zu 4 Stunden auf Eis lagern. Bei längerer<br />
Lagerung sollte die Probe bei -70 °C mit Stabilisierungslösung eingefroren werden.<br />
Referenzwerte: Serum 71,0 – 589,2 ng/ml<br />
EDTA Plasma 33,5 – 268,1 ng/ml<br />
Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch C3a des-Arg.<br />
Spezies: Human, Cynomolgus-Makake, Pavian, Rhesusaffe, Schwein<br />
Anwendung:<br />
Der C3a Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung von C3a des-Arg in menschlichem EDTA-Plasma, Serum<br />
sowie <strong>and</strong>eren experimentellen Proben.<br />
Unter normalen Bedingungen führt die Aktivierung des klassischen, alternativen oder Lektin-Weges zur Bildung der C3-<br />
Konvertase, einem Enzym, das fähig ist, C3 in C3a und C3b zu spalten. C3a ist ein niedermolekulares Proteinfragment<br />
(etwa 9 kD), das aus 77 Aminosäuren besteht. C3a wird durch das Serumenzym Carboxypeptidase N rasch zu der stabileren<br />
76-Aminosäuren-Form C3a des-Arg metabolisiert. Die Quantifizierung von C3a des-Arg ermöglicht es, zuverlässige<br />
Rückschlüsse in Bezug auf die Komplementaktivierung in der Probe zu ziehen.
C5a ��������� Quidel ®<br />
Messung der Aktivierung des terminalen Komplementwegs in experimentellen Proben<br />
Kat.-Nr.: A025<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich: 0,1 – 1 ng/ml<br />
Sensitivität: 0,050 ng/ml<br />
Inkubationszeit: 2 Stunden 15 Minuten<br />
Probenmenge: � �������������������������������������������������<br />
Probentyp:� ������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Probenvorbereitung: Die korrekte Abnahme, Lagerung und der vorschriftsmäßige Vers<strong>and</strong> der Proben sind unbedingt<br />
erforderlich. Sofort testen oder bis zu 4 Stunden bei 2 – 8°C oder auf Eis lagern. Bei längerer<br />
Lagerung sollten die Proben bei -70 °C mit Stabilisierungslösung (Kat.-Nr. A9576) eingefroren<br />
werden. Proben mit Stabilisator 1:1 verdünnen.<br />
Referenzwerte: EDTA Plasma 0,37 – 74,33 ng/ml<br />
Serum 13,31 – 179,23 ng/ml<br />
Spezifität: C5a und C5a des-Arg<br />
Spezies: Human<br />
Anwendung:<br />
C5a entsteht durch die Spaltung des terminalen Komplementproteins C5 während der Aktivierung des Komplementsystems<br />
über den klassischen, alternativen oder den Lektin-Weg. C5a ist ein niedermolekulares Proteinfragment (etwa 9 kD), das<br />
aus 74 Aminosäuren besteht. C5a wird durch das Serumenzym Carboxypeptidase rasch in die stabilere, weniger aktive<br />
73-Aminosäuren-Form C5a des-Arg gespalten.<br />
In Forschungsarbeiten werden erhöhte C5a-Konzentrationen in Flüssigphase und adsorbiertem Zust<strong>and</strong> mit Hämoinkompatibilität<br />
einiger Biomaterialien, insbesondere in extrakorporalen Kreisläufen assoziiert. C5a-Konzentrationen werden auch<br />
mit der Pathogenese verschiedener Krankheitszustände wie Myokardinfarkt, Schlaganfall sowie Vascular Leak Syndrome<br />
(VLS) und assoziierter Nierenschädigung in Zusammenhang gebracht. Die Rolle des C5a bei der Krankheitsentwicklung<br />
von Malaria und <strong>and</strong>eren Infektionskrankheiten sowie Sepsis ist gleichfalls gut dokumentiert.<br />
35
36<br />
CH50 Eq ��������� Quidel ®<br />
Gesamtaktivität des klassischen Komplementwegs<br />
/FDA<br />
Kat.-Nr.: A018<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich: circa 0 - 300 U Eq/ml<br />
Inkubationszeit: 3,5 Stunden<br />
Probenmenge: � ����������������������<br />
Probentyp: NUR Serum. Plasma KANN NICHT verwendet werden.<br />
Probenvorbereitung: Die korrekte Abnahme, Lagerung und der vorschriftsmäßige Vers<strong>and</strong> der Proben sind unbedingt<br />
erforderlich, da Komplement in unsachgemäß geh<strong>and</strong>habten Proben aktiviert werden kann. Sofort<br />
testen oder bis zu 4 Stunden auf Eis lagern. Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei -70 °C<br />
eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.<br />
Referenzwerte: 133 ± 54 U Eq/ml<br />
Spezifität: Der monoklonaler Antikörper bindet spezifisch an terminale Komplementkomplexe, die während<br />
der Aktivierungsstufe des Tests entstehen.<br />
Spezies: Human, Cynomolgus-Makake<br />
Anwendung:<br />
Die Bindung der C1q-Komponente von C1 an Immunkomplexe löst den klassischen Komplementweg aus. Die Aktivierung<br />
führt zu einer Kaskade enzymatischer und nicht-enzymatischer Reaktionen, die schließlich in der Bildung des terminalen<br />
Komplementkomplexes (TCC) gipfelt. Unter St<strong>and</strong>ardbedingungen ist die Konzentration an TCC, das in Serum gebildet<br />
werden kann, ein quantitativer Ausdruck der gesamten klassischen Komplementaktivität im Serum. Der MicroVue CH50<br />
Eq Enzymimmunoassay dient zur Messung der gesamthämolytischen Aktivität des klassischen Komplementwegs in<br />
menschlichen Serumproben. Auch ein Mangel an einem oder mehreren Komplementfaktoren (C1 bis C9) kann durch die<br />
Messung von CH50 nachgewiesen werden.
Ba ��������� Quidel ®<br />
Quantifizierung des Ba-Fragments<br />
Kat.-Nr.: A034<br />
Tests: 96<br />
Methode: ELISA<br />
Bereich: 0,05 – 2,1 ng/ml<br />
Sensitivität: Obere Bestimmungsgrenze: 3,239 ng/mL<br />
Untere Bestimmungsgrenze: 0,033 ng/mL<br />
Nachweisgrenze: 0,011 ng/mL<br />
Inkubationszeit: 3 Stunden<br />
Probenmenge: � ���������������������������������������������������������������������������<br />
Probentyp: EDTA-Plasma, Serum, Urin<br />
Probenvorbereitung: Serum / Plasma:<br />
Das Ba-Fragment des Faktors B ist empfindlich gegenüber Proteolyse. Um optimale Ergebnisse mit<br />
Plasma zu erzielen, sollte K2 EDTA verwendet werden. Die Blutprobe abnehmen und unverzüglich<br />
bei 2 – 8 °C zentrifugieren. Sofort testen, nicht länger als 2 Stunden bei 2 – 8 °C aufbewahren.<br />
Eine längere Lagerung kann bei -70 °C erfolgen.<br />
Urin: Ersten oder zweiten Morgenurin ohne Konservierungsmittel vor 10.00 Uhr sammeln. Probe gekühlt<br />
bei 2 – 8 °C weniger als 24 Stunden aufbewahren. Für eine längere Lagerung die Probe bei -70 °C<br />
einfrieren. Maximal 5 Gefrier-Auftau-Zyklen möglich.<br />
Referenzwerte:<br />
Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch das Ba-Fragment<br />
Spezies: Human, afrikanischer Grünaffe, Cynomolgus-Affe, Rhesusaffe, Hund<br />
Anwendung:<br />
Durch die Quantifizierung der Menge an Ba kann das Ausmaß der Aktivierung des alternativen Komplementweges zum<br />
Zeitpunkt der Probengewinnung bestimmt werden.<br />
Die Aktivierung des alternativen Weges wird mit unterschiedlichen Krankheitszuständen wie SLE, chronischer Glomerulonephritis,<br />
rheumatoider Arthritis, Sichelzellanämie und Gram-negativen bakteriellen Infektionen in Zusammenhang<br />
gebracht.Die Aktivierung des alternativen Komplementweges kann durch eine Vielzahl von Substanzen, darunter mikro-<br />
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Parasiten, viral infizierte Mastzellen und Krebszellen ausgelöst werden. Bei Autoimmunerkrankungen kann die Aktivierung<br />
des alternativen Komplementweges direkt zu Gewebeschäden führen.<br />
Zudem kann die Aktivierung dieses Weges ein Indikator für die Hämoinkompabilität von Biomaterialien sein.<br />
Applikation:<br />
• Nierenerkrankungen<br />
chronische Glomerulonephritis<br />
Lupusnephritis<br />
• Hauterkrankungen<br />
Dermatitis herpetiformis<br />
Pemphigus vulgaris<br />
�������������������������������������<br />
��������������������������������������������������<br />
������������������������<br />
������������������<br />
Probe n Mittelwert ����������<br />
EDTA Plasma 35 658 226 – 2153<br />
Serum 29 1642 436 – 3362<br />
Urin 16 7,7 0,6 – 27,0<br />
37
38<br />
8.1.1 Kreuzreaktionen von Komplementfragmenten im ELISA<br />
mit Proben von Primaten<br />
Zusammenfassung der Ergebnisse:<br />
Die Spezies-Kreuzreaktion aus verschiedenen Plasma- und Serumproben von Primaten wurde sowohl mit den QUIDEL®<br />
��������������������������������������������������������������������������������������������������noassay<br />
bestimmt. Von den untersuchten Proben zeigten C3a, Bb, C4d, SC5b-9 und CH50 alle in hohem Grade eine<br />
Spezies-Kreuzreaktion mit Proben von Pavian und Altweltaffe. Die Ergebnisse von normalen und aktivierten Seren waren<br />
mit menschlichen Kontrollproben vergleichbar.<br />
Experiment I:<br />
Die Proben wurden auf die Fähigkeit hin geprüft, die Bindung von aktiviertem humanen Komplement an neoantigen-spezifischen<br />
monoklonalen Fangantikörpern im ELISA-Inhibitionsassay zu blockieren. Die monoklonalen Fangantikörper sind<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Blockierfähigkeit wurde definiert als eine mehr als 80%ige Reduktion des Signals gegenüber einer St<strong>and</strong>ardverdünnung<br />
