Clinical and Technical Review - Tecomedical

Clinical and 

Technical Review 

Komplementdiagnostik 

Hämokompatibilitätstestung 

von Medizinprodukten, Pharmaka 

und Blutprodukten

2 

Inhaltsverzeichnis 

Komplementdiagnostik – 

Hämokompatibilitätstestung von Medizinprodukten, Pharmaka und Blutprodukten 

1 Das Komplementsystem . ....................................................................... 3 

2 Diagnostik des Komplementsystems . ............................................................. 4 

3 Biokompatibilitätstestung unterschiedlicher Materialien . .............................................. 7 

4 Komplementmessung zur Prüfung der Biokompatibilität . ............................................. 11 

5 In-vitro-Untersuchung zur Biokompatibilität . ....................................................... 15 

5.1 Experimentelles Design . .................................................................. 17 

5.2 Versuchsanordnung . ..................................................................... 18 

6 Messung der Komplementaktivierung in Seren von Nicht-Primaten mittels hämolytischem Assay – CxH50 . ..... 22 

6.1 Experimentelles Design CxH50 . ............................................................ 24 

7 Literaturhinweise . ............................................................................ 26 

8 Komplement- und Biokompatibilität Produkte . ..................................................... 27 

8.1 Komplement ELISA Kits . ................................................................. 27 

8.1.1 Kreuzreaktionen von Komplementfragmenten im ELISA mit Proben von Primaten . ............... 38 

9 Komplement-Antikörper und Reagenzien . ......................................................... 40 

10 Komplement-spezifische Antiseren: Applikationen . .................................................. 42 

10.1 Produktinformation zu monoklonalen Antikörpern . ............................................. 44 

10.2 Kreuzreaktionen Tierspezies – Monoklonale . .................................................. 46 

10.3 Kreuzreaktionen Tierspezies – Polyklonale Antikörper . .......................................... 47 

11 Appendix .............................................................................. 49 

11.1 Assay Protokolle (Beispiele) . ............................................................. 49 

11.1.1 Prüfung auf Aktivierung des Komplementsystems am Beispiel von Liposomenpräparationen . ....... 50 

11.1.2 Messung der Komplementaktivierung in Seren von Nicht Primaten (CxH50) . .................... 54 

11.2 Technische Daten Blätter und Analyse Zertifikate (Beispiele) . ................................. 59 

Normal Human Serum Complement (A113) . .................................................. 59 

Guinea Pig Serum Complement (A119) . ...................................................... 60 

HAGG Activator (A114) . .................................................................. 61 

Activator Cobra Venom Factor (A600) . ....................................................... 62 

Specimen stabilizer (A9576) . .............................................................. 63 

Normal human complement Standards (A100) . ................................................ 64 

04/2011

1. Das Komplementsystem 

Das Komplementsystem als Teil des angeborenen Immunsystems 

dient primär der Eliminierung pathogener 

Organismen. Durch proteolytische Spaltung von inaktiven 

Komplementproteinen werden reaktive Effektoren gebildet, 

die sich zu enzymatisch aktiven Proteinkomplexen zusammenfügen. 

Die Haupteffekte des aktivierten Komplementsystems 

bestehen 

�� 

eine Vasodilatation bewirken, die Ausschüttung von Histamin 

induzieren und chemotaktische Aktivität auf Effektorzellen 

der Entzündungsreaktion ausüben. 

�� 

Organismen (Opsonisierung) um diese den Phagozyten 

zu präsentieren sowie 

�� 

C5b-9 (Membran-Attack-Complex-MAC) [1], der zur Bildung 

von Zellmembran-Poren und letztlich zur Lyse der 

Zelle führt. 

Aufgrund der starken zell- und gewebszerstörenden Effekte 

des aktivierten Komplementsystems besteht eine 

strenge Kontrolle durch Regulatorproteine/Inhibitoren. 

Überschießende Aktivierung kann zu lebensbedrohlichen 

Entzündungszuständen führen. Mängel oder Defekte der 

Komplementproteine oder der Regulatoren haben zahlreiche 

Krankheitsbilder zur Folge. 

Eine überschießende Komplementaktivierung kann ebenso 

durch den intra- oder extrakorporalen Kontakt mit hämoinkompatiblen, 

synthetischen Medizinprodukten, Blutprodukten 

und Pharmaka ausgelöst werden. 

Quidel ® bietet Enzymimmunoassays zur quantitativen Bestimmung 

von Komplement-Aktivierungsprodukten, zirkulierenden 

Immunkomplexen sowie zur Bestimmung der 

Gesamthämolytischen Aktivität des klassischen bzw. alternativen 

Aktivierungsweges an. Daneben steht ein zuverlässiger 

ELISA zur Erfassung funktionell aktiven C1-Inhibitors 

zur Verfügung. 

Eine breite Palette monoklonaler und polyklonaler Komplementantikörper, 

Mangelplasmen und Reagenzien (z. 

B. Cobra venom faktor) für die Komplementanalytik vervollständigen 

das Portfolio. Quidel ® Komplementprodukte 

werden sowohl bei klinischen Fragestellungen als auch zur 

Prüfung der Hämokompatibilität von Medical Devices und 

Pharmaka eingesetzt. 

Classical 

Pathway 

C1- 

INH 

C1C 

C1q 

C1r 

C1s 

Aktivierung und Regulierung des Komplementsystems 

Proteases C4 

Komplementproteine liegen im Plasma in inaktiver Form vor. Man bezeichnet sie als Komplementfaktoren C1-C9. Nach 

Aktivierung des Systems werden die Komplementfaktoren gespalten; z.B. C3 in C3a und C3b. Die Spaltprodukte reagieren 

miteinander und bilden Komplementkomplexe z.B. den C4b2a-Komplex. 

MASP2 

MASP1 

MBL 

Aufgrund unterschiedlicher Aktivierung unterscheiden wir drei Wege (Pathways): 

1. Klassischer Weg (Classical Pathway) 

2. Lektin-Weg (Lectin Pathway) 

3. Alternativer Weg (Alternative Pathway) 

-CHO 

C3aR C5aR C1qR 

CR1 

Lectin 

Pathway 

Complement Receptors 

CR2 

CR3 

C3c 

C3d.g 

Complement System 

SC5b-9 

(TCC) 

C3f 

iC3b 

C4BP 

C4b 

C2 

Factor 

I 

C4a C4c C4d C2b 

C3a 

C5a 

C2a 

C3 

C5 

Factor 

P 

Bb 

C3 

Convertase 

Factor 

H 

C5 

Convertase 

C5b 

C6 

C7 

C8 

C9 

C3b 

SProtein 

Clusterin 

Factor 

I 

Factor 

D 

Factor 

B 

Ba 

Surface 

C3i 

Amplification 

Loop 

Terminal 

Pathway 

C3 

Tickover 

CR4 

MAC Assembly 

(TCC) 

Quidel Corporation • Specialty Products Group • 2981 Copper Road, Santa Clara, CA 95051 • www.quidel.com 

Abbildung 1: 

Stark vereinfachte Darstellung des Komplementsystems. 

C3b 

Alternative 

Pathway 

Regulatory Proteins 

CRI DAF 

MCP 

CD59 

LPS 

= Regulatory Proteins 

= Activators 

*MicroVue Products 

are indicated in green 

3

4 

Der klassische Aktivierungsweg startet durch die Bindung der Untereinheit C1q vom C1 an einen Antigen-Antikörper- 

Komplex. Die Untereinheit C1s wird aktiv und spaltet seinerseits C4 und C2 in C4a und C4b sowie C2 in C2a und C2b. 

Die neuen Spaltprodukte bilden nun den C4bC2a Komplex, der als C3 Konvertase bezeichnet wird und nun seinerseits 

C3 in C3a und C3b spaltet. Bei der Aktivierung des Lektinwegs erkennt Mannose-bindendes Lektin (MBL) spezifische 

��dung 

der C3 Konvertase C4bC2a und somit zur Spaltung von C3 in C3a und C3b führt. Die Aktivierung des alternativen 

�� 

C3a diffundiert und besitzt eine chemotaktische und entzündungsauslösende Wirkung als Anaphylatoxin. C3b kann an 

�� 

�� 

alternative Komplementweg zwischen „Selbst“ und „Fremd“ unterscheiden. Weitere Reaktionsschritte führen zur Anlagerung 

von Faktor B, wobei durch proteolytische Spaltung von Faktor D das Fragment Ba freigesetzt wird, während das 

Fragment Bb assoziiert bleibt. Die gebildete C3-Konvertase des alternativen Wegs (C3bBb) besitzt enzymatische Aktivität 

und verstärkt durch eine Amplifikationsschleife die Bildung von weiteren C3b-Molekülen. Die biologische Halbwertszeit 

von C3bBb wird durch Anlagerung von Properdin (P) verlängert. Die C3-Konvertasen (C3bBb und C4bC2b) aller Aktiverungswege, 

spalten nun mit hoher Aktivität weitere C3Moleküle in C3b und C3a. Dies führt zur Beladung der Zielstruktur 

mit vielen C3b Molekülen (Opsonisierung) und zur Phagozytose der Zelle. Andere C3b Moleküle binden an die C3 Konvertasen 

und es entstehen die C5- Konvertasen (C4b2b3b bzw. C3bBb3b). Freies C3b wird durch Faktor H und Faktor I 

inaktiviert. C5 wird durch die C5- Konvertasen in C5a (Anaphylatoxin) und C5b gespalten, das als Anker an der Zielzelle 

durch Bindung der weiteren Komplementfaktoren den lytischen Komplex C5b-9 (TCC=terminaler ComplementComplex) 

bildet, was zu einer Porenbildung in der Zellmembran und letztlich zur Lyse führt. 

Nach der Initiierung der Komplementkaskade ist die Aktivierung nicht spezifisch, d. h. Moleküle können auf jeder in der 

�� 

Einige sezernierte Regulatoren wie der C1-Inhibitor (inaktiviert den C1-Komplex), das C4-Bindungsprotein (C4BP), Faktor 

I und Faktor H beschleunigen die Dissoziation der beiden C3-Konvertasen und inaktivieren die C4b- und C3b-Moleküle. 

Membrangebundene Komplementregulatoren wie MCP (Membran-Cofaktor-Protein, CD46), DAF (Decay Accelerating 

Factor, CD55) und Protektin (CD59) können den Zerfall der C3-Konvertasen beschleunigen bzw. die Integration des C5b- 

9-Komplexes verhindern. 

Wechselwirkungen des Komplementsystems 

Das Komplementsystem ist nicht nur ein humorales Abwehrsystem, sondern kann zusätzlich als Vermittler der zellulären 

Abwehrkaskade wirken. So führt die Aktivierung der Leukozyten auch zur Aktivierung des Gerinnungs-, Fibrinolyse-und 

Kontaktphasensystems (Kininogen-Kinin-System) und die Leukozyten ihrerseits aktivieren wieder in positiver Rückkopplung 

das Komplementsystem. Dieser stark ausgeprägte positive Feedback-Mechanismus kann insbesondere durch eine fehlende 

Rückkopplung des Komplementsystems mit dessen terminalem Endprodukt eintreten und zu pathophysiologischen 

�� 

den Initialphasen der klassischen Komplementaktivierung (C1) und dem Kontaktphasensystem sowie dem Schlüsselenzym 

der Fibrinolyse (Plasmin) sind sowohl in vitro als auch in vivo beschrieben worden. Eine Plasminaktivierung kann sowohl 

über endothelialen t-PA-Release als auch über kallikreinaktivierte Urokinase stattfinden. Plasmin kann den ersten Faktor 

der Komplementkaskade (C1) direkt oder über die Freisetzung des F-XII-Spaltprodukts ß-F XIIa aktivieren. Beim Kontakt 

von Blut mit nicht körpereigenen Materialien (Medizinprodukten) muss daher mit einer Komplementaktivierung gerechnet 

werden. 

2. Diagnostik des Komplementsystems 

Das Komplementsystem ist ein streng reguliertes System und ein Defekt kann gewaltige Auswirkungen mit verschiedenartigen 

pathologischen Folgezuständen haben. 

Indikationen für Komplementdiagnostik sind: 

�� 

�� 

�� 

Komplementdefekte können primär (hereditär) oder sekundär (erworben) sein. Die angeborenen Fälle machen ca. 10 % 

aller primären humoralen Immundefekte aus und werden in der Regel autosomal rezessiv vererbt. Demzufolge bleiben 

heterozygote Träger klinisch meist unauffällig. Sekundäre Defizienzen werden durch Komplementverbrauch, verminderte 

Synthese und/oder gesteigerten Katabolismus verursacht. Während ein Fehlen der Komponenten der klassischen Aktivierungssequenz 

(C1, C4, C2) oftmals mit Autoimmunprozessen assoziiert ist (SLE und Lupus-ähnliche Krankheitsbilder), 

prägen rezidivierende bakterielle Infektionen das klinische Bild bei Defekten der Komponenten C3 bis C8. Insbesondere 

bei Defizienz der späten Komponenten herrschen Infektionen mit Neisserien vor. Defekte wurden für nahezu alle Komplement- 

und Regulatorproteine mit Ausnahme des Faktors B beschrieben.

Die Erforschung der funktionalen Wirkung der einzelnen Komplementfaktoren wurde durch das Auftreten von Krankheiten, 

bei denen ein Mangel einzelner Faktoren oder Regulatoren vorliegt, wesentlich erleichtert. Komplement-assoziierte 

Krankheitsbilder können einerseits auf Komplementdefekte zurückgeführt werden, andererseits kann die Komplementaktivierung, 

insbesondere bei falsch pathophysiologischen Reaktionen, stark zellzerstörende Eigenschaften entwickeln und 

für massive Gewebeschäden verantwortlich sein. Für die Diagnostik werden sowohl erhöhte als auch verminderte Werte 

der unterschiedlichen Komplementfaktoren oder ihrer Metaboliten genutzt: 

Krankheitsbilder Assoziierte Komplementfaktoren 

systemischer Lupus erythema-todes (SLE) und 

Lupusnephritis CP: C4d Nachweis 

CH50, C3, C4 ↑ 

C1, C4, C2 and C3, Factor B ↓ 

Herzinfarkt und Schlaganfall terminaler Weg [SC5b-9] und Anaphylatoxine, ↑ 

insbesondere C5a 

Vaskulitis, Glomerulonephritis Verbrauch von C3, C4 

Angioödeme, Capillary-Leak-Syndrom C1-INH 

hämolytisch-urämisches Syndrom Faktor H 

rheumatoide Arthritis Faktor H, C3d, C1q 

Transfusionsreaktionen, Transplantation/ 

Allotransplantat-abstoßung 

klassischer Weg C4d 

altersbedingte Makuladegeneration (AMD) Faktor H, C3, C5 

Alzheimer C3, C5, SC5b-9, Faktor H, E100 

Polytrauma, Verbrennung, Sepsis C5a 

akutes respiratorisches Distress-Syndrom (ARDS), 

Multiorganversagen 

C5a 

diabetische Ketoazidose (DKA) C3a and sC5b-9 

Abbildung 2 

Aufstellung der Komplementfaktoren und damit assoziierten Krankheitsbildern 

Komplement Mangel assoziierte Krankheitsbilder 

Komplementfaktoren 

C1, C4, C2 

SLE, Lupus-ähnliches Syndrom 

(rezidivierende Infektionen) 

C3 rezidivierende schwere bakterielle Infektionen 

C5 – C8, MBL 

rezidivierende bakterielle Infektionen 

(vor allem Neisserien) 

C9 überwiegend keine 

Regulatoren 

C1 Inhibitor hereditäres Angioödem 

Faktor I, Properdin rezidivierende Infektionen 

Faktor H hämorrhagisch-urämisches Syndrom (HUS), MPGN 

DAF, C8bp, CD59 paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie 

Rezeptoren 

CR 1 SLE 

CR 3, CR 4 rezidivierende Infektionen 

(CD11b/c, CD18) (Leukozyten-Adhäsions-Defekt, LAD) 

Abbildung 3: 

Darstellung der Komplementfaktoren und damit assoziierten Krankheitsbildern 

5

6 

Methoden für die Komplementanalytik 

Gesuchter Parameter Methoden der Komplementanalytik 

Gesamtfunktion 

Klassischer Weg CH50: ELISA, hämolytische Titration 

Alternativweg APH50: ELISA, hämolytische Titration 

Lektin-Weg hämolytische Titration, ELISA 

Einzelfaktoren 

Proteinbestimmung: C1q, C2 – C9 hämolytische Titration, ELISA 

Funktionale Bestimmung: C1 – C9 hämolytische Titration (Mangelserum) 

Aktivierungsprodukte – alle Wege 

C3a, iC3b, C5a, SC5b-9 ELISA 

C3d ELISA, Rocketelektrophorese 

Aktivierungsprodukte – klassischer Weg 

C1rs C1- Inhibitor ELISA 

C4a, C4d ELISA 

Aktivierungsprodukte – Alternativweg 

C3b (Bb) P ELISA 

Ba, Bb ELISA 

Aktivierung der terminalen Sequenz 

C5a, SC5b-9 ELISA 

Regulatoren 

C1-Inhibitor-Protein (C1-Esterase-Inhibitor) (C1-INH) Nephelometrie, RID, ELISA 

C1-Inhibitor-Funktion Enzyminhibitionstest, ELISA 

Faktor-H- und Faktor-I-Protein ELISA, Rocketelektrophorese 

Faktor-H- und Faktor-I-Funktion hämolytischer Test 

Carbopeptidase N Enzymtest mit chromogenem Substrat 

DAF, C8bp, CD59 Protein �� 

DAF, C8bp, CD59 Funktion Säure-Hämolyse-Test 

C3-Nephritisfaktor Immunfixation, hämolytischer Test 

Faktor P – Properdin ELISA 

Faktor B – C3-Proaktivator ELISA, RID 

Zirkulierende Immunkomplexe 

Zirkulierende Immunkomplexe – C1q-Fragmente CIC-C1q ELISA 

Zirkulierende Immunkomplexe – C3-Fragmente CIC-RCR ELISA 

Abbildung 4

3. Biokompatibilitätstestung unterschiedlicher Materialien 

Der Begriff Biokompatibilität (gr. bios = Leben, kompatibel = verträglich) beschreibt im weitesten Sinne die Verträglichkeit 

von Werkstoffen mit lebendem Körpergewebe (Knochen, Weichgewebe, Blut). Eine exakte Definition in physikalischen 

und chemischen Einheiten ist bisher noch nicht gelungen. Die heute eingesetzten Materialien sollten sich im Körper inert 

�� 

wird intensiv daran geforscht, Biokompatibilität zu verstehen und Werkstoffe zu entwickeln, die im Körper physiologisch 

adaptiert werden und eine funktionelle Gewebeintegration ermöglichen. 