von aktiviertem menschlichen Serum mit einem Endpunktsignal (Extinktion bei 405) zwischen 1,2 und 1,4 Einheiten. Die<br />
Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt.<br />
Abbildung 19:<br />
Ergebnisse der EIA-Inhibition<br />
Pavian Cynomolgus-<br />
Makake<br />
Experiment II:<br />
Spezies-Kreuzreaktionen in den ELISAs wurden durch die Verwendung von verschiedenen komplementaktivierenden<br />
Substanzen (CVF, Zymosan und hitzeaggregiertes Gammaglobulin) nachgewiesen. Diese Produkte aktivieren spezifische<br />
Proteine und Wege des Komplementsystems. Normale Ergebnisse sind in der Tabelle II aufgeführt. Eine positive Kreuzreaktion<br />
wurde definiert als ein mehr als zehnfacher Anstieg in Fragmentebenen nach der Aktivierung. Dieser Schwellenwert<br />
basiert auf vergleichbarem menschlichen Ansprechverhalten. Von den geprüften Proben zeigten Cynomolgus-,<br />
Pavian- und Rhesusaffenproben eine deutliche Kreuzreaktion in den Bb, C4d, C3a, SC5b-9 und CH50 EIA Testkits. Keine<br />
spezifische Reaktion konnte bei Verwendung von Seidenäffchenserum oder <strong>and</strong>eren nicht-menschlichen Seren in dem<br />
IC3b-Enzymimmunoassay aufgezeigt werden.<br />
Abbildung 20:<br />
Kreuzreaktion von ausgewählten Primatenseren mit den CSP-Assay-Testkits<br />
Rhesus Lemur Seidenäffchen<br />
Totenkopfäffchen<br />
Afrikanische<br />
grüne<br />
Meerkatze<br />
Hund Schwein<br />
BA A034 - + + - - - + + -<br />
Bb (neo) A252 + + + - - - - N/T N/T<br />
iC3b (neo) A209 N/T - - - - - - - -<br />
SC5b-9 (neo) A239 + + + - - - - - -<br />
C4d (neo) A251 + + + - - - - - -<br />
C3a (neo) A015 + + + - - - - N/T +<br />
C5a (neo) A025 - - - - - - - - -<br />
����������� C4D (�����) ������������ C3a (ng/ml) SC5b-9 (ng/ml) CH50 (U Eq/ml)<br />
Human (N = 5) 1,5 ± 0,975 4,1251 ± 2,55 51,0 ± 1,5 1209 ± 177 237 ± 28 110,3 ± 6,3<br />
Cynomolgus-<br />
Makake (N = 10)<br />
0,83 ± 0,45 4,065 ± 0,82 NR 879 ± 110 241 ± 28 72,9 ± 13<br />
Pavian (N = 12) 0,75 ± 0,43 3,75 ± 1,5 NR 900 ± 177 165 ± 57,5 NT<br />
Seidenäffchen<br />
(N = 8)<br />
NR 4,41 ± 1,8 NR NR NR NR
Ausgewählte Literaturhinweise:<br />
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Rother K <strong>and</strong> Till GO (eds), Springer Verlag Berlin<br />
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inhibits complement <strong>and</strong> leukocyte activation in<br />
a baboon model of cardiopulmonary bypass.<br />
Ann Thorac Surg 74, 355 – 362.<br />
39
40<br />
9. Komplement-Antikörper und Reagenzien<br />
Depletierte oder Mangelseren<br />
Mit Ausnahme der C3-dpl-, C3/C4-dpl- und C4-defizienten<br />
Meerschweinchenseren wurde ein spezifisches Komplementprotein<br />
immunochemisch aus jedem depletierten<br />
Humanserumreagenz entfernt. Depletierte Seren sind gut<br />
geeignet zur Detektion und Quantifizierung der hämolytisch<br />
aktiven Komplementproteine. Mit Ausnahme der spezifisch<br />
depletierten Komponente sind klassische und alternative<br />
Wege intakt. 1,0 ml pro Fläschchen.<br />
C2 Depleted A500<br />
C5 Depleted A501<br />
C6 Depleted A502<br />
C7 Depleted A503<br />
C8 Depleted A504<br />
C9 Depleted A505<br />
Factor B Depleted A506<br />
C4 Depleted (Meerschweinchen) A507<br />
C3 Depleted A508<br />
C1Q Depleted A509<br />
Factor P Depleted A512<br />
C3/C4 Depleted A521<br />
IgG Depleted<br />
Komplementreagenzien<br />
Katalog-Nr.<br />
Katalog-Nr.<br />
CVF, Cobra Venom Factor A600 (1,0 ml)<br />
Human Complement St<strong>and</strong>ard A100 (1,0 ml)<br />
Normal Guinea Pig Serum<br />
Complement<br />
A119 (1.0 ml)<br />
Normal Human Serum<br />
Complement<br />
A112 (2,5 ml)<br />
Normal Human Serum<br />
Complement<br />
A113 (5,0 ml)<br />
Complement Activator (HAGG) A114 (0,2 ml)<br />
Complement Sample Panel A115 (10 x 0,025 ml)<br />
CVF Activated-NHS A116 (0,1 ml)<br />
CIC Sample Panel A117 (5 Samples)<br />
Specimen Stabilizing Solution A9576 (25 ml)<br />
Gereinigte Proteine<br />
Die Reinheit jedes Komplementproteins (funktionell und<br />
biochemisch) wurde mit Hilfe von St<strong>and</strong>ardhämolysetests<br />
und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese geprüft. Die<br />
Konzentration für jedes Komplementprotein mit Ausnah-<br />
������������������������������������������������������<br />
pro Fläschchen.<br />
Katalog-Nr.<br />
C1q A400 (1,0 ml)<br />
C3 A401<br />
C4 A402<br />
C5 A403<br />
C6 A404<br />
C7 A405<br />
C8 A406<br />
C9 A407<br />
Faktor B A408<br />
Faktor D A409<br />
Faktor H A410<br />
Faktor I A411<br />
Faktor P A412<br />
C3b ������������<br />
C3a �������������<br />
Polyklonale Antikörper (IgY) vom Huhn<br />
Jeder polyklonale IgY-Antikörper wurde aus Hühnereidottern<br />
isoliert, die Reinheit wurde mit Hilfe der SDS-Polyacryl-<br />
Gelelektrophorese getestet. Spezifität und Aktivität wurden<br />
mittels Enzymimmunoassay bestimmt. Die Proteinkonzentration<br />
beträgt ca. 1 mg/ml in phosphatgepufferter physio-<br />
������������������������������������������������<br />
Anti Human C3d A800<br />
Anti Human C4b A801<br />
Katalog-Nr.<br />
Anti Human SC5b-9 A802
Monoklonale Antikörper<br />
Jeder monoklonale Antikörper wurde aus Mäuse-Aszites-<br />
����������������������������������������������������������<br />
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getestet. Die Proteinkonzentration<br />
beträgt ca. 1 mg/ml in boratgepufferter<br />
physiologischer Kochsalzlösung mit 0,02 % Natriumazid.<br />
����������������������<br />
C1q A201<br />
C3a A203<br />
C3c A205<br />
C3d A207<br />
iC3b (Neoantigen) A209<br />
C4c A211<br />
C4d A213<br />
C4 Binding Protein A215<br />
C5 A217<br />
C6 A219<br />
C7 A221<br />
C8 A249<br />
C9 A223<br />
Faktor B (Ba )<br />
C3 Proactivator<br />
Faktor B (Bb)<br />
C3 Proactivator<br />
Katalog-Nr.<br />
A225<br />
A227<br />
Faktor H #1 A229<br />
Faktor I #1 A247<br />
Faktor I #2 A231<br />
Faktor P #1 (Properdin) A233<br />
Faktor P #2 (Properdin) A235<br />
S Protein (Vitronectin) A237<br />
SC5b-9<br />
A239<br />
(TCC-Neoantigen)<br />
Clusterin<br />
A241<br />
(SP40, 40 und APO J)<br />
C3d (Neoantigen) A250<br />
C4d (Neoantigen) A251<br />
Bb (Neoantigen) A252 0,5 ml<br />
C4d (Neoantigen) A253<br />
Faktor H #2 A254<br />
Faktor H #3 A255<br />
Biotinylierte monoklonale Antikörper<br />
Biotin-markierte monoklonale Antikörper<br />
���������������������������������������������������������<br />
gereinigt und mit Biotin markiert. Die Proteinkonzentration<br />
���������������������������������������������<br />
C1q A700<br />
C3c A701<br />
C3d A702<br />
C4c A703<br />
C4d A704<br />
C5 A705<br />
C6 A706<br />
C7 A707<br />
C8 A708<br />
C9 A709<br />
iC3b (neoantigen) A710<br />
SC5b-9 (neoantigen) A711<br />
Polyklonale Antiseren von der Ziege<br />
Die QUIDEL Komplementantiseren werden in Ziegen gezüchtet.<br />
Die Qualitätskontrolle der Spezifität wird durch<br />
immunochemische Analysen sichergestellt. Jedes Serum<br />
enthält 0,02 % Natriumazid. 2,0 ml pro Fläschchen.<br />
C1 Inhibitor A300<br />
C1q A301<br />
C1s A302<br />
Katalog-Nr.<br />
C2 (Ig Fraction) A303 1,0 ml<br />
C3 A304<br />
C4 A305<br />
C5 A306<br />
C6 A307<br />
C7 A308<br />
C8 A309<br />
C9 A310<br />
Factor B A311<br />
Factor H A312<br />
Factor I A313<br />
Katalog-Nr.<br />
Factor Bb A712<br />
41
42<br />
10. Komplement-spezifische Antiseren: Applikationen<br />
Zubereitung<br />
Hyperimmune Antiseren werden durch St<strong>and</strong>ard-Immunisierungsverfahren in Ziegen gewonnen. Dabei werden hochreine<br />
Komplement-Antigene eingesetzt, die aus frisch gewonnenem normalen Humanplasma isoliert wurden. Die Antiserum-<br />
Absorption wurde, falls erforderlich, mit Hilfe von Festphasen-Adsorptionsverfahren durchgeführt. Die Antiseren wurden<br />
als monospezifisch eingestuft, nachdem sie mit Hilfe von Doppelimmundiffusion, ein- und zweidimensionaler Immunelektrophorese<br />
und Rocket-Immunelektrophorese bei unterschiedlichen Konzentrationen gegen frisch gewonnenes, mit<br />
10 mM EDTA versetztem normalen Humanserum getestet worden waren. Antiseren enthalten 0,02 % Natriumazid als<br />
Konservierungsstoff.<br />
Anwendungen<br />
Die QUIDEL Komplement-Antiseren werden bei einer Vielzahl von Techniken eingesetzt, darunter Doppelimmundiffusion,<br />
quantitative radiale Immundiffusion (RID), Rocket-Immunelektrophorese, Western Blotting, Immunhistochemie und ELI-<br />