Streng genommen muss der Begriff Biokompatibilität in die Bereiche Zytokompatibilität (Zell- und Gewebeverträglichkeit) 

und Hämokompatibilität (Blutverträglichkeit) gegliedert werden. Die Frage der Zytokompatibilität ist für Langzeitimplantate 

von primärer Bedeutung. Implantat ist eine zusammenfassende Bezeichnung für alle Materialien, die zur Erfüllung einer 

bestimmten Ersatzfunktion für einen begrenzten Zeitraum oder auf Lebenszeit in den Körper eingebracht werden. Im Gegensatz 

zum Transplantat besteht ein Implantat üblicherweise aus unbelebter Materie (Ausnahmen sind z. B. endothelialisierte 

Stents oder biologische Herzklappen). Da viele Implantate nicht nur mit Gewebe sondern auch mit Blut (zumindest für eine 

gewisse Zeit während der operativen Phase der Implantation) in Kontakt kommen, spielt außerdem die Hämokompatibilität 

eine bedeutende Rolle. Für den Bereich „extrakorporale Zirkulation“ ist aufgrund der kurzen einmaligen Einsatzdauer nur 

die Hämokompatibilität von Relevanz. 

Medizinprodukte können für sehr unterschiedliche Blutkontaktzeiten konzipiert sein: 

�� 

�� 

�� 

Blutkontaktierendes Produkt Blutkontaktierendes Material Anzahl 

Katheter �� 200 Mio. 

Stents Edelstahl, Styren-Isobutylen-Polymer, Magnesium 4 Mio. 

Führungsdrähte Edelstahl, Nitinol mehrere Millionen 

Dialysatoren Polyacrylonitril, Polysulfon, Zellulose 1.2 Mio. 

Oxygenatoren (HLM) Hohlfasern (PP etc.) ~1 Mio. 

Schrittmacher Silikon, Polyurethan, Platin 300,000 

Gefäßprothesen �� 200,000 

Herzklappen Titan, Karbon, Dacron, fixiertes natürliches Gewebe 200,000 

Künstliche Lungen Silikon, PP etc. 20,000 

Herzunterstützungssysteme Polyurethan etc. 1,000 

Abbildung 5: 

Überblick über die Anzahl viel verwendeter Medizinprodukte mit Blutkontakt (modifiziert nach Rutner) 

Probleme der Hämokompatibilität 

Buddy Rutner [4] beschreibt in seinem etwas provokanten Übersichtsartikel „The Catastrophe Revisited: Blood Compatibility 

in the 21st Century“ äußerst treffend das Unvermögen der Forschungsgemeinde im Bereich Biomaterialien, sich trotz 50 

Jahren intensiver Forschung auf eine genaue Defintion des Begriffs „Blutkompatibilität“ zu einigen [5]. 

Er stellt fünf Hypothesen auf, warum der Fortschritt zum klaren Verständnis der Blutkompatibilität so langsam verläuft: 

Hypothese 1: Es ist unmöglich, ein komplett blutkompatibles Material herzustellen. 

Hypothese 2: Wir verstehen die biologischen Vorgänge der Blutkompatibilität nicht. 

Hypothese 3: Wir wissen nicht, wie wir Blutkompatibilität testen sollen. 

Hypothese 4: Bestimmte Materialien natürlichen Ursprungs scheinen eine bessere Blutkompatibilität zu besitzen, 

aber wir wissen nicht warum. 

Hypothese 5: Mittlerweile stehen besser blutverträgliche Materialien zur Verfügung, aber die regulatorischen und 

ökonomischen Rahmenbedingungen verhindern eine Umsetzung in die klinische Praxis. 

7

8 

Strategien zur Verbesserung der Hämokompatibilität von Fremdoberflächen 

Die zur klinischen intra- oder extrakorporalen Applikation gehörigen „medizintechnischen Produkte“ umfassen ein weites 

Spektrum an Kunststoffen: Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid (PVC), Polyester, Polystyren, Polyurethan, Silikon, 

�� 

viele metallische Werkstoffe wie Edelstahl, Titan und deren Legierungen verwendet. Obwohl diese Produkte ausgezeichnete 

mechanische und physikalische Eigenschaften besitzen, wurden sie doch ursprünglich für den industriellen Einsatz 

entwickelt und erst sekundär im biomedizinischen Bereich eingesetzt [9]. Da sich alle diese Werkstoffe durch den Nachteil 

einer mehr oder weniger starken Hämoinkompatibilität auszeichnen, kann dies bei Blutkontakt zu einer pathophysiologischen, 

dem traumatischen Schock ähnlichen Antwort des Organismus führen. Beispielsweise kommt bei kardiopulmonalen 

Bypass-Operationen unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine das gesamte Blut des Patienten über einen Zeitraum von 

��siven 

Aktivierung der humoralen und zellulären Abwehrmechanismen gegen den vermeintlich pathogenen „Eindringling“ 

reagiert und somit der Ablauf der verschiedenen Kaskadensysteme in Gang gesetzt wird. 

�� 

�� 

die unspezifische Adsorption von Proteinen (Fibrinogen, C3 etc.), die durch Konformationsänderungen zu Signalstoffen 

�� 

eigentliche Matrix für die Adhäsion von Blut- und Gewebezellen sowie die Bakterienkolonisation darstellen. 

In den letzten Jahren wurde von den Medizingeräteherstellern vermehrt der Versuch unternommen, durch die Entwicklung 

�� 

[10]. Mehr denn je besteht jedoch die dringende Notwendigkeit, die Anstrengungen zur Optimierung der präklinischen 

Evaluierungsstrategien von blutkontaktierenden Medizinprodukten zum Wohle des Patienten zu verstärken. 

Internationaler Standard ISO 10993 

Der Aspekt der Hämokompatibilität von Medizinprodukten wird leider häufig noch etwas stiefmütterlich behandelt. Weder 

die US-amerikanische „Food and Drug Administration“ (FDA) noch die europäischen Direktiven oder die deutsche „Zentralstelle 

der Länder für Gesundheitsschutz bei Arzneimitteln und Medizinprodukten“ (ZLG) haben bisher eindeutige qualitative 

und quantitative Richtlinien für die Blutverträglichkeit von Kunststoffen vorgegeben. Sogar die Durchführungsnorm ISO 

10993-4 (Prüfung zur Wechselwirkung mit Blut) ist relativ unkonkret und sehr offen verfasst. 

Die ISO 10993 beinhaltet nachfolgende Teilbereiche, die unter die Rubrik 

„Biologische Evaluierung von Medizingeräten“ fallen: 

Teil 1: Evaluierung und Prüfung 

Teil 2: Anforderungen für den Tierschutz 

Teil 3: Tests auf Genotoxizität, Karzinogenität und reproduktive Toxizität 

Teil 4: Auswahl von Tests für Wechselbeziehungen mit Blut 

Teil 5: Tests für In-vitro-Zytotoxizität 

Teil 6: Tests für lokale Auswirkungen nach der Implantation 

Teil 7: Ethylenoxid-Sterilisationsrückstände 

Teil 8: Auswahl und Eignung des Referenzmaterials für biologische Tests 

Teil 9: Rahmenbedingungen für die Identifizierung und Quantifizierung potenzieller Abbauprodukte 

Teil 10: Tests auf Reizung und Sensibilisierung 

Teil 11: Tests für systemische Toxizität 

Teil 12: Probenvorbereitung und Referenzmaterialien 

Teil 13: Identifizierung und Quantifizierung von Abbauprodukten aus polymerhaltigen Medizinprodukten 

Teil 14: Identifizierung und Quantifizierung von Abbauprodukten aus Keramik 

Teil 15: Identifizierung und Quantifizierung von Abbauprodukten aus Metallen und Legierungen 

Teil 16: Toxikokinetisches Studiendesign für Abbauprodukte und auswaschbare Substanzen 

Teil 17: Festlegung zulässiger Grenzen für auswaschbare Substanzen 

Teil 18: Chemische Charakterisierung von Materialien 

Note: Bitte beachten: Eine neue Fassung der ISO 10993-4 wird 2012 in Kraft treten.

Der Durchführungsstandard ISO 10993-4, „Auswahl von Prüfungen zur Wechselwirkung mit Blut“, Version 2002 (zweite 

�� 

Er gilt für die folgenden Medizinprodukte: 

1. Externe Medizinprodukte, die nicht mit zirkulierendem Blut in Berührung kommen, sind u.a.: 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� Geräte für die Lagerung und Verwaltung von Blut und Blutprodukten (z. B. Schläuche, Nadeln und Beutel) 

� �� 

2. Externe Medizinprodukte, die mit zirkulierendem Blut in Berührung kommen, sind u. a.: 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

3. Implantate, die weitgehend oder vollständig in das Gefäßsystem eingebracht werden, sind u. a.: 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

Für die o. a. Medizinprodukte müssen entsprechend der ISO 10993-4 mindestens ein, mitunter auch mehrere Tests aus 

nachfolgender Liste durchgeführt werden: 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

� �� 

9

10 

Als Testmethoden zur Evaluierung der Komplementaktivierung von Medizinprodukten werden in der ISO 10993-4 folgende 

Parameter vorgeschlagen: C3a, C5a, Bb, iC3b, C4b, SC5b-9, CH50, C3-Konvertase, C5-Konvertase. 

Zusätzlich wird auf die Empfehlungen der „American Society for Testing and Materials“ verwiesen: 

ASTM F1984-99, Standard Practice for Testing for Whole Complement Activation in Serum by Solid Materials 

ASTM F2065-00, Standard Practice for Testing for Alternative Pathway Complement Activation in Serum 

by Solid Materials 

Als Testsysteme sollen statische und dynamische Systeme eingesetzt werden (siehe Kapitel 4 und 5). 

Pharmaka, Blutprodukte, Infusionslösungen 

Prinzipiell sollten alle intravenös applizierten Pharmaka, wie z. B. Antikörper (passive und humanisierte), Oligonukleotide 

(Antisense-Therapie), Infusionslösungen und Blutprodukte (Plasma, Albumin, Gerinnungsfaktoren etc.) in Bezug auf eine 

direkte Komplementaktivierung getestet werden (Testung von C3a oder SC5b-9). Zudem ist die Erfolgsbeurteilung von 

immunsuppressiven Therapien, Plasmaaustauschbehandlungen und von Immunglobulintransfusionen (IVIG) oft von einer 

wiedergewonnenen Homöostase des Komplementsystems abhängig (Testung von C3a oder C4d). Beim hereditären Angioödem 

(HAE) wird mit C1-Inhibitorkonzentrat oder aus Spenderblut isoliertem rekombinanten C1-Inhibitor erfolgreich 

therapiert. 

Auch die auf dem neuen Gebiet des Tissue Engineering entstehenden Produkte (natives Gewebe und Zellen; mit und 

ohne Polymer-Gerüst) bedürfen vor dem klinischen Einsatz einer eingehenden Prüfung in Bezug auf ihr komplementaktivierendes 

Potenzial. 

Bei der Therapie mit monoklonalen Antikörpern wird über die C1q-Bindungsstelle der schweren Kette des Maus-IgG eine 

Komplementaktivierung ausgelöst. Die Klasse der humanisierten Antikörper wurde eingeführt, da sich durch deren Einsatz 

diese Aktivierung verringert. 

In neuerer Zeit wurden unterschiedliche Therapeutika zur Aktivierung oder Inhibition des Komplementsystems entwickelt. 

Spezielle Komplementinhibitoren wie Eculizumab (ein monoklonaler Antikörper gegen C5) blockiert die terminale Aktivierung. 

Eculizumab wird gegen die paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) eingesetzt, eine seltene erworbene und 

lebensbedrohliche Erkrankung blutbildender Stammzellen (CD59-Defekt auf Erythrozytenmembran). 

Weitere peptidbasierte Komplementinhibitoren (C3, C5) werden derzeit intensiv erforscht.

4. Komplementmessung zur Prüfung der Biokompatibilität 

Wie in Kapitel 1 ausführlich behandelt, dient das Komplementsystem der Klärung von Immunkomplexen und stellt ein 

lytisches System zur Beseitigung von pathogenen Mikroorganismen dar. Das zentrale Ereignis in der Komplementkaskade 

ist die enzymatische Spaltung von C3 in C3b und C3a, initiiert von zwei C3-Konvertasen (C4b,2a und C3b,Bb), welche 

durch alle drei Komplementwege aktiviert werden können. 

Klassischer Weg 

Antikörper C1-Komplexe 

Aktivierungsweg des Komplementsystems 

C4-Aktivierung 

Lektin-Weg 

MBL-MASP2-Komplexe 

C3-Aktivierung 

Terminaler Weg 

Alternativer Weg 

Aktive Oberflächen 

Abbildung 6: 

Schematische Darstellung der Komplementkaskade. Die Komplementaktivierung durch körperfremde Oberflächen kann über den klassischen, den 

Lektin- und alternativen Weg erfolgen. Auslösendes Moment für den klassischen und den Lektin-Aktivierungsweg ist ein Antigen-IgG-C1-Komplex bzw. 

Zucker-MBL-MASP2-Komplex, der eine enzymatische Aktivierung der Komplementproteine C4 und C2 bewirkt. Dies führt zur Bildung der C3-Konvertase, 

die C3 in die biologisch aktiven Komplementfaktoren C3a und C3b spaltet. Im alternativen Aktivierungsweg interagiert C3 direkt mit gebundenem C3b und 

erzeugt dadurch eine Amplifikationsschleife des klassischen und des Lektin-Wegs. Das Proteinfragment Bb (entstanden durch die enzymatische Spaltung 

des Faktors B) bindet an das gebundene C3b, um die C3-Konvertase des alternativen Aktivierungswegs zu generieren. C3b bildet einen Teil der C5-Konvertase, 

die C5 in C5a und C5b spaltet. C5b führt letztendlich zur Bildung des Terminalen Komplement-Komplexes (TCC). TCC ist der zusammenfassende 

Begriff für C5b-9 (Protein der Plasmamembran) und SC5b-9 (Protein in Phase). 

Nachweis einer Aktivierung des Systems und Überprüfung einer ausreichenden Funktion 

Verlaufsbeobachtungen der Komplementaktivierung sind zur Erkennung von Risikopatienten nach Polytrauma, Verbrennung, 

Sepsis, Transplantation etc. notwendig. Die wiederholte Kontrolle von Aktivierungsprodukten erleichtert die Einschätzung 

immunologisch-entzündlicher Aktivität, insbesondere bei der Überwachung einer immunsuppressiven Therapie. In die 

umfassende Komplementdiagnostik sollten alle Komponenten und Regulatoren, sowohl in Bezug auf ihre Plasmakonzentration 

als auch ihre Funktion innerhalb der Kaskadenreaktion, einbezogen werden. 

Die moderne Komplementdiagnostik, die einen Defekt oder eine Aktivierung des Systems sicher erfasst, verlangt ein 

stufenweises Vorgehen. Folgende Parameter können dabei analytisch eingesetzt werden: 

Als Eingangsuntersuchung wird die Gesamthämolyseaktivität des klassischen Weges (CH50) und des Alternativweges 

(APH50) sowie der Nachweis des Komplement-Aktivierungsproduktes C3d empfohlen. 

CH50: ELISA oder Titration der gesamthämolytischen Aktivität des Komplementsystems, klassischer Weg. 

APH50: ELISA oder Titration der gesamthämolytischen Aktivität des Komplementsystems, Alternativweg. 

C3d: ELISA oder Rocketimmunelektrophorese-Nachweis des C3-Spaltproduktes C3dg/C3d. Parameter für die 

Aktivierung des klassischen und alternativen Weges der C-Aktivierung. 

11

12 

Testsysteme zur Überprüfung der Komplementaktivierung 

Zur präklinischen Bewertung neuer Komponenten („artificial devices“) hinsichtlich ihrer klinischen Einsatzfähigkeit für den 

Blutkontakt können mehrere In-vitro- und Ex-vivo-Testmodelle zum Einsatz kommen. Für alle diese Modelle ist die Qualität 

der eingesetzten Blutkomponenten (Vollblut, plättchenreiches Plasma, Plasma, Serum) und die Wahl der geeigneten Antikoagulanzien 

(Citrat, EDTA, Heparin, Hirudin) von entscheidender Bedeutung. Deshalb müssen die folgenden Ausschlusskriterien 

für die Probandenauswahl strikt eingehalten werden: keine Raucher, keine Einnahme von Medikamenten 14 Tage 

�� 

nichtsteroidale Antiphlogistika u. a.). Ebenso wichtig sind die schonende Blutabnahme und die rasche Weiterbearbeitung. 

Zur Testung der gesamten Hämokompatibilität inklusive der Komplementaktivierung sollten dynamische Modelle unter 

Verwendung von frischem humanen Vollblut bevorzugt werden. 

Blut-, Plasma-, Serumgewinnung und Heparinisierung 

Zur Testung einer Herz-Lungen-Maschine etc. wird eine große Menge an Blut benötigt, bei anderen Untersuchungen sollte 

ein definiertes Serum, das entsprechend vorbereitet und getestet wurde, verwendet werden. Wenn kein frisches Vollblut 

zur Verfügung steht, bietet sich tiefgefrorenes NHS (Normal Human Serum, z. B. A113 oder A112) an, welches speziell 

präservierend für Komplementfaktoren gewonnen wurde und auf Infektionskrankheiten, Komplementaktivierung und CH50 

getestet ist. EDTA-Plasma oder rekalzifiziertes Plasma sind nicht geeignet. 

Bitte beachten: NHS muss vor der Aktivierung ununterbrochen auf Eis aufbewahrt werden. 

Für Plasma oder Vollblut sind Heparin (niedrig dosiert) oder Hirudin zu verwenden. Nach dem Test müssen die Plasma-/ 

Blutproben mit EDTA versetzt werden, um weitere In-vitro-Aktivierungen zu vermeiden. 

Verwendung von Frischblut 

Wichtige Kriterien für die Blutspender: 

�� 

�� 

�� 

��sende 

Pharmaka) 

Statische Modelle mit Serum 

Hierbei werden die zu testenden Prüfmaterialien für definierte Zeiten mit Serum (z. B. NHS = Normal Human Serum, definiertes 

und Komplement-getestetes Standardserum) inkubiert. Mit der Bestimmung der einzelnen Komplementfaktoren 

können sowohl Rückschlüsse auf die gesamte Komplementaktivierung als auch auf den jeweiligen Komplementweg gezogen 

werden. Serum wird bevorzugt eingesetzt, nicht nur für die Testung von Biomaterialien, sondern auch von Pharmaka, 

Lösungen, Blutprodukten etc. 

Beispiel für einen statischen Test 

Prüfgegenstand sind hier runde Plättchen aus Metall, Keramik oder Polymerkunststoff. 

Wichtige Kriterien für die Blutentnahme: 

�� 

�� 

�� 

mit einer Injektionskanüle 

�� 

�� 

(Heparin niedrig dosiert, Hirudin etc.) 