SA. Es gilt zu beachten, dass es sich bei diesen Produkten um Gesamt-Antiserum h<strong>and</strong>elt und deshalb entsprechende<br />
Gesamt-Serumkontrollen in einigen Anwendungen erforderlich sein können.<br />
Doppelimmundiffusion<br />
Optimale Verdünnungen hängen von der Anwendung ab. Im Allgemeinen liefern QUIDEL Antiseren klare Präzipitin-Linien<br />
bei einer Verdünnung von 1:8 oder höher unter folgenden Bedingungen:<br />
����������������������������������������������������������������������������������<br />
���������������������������������������<br />
��������������������������������<br />
��������������������������������������������������������������<br />
Antigen- oder Antikörperüberschuss kann zu “undeutlichen” Präzipitin-Linien führen.<br />
Quantitative radiale Immundiffusion<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������������������������������������������������������<br />
����������������������������������������<br />
������������������������������������������<br />
������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Ist ein größerer Bereich von NHS-Verdünnungen für eine bestimmte Anwendung erforderlich, dann sollte die Menge an<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Position Antigen Zugabe von Antiserum Optimale Verdünnung<br />
A300 C1 Inhibitor ��������� 2 1:2<br />
A301 C1q ��������� 2 1:2<br />
A302 C1s �������cm 2 1:2<br />
A303 C2 N/T N/T<br />
A304 C3 ��������� 2 1:4<br />
A305 C4 ��������� 2 1:4<br />
A306 C5 ���������� 1:2<br />
A307 C6 ���������� 1:2<br />
A308 C7 ��������� 2 1:2<br />
A309 C8 ��������� 2 1:2<br />
A310 C9 ��������� 2 1:2<br />
A311 Factor B ��������� 2 1:2<br />
A312 Factor H ��������� 2 1:2<br />
A313 Factor I ��������� 2 1:2<br />
Abbildung 21:<br />
Spezifische Ergebnisse für RID
Immunhistochemie<br />
Die optimalen Verdünnungen der Antikörper schwanken je nach spezifischem Gewebetyp und den Versuchsbedingungen.<br />
Im Allgemeinen weisen polyklonale und monoklonale Antiseren von QUIDEL optimale Verdünnungen zwischen 1:1000 und<br />
1:50000 in histologischen Anwendungen auf. Es wird nachdrücklich empfohlen, die optimale Verdünnung auszutesten und<br />
diesen Bereich nur als Indikation anzusehen.<br />
Verschiedene Techniken zur histologischen Auswertung der Komplement-Deposition wurden publiziert unter Verwendung<br />
von QUIDELs monoklonalen Antikörpern gegen Komplementantigene [1–4]. Das folgende Protokoll (adaptiert von<br />
Rogers et al.) beschreibt eine Methode, die in verschiedenen Studien exzellente Ergebnisse geliefert hat. Experimentelle<br />
Verfahren sollten den Probentyp, die Bedingungen, unter denen die Probe gewonnen wurde, die spezifischen Antikörper<br />
und sekundären Reagenzien sowie <strong>and</strong>ere laborspezifische Phänomene in Betracht ziehen. Dieses Protokoll dient nur als<br />
Referenz.<br />
Gewebekonservierung<br />
Gewebeproben wurden in 4 % (wt/vol) Paraformaldehyd (0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4) 24 Stunden lang fixiert<br />
und dann in 2 % DMSO/10 % Glycerol, anschließend in 2% DMSO/20 % Glycerol für jeweils 48 Stunden kryogeschützt.<br />
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
(vol/vol) Glycerol, 33 % Polyethylenglycol und 33 % Phosphatpuffer (0,1M, pH 7,4) gelagert.<br />
Histologie<br />
Die Sektionen wurden 6 x für jeweils 15 Minuten in TBS (0,01 M Tris-HCl, pH 7,6/0,09 M NaCl) gewaschen. Endogene<br />
Peroxidase wurde durch Inkubation mit 0,3 % H202 in 50% Methanol (vol/vol) in TBS blockiert, dann 3 x 15 Minuten mit<br />
TBS/0,5 % Triton X 100 gewaschen. Die Proben wurden eine Stunde mit 3 % BSA blockiert. Die Sektionen wurden über<br />
Nacht bei 4 °C bei optimaler Verdünnung des primären Antikörpers inkubiert (die Bestimmung des Optimums erfolgte durch<br />
Inkubieren fortlaufender Verdünnungen der Antikörper von 1:500 bis 1:128000 auf einem stark positiven Kontrollgewebe).<br />
Die Sektionen wurden dann 3 x mit TBS/0,05 % Triton X-100 gewaschen und mit Biotin-konjugiertem Antikörper gemäß<br />
den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Der gebundene sekundäre Antikörper konnte mit DAB (Diaminobenziden) wie<br />
in der St<strong>and</strong>ard-ABC/DAB-Immunhistochemie reagieren.<br />
Kontrollen<br />
Empfohlene Negativkontrollen sind unter <strong>and</strong>erem die Auslassung des primären Antikörpers, die Präabsorption mit gereinigtem<br />
Komplementantigen und St<strong>and</strong>ard-Negativgewebe. Als Positivkontrollen werden unter <strong>and</strong>erem Proben von<br />
pathologischem Nierengewebe (Glomerulonephritis) und Alzheimer-Gehirngewebe empfohlen<br />
ELISA<br />
Optimale Verdunnungen fur diese Antiseren sind groser als 1:50000 in einem Antigen-capture ELISA. Spezifische optimale<br />
Verdunnungen hangen von Charge und Assaytyp ab.<br />
Allgemeine Hinweise<br />
Für die QUIDEL polyklonalen Antiseren (A300’s) wird empfohlen, eine Blockierung mit einer entsprechenden Verdünnung<br />
von normalen Ziegenseren.<br />
Referenzen<br />
[1] Rogers, J., Cooper, N. et al. (1992)<br />
Complement Activation by β-amyloid in<br />
Alzheimer disease.<br />
PNAS 89:10016-10020<br />
[2] Qian, Z. Wasowska, B.A., Baldwin, W., et al. (1999)<br />
C6 produced by macrophages contributes to<br />
cardiac allograft rejection.<br />
Amer. J. Path 155:4<br />
[3] Baldwin, W. et al. (1999)<br />
Complement deposition in early cardiac<br />
transplant biopsies is associated with ischemic<br />
injury <strong>and</strong> subsequent rejection episodes.<br />
Transplantation 68:6<br />
[4] Murphy, B, Kirszbaum, L, et al. (1998)<br />
SP-40,40, a newly identified normal human serum<br />
protein found in SC5b-9 complex of complement<br />
<strong>and</strong> in immune deposits in glomerulonephritis.<br />
Clin Invest 81:1858 – 1864k<br />
43
44<br />
10.1 Produktinformation zu monoklonalen Antikörpern<br />
Artikel Nr. Beschreibung (murin anti human) Epitop-Beschreibung Isotype<br />
A201 C1q bindet an globulären Kopf des C1q IgG1k<br />
A203 C3a bindet C3 und C3a IgG1k<br />
A205 C3c bindet C3 und C3c IgG1k<br />
A207 C3d<br />
bindet C3 und C3d-enthaltende<br />
Fragmente<br />
IgG1k<br />
A209 iC3b Neoantigen, bindet nur iC3b IgG2bk<br />
A211 C4c<br />
bindet C4 und C4c-enthaltende<br />
Fragmente<br />
IgG1k<br />
A213 C4d<br />
bindet C4 <strong>and</strong> C4d-enthaltende<br />
Fragmente<br />
IgG1k<br />
A215 C4 Binding Protein IgG2bk<br />
A217 C5 hemmt die Lyse von Schaf-EA, erkennt<br />
membrangebundenen MAC nicht<br />
IgG1k<br />
A219 C6 erkennt MAC IgG1k<br />
A221 C7 hemmt die Lyse von Schaf-EA, erkennt<br />
membran-gebundenen MAC nicht<br />
IgG1k<br />
A249 C8 erkennt MAC IgG2ak<br />
A223<br />
C9 hemmt die Lyse von Schaf-EA nicht,<br />
erkennt MAC nicht<br />
IgG2bk<br />
A225 Faktor B (Ba)<br />
hemmt die Funktion von Faktor B; bindet IgG1k<br />
C3 Proactivator<br />
sowohl den naszierenden Faktor B als<br />
auch das Ba-Spaltprodukt<br />
A227 Faktor B (Bb) C3 Proactivator hemmt die Funktion von Faktor B; bindet<br />
sowohl den naszierenden Faktor B als<br />
auch das Bb-Spaltprodukt<br />
IgG1k<br />
A229 Factor H #1 hemmt die Funktion nicht, Faktor Hähnliches<br />
Protein wird nicht erkannt<br />
IgG1k<br />
A247 Faktor I #1 hemmt die Funktion nicht IgG1k<br />
A231 Faktor I #2 hemmt die Funktion von Faktor I nicht IgG1k<br />
A233 Faktor P #1 (Properdin) blockiert die Funktion IgG1k<br />
A235 Faktor P #2 (Properdin hemmt die Funktion von Faktor P nicht IgG1k<br />
A237 S Protein (Vitronectin) bindet freies S-Protein (Vitronectin)<br />
sowie SC5b-9<br />
IgG1k<br />
A239 SC5B-9 gerichtet gegen ein Neoantigen auf Poly-<br />
C9 und denaturiertes C9<br />
IgG2ak<br />
A241 Clusterin Clusterin wird auch Apo J und SP40,40<br />
genannt<br />
IgG1k<br />
A250 C3d (Neoantigen) bindet nur an C3d-enthaltende Aktivierungsprodukte<br />
von C3<br />
A251 C4d (Neoantigen) bindet nur C4d-Aktivierungsprodukte<br />
von C4<br />
A252 Bb (Neoantigen) bindet nur die Bb-Untereinheit<br />
A253 C4d (Neoantigen)<br />
bindet C4 und C4d-enthaltende<br />
Fragmente<br />
IgG1k<br />
A254 Faktor H #2 hemmt die Funktion nicht lgG1k<br />
A255 Faktor H #3 hemmt die Funktion nicht lgG1k<br />
Anmerkungen:<br />
Alle monoklonalen Antikörper werden geliefert ab 100 μl pro Flasche – 1,0 mg/ml – in boratgepufferter Kochsalzlösung. Die empfohlene Ausgangsverdünnung<br />
für alle Antikörper in IHC-Applikationen ist 1:1000; die tatsächliche Applikation und der Gewebetyp bestimmen die korrekte Verdünnung.
Getestet Anwendung<br />
ELISA RIA IHC W.Blot FACS Funktion<br />
Verdünnung<br />
ELISA<br />
X X N/T N/T X hemmt die Funktion des C1q-Moleküls wahrscheinlich nicht 1:16000<br />
X X N/A X N/A<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
X N/T N/T N/T N/T<br />
C3a bindet sich nicht an Zellen, so dass es deshalb<br />
in FACS oder IHC normalerweise nicht detektiert wird<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
nur reaktiv mit dem Aktivierungsprodukt iC3b, nicht mit<br />
C3b oder <strong>and</strong>eren Produkten<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
1:6200<br />
1:10500<br />
1:5400<br />
1:64000<br />
X X N/A X N/A 1:10000<br />
X X X N/T X<br />
X X N/A X N/A<br />
X N/T X X X<br />
X X N/A N/T N/A<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
X N/T X X X > 1:1000<br />
X X X X N/T 1:34000<br />
X X X X N/T<br />
X X X N/T N/T<br />
X X X N/T N/T<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
X X X X X<br />
X N/T X<br />
X N/T X<br />
X N/T X<br />
X X X X X<br />
bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein<br />
und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet<br />
X X X X N/T ���������<br />
X X X N/T N/T ���������<br />
Für IHC hat sich die ABC-Methode als die zuverlässigste Methode für diese Antikörper und Analyten herausgestellt; gefrorenes Gewebe wird bevorzugt.<br />
Antikörper in Fettdruck werden in den EIA-Kits von QUIDEL verwendet. Empfohlene Ausgangsverdünnung für alle Antikörper in Westernblot 10 ug/ml.<br />
Empfohlene Verdünnung für FACS 10:<br />
40 μl/ml, 1:100-Verdünnung, 200 Proben pro Flasche.<br />
45
46<br />
10.2 Kreuzreaktionen Tierspezies – Monoklonale<br />
Antikörper Spezies-Kreuzreaktionen monoklonale Antikörper*<br />
ANTIHUMAN-ANTIKÖRPER KREUZREAGIERENDE SPEZIES<br />
PAVIAN<br />
KATZE<br />
HUHN<br />
RIND<br />
HUND<br />
C1q A201 - - - - - - - - + slight - N/T - - -<br />
C3a A203 + - - - - - - - + + - + - - -<br />
iC3b (neo) A209 N/T - - - - - - - + N/T - N/T - - -<br />
C3c A205 + + - - - + - + + + - N/T - - -<br />
C3d A207 - - - - - - - - + - - slight - + -<br />
C4c A211 + - - - - - - - + + - N/T - - -<br />
C4d (neo) A251 + N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + + N/T N/T N/T N/T N/T<br />
C4/C4d A213 + + - + + + - - + - + - + + +<br />
C5 A217 + - - - - - - - + + - N/T - - -<br />
C6 A219 N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + N/T N/T N/T N/T N/T N/T<br />
C7 A221 - + - + + - + + + N/T - + + + -<br />
C8 A249 N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + N/T N/T N/T N/T N/T N/T<br />
C9 A223 + - + + - + + + + + - N/T - - -<br />
SC5b-9 (TCC)(neo) A239 + - - - - - - - + + - N/T - - -<br />
Factor H (#1) A229 + - - - - - - + + + - N/T - - -<br />
Factor H (#2) A254 + - - - - - - - + + - N/T - - -<br />
Factor H (#3) A255 + - - - - - - - + + - N/T - - -<br />
Factor I (#1) A247 - - - - - - - - + N/T - N/T - - -<br />
S Protein A237 - - - - - - - - + N/T - N/T - - -<br />
Clusterin/SP40,40 A241 N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + + - N/T N/T - N/T<br />
+ Kreuzreaktion<br />
| Kreuzreaktion in der Immunhistochemie**<br />
N/T nicht untersucht<br />
- keine Kreuzreaktion<br />
* Die monoklonalen Antikörper wurden bei QUIDEL mittels Inhibitions-ELISA auf Kreuzreaktionen untersucht. Es besteht<br />
die Möglichkeit, dass ein sensitiver Test Kreuzreaktionen nachweisen könnte, auch wenn sie bei der ELISA-Inhibition<br />
nicht gefunden wurden.<br />
** Die Immunhistochemie-Daten stammen aus externen Untersuchungen; diese Experimente wurden nicht bei QUIDEL<br />
durchgeführt und sind nicht bestätigt.<br />
MEERSCHW.<br />
HAMSTER<br />
PFERD<br />
HUMAN<br />
AFFE<br />
MAUS<br />
SCHWEIN<br />
KANINCHEN<br />
RATTE<br />
SCHAF
10.3 Kreuzreaktionen Tierspezies – Polyklonale Antikörper<br />
Spezies-Kreuzreaktionen monoklonale Antikörper<br />
PAVIAN<br />
KATZE<br />
HUHN<br />
RIND<br />
HUND<br />
CROSS-REACTING SPECIES<br />
Goat anti-human C1-INH A300 +++ - - - + - - - +++ - ++ + - - -<br />
Goat anti-human C1q A301 +++ +++ - - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human C1s A302 +++ - - - - - - - +++ - - - - - -<br />
Goat anti-human C3 A304 +++ - - - - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human C4 A305 +++ + - - +++ - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human C5 A306 +++ + - - +++ +++ + +++ +++ + +++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human C6 A307 +++ +++ - - +++ - - + +++ - +++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human C7 A308 +++ +++ - - - +++ + + +++ - ++ +++ - - -<br />
Goat anti-human C8 A309 +++ + - - +++ +++ + + +++ + +++ +++ + - -<br />
Goat anti-human C9 A310 +++ - - - - - + +++ +++ - ++ + - - -<br />
Goat anti-human Factor B A311 +++ +++ - - - +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human Factor H A312 +++ +++ - - +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - -<br />
Goat anti-human Factor I A313 +++ - - - - - - - +++ - - - - - -<br />
Chicken Anti-Human C3d (IgY) A800 +++ - - +++ ++ ++ ++ - +++ +++ ++ ++ +++ ++ ++<br />
Chicken Anti-Human C4b (IgY) A801 +++ - - ++ ++ - ++ - +++ ++ ++ ++ ++ + ++<br />
Chicken Anti-Human SC5b-9 (IgY) A802 +++ - - ++ +++ - ++ - +++ ++ ++ ++ +++ + ++<br />
+++ starke Kreuzreaktion<br />
++ moderate Kreuzreaktion<br />
+ schwache Kreuzreaktion<br />
- keine Kreuzreaktion<br />
- unbekannt<br />
MEER-<br />
SCHWEINN<br />
Für die Spezies-Kreuzreaktion wurde alle Antiseren durch Doppelimmundiffusion und/oder<br />
mittels eindimensionaler Immunelektrophorese untersucht.<br />
HAMSTER<br />
PFERD<br />
HUMAN<br />
MAUS<br />
SCHWEIN<br />
KANINCHEN<br />
RATTE<br />
SCHAF<br />
GOAT<br />
47
48<br />
Notizen
11 Appendix<br />
11.1 Assay Protokolle (Beispiele)<br />
11.1.1 Prüfung auf Aktivierung des Komplementsystems am Beispiel von Liposomenpräparationen<br />
11.1.2 Messung der Komplementaktivierung in Seren von Nicht Primaten mittels hämolytischem Assay – CxH50 /<br />
Quantifiying Complement Activation in a Non-human Specimen (CxH50))<br />
11.2 Technische Daten Blätter und Analyse Zertifikate (Beispiele)<br />
Normal human complement serum (A113)<br />
HAGG Activator (A114)<br />
Activator Cobra Venom Factor (A600)<br />
Specimen stabilizer (A9576)<br />
C3 Depleted Serum (A508)<br />
Normal human complement St<strong>and</strong>ards (A100)<br />
49
50<br />
11.1.1 Protokoll:<br />
Prüfung auf Aktivierung des Komplementsystems am Beispiel von<br />
Liposomenpräparationen<br />
Bestimmung des Aktivierungsprodukts C3a<br />
Reagenzien und Materialien Lagerung Inhalt Art.-Nr.<br />
Quidel Complement ELISA 2 – 8 °C 96 wells Axxx<br />
Quidel Normal Human Serum Complement<br />
Charge 906680 z. B. C3a 800 ng/ml (siehe Analysenzertifikat)<br />
EDTA-, Heparin- und rekalzifiziertes Plasma sind nicht geeignet<br />
Cobra Venom Factor / Aktivierung des alternativen Weges<br />
Charge 905605 Titer: 686 U/ml (siehe Analysenzertifikat) 8-20 U/ml sind<br />
ausreichend, um nahezu das gesamte C3 zu C3-Fragmenten zu<br />
konvertieren, wenn eine Inkubation mit unverdünntem Humanserum<br />
für 30 - 90 Minuten bei 37 °C erfolgt<br />
Complement Aktivator Quidel - klassischer Weg:<br />
HAGG, 10 ul for 1 ml = vollständige Aktivierung nach 30 Minuten bei 37 °C<br />
Probenstabilisator / Quidel<br />
Proben verdünnen 1:1<br />
Komplementinhibitor: EDTA<br />
EDTA 10 mMol Endkonzentration - eiskalt<br />
Bitte beachten:<br />
geeignete Schale mit Eis bereitstellen<br />
Eppendorf Polypropylen-Röhrchen Proben vorsichtig mischen, aber nicht vortexen<br />
Reagenzien-H<strong>and</strong>habung - Lagerung<br />
-70 °C 5 ml<br />
2.5 ml<br />
A113<br />
A112<br />
-70 °C 1 ml A600<br />
-70 °C 0.2 ml A114<br />
2 – 20 °C 25 ml A9576<br />
Cobra Venom schnell bei 37 °C auftauen und unverzüglich auf Eis lagern<br />
nicht benötigtes Material in Aliquoten bei - 70 °C aufbewahren<br />
Berechnung der benötigten Menge: z. B. Titer ist 685 Units/1000 ul<br />
für 1000 ul Serum sind 20 Units zur völligen Aktivierung erforderlich; entspricht 29 ul<br />
1000/685*20 = 29 ul<br />
HAGG nicht benötigtes Material sofort wieder bei - 70 °C aufbewahren<br />
10 ul für 1 ml Serum<br />
Probenstabilisator bei 37 °C im Wasserbad lösen und mischen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen<br />
Normalserum = NHS schnell bei 37 °C auftauen und unverzüglich auf Eis aufbewahren<br />
nicht benötiges Serum in PPE-Röhrchen aliquotiert wieder bei - 70 °C einfrieren<br />
5 Aliquote zu je 100 ul (50 ul) in Eppendorf-Röhrchen auf Eis vorbereiten<br />
in 1 Aliquot sofort 100 ul (50 ul) Probenstabilisator geben<br />
NHS/Puffer entsprechend dem Pufferanteil in den Proben; z. B. 80:20<br />
davon 5 Aliquote zu je 100 ul (50 ul ) in Eppendorf-Röhrchen auf Eis vorbereiten<br />
in 1 Aliquot sofort 100 ul (50 ul ) Probenstabilisator geben<br />
NHS – aktiviert 5 ul Aktivator oder 15 ul CVF zu 500 ul NHS geben und sofort 6 Aliquote zu<br />
100 ul auf Eis legen<br />
NHS – inhibiert 500 ul plus EDTA - 5 Aliquote zu je 100 ul auf Eis aufbewahren<br />
Lipos/NPs 5 Aliquote in verschiedenen Verdünnungen herstellen<br />
Aliquote zu 100 ul (50 ul) sofort auf Eis legen
Grundsätzlich ist beim Arbeiten mit Komplementaktivierungsassays zu beachten, dass eine Kontamination<br />
mit Bakterien vermieden werden muss; d.h. Pipettenspitzen und Reaktionsgefässe müssen höchstrein sein,<br />
um eine nicht erwünschte Aktivierung durch Lipopolysccharide zu vermeiden<br />
Testdurchführung<br />
1. Zubehör für den ELISA<br />