�� 

Abbildung 7: 

Schematische Darstellung einer 12-Kavitäten-Platte. Die vorderen Kavitäten beinhalten Plasma oder Serum. Die Wände der Kavitäten sind mit Silikonschlauchstücken 

ausgekleidet. Plasma oder Serum kommt nur mit dem Silikonschlauch und dem am Kavitätenboden liegenden Testmaterial in Kontakt.

Dynamische Modelle mit frischem Vollblut 

Chandler-Loop-Modell 

In einem In-vitro-„Closed-Loop”-Modell (modifizierter Chandler Loop) werden in kreisförmig geschlossenen Schlauchstücken 

30 ml heparinisiertes (1 IE/ml Heparin) frisches Humanblut rezirkuliert (20 U/min, 37 °C). Diese Versuchsanordnung 

kann durch unterschiedliche Modifikationen zur Testung von neuen Beschichtungen, neuen Pharmaka (Antikoagulanzien, 

Inhibitoren etc.), Stents usw. eingesetzt werden. Mit Hilfe dieses Modells können die Aktivierungsprodukte direkt über 

traditionelle ELISAs quantifiziert (C3a, C5a, SC5b-9) und die adsorbierten Plasmaproteine mittels einer neu entwickelten 

��chenden 

Schlauchstücke direkt nach der Beendigung der Chandler-Zirkulation gespült, fixiert (4 % Paraformaldehyd in 

PBS [w/v], pH 7,4), in 2 cm lange Stücke geschnitten und eingefroren. Die Schlauchstücke werden dann an einer Seite 

verschlossen und direkt als große „ELISA-Kavität“ eingesetzt. Mit Hilfe der entsprechenden Antikörper kann ein direkter 

�� 

Inkubationszeiten im Chandler-Loop-Modell ist es möglich, eine Kinetik des Adsorptionsverhaltens von Plasmaproteinen 

zu bestimmen. Zudem können aus dem systemischen Blut die löslichen Komplementaktivierungsmarker C3a, C5a, SC5b- 

9 etc. gemessen werden. 

Herz-Lungen-Maschinen-Modell 

In diesem eher aufwändigen Modell wird frisches Humanblut in einem kurzgeschlossenen System rezirkuliert, und zwar 

unter Oxygenierung, definierter Schlauchlänge und Aufbau eines arteriellen Gegendrucks (d. h. unter denselben Bedingungen 

wie bei einem Patienten während einer kardiopulmonalen Bypass-Operation). Das Aktivierungspotenzial von 

�� 

körpereigene Regulativa diese Effekte zu egalisieren versuchen [9]. Aus dem nach unterschiedlichen Zeiten entnommenen 

Blut können die Konzentrationen von C3a, C5a, SC5b-9 etc. bestimmt werden und auf diese Weise lässt sich die Kinetik 

der Komplementaktivierung quantifizieren. 

Durchflusszytometrische Untersuchungen 

��- 

��- 

�� 

�� 

�� 

Menge der adhärenten Komplementproteine und deren Zusammensetzung nach unterschiedlichen Inkubationszeiten. 

13

14 

sC5b-9 

ALTERNATIVER WEG KLASSISCHER WEG 

C3c 

C3d 

C3 

B 

Faktor D 

Faktor I 

IC3b 

C5 

Bb 

C3b 

C5a 

C3 

Konvertase 

C5b 

C3b3bBb 

C5 

Konvertase 

C6, C7, C8, C9 

C5a 

C4b2a3b 

C5 

Konvertase 

MIKROPARTIKEL 

C5 C2 C3 

C3 

Konvertase 

C2a 

C4b 

C3a 

C4 

C4a 

CI-INH 

CIs CIr 

IgG 

Abbildung 8: 

Schematische Darstellung der Komplementkaskade an der Oberfläche eines Mikropartikels (modifiziert nach Gemmell). Die Komplementaktivierung 

durch artifizielle Oberflächen kann durch den alternativen oder klassischen Weg erfolgen. Auslösendes Moment des klassischen 

Aktivierungsweges ist ein Antigen-IgG-Komplex, der eine enzymatische Aktivierung der drei Komplementproteine C1, C4 und C2 bewirkt. Dies 

führt zur Bildung der C3-Konvertase, die C3 in die biologisch aktiven Komplementfaktoren C3a und C3b spaltet. C3b ist Bestandteil der C5- 

Konvertase, die C5 in C5a und C5b spaltet. C5b führt letztendlich zur Formierung des Terminalen Komplement-Komplexes (TCC). TCC ist der 

zusammenfassende Terminus für C5b-9 (membranständiges Protein) und sC5b-9 (Protein in Phase). 

Beim alternativen Aktivierungsweg interagiert C3 mit der artifiziellen Oberfläche, um C3b zu adsorbieren. Das Proteinfragment Bb (entstanden 

durch enzymatische Spaltung des Faktors B) bindet an gebundenes C3b, um die C3-Konvertase des alternativen Aktivierungsweges zu generieren. 

Dies mündet, wie beim klassischen Aktivierungsweg, in die Bildung der C5-Konvertase und am Ende in die Bildung des TCC. 

Der C1-INH verhindert die Komplementaktivierung über seine hemmende Wirkung auf C1r und C1s. 

CIq

5. In-vitro-Untersuchung zur Biokompatibilität 

Das Komplementsystem wird über drei unterschiedliche Wege, den klassischen, den Lektin- und den alternativen Komplementweg 

aktiviert. Die Aktivierung einer dieser Wege führt zur Spaltung des C3-Proteins, einem äußerst wichtigen 

Molekül der Komplementkaskade. Der finale Schritt im Komplementsystem, der terminale Weg, wird anschließend durch 

C3-Aktivierung eingeleitet. Jeder Komplementweg kann durch einzelne Proteine, die in spezifische Komplementfragmente 

gespaltet werden können (siehe Abbildung 8), diskriminiert werden. Diese Fragmente exprimieren einzigartige Neoepitope, 

die durch spezifische monoklonale Antikörpern nachweisbar sind. Die Exposition von Serum (Komplementquelle) gegenüber 

einer Testprobe (Biomaterial oder Therapeutikum) führt zur Bildung dieser Fragmente, deren quantitative Charakterisierung 

unter Standardbedingungen möglich ist. Die nachfolgenden Schritte vereinfachen die Untersuchung der Komplementaktivierung 

und die Identifizierung des genau zugrundeliegenden Aktivierungsweges. 

Schritt 1. Test für die C3-Spaltung 

Die Komplementkomponente 3 (C3) ist das Schlüsselprotein des Komplementsystems. Die beiden C3-Konvertasen, 

C4b2a (klassischer und Lektin-Weg) und C3bBb (alternativer Weg) spalten C3 in C3a und C3b. Dieser Schritt exponiert 

�� 

�� 

Daher ist es möglich, die C3-Aktivierung durch den Nachweis von oberflächengebundenem C3b und/oder 

Flüssigphasen-C3a zu testen. 

C3: Sonderfälle 

In einigen Fällen ist es möglich, dass C3-Spaltprodukte in der Komplementprobe maskiert sind. C3a kann beispielsweise 

auf spezifischen Biomaterialien wie Polyacrylonitril (PAN) adsorbiert werden und C3b haftet möglicherweise an der Ober- 

�� 

C3a und C3b, sondern auch auf SC5b-9 und C5a zu testen (siehe Schritt 2). 

Schritt 2. SC5b-9 und C5a: Bestätigung der Ergebnisse 

Die C5-Spaltung und die darauf folgende Bildung des Terminalen Komplementkomplexes (TCC) beweist die Aktivierung 

des terminalen Wegs als Reaktion auf die Komplementaktivierung. Es gibt mehrere Gründe dafür, die Aktivierung des 

terminalen Weges zu prüfen: 

1. Bestätigung, dass Biomaterialien C3 nicht aktivieren (siehe C3: Sonderfälle) 

2. Überprüfung des Ausmaßes der Komplementaktivierung, wenn die C3-Spaltung (Schritt 1) positiv ist 

Bei SC5b-9 und C5a handelt es sich um einzigartige Fragmente des terminalen Komplementweges. Nach der C3-Aktivierung 

spalten die zwei C5-Konvertasen, C4b3aC3b (klassischer und Lektin-Weg) und C3bBbC3b (alternativer Weg) C5 in C5a 

(das stärkste Anaphylatoxin) und C5b. C5b bindet die Komponenten C6 und C7, die wiederum C8 und C9 binden und 

dabei den lytischen C5b-9-Komplex bilden. Auch der lösliche, nicht-lytische Komplex SC5b-9 wird gebildet und kann in 

Flüssigphase zusammen mit C5a nachgewiesen werden. 

Schritt 3. Verstehen des Prozesses: Untersuchung auf C4d und Bb 

��chencharakterisierung), 

kann eine Testung auf C4d und Bb vorgenommen werden. C4d ist ein Fragment des C4b, das 

durch die Aktivierung des klassischen und des Lektin-Weges nach der Spaltung von C4 gebildet wird. C4b wird auf einer 

�� 

ein Fragment des alternativen Weges, ist nachweisbar, wenn Faktor B in Bb und Ba gespalten wird. Bb wird indirekt über 

�� 

Modifikationen oder andere biotechnologische Methoden zur Umgehung des Problems gewähren. 