2. Plattenleser, Waschsystem, Mehrkanalpipetten, PP-Röhrchen, sterile Pipettenspitzen<br />
geeignete Pipetten und Gefässe aus PP für die Verdünnungen<br />
3. Eisbad vorbereiten<br />
4. Inkubation bei 37 °C unter Rotation vorbereiten<br />
5. Materialien / Kontrollen / Reagenzien bereitstellen<br />
a) Human Normal Serum<br />
a) Aktivator: HAGG oder Kobragift oder Zymosan<br />
b) Inhibitor - EDTA<br />
d) Liposomen / Nanopartikel / Therapeutika-Präparationen<br />
e) alle Puffer<br />
f) Probenstabilisator<br />
6. Proben und Kontrollen für die Inkubation vorbereiten -unbedingt auf Eis durchführen<br />
a) Kontrolle 1: Human Normal Serum ohne Zusätze - Konzentration siehe Analysenzertifikat<br />
b) Human Normal Serum plus Aktivator - Anstieg auf 10-fache Konzentration möglich<br />
c) Human Normal Serum plus EDTA - Inhibitionskontrolle<br />
d) alle verwendeten Puffer im Verhältnis wie in den Präparationen mit Human Normal Serum herstellen<br />
e) Liposomen/Nanopartikelpräparationen in geeignetem Verhältnis mit Human Normal Serum (20:80) herstellen<br />
z.B. je 500 ul herstellen, 5 Aliquote zu je 100 ul auf Eis vorbereiten<br />
7. Inkubation aller Kontrollen und Proben<br />
pipettieren Inkubationsintervalle bei 37 °C auf Rotor auf Eis<br />
15 min 30 min 60 min 120 min 120 min<br />
NHS ���������� ������ ������ ������ ������ ������<br />
NHS Plus Aktivator ���������� ������ ������ ������ ������ ������<br />
NHS Plus Inhibitor ���������� ������ ������ ������ ������ ������<br />
Puffer ���������� ������ ������ ������ ������ ������<br />
Probe ���������� ������ ������ ������ ������ ������<br />
8. Den Aliquoten nach den Inkubationsintervallen 100 ul Probenstabilisator (1+1) zugeben und auf Eis halten<br />
9. Proben mit Probendiluent verdünnen entsprechend der Testvorschrift und der erwarteten Reaktion -<br />
Beispiel C3a: alle Proben sind bereits 1+1 mit Stabilisator verdünnt und bleiben auf EIS<br />
a) Human Normal Serum ohne Zusätze - Konzentration z. B. C3a 800 ng/ml<br />
b) Human Normal Serum plus Aktivator - Positivkontrolle der Methode<br />
c) Human Normal Serum plus EDTA - Inhibitionskontrolle = siehe Kontrolle a<br />
d) alle verwendeten Puffer im Verhältnis wie in den Präparationen mit Human Normal Serum herstellen<br />
e) Liposomen/Nanopartikelpräparationen in geeignetem Verhältnis mit Human Normal Serum (z. B. 20:80)<br />
herstellen und verschiedene Konzentrationen des Therapeutikums austesten<br />
51
52<br />
Mit folgenden Verdünnungen wird ein Bereich abgedeckt<br />
1:500 bis zu 2500 ng (2,5 ng *2*500 = 2,500 ng)<br />
1:1000 bis zu 5000 ng (2,5 ng *2*1000 = 5,000 ng)<br />
1:5000 bis zu 25000 ng (2,5 ng *2*5000 = 25,000 ng)<br />
Verdünnung mit Probendiluent auf Eis<br />
15 min 30 min 60 min 120 min 120 min<br />
NHS 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500<br />
NHS plus Aktivator 1:1000 1:1000 1:5000 1:5000 1:5000<br />
NHS plus Inhibitor 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500<br />
Puffer 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500<br />
Probe Lipos/NPs 1:500 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000<br />
Empfehlung:<br />
Vorversuche z. B. mit 2 Proben unterschiedlicher Konzentration und mit 3 Inkubationszeiten durchführen.<br />
Die Aktivierung, Inhibierung und die Puffer in einem separaten Ansatz testen.<br />
Wenn die optimale Verdünnung und die optimalen Inkubationsintervalle mit der maximalen Aktivierung gefunden,<br />
sind, dennoch in weiteren Ansätzen mit den Präparationen immer ein Aliquot mit 0 und Max der Kontrollen mitführen.<br />
Auswertung:<br />
1. ELISA Kit-Kontrollen im Bereich?<br />
2. Normal Human Serum entsprechend des Analysenzertifikats in der 0-Probe / Anstieg bei 37 °C 2-3 x<br />
3. Aktiviertes Normalserum: kann bis zum 10-fachen des Ausgangswertes steigen<br />
4. Inhibiertes Material: auch während der Inkubation kein Anstieg<br />
5. Normalserum mit Puffer: Verhältnis beachten (80:20), Zielwert ist demnach nicht 800 sondern 640 ng/ml<br />
6. Wie verhält sich das Serum mit den Lipos/NPs im Vergleich zum Normalserum?
Auswertung Beispiel C3a<br />
Serum mit Aktivator zeigt die max. mögliche Aktivierung 18,235<br />
Serum mit Inhibitor<br />
Normalserum<br />
Lipo/Nano Proben<br />
20 % Probe / 80 % Serum<br />
Puffer / Serum<br />
20 % Puffer / 80 % Serum<br />
Beispiele für geeignete Verdünnungsschritte<br />
1:500<br />
1. Step: 240 ul Diluent plus 10 ul Probe – 1:25<br />
2. Step: 380 ul Diluent plus 20 ul Verdünnung I – 1:20<br />
1:1000<br />
1. Step: 245 ul Diluent plus 5 ul Probe – 1:50<br />
2. Step: 380 ul Diluent plus 20 ul Verdünnung I – 1:20<br />
1:5000<br />
1. Step: 495 ul Diluent plus 5 ul Probe – 1:100<br />
2. Step 490 ul Diluent plus 10 ul Verdünnung 1 – 1:50<br />
bestätigt Komplementhemmung,<br />
die Werte bleiben trotz<br />
37 °C Inkubation wie beim 0-Wert (Eis)<br />
0 min<br />
60 min<br />
120 min<br />
Aktivierung wird in Relation zum<br />
Normalserum beurteilt<br />
0 min (Eisprobe)<br />
30 min<br />
60 min<br />
120 min<br />
240 min<br />
Präparation 2<br />
0 min (Eisprobe)<br />
60 min<br />
120 min<br />
180 min<br />
240 min<br />
< 1000<br />
0,75<br />
1,848<br />
1,98<br />
0,985<br />
2,392<br />
2,716<br />
4,963<br />
4,946<br />
1,142<br />
2,175<br />
2,356<br />
3,013<br />
3,432<br />
ergab keine Aktivierung und keine Inhibition < 1000<br />
Die Verdünnungen wurden so gewählt, dass möglichst wenig Diluent verbraucht wird und die Endmenge<br />
genügt, um mit der Mehrkanalpipette 2x 100 ul auf die ELISA Platte vozulegen.<br />
53
54<br />
11.1.2 Protocol:<br />
Quantifiying Complement Activation<br />
in a Non-human Specimen (CxH50)<br />
Operation Performed by: ......................................... Date: .............................................<br />
<strong>Review</strong>ed by: .............................................................. Date: .............................................<br />
I. Purpose<br />
To define the procedure <strong>and</strong> reagents used in the CxH50 assay for serum.<br />
Materials/Reagents/Equipment required<br />
Gelatin Veronal Buffer (GVB++)<br />
5X Veronal Buffer with Ca/Mg<br />
Gelatin<br />
Deionized water<br />
Sheep Erythrocytes in Alsevers Solution<br />
Hemolysin (Rabbit Anti-Sheep Erythrocyte)<br />
Bulk, EDTA 0.2M<br />
Gelatin Veronal Buffer with Ca/Mg (GVB++)<br />
Hemolysin-Treated Sheep Erythrocytes (EAs)<br />
On-Test Normal Guinea Pig Serum<br />
On-Test Complement Activated Guinea Pig Serum<br />
C3 depleted human serum (Quidel P/N A508)<br />
Normal human complement st<strong>and</strong>ard (Quidel P/N A100)<br />
Control (as appropriate)<br />
Materials/Reagents/Equipment required<br />
Thermometer<br />
Balance<br />
Water Bath, 37°C<br />
Heat Block/Stir Plate<br />
Stir Bar<br />
Assorted Glassware<br />
Pipettes<br />
Parafilm<br />
50 mL Conical Tubes (polypropylene)<br />
Refrigerated Table-Top Centrifuge (e.g., Dupont/Sorval RT6000)<br />
Spectrophotometer (capable of 540 nm wavelength)<br />
13 x 100 mm disposable glass test tubes<br />
12 x 75 mm disposable glass test tubes<br />
Ice bucket with ice<br />
Lot Number Expiration Date
II. References<br />
[1] Mayer, M.M. (1961) Complement <strong>and</strong> complement fixation.<br />
In Experimental Immunochemistry,<br />
edited by E.A. Kabat <strong>and</strong> M.M. Mayer. 2nd Ed. Charles C. Thomas, Springfield, IL, pp 133-240.<br />
[2] Nilsson, U.R. <strong>and</strong> B. Nilsson.<br />
Simplified Assays of Hemolytic Activity of the Classical <strong>and</strong> Alternative Complement Pathways.<br />
Journal of Immunological Methods, 72 (1984), pp 49-59.<br />
[3] Ruddy, S. (1985) Complement.<br />
In Laboratory Diagnostic Procedures in the Rheumatic Diseases,<br />
Grune & Stratton, pp 137-161.<br />
III. Procedure<br />
1. Gelatin Veronal Buffer (GVB++) (Makes 1 Liter):<br />
a. Add 2.0 grams of gelatin to 200 mL of D.I. water in a heat-resistant glass container.<br />
Heat to boiling to dissolve with const ant stirring.<br />
b. Measure out 200 mL of 5X VB++ in a clean graduated cylinder.<br />
Add an additional 500 mL of D.I. water to the cylinder <strong>and</strong> mix well.<br />
c. Add 100 mL of the dissolved gelatin <strong>and</strong> bring to a final volume of one liter with D.I. water.<br />
Cover with Parafilm ® <strong>and</strong> mix well by repeated inversion of the container.<br />
� ��� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
Label container with date of preparation, description, your initials, <strong>and</strong> the expiration date.<br />
(Note: The GVB++ is good for 3 months when stored at 2-8°C <strong>and</strong> protected from contamination.)<br />
2. Sensitized Sheep Erythrocytes (EAs) (Makes about 25 mL of EA stock solution for adjustment;<br />
can be repeated <strong>and</strong> pooled for larger volumes):<br />
Wash SRBCs as follows:<br />
a. Place 5 mL of SRBCs in a 50 mL conical tube <strong>and</strong> bring to 50 mL with cold GVB++. Keep the GVB++ on ice<br />
throughout the procedure. Invert the tubeseveral times to suspend the cells <strong>and</strong> then spin 900 to 1500 Xs g<br />
(2000 rpm in QCT#348 centrifuge) at 2 – 8 °C for 10 minutes. Decant supernatant <strong>and</strong> discard while saving the<br />
pellet of cells. The pellet should be about 1 mL in volume. Re-suspend the cell pellet into 50 mL of fresh GVB++<br />
by gently inverting the tube <strong>and</strong> spinning again as described above. Continue to wash the cells in this manner<br />
until the supernatant is clear <strong>and</strong> colorless.<br />