Überblick 

3a.Test für den Nachweis des klassischen Weges 

(Aggregation) C4d 

Abbildung 9 

1. Test für den Nachweis der C3-Spaltung 

C3a und iC3b 

2. Test für den Nachweis des terminalen Weges 

SC5b-9 und C5a 

3b.Test für den Nachweis des alternativen Weges 

(bakteriell) Bb 

15

16 

Algorithmus für die Testung der Komplement-Biokompatibilität 

Für eine korrekte Versuchsplanung sind drei Komponenten zu berücksichtigen: 

1. Komplementquelle 

2. Kontrollen 

3. Standardisierung 

1. Komplementquelle 

Humanserum ist als Komplementquelle am besten geeignet. Das Serum muss jedoch frisch sein, gefrorenes Serum mit 

geringen Konzentrationen an Aktivierungsfragmenten. EDTA-, heparinisiertes und rekalzifiziertes Plasma sind nicht geeignet. 

QUIDEL stellt standardisiertes Humanserum bereit, das mit einem speziellen Verfahren gewonnen wird, um aktives Komplement 

zu konservieren (Produkt-Nr. A113 5,0 ml oder A112 2,5 ml). Dieses Humanserum ist auf infektiöse Erkrankungen, 

Marker für Komplementaktivierung und CH50 getestet. Nach der Testung muss Probenstabilisator (QUIDEL A9576) zu den 

Plasma-/Blutproben zugegeben werden, um eine weitere Komplementaktivierung zu unterbinden. 

2. Kontrollen 

Es müssen immer ausreichend viele Kontrollen und Referenzmaterialien für das jeweilige experimentelle Testsystem mitgeführt 

werden. Die meisten Testkits enthalten interne Kontrollen und Standardlösungen. Die Komplementaktivierung findet 

�� 

dem eingesetzten Volumen (Serum, Plasma, Blut) eine sehr entscheidende Größe dar und ist zur Standardisierung des 

Testsystems unabdingbar. 

Zusätzlich zu den Kontrollen, die mit dem Testkit zur Verfügung gestellt werden, sollten folgende Versuchskontrollen 

(KONTROLLE) in Betracht gezogen werden: 

KONTROLLE 1 Hintergrund: nur Serumquelle 

�� 

KONTROLLE 2 Positivkontrolle: Serum + Aktivator im Versuchsprotokoll 

bestätigt die Komplementaktivität und weist starkes positives Signal nach 

KONTROLLE 3 Negativkontrolle: Serum + Inhibitor (EDTA) 

Negativkontrollen zeigen eine direkte Störung im Assay an 

KONTROLLE 4 Pufferkontrolle (NEG): Puffer, der die Therapeutika enthält 

bestätigt, dass Puffer nicht störend einwirkt 

Aktivator – Da das gesamte Handling der Proben nie gänzlich ohne artifizielle Aktivierungen möglich ist, kann mit Hilfe der 

Kontrollproben die Hintergrundaktivierung quantifiziert und dann in Relation zu den Testproben gesetzt werden. Basierend 

auf den Versuchsbedingungen kann entschieden werden, welcher Aktivator als Positivkontrolle eingesetzt wird. 

�� 

Kontrollproben die Hintergrundaktivierung quantifiziert und dann in Relation zu den Testproben gesetzt werden. Basierend 

auf den Versuchsbedingungen kann entschieden werden, welcher Aktivator als Positivkontrolle eingesetzt wird. 

�� 

Aktivator des alternativen Komplementweges – iC3b - C3a - C5a - SC5b-9 - Bb 

�� 

�� 

wirkt direkt auf C3 ein und ist ein außerordentlich potenter Aktivator, um das Komplementsystem vollständig zu 

aktivieren. 

�� 

�� 

ähnlich ist. 

Es gilt zu beachten, dass es in Inhibitionsexperimenten bei dem Titrieren eines Aktivators schwierig ist, die richtige Balance 

zwischen Aktivierung und Inhibition zu finden, wenn CVF verwendet wird. In diesem Fall stellt HAGG die bessere 

Alternative dar. 

Die Temperatur��tem 

generiert werden (z. B. “nephritische” Faktoren), zu kontrollieren, ist eine Probe jeder Kontrolle (KONT 1-4) auf Eis zu 

lagern. 

3. Material oder Therapeutikum 

�� 

Therapeutikums/Biomaterials sind von großer Bedeutung.

5.1 Experimentelles Design 

Versuchsanordnung nur mit Kontrollen 

bei 37 °C inkubieren 

Aliquote in 15-min-Intervallen auf Eis legen 

Abbildung 10 

1:2 mit Probenstabilisator 

verdünnen 

bei -80 °C einfrieren 

oder im Assay bestimmen 

Versuchsanordnung mit Testmaterial 

Therapeutikum 

unterschiedliche Konzentrationen 

Therapeutikum in 

unterschiedlichen 

Kozentrationen 

auf Eis 


verdünnen 

Bei -80 °C einfrieren 

oder im Assay 

bestimmen 

Abbildung 11 

Bei 37 °C inkubieren 

Aliquote in 15-min- 

Intervallen auf Eis 

legen 


verdünnen 


oder im Assay 

bestimmen 

Normales humanes 

Komplementserum A113 

Kontrollen 

1 – 4 

Normales humanes 

Komplementserum A113 

Gegebenenfalls sind zusätzliche 

Kontrollen zu verwenden 

Kontrolle 1 – 4 

auf Eis 


verdünnen 

Option 1 

1 Aliquot jeder Kontrolle mit 

Probenstabilisator in 15-min-Intervallen 

verdünnen 

Option 2 

Kontrollen mit Probenstabilisator im 

letzten Zeitintervall verdünnen 

bei -80 °C einfrieren 

oder mit Assay bestimmen 

Bei 37 °C inkubieren 

Aliquote in 15-min- 

Intervallen auf Eis 

legen 


verdünnen 


oder im Assay 

bestimmen 

Kontrollen 1–4 

Kontrolle 1–4 

auf Eis 


verdünnen 


oder im Assay 

bestimmen 

17

18 

5.2 Versuchsanordnung 

Siehe auch Algorithmus für die Testung der Komplement-Biokompatibilität 

Seite 16 

Komplementquelle 

�� 

�� 

�� 

Therapeutika 

�� 

Kontrollen 

Aktivator HAGG (A114) für Positivkontrolle 2: 

�� 

Aktivator CVF (A600) für Positivkontrolle 2: 

�� 

bei 37 °C 

Aktivator Zymosan für Positivkontrolle: 

�� 

Inhibitor für Negativkontrolle 3: 

�� 

Ein Aliquot von allen Kontrollen auf Eis legen = Hintergrundaktivierung 

Inkubation 

�� 

�� 

(um Komplementreaktion zu blockieren) 

Zeitpunkte 

��15 – 30 – 45 – 60 – 120 – 240 Minuten 

Assays (Testkits) 

Assay: 

�� 

�� 

�� 

�� 

�� 

Optimierung des Protokolls 

�� 

�� 

�� 

�� 

��

Auswertung der Ergebnisse – Kontrollen 

KONTROLLE 1 Hintergrund: nur Serumquelle 

� �� 

�� 

�� 

kontrollblatt angegeben 

KONTROLLE 2 Positive control: Serum + activator in the experimental protocol 

Bestätigt Komplementaktivität und zeigt starkes positives Signal auf 

�� 

�� 

KONTROLLE 3 Negativkontrolle: Serum + Inhibitor (EDTA) 

Negativkontrollen zeigen direkte Beeinträchtigungen des Assays 

�� 

�� 

KONTROLLE 4 Pufferkontrolle (NEG): Puffer, der die Therapeutika enthält 

Bestätigt, dass Puffer (Therapeutika) nicht störend einwirkt 

�� 

�� 

Protokollbeispiele für die Versuchsanordnung zur Messung der Komplementaktivierung 

verschiedener Biomaterialien sind über erhältlich. 

19

20 

In-vivo- / In-vitro-Testung 

�� 

�� 

�� 

eine Komplementreaktion/-aktivierung stattfinden wird 

�� 

· Blutentnahme (Patienten ohne Therapie) 

· Serum bei -80 °C lagern 

· Diese Seren als Komplementquelle für die Testung verwenden 

· Therapeutikum in unterschiedlichen Konzentrationen zu den Seren der einzelnen Patienten hinzugeben 

· Nach dem Protokoll Ablaufplan für Schnellbewertung Seite 17 vorgehen 

· Auf Komplementfaktoren C3a/iC3b/SC5b-9/C5a/C4d/Bb testen 

�� 

· Serumproben von Primaten gewinnen und auf Komplementfaktoren 

C3a/iC3b/SC5b-9/C5a/C4d/Bb testen 

· Therapeutikum Primaten verabreichen (möglicherweise in unterschiedlichen Konzentrationen) Serum 

an unterschiedlichen Zeitpunkten gewinnen und die Komplementaktivierung direkt im Serum messen – 

C3a/iC3b/SC5b-9/C5a/C4d/Bb 

Probentypen und Methoden für Präklinische/Klinische Testung 

Probentypen: 

�� 

�� 

�� 

Methoden: 

�� 

�� 

- Western Blot 

- RID 

- FACS 

- IHC 

Beispiele für die Testung 

�� 

�� 

�� 

�� 

Methylation of the phosphate oxygen moiety of phospholipid-methoxy (polyethylene glycol) conjugate prevents 

PEGylated liposome-mediated complement activation and anaphylatoxin production, Moghimi et al., The FASEB 

Journal, Vol. 20 December 2006 

�� 

�� 

Loop Model, Paul, Wendel et al., Clinical Application Thromb Hemost, December 2008

Beispiele für Komplementanalysen 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 

C5a [μg/l] 

1 5 10 20 30 60 120 

Bioactive 

Biopassive 

Uncoated 

Abbildung 12: 

Zeitlicher Verlauf (0 bis 120 min) der Komplementaktivierung, quantifiziert mittels ELISA C5a in einem Herz-Lungen-Maschinen-Modell mit zwei unterschiedlichen 

Oberflächenmodifikationen von Oxygenatoren gegen eine unbeschichtete Kontrollgruppe [11]. 

Abbildung 13: 

Aktivierungspotenzial (SC5b-9) unterschiedlicher Oberflächenbeschichtungen auf Edelstahl (Stentmaterial), getestet über eine Stunde in einem Chandler- 

Loop-Modell mit frischem Humanblut. 

21

22 

Beispiele für Komplementanalysen 

Abbildung 14: 

Aktivierungspotenzial (SC5b-9) unterschiedlicher Oberflächenstrukturen und –modifikationen auf Titan (Dentalimplantat) versus Referenz (PVC), getestet über 

eine Stunde in einem Chandler-Loop-Modell mit frischem Humanblut. 

Konzentration (ng/ml) 

Zeit (min) 

Abbildung 15: 

Komplementaktivierung C3a, C5a und SC5b-9 von Biomaterial in einem Chandler-Loop-Modell.

6. Messung der Komplementaktivierung in Seren von 

Nicht-Primaten mittels hämolytischem Assay – CxH50 

In der Komplementforschung wird die Verfügbarkeit von Methoden zur direkten Bewertung der Komplementaktivierung in 

nicht-humanen Modellen selten angesprochen. Um Komplement in nicht-humanen Modellen zu untersuchen, muss daher 

der Nachweis der Komplementaktivierung indirekt über einen hämolytischen Assay wie beispielsweise CH50 erfolgen. Der 

traditionelle CH50 misst die gesamthämolytische Komplementaktivität auf der Basis der Fähigkeit des Komplementsystems, 

sensibilisierte rote Blutkörperchen des Schafes zu lysieren. Der CH50-Assay spiegelt die Fähigkeit des Komplements in 

einer Probe zu aktivieren; je stärker die Aktivierung, desto höher das CH50-Signal. Dieses Signal steht jedoch nicht für 

eine direkte Messung der Komplementaktivierung. 

Nachteile des CH50 als Technik für die Messung der Komplementaktivierung: 

�� 

�� 

was zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann. Diese Empfindlichkeit tritt bei direkten Messungen seltener auf. 

�� 

Fluktuation manifestiert sich als niedriger CH50-Wert und schwacher Komplementaktivierung. Dies erschwert die Verwendung 

nicht-humaner Modelle, wo die Konzentrationen der Komplementproteine sich sehr von denen des Menschen 

unterscheiden können. 

CxH50 

Der traditionelle Hämolysetest kann durch die Fokussierung auf ein einziges Protein eine höhere Spezifität erhalten. Dieser 

Assay, der sogenannte CxH50, weist die funktionale Aktivität einer spezifischen Komplementkomponente (z. B. C3H50 

für die C3-Funktion) nach. Die Methode setzt spezifische Komplement depletierte Seren als Quelle von Komplementproteinen 

ein. Eine Testprobe kann das spezifisch depletierte Protein in der Testmatrix wieder einsetzen und dadurch die 

Komplementaktivierung wiederherstellen. Daher hängt die gesamte Lyse des Erythrozyten (minus Hintergrundlyse von 

depletiertem Serum und Erythrozyten) von dem spezifischen Komplementprotein aus der Testprobe ab. Studien haben 

gezeigt, dass nicht-humanes Serum dazu dienen kann, das depletierte Protein zu ersetzen und die Komplementfunktion 

wiederherzustellen. 

CXH50 steht in vielen Testsystemen wie den Folgenden zur Verfügung: 

�� 

�� 

�� 

�� 

�� 

Abbildung 16: 

CxH50-Assay. Ein depletiertes Serum (z. B. C3) wird als Hauptkomplementquelle, der ein Komplementprotein fehlt, verwendet. Durch das Hinzufügen einer 

Testprobe wird das fehlende Protein bereitgestellt und dadurch die Komplementaktivität, die durch die Lyse der Erythrozyten gemessen werden kann, wiederhergestellt. 

Beispiel: C3H50-Assay 

Durch die Rekonstitution des lytischen Potenzials eines C3-depletierten Humanserums mit C3 einer nicht-humanen Spezies 

stellt der Test eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung der Komplementaktivität, durch C3-Verbrauch, 

in Nicht-Primaten-Spezies bereit, für die Direct-Capture-Assays nicht vorhanden sind. Diese Methode bietet eine Reihe 

von Vorteilen: 

�� 

�� 

Quelle (der terminale Weg nicht-humaner Seren kann sehr unterschiedlich sein). 

�� 

Gegensatz zur nicht-humanen klassischen Aktivierung gut charakterisiert und dokumentiert ist. Beispielsweise weist 

besonders Komplement von Ratten und Mäusen eine äußerst niedrige Affinität für Erythrozyten auf. 

Die folgenden Experimente wurden von DeSautel et al. 1999 adaptiert und gemeinsam mit QUIDEL Corp. durchgeführt. 

23

24 

6.1 Experimentelles Design CxH50 

Beispiel C3H50 Assay 

BENÖTIGTE MATERIALIEN 

�� 

�� 

�� 

�� 

in Gelatine-Veronal-Puffer oder HEPES 20 mM mit 20 mM CaCl und 20 mM MgCl (GVB++) 

�� 

�� 1. Schritt: Optimale Verdünnung von normalem Tierserum genau bestimmen 

· Verdünnung von normalem, nicht behandeltem Tierserum 1:10 – 1:10 6 

· Verdünnung von normalen Human Complement Standard 1:10 – 1:10 6 

· GVB++ in alle Röhrchen hinzugeben 

· Die verdünnten Proben in GVB++-Puffer pipettieren 

�� 

· Eine Probe von jeder Verdünnung ohne C3 Depleted Serum 

�� 

�� 

�� 

Serum sollte bis zur Verwendung bei -70 °C gelagert werden. 

Alle Teströhrchen während des Pipettierens auf Eis und alle 

Teströhrchen zusammen transferieren für die 37 °C Inkubation. 

Test: in 345 μl kaltes GVB++ 10 μl C3 

dpl, 120 μl Ea und 25 μl verdünntes 

NRS hinzugeben 

Positiv: 380 μl entionisiertes oder 

steriles Wasser zu 120 μl Ea zugeben 

Abbildung 17 

Ea in eiskaltem GVB++ zubereiten 

Verdünnungen des NRS von 1:10 

bis 1:1^06 zubereiten 

Referenz: Zu 345 μl kaltem GVB++ 

10 μl C3 dpl, 120 μl Ea und 25 μl 

verdünnte Humansera (A100) 

hinzugeben 

Hintergrund: zu 355 μl kaltem 

GVB++ 120 μl Ea und 25 μl NRS 

(kein C3 dpl) hinzugeben 

Alle Teströhrchen mischen und bei 

37 °C 30 Minuten inkubieren. Mit 

2000 rpm bei 4 °C 10 Minuten 

zentrifugieren. Die Ergebnisse bei 

540 nm ablesen und eintragen

C3H50 Assay 

��2. Schritt: Serum von behandelten Versuchstieren 

· Die optimale Verdünnung, die im 1. Schritt ermittelt wurde, verwenden 

· Kontrolle: Serum von nicht behandelten Versuchstieren 

· Kontrolle: Serum von Versuchstieren, die mit CVF behandelt wurden 

�� 

· Proben (verdünnt) vor und nach Behandlung direkt vergleichen 

Bestimmung von C3H50 

�� 

normale unaktivierte Kontrolle (100 %) bei optimaler Verdünnung gemessen. 

�� 

�� 

�� 

�� 

der optimalen Verdünnung erstellt werden. 

Abbildung 18: 

Die Proben 1 und 3 weisen einen hohen Grad einer Komplementaktivierung auf. 

Schlussfolgerung 

�� 

· Im Unterschied zum Standard-CH50-Verfahren, das die gesamte Komplementaktivierung misst, ist C3H50 spezifisch 

für die Spaltung und Funktion von C3. 

� �� 

die Testergebnisse in keinem signifikanten Maß. 

�� 

sich in zweifacher Weise: 

· Er ist spezifisch für ein einziges Schlüsselprotein, in diesem Fall C3, und ist daher ein sensitiver Assay für die Komplementaktivierung. 

· Er beruht auf einem charakterisierten und hoch funktionellen Standardreagenz (C3 Depleted Serum) als Komplementquelle 

und nicht auf einem Serum mit unbekanntem lytischen Potenzial (Tierserum). 

�� 

In ähnlicher Weise wurden andere humane depletierte Seren (unter anderem C1q, C5, C4, C2 und Faktor B) eingesetzt, 

um eine spezifische Komplementaktivierung in anderen Spezies zu bestimmen. Eine Änderung der optimalen Verdünnung 

ist möglich. 

25

26 

7. Literaturhinweise 

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8. Komplement- und Biokompatibilität Produkte 

8.1 Komplement ELISA Kits 

CIC-C1q �� Quidel ® 

Quantifizierung zirkulierender Immunkomplexe 

Kat.-Nr.: A001 

Tests: 96 

Methode: ELISA 

Bereich:�� 

Sensitivität:� �� 

Inkubationszeit: 2 Stunden 

Probenmenge: � �� 

Probentyp: Serum und Plasma 

Probenvorbereitung: Proben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und nicht hitzeinaktiviert werden. 

Probe kann über einen Zeitraum bis zu 7 Tagen gekühlt (2 – 8 °C) gelagert werden. Bei längerer 

Lagerung sollte die Probe bei mindestens -20 °C eingefroren werden. 