b. Re-suspend the pellet into 20 mL of GVB++. In a separate container combine 27 mL of GVB++, 3.0 mL of 0.2M<br />
EDTA solution, <strong>and</strong> the optimal dilution of Hemolysin for the assay (usually 1:200 to 1:1000) as determined for<br />
each lot of Hemolysin (see Section 5 for titration of Hemolysin). Add this second mixture to the suspended<br />
SRBCs in GVB++ <strong>and</strong> mix by gentle inversion of the conical tube. (NOTE: The dilution of Hemolysin is based<br />
upon the total 50 mL mixture volume of GVB++, EDTA, <strong>and</strong> suspended EAs.)<br />
c. Incubate the SRBCs, Hemolysin, EDTA mixture at 37 °C for 30 minutes with frequent, gentle mixing<br />
(e.g., inversion) every 5 minutes.<br />
d. Spin the cell suspension as described above, <strong>and</strong> wash at least two times with GVB++ or until the supernatant is<br />
clear <strong>and</strong> colorless. Re-suspend the cells in 20 to 25 mL of GVB++ <strong>and</strong> store at 4 °C. Label this suspension with,<br />
“EA Stock Solution,” the date of preparation, the expiration date, <strong>and</strong> your initials. The EA Stock Solution is used<br />
to make the daily working solution of EAs used in the CxH50 Assay. The EA Stock Solution is good for 10 days<br />
when stored at 2 – 8 °C <strong>and</strong> protected from contamination.<br />
55
56<br />
e. Adjust a portion of the cells to a final concentration of 6.5 x 10 7 cells per mL to make a daily working solution of<br />
EAs as described below. The working solution is best made in the morning <strong>and</strong> can be used throughout the day.<br />
Make a freshly washed <strong>and</strong> adjusted working EA solution for each day of testing.<br />
f. Make sure the cells are washed at least twice or until the supernatant is clear <strong>and</strong> colorless using GVB++ as the<br />
washing solution. Using 12 x 75 glass tubes, mix 1.3 mL of water plus 0.2 mL of cell suspension to test the<br />
concentration of the EAs. Read the O.D. at 540 nm using water as a blank. If the mixture is 1.2 ≤ OD ≤1.6, the<br />
cells are at 6.5 x 107 cells per mL. Dilute or spin down <strong>and</strong> re-suspend in an appropriate volume should any<br />
adjustments become necessary. Only a portion of the EA Stock Solution need be adjusted wto produce the<br />
working solution for any particular day.<br />
3. Optimization of CxH50 Assay<br />
Keep all testing materials on ice. Thaw all materials quickly in a 37° C water bath then place immediately on ice.<br />
a. Prepare a 1:10 – 1: 1 X 10 6 dilutions of Normal Guinea Pig Serum (NGPS) in GVB++ these will be the initial test<br />
samples. The amount of NGPS can be altered if necessary.<br />
� ��� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
thoroughly, but gently.<br />
Sample �����������������<br />
c. Prepare controls <strong>and</strong> samples in triplicate– Positive control (D.I. water), Background Control (NGPS, GVB++),<br />
Negative Control (GVB++), <strong>and</strong> Reference Control (GVB++ + NHS). Add the sample to the tubes last.<br />
d. Place the tubes in a 37°C water bath for 30 minutes, vortexing very gently every 5 minutes. H<strong>and</strong>le tubes carefully<br />
so no water gets inside as this will cause lysis.<br />
e. Centrifuge the tubes at 900 to 1500 Xg (2000 rpm) for 10 minutes at 2 – 8 °C.<br />
f. Read supernatants at 540mn using GVB++ as the blank.<br />
g. Attach printout, <strong>and</strong> calculate data as described in step 4.<br />
�����������������������<br />
serum<br />
�������� ������������<br />
Test Sample (sample: NGPS) 345 10 120 25<br />
Reference (sample: NHS: A100) 345 10 120 25<br />
Positive sample: sterile H20) 0 0 120 380<br />
Background (sample: NGPS) 355 0 120 25<br />
Negative (no sample) 380 0 120 25
4. Calculations<br />
a. Calculate the percent lysis (Y) in decimal form as follows:<br />
Y= O.D. 540 nm Experimental<br />
Avg. O.D. 540 nm Positive Control<br />
b. Next, determine the value of Y/1-Y for each experimental value.<br />
NOTE: Since the CH50 assay is used to determine the 50 % point of lysis as compared to the Positive Control,<br />
the point at which Y/1-Y = 1.0, i.e., the 50 % lysis point, must be calculated.<br />
Example: With an experimental O.D. 540nm = .554, <strong>and</strong> a Positive Control<br />
O.D. 540 nm = 1.483, the percent lysis is calculated as follows:<br />
Y = 0.554 / 1.483 = 0.374 <strong>and</strong> Y/1-Y - 0.374 / (1-0.374) = 0.597<br />
c. Determine the volume of serum that corresponds to the 50% point of lysis using either of the following methods:<br />
� � ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
per assay tube for each serum tested. Draw a best fit line through the points. Graphically determine the volume<br />
�������������������������������������������������������������������������������<br />
or<br />
II. Using a calculator that is capable of linear regression analysis, enter the values as described above for the<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
the 50 % point of lysis using point-to-point regression.<br />
III. To calculate the CH50 units/ml present in the original undiluted serum, use the following formula:<br />
CH50 units/ml= ������������<br />
�������������������������������<br />
5. Hemolysin Titration for the Production of EAs<br />
A determination of the optimal concentration of hemolysin used for the production of EAs must also be performed using<br />
the methods described previously. This proceduremust be done for every new lot of hemolysin purchased or when the<br />
activity of any hemolysin preparation is in question.<br />
The titration assay will include various concentrations/volumes of hemolysin (e.g., final dilutions of 100-, 200-, 500-, 1000-,<br />
<strong>and</strong> 2000-fold) used to produce small lots of EAs. These EAs are then examined against a dilution of serum known to<br />
generate a high level (80 – 100%) of lysis of EAs as compared to the positive control (EAs plus water). In this manner,<br />
every lot of hemolysin will be examined for optimal performance. The concentration of hemolysin chosen to produce future<br />
preparation of EAs should be the concentration that results in maximal lysis using a serum of known CH50 activity.<br />
IV. Additional Information<br />
1. If the data points do not fall on a straight line, possible problems include pipetting errors, reaction mixtures were not<br />
vortexed completely or often enough during the assay, EAs not functioning properly (too old), or contaminated GVB++.<br />
2. Human plasma can also be examined using these methods since the original dilution of 80- to 100-fold will prevent<br />
clot formation during the assay.<br />
3. If the series of tubes for a serum does not afford the presence of a 50 % lysis point somewhere in the series, adjust<br />
the original serum dilution <strong>and</strong> repeat the assay using a less concentrated or more concentrated serum dilution as<br />
appropriate.<br />
57
58<br />
V. Determination of optimal Dilution for later Testing<br />
1. C3H50 is determined by the dilution yielding a 50% lysis of Ea.<br />
2. The dilution of the normal guinea pig serum at which 50% lysis occurs can then be used as the optimal dilution for all<br />
future experiments.<br />
3. Normal human serum can be used as an experimental control for the process.<br />
4. The positive control sample (DI water only) is used as the 100 % lysis point.<br />
5. Normal guinea pig serum is a background value.<br />
6. Once the optimal (50 % lysis) dilution is determined in an unactivated normal control all future assays can be use this<br />
dilution as 100 %.<br />
VI. Determination of C3H50<br />
1. To determine C3H50 in test sera samples are run verus a normal unactivated conrol (100 %) at the optimal dilution<br />
determined in section V.<br />
2. Dilute all experimental samples with cold GVB++ to the optimal dilution. For assay controls NGPS (100 % control) <strong>and</strong><br />
NHS (assay control), DI water (100 % lysis control). Perform the hemolytic assay.<br />
a. Prepare a optimal dilution of Normal Guinea Pig Serum (NGPS) <strong>and</strong> test specimens in GVB++ these will be samples.<br />
�� ��� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
thoroughly, but gently.<br />
Sample �����������������<br />
c. Prepare controls <strong>and</strong> samples in triplicate– Positive control (D.I. water), Background Control (NGPS, GVB++),<br />
Negative Control (GVB++), <strong>and</strong> Reference Control (GVB++ + NHS). Add the sample to the tubes last.<br />
d. Place the tubes in a 37 °C water bath for 30 minutes, vortexing very gently every 5 minutes. H<strong>and</strong>le tubes carefully<br />
so no water gets inside as this will cause lysis.<br />
e. Centrifuge the tubes at 900 to 1500 X g (2000 rpm) for 10 minutes at 2 – 8 °C.<br />
f. Read supernatants at 540 mn using GVB++ as the blank.<br />
g. Read supernatants at 540 mn using GVB++ as the blank.<br />
�����������������������<br />
serum<br />
�������� ������������<br />
100% Normal<br />
(sample: NGPS@ optimal dilution)<br />
345 10 120 25<br />
Reference (sample: NHS: A100) 345 10 120 25<br />
Positive (sample: sterile H20) 0 0 120 380<br />
On Test (sample: test GP serum) 345 10 120 25<br />
Negative (no sample) 380 0 120 0<br />
h. Use the A540 of NGPS as 100 % control. From the A540 of the test samples calculate % of 100% control <strong>and</strong> plot<br />
accordingly.
11.2 <strong>Technical</strong> Data sheet <strong>and</strong> certificate of analysis (examples)<br />
Complement <strong>Technical</strong> Data Sheet<br />
Normal Human Serum Complement<br />
For Research Use Only. Not for use in Diagnostic Procedures.<br />
Background<br />
Quidel human serum complement st<strong>and</strong>ard is a uniform pool of human serum complement that has been characterized<br />
for levels of complement activation fragments (complement split products) as well as CH50. Because the anticoagulants<br />
used in the preparation of plasma (EDTA, ACD <strong>and</strong> even heparin) can interfere with complement activation in vitro,serum<br />
has long been used as a human complement source for experimentation. Many commercially available sera, however,<br />
are not processed appropriately to conserve complement activity. Lyophilization <strong>and</strong> plasma recalcification can raise<br />
background levels of complement split products (SC5b-9 or TCC, iC3b,Bb, C4d <strong>and</strong> particularly the anaphylatoxins C3a,<br />
C5a <strong>and</strong> C4a) <strong>and</strong> decrease CH50. Sera, however, must be processed quickly <strong>and</strong> correctly to prevent complement turnover.<br />
For this reason, sera obtained from blood banks <strong>and</strong> other large pools may not be suitable for many experimental<br />
procedures. Conversely, in house serum draws are complicated by several factors including the necessity of maintaining<br />
st<strong>and</strong>ardized pools of complement for ongoing experimentation <strong>and</strong> the confidentiality requirements relating to infectious<br />
disease testing. Quidel Normal Human Serum Complement is designed to address these specific issues.<br />
Storage <strong>and</strong> H<strong>and</strong>ling<br />
This product should be stored at or below -70 °C.When needed, it should be thawed rapidly at 37 °C <strong>and</strong> immediately placed<br />
on ice until use.Any remaining sera should be aliquotted into polypropylene tubes in a convenient volume <strong>and</strong> re-frozen at<br />
-70 °C or below. Avoid repeated freeze thaw. Storage at temperatures warmer than -70 °C is not recommended.<br />
Applications<br />
Normal human serum complement is suitable for in vitro experiments relating to complement activation. It has been widely<br />
used in biomaterials research, pharmaceutical development <strong>and</strong> cytotoxicity assays. It is ideal for experiments <strong>and</strong> assays<br />
for which a high level of in vitro complement activity is necessary or a low level of complement activation fragments is<br />
required.<br />
Specifications<br />
Catalog Number: A113<br />
Volume/Vial: 5.0 ml<br />
Storage: ≤ – 70°C<br />
Form: Frozen Liquid<br />
References<br />
[1] Idusogie, E. E.,Presta, L., et al.<br />
Mapping of the C1q binding site on Rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1<br />
FC. J. Immunol 164:4178-4184 (2000).<br />
[2] Hinton, PR., Xiong, J., et al.<br />
An Engineered Human IgG1 Antibody with Longer Serum Half-Life.<br />
J Immunol 176:346-356 (2006).<br />
[3] Dall’Acqua, W.F., Cook, K.E., et al.<br />
Modulation of the Effector Functions of a Human IgG1 through Engineering of Its Hinge Region.<br />
J Immunol 177:1129-1138 (2006).<br />
59
60<br />
Complement <strong>Technical</strong> Data Sheet<br />
Guinea Pig Serum Complement<br />
For Research Use Only in the U.S. Not for use in Diagnostic Procedures.<br />
Background<br />
Quidel guinea pig serum complement is a uniform pool of guinea pig serum that has been characterized for both classical<br />
<strong>and</strong> alternative pathway activity. Guinea pig serum has been in use from the beginning of the twentieth century to the<br />
present for the study of complement activity <strong>and</strong> its relationship to immunity [1-4]. The discovery of guinea pigs deficient<br />
in specific complement fragments has furthered this research. Guinea pig serum is recommended by both the U.S. <strong>and</strong><br />
European Pharmacopoeia for testing the anticomplementary activity of immunoglobulin.<br />
Storage <strong>and</strong> H<strong>and</strong>ling<br />
This product should be stored at or below -70 °C. When needed, it should be thawed rapidly at 37 °C <strong>and</strong> immediately placed<br />
on ice until use. Any remaining sera should be aliquotted into polypropylene tubes in a convenient volume <strong>and</strong> re-frozen<br />
at -70 °C or below. Avoid repeated freeze thaw. Storage at temperatures warmer than -70 °C is not recommended.<br />
Applications<br />
Guinea pig serum complement is suitable for in vitro experiments relating to complement activation. It has been widely<br />
used in biomaterials research <strong>and</strong> pharmaceutical development. It is ideal for experiments <strong>and</strong> assays for which a high<br />
level of in vitro complement activity is necessary or a low level of complement activation fragments is required.<br />
Specifications<br />
Catalog Number: A119<br />
Volume/Vial: 1.0 ml<br />
Concentration: >40 mg protein/ml<br />
Activity: >500 CP50 Units/ml<br />
>50 AP50 Units/ml<br />
Storage: ≤ -70°C<br />
Form: Frozen Liquid<br />
Origin: Manufactured in the USA<br />
References<br />
[1] Moore, H.D.<br />
Complementary <strong>and</strong> opsonic functions in their<br />
relation to immunity: A study of the serum of<br />
guinea-pigs naturally deficient in complement.<br />
J. Immunol 4:425-441 (1919).<br />
[2] Hyde R.R. <strong>and</strong> Parsons E.I.<br />
Quantitative interdependence of sensitizer <strong>and</strong><br />
complement in hemolysis.<br />
Am. J. Epidemiol. 7(1):11-21 (1927).<br />
[3] Muller F. <strong>and</strong> Segerling M.<br />
A factor in guinea-pig serum with accelerating<br />
effect on immune immobilization of Treponema<br />
pallidum (IAF): Isolation, purification <strong>and</strong><br />
differentiation from the known haemolytic<br />
complement components <strong>and</strong> from lysozyme.<br />
Immunology 27:33-41 (1974).<br />
[4] Wooley, R.E. et al.<br />
Comparison of chicken plasma <strong>and</strong> guinea pig<br />
serum in a quantitative microtiter method of<br />
determining microbial complement resistance.<br />
Avian Diseases 35(4):897-900 (1991).
Complement <strong>Technical</strong> Data Sheet<br />
Complement Activator (HAGG) Heat Aggregated Gamma Globulin<br />
For Research Use Only. Not for use in Diagnostic Procedures.<br />
Background<br />
The classical pathway of complement can be triggered by antibody bound to a foreign particle (immune complex, cell or<br />
other material). Particles of this type interact directly with C1q. C1q can then activate the C1r(2)C1s(2) sub-units of the C1<br />
complex. The activated C1s cleaves C4 to C4b near the amino terminus of the gamma chain releasing C4a in the process.<br />
Activation of the Classical Pathway is under stringent control in vivo. C4b is rapidly degraded to iC4b <strong>and</strong> then to C4c<br />
<strong>and</strong> C4d. Because of the short life of the C4b molecule, much of the C4d is free <strong>and</strong> circulates in serum. As such C4d is<br />
an excellent marker for classical complement activation in vivo or in vitro <strong>and</strong> is therefore the basis of the MicroVueTM<br />
C4d EIA Kit (Item A008).<br />
Heat Aggregated Gamma Globulin acts as a potent classical complement pathway activator, functioning similarly to naturally<br />
occurring immune complexes. When activated by a potent activator, such as Quidel’s Complement Activator, nearly<br />
all the C4 in a given complement source may be converted into cleavage products.<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ted<br />
with a referenceserum (Normal Human Serum Complement, Cat. A113) at 37 °C for 90 minutes. At fixed time points,<br />
samples of the reference serum are taken. Ice cold 20 mM EDTA is added to each sample to block further complement<br />
activation; the samples are stored on ice until assay. Upon completion of the activation phase, the resulting samples are<br />
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
a rapid increase in C4d concentration followed by a plateau. Quidel’s complement activator will fully activate the classical<br />
complement pathway of the reference sera within 30 minutes at 37 °C.<br />
Specifications<br />
Catalog Number: A114<br />
Protein Concentration: ~ 50 mg/ml<br />
Volume/Vial: 0.2 ml/vial<br />
Storage: ≤ – 70°C<br />
Buffer: Phosate Buffered Saline (pH 7.3, 20 mM CaCl <strong>and</strong> MgCl)<br />
61
62<br />
Complement <strong>Technical</strong> Data Sheet<br />
Cobra Venom Factor<br />
For Research Use Only. Not for use in Diagnostic Procedures.<br />
Background<br />
Cobra Venom Factor (CVF), sometimes referred to as C3b(Cobra), is the non-toxic, complement activating component of<br />
cobra venom. 1–3 Like naturally occurring C3b, CVF forms a complex with complement components Factor B <strong>and</strong> Factor D.<br />
This CVFBbD convertase is capable of activating C3 in a wide variety of species via the alternative complement pathway.<br />
Unlike the naturally occurring convertase (C3bBbD), the C3b(Cobra)BbD convertase is Factor H resistant <strong>and</strong> is therefore<br />
not inactivated by Factor I or CR1. Given appropriate incubation time, CVF will convert nearly 100 % of the C3 to C3 end<br />
products. Unlike CVF purified from the Naja naja haje species, CVF from Naja naja kaouthia activates the terminal pathway<br />
directly by forming a C5 convertase. 4,5 This depletes C5 in a manner analogous to that described above for C3. Levels of<br />
iC3b, C3a, SC5b-9, C5a <strong>and</strong> the Factor B cleavage product Bb are all extremely high in CVF treated sera.<br />
Storage <strong>and</strong> H<strong>and</strong>ling<br />
Purified CVF may be stored at -70°C until the expiration date listed on the vial <strong>and</strong> the accompanying Certificate of Analysis.<br />
CVF should be thawed rapidly at 37°C <strong>and</strong> immediately placed on ice until use.<br />
Applications<br />
Note: When using any CVF in vivo or in vitro,�����������������������������������������������������������������������������������<br />
vary slightly between preparations <strong>and</strong> suppliers. In general, one unit of CVF is equal to 2 – 6 μg of CVF.<br />
Quidel’s CVF has been used in a variety of in vitro <strong>and</strong> in vivo models to deplete complement. For in vitro experiments,<br />
8 – 20 units/ml of serum is adequate to convert nearly all the available C3 to C3 fragments when incubated with neat<br />
human serum for 60 – 90 minutes at 37° (data on file at Quidel).This will also convert nearly all the available C5 to C5a<br />
<strong>and</strong> SC5b-9.<br />
Quidel’s CVF has also been used successfully in a variety of animal models, 6 – 8 including mice, rats, guinea pigs, various<br />
primates, dogs, pigs <strong>and</strong> sheep to deplete complement in vivo.This application has not been tested or verified at Quidel.<br />
For a list of studies, please refer to Quidel’s exp<strong>and</strong>ed bibliographic references for this product, available upon request<br />
from Quidel <strong>Technical</strong> Service.<br />
Specifications<br />
Catalog Number: A600<br />
Concentration: 1.0 – 1.2 mg/ml<br />
Purity: ≥ 95 % by SDS PAGE<br />
Volume/Vial: 1.0 ml<br />
Activity/Vial: ≥ 350 units<br />
Storage: ≤ – 70 °C<br />
Buffer: Phosphate Buffered Saline<br />
(pH 7.2 ± 0.2)<br />
References<br />
[1] Fritzinger,D.C.,Bredehorst,R.Vogel,C-W<br />
Molecular cloning <strong>and</strong> derived primary structure<br />
of cobra venom factor.<br />
PNAS 91:26, 12775-12779 (1994).<br />
[2] O’Keefe, M.C., Caporale, L.H., Vogel, C-W.<br />
Comparison of the Alpha Chain Fragments<br />
of C30 <strong>and</strong> C3c <strong>and</strong> CVF implications for C3<br />
convertase formation.<br />
Complement 4:3-4 (1987).<br />
[3] Gowda D.C., et al.<br />
Modulation of the Effector Functions of a Human<br />
IgG1 through Engineering of Its Hinge Region.<br />
J Immunol 177:1129-1138 (2006).<br />
[4] Van Den Berg, C.W., et al.<br />
In vivo anti complementary activities of cobra<br />
venom factors from Naja naja <strong>and</strong> Naja haje.<br />
J Immunol Meth 12:6,287-294 (1991).<br />
[5] Bauman, N.<br />
Lack of complement C5 convertase generating<br />
activity in Naja haje cobra venom factor.<br />
J Immunol 120:5, 1763-1764 (1978).<br />
[6] Till, G.O., et al.<br />
Activation of C5 by CVF is required in<br />
nuetrophil-mediated lung injury in the rat.<br />
Am J Pathol 129:144-53 (1987).<br />
[7] Rajasinghe, H., et al.<br />
Key role of the alternative pathway in hyperacute<br />
rejection of rat hearts transplanted into<br />
fetal sheep.<br />
Transplantation 62:3, 407-426, 1996.<br />
8] Koymada, N., Bach, F.<br />
Transient complement inhibition plus T-Cell<br />
immunosuppression induces long term graft<br />
survival of mouse to rat cardiac xenografts.<br />
Transplantation 66:9, 1210-1215 (1998).
Complement <strong>Technical</strong> Data Sheet<br />
Specimen Stabilizing Solution<br />
For Research Use Only. Not for use in Diagnostic Procedures.<br />
Background<br />
The Quidel Specimen Stabilizing Solution, when used in accordance with the procedure described below, will retard the<br />
generation of complement activation fragments <strong>and</strong> complexes in human serum <strong>and</strong> plasma during processing <strong>and</strong> storage.<br />
This product extends the stability of the specimens significantly reducing the likelihood of in-vitro generated elevation of<br />
complement fragments. The Quidel Specimen Stabilizing Solution should be used for stabilizing serum <strong>and</strong> plasma<br />
specimens that cannot be tested or stored at or below -70 °C, within four hours after phlebotomy. The Quidel Specimen<br />
Stabilizing Solution is intended for use with all assays designed to assess complement activation fragments, specifically<br />
���������������������������������������������������������������<br />
Preparation<br />
Warm the bottle containing the Specimen Stabilizing Solution in a 37 °C water bath to dissolve the contents. Mix thoroughly<br />
until the solution is clear. Allow the contents to return to room temperature prior to use.<br />
Procedure<br />
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������<br />
complement activation; this should be performed on ice.<br />
��������������������������������������������������������������<br />
�����������������<br />
Specimen Storage<br />
Stabilized specimens may be stored for up to six days at 4 °C prior to testing or at -20 °C or below for one month. Storage<br />
of unstabilized specimens at -20 °C or warmer will result in complement activation.<br />
Use of Stabilized Specimens<br />
Stabilized specimens should be tested as soon after thawing as possible. As with any complement specimen, thaw at<br />
37 °C. Remove to ice as soon as the specimen has thawed. Do not leave specimens at 37 °C. Since the specimen is already<br />
diluted 1:2 in specimen stabilizer, the required assay dilution should be reduced two-fold (e.g., if the required dilution is 1:50,<br />
make a 1:25 of the stabilized specimen). Normal ranges should be determined for stabilized specimens independently. In<br />
some assays, the concentration of the analyte will differ slightly between stabilized <strong>and</strong> unstabilized specimens.<br />
Specifications<br />
Catalog Number: A9576<br />
Volume/Vial: 25 mL<br />
Storage: 2 – 20 °C<br />
63
64<br />
Complement <strong>Technical</strong> Data Sheet<br />
Normal Human Complement St<strong>and</strong>ard<br />
For Research Use Only. Not for use in Diagnostic Procedures.<br />
Background<br />
Quidel’s human complement st<strong>and</strong>ard is a uniform pool of human serum complement that has been characterized for<br />
levels <strong>and</strong> activities of a variety of complement proteins. Unlike lyophilized complement sources, Quidel complement<br />
st<strong>and</strong>ard maintains high levels of complement hemolytic activity <strong>and</strong> antigenic integrity. For this reason it is an ideal external<br />
st<strong>and</strong>ard for a variety of laboratory functional <strong>and</strong> antigenic assays for specific complement proteins (e.g., CH50,<br />
APH50, RID, C3 H50, etc.)<br />
Sera obtained from blood banks <strong>and</strong> other large pools may not be suitable for many procedures due to high levels of<br />
background complement activation. Conversely, in house serum draws are complicated by several factors including the<br />
necessity of maintaining st<strong>and</strong>ardized pools of complement for ongoing experimentation <strong>and</strong> the confidentiality requirements<br />
with regard to infectious disease testing.<br />
Characterization <strong>and</strong> Testing/Analysis <strong>and</strong> Testing<br />
Quidel’s Human Complement St<strong>and</strong>ard has been tested for antigenic levels of C1q, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9,<br />
Factor B, Factor H <strong>and</strong> Factor P, by Radial Immuno-Diffusion (RID). Functional levels of the complement proteins<br />
C1q, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 <strong>and</strong> Factor B <strong>and</strong> Factor D have been determined by st<strong>and</strong>ard hemolytic assay.<br />
Classical pathway hemolytic activity (CH50) <strong>and</strong> alternative pathway hemolytic activity (AH50) have also been measured<br />
by st<strong>and</strong>ard techniques. Levels of the complement fragment iC3b, a measure of C3 cleavage,were assessed using the<br />
MicroVueTM iC3b EIA kit.<br />
Storage <strong>and</strong> H<strong>and</strong>ling<br />
This product should be stored at or below -70 °C. Storage at temperatures warmer than -70 °C is not recommended.<br />
When needed, it should be thawed rapidly at 37 °C <strong>and</strong> immediately placed on ice until use. Refer to the Certificate of<br />
Analysis for this product for specific h<strong>and</strong>ling instructions. Any remaining sera should be aliquotted into polypropylene<br />
tubes <strong>and</strong> refrozen at -70 °C or below. Avoid repeated freeze thaw.<br />
Applications<br />
This product is intended for use in a research setting as a st<strong>and</strong>ard material for complement assays. Protocols for the RID,<br />
hemolytic <strong>and</strong> other assays used in the characterization of this product are available from Quidel <strong>Technical</strong> Service. This<br />
product should not be used in experiments where measurement of in vitro complement activation (e.g. complement<br />
biocompatibility) is required. Quidel provides Item A113 expressly for use in these applications.<br />
Specifications<br />
Catalog Number: A100<br />
Volume/Vial: 1.0 ml<br />
Storage: ≤ – 70°C<br />
Form: Frozen Liquid
Example<br />
only<br />
65
66<br />
Example<br />
only
Example<br />
only<br />
67
68<br />
Example<br />
only
Example<br />
only<br />
69
Example<br />
only<br />
71
Complement System<br />
Classical<br />
Pathway<br />
Factor<br />
D<br />
Factor<br />
P<br />
Factor<br />
I<br />
C4BP<br />
C1-<br />
INH<br />
C1C<br />
C1q<br />
C4<br />
C1s<br />
C1r<br />
LPS<br />
C3<br />
Tickover<br />
C3i<br />
Factor<br />
B<br />
Bb<br />
C2<br />
C4b<br />
C2a<br />
Proteases<br />
MASP2<br />
MASP1<br />
MBL<br />
-CHO<br />
Alternative<br />
Pathway<br />
Ba<br />
C3<br />
Convertase<br />
C2b<br />
C4d<br />
C4c<br />
C4a<br />
Lectin<br />
Pathway<br />
Amplification<br />
Loop<br />
Factor<br />
I<br />
Factor<br />
H<br />
C3<br />
C3a<br />
C3f<br />
Regulatory Proteins<br />
C3b<br />
DAF<br />
CRI<br />
Surface<br />
C3b<br />
C3c<br />
CD59<br />
MCP<br />
C5<br />
Convertase<br />
iC3b<br />
C5<br />
C5a<br />
SProtein<br />
C3d.g<br />
= Regulatory Proteins<br />
Terminal<br />
Pathway<br />
C5b<br />
Clusterin<br />
= Activators<br />
C6<br />
*MicroVue Products<br />
are indicated in green<br />
C7<br />
SC5b-9<br />
(TCC)<br />
Complement Receptors<br />
C8<br />
C9<br />
C1qR<br />
C5aR<br />
C3aR<br />
MAC Assembly<br />
(TCC)<br />
CR4<br />
CR3<br />
CR2<br />
CR1<br />
Quidel Corporation • Specialty Products Group • 2981 Copper Road, Santa Clara, CA 95051 • www.quidel.com
74<br />
Notizen
Notizen<br />
75
The Specialist for Biochemical Markers<br />
For further information please contact: / Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an: / Pour plus d’informations, vous pouvez contacter:<br />
Exclusive Strategic Partnership in Europe:<br />
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