Referenzwerte: Seren von 106 normalen, asymptomatischen Probanden wurden gesammelt. Der Mittelwert der 

�� 

Spezifität: Komplement-CICs werden an immobilisierte C1q-Proteine gebunden. 

Spezies: Human 

/FDA 

Anwendung: 

Der CIC-C1q Assay dient dem Nachweis von Immunkomplexen (CIC) in menschlichem Serum oder Plasma. Zirkulierende 

Immunkomplexe werden bei unterschiedlichen Erkrankungen nachgewiesen: Infektionen, Autoimmunkrankheiten, Trauma 

und neoplastischen proliferativen Erkrankungen. Zudem kann die Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe bei 

der Bewertung bestimmter Formen der rheumatoiden Arthritis und bei der Überwachung der Therapiewirksamkeit eine 

wichtige Rolle spielen. 

CIC Kontrolle 


1 Set (2 verschiedene Konzentrationen) 

27

28 

CIC-C3d �� Quidel ® 

Raji-Cell-Replacement 

Quantifizierung zirkulierender Immunkomplexe mit C3-Aktivierungsfragmenten 


Tests: 96 


Bereich:� �� 

Sensitivität:�� 




Probenvorbereitung: Proben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und nicht hitzeinaktiviert werden. Sie 

können bis zu 6 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei 

mindestens -70 °C eingefroren werden. 

Referenzwerte:�� 

�� 

Spezifität: Immobilisierte monoklonale Humanantikörper gegen C3-Fragmente binden C3d-enthaltende 

Immunkomplexe. 


/FDA 

Anwendung: 

Der CIC-RCR Assay dient dem Nachweis von Immunkomplexen (CIC) in menschlichem Serum oder Plasma. Zirkulierende 

Immunkomplexe werden bei unterschiedlichen Erkrankungen nachgewiesen: Infektionen, Autoimmunkrankheiten, 

Trauma und neoplastischen proliferativen Erkrankungen. Zudem kann die Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe bei 

der Bewertung bestimmter Formen der rheumatoiden Arthritis und bei der Überwachung der Therapiewirksamkeit eine 

wichtige Rolle spielen.

C1-Inhibitor �� Quidel ® 

Funktionelle C1-Inhibitor-Proteine 


Tests: 96 


Bereich: Konzentrationen des funktionellen C1-INH werden als Prozentsatz des Mittelwertes angegeben. 

Der Bereich des Tests ist 35 - 100 %. 





Probenvorbereitung: Proben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen werden. Bei Raumtemperatur 

(15 – 30 °C) können Serumproben nicht länger als 6 Stunden, EDTA-Plasmaproben bis zu 24 

Stunden gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollten die Proben bei mindestens -20 °C 

eingefroren werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden. 

Referenzwerte: Werte ≥ 68 % des mittleren Normalwerts werden als normal betrachtet. 

Spezifität: C1-INH-Reaktant, bindet spezifisch an funktionell aktiven C1-INH. 


/FDA 

Anwendung: 

Der C1-Inhibitor Assay dient der Bestimmung funktioneller C1-Inhibitor-Proteine (C1-INH) in menschlichem Plasma oder 

Serum. Dieser Proteaseinhibitor erfüllt enzymregulierende Aufgaben. Ein Mangel an funktionell aktivem C1-INH kann zu 

lebensbedrohlichen Angioödemen führen. Man unterscheidet zwei Hauptformen des C1-INH-Mangels: die angeborene 

Form, das hereditäre Angioödem (HAE), und die erworbene Form, die mit einer Vielzahl von Krankheiten, wie z. B. malignen 

Erkrankungen der Lymphozyten, in Zusammenhang steht. Hereditäre Angioödeme werden von transitorischen, aber 

rezividierenden, anfallartig ablaufenden nicht pruritischen Schwellungen begleitet, die verschiedene Gewebe des Körpers 

betreffen können. 

29

30 

iC3b �� Quidel ® 

Quantifizierung zirkulierender Immunkomplexe mit C3-Aktivierungsfragmenten 


Tests: 96 


Bereich:� �� 

Inkubationszeit: 1,5 Stunden 



Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme und Lagerung ist unbedingt erforderlich, da C3 höchst empfindlich 

für Proteolyse und Hydrolyse ist. Serum oder EDTA-Plasmaproben sollten unter keimfreien 

Bedingungen entnommen und sofort getestet oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. 

Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei mindestens -70 °C innerhalb von 2 Stunden nach 

Blutentnahme eingefroren werden. 

Spezifität: Anti-iC3b monoklonaler Antikörper, bindet spezifisch an iC3B und nicht an C3. 


Anwendung: 

Der iC3b Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung der iC3b-Fragmente in menschlichem Plasma und 

Serum sowie in anderen biologischen Flüssigkeiten, experimentellen Proben oder Gemischen. 

Bei einigen Patienten mit immunkomplexbedingten Krankheiten wie beispielsweise rheumatoider Arthritis und systemischem 

Lupus erythematodes kann der iC3b-Spiegel signifikant erhöht sein. Erhöhte iC3b-Konzentrationen können auch 

�� 

respiratorischen Distress-Syndrom auftreten.

Bb Plus �� Quidel ® 

Bb-Fragment des Faktors B des alternativen Komplementwegs 

/FDA 


Tests: 96 







Probenvorbereitung: Proben sollten sofort getestet oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung 

sind die Proben bei -70 °C innerhalb von 2 Stunden nach Blutentnahme einzufrieren. 

Referenzwerte:�� +2 SD) 

� ��+2 SD) 

Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch an Bb. 

Spezies: Human, Cynomolgus-Makake, Pavian, Rhesusaffe 

Anwendung: 

Der Bb-Fragment Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung des Komplementfragments Bb, einem Aktivierungsfragment 

des Faktors B, in menschlichem Plasma und Serum sowie in anderen biologischen Flüssigkeiten, experimentellen 

Proben oder Gemischen. Die Messung erlaubt eine quantitative Beurteilung über das Ausmaß der Aktivierung 

des alternativen Komplementweges in der Probe und sie ist hilfreich für die Diagnose verschiedener Nierenerkrankungen 

(z. B. chronische Glomerulonephritis, Lupusnephritis) sowie mehrerer Hauterkrankungen (z. B. Dermatitis herpetiformis 

und Pemphigus vulgaris). Die Aktivierung des alternativen Komplementweges wurde auch bei rheumatoider Arthritis, 

Sichelzellanämie und Gram-negativen bakteriellen Infektionen beobachtet. 

31

32 

C4d �� Quidel ® 

Quantifizierung der C4d-enthaltenden Fragmente des aktivierten C4 des klassischen Komplementwegs 


Tests: 96 






Probentyp: Serum, EDTA-Plasma oder andere biologische Flüssigkeiten 

Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme ist unbedingt erforderlich, da C4d höchst empfindlich für Proteolyse 

ist. Serum und Plasma sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und sofort 

getestet oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollte die Probe 

bei -70 °C innerhalb von 2 Stunden nach Probeentnahme eingefroren werden. 

Referenzwerte:�� +2SD) 

� ��+2SD) 

Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch C4d. 


/FDA 

Anwendung: 

Der C4d-Fragment Enzymimmunoassay dient der Konzentrationsbestimmung C4d-haltiger Aktivierungsfragmente von 

C4 (C4b, iC4b und C4d) in menschlichem Serum, EDTA-Plasma sowie in anderen biologischen Flüssigkeiten und experimentellen 

Proben. 

Die für endogenes C4 normalisierten C4d-Konzentrationen können in Plasmaproben von Patienten, die an rheumatoider 

Arthritis, hereditärem Angioödem, systemischem Lupus erythematodes und anderen Krankheiten leiden, deutlich erhöht 

�� 

eine nach dem klassischen Weg ablaufende Aktivierung stattgefunden hat, z. B. bei Patienten mit unterschiedlichen humoralen 

Autoimmunerkrankungen, Septikämie, thermischer Verletzung, Multiorgantrauma, Myokardinfarkt, hereditärem 

Angioödem, Glomerulonephritis und akutem respiratorischen Distress-Syndrom.

SC5b-9 Plus �� Quidel ® 

Quantifizierung des SC5b-9-Komplexes 


Tests: 96 


Bereich: 10 – 170 ng/ml 

Sensitivität: 8,8 ng/ml 



Probentyp:�� 

Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme und –lagerung ist unbedingt erforderlich, da sich SC5b-9 in unsachgemäß 

behandelten Proben bilden kann. 

Serum und EDTA-Plasma sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und sofort getestet 

oder bis zu 4 Stunden auf Eis gelagert werden. Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei 

-70 °C eingefroren werden. Plasmakonzentrationen spiegeln die In-vivo-Konzentrationen besser 

wider als Serumkonzentrationen. 

Referenzwerte: Serum 334 – 1672 ng/ml 

EDTA Plasma 127 – 303 ng/ml 

Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch SC5b-9 


Anwendung: 

Der SC5b-9 Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung des SC5b-Komplexes in menschlichem Serum und 

Plasma sowie in anderen biologischen Flüssigkeiten und experimentellen Proben. 

Der terminale Komplementkomplex (TCC, SC5b-9) wird durch die Zusammenlagerung von C5 bis C9 infolge der Aktivierung 

des Komplementsystems entweder über den klassischen, Lektin- oder den alternativen Weg gebildet. Der Membranangriffskomplex 

(MAC), eine Form des TCC, ist ein stabiler Komplex, der den irreversiblen Schaden an Zielzellmembranen, 

der mit der Komplementaktivierung einhergeht, vermittelt. 

33

34 

C3a Plus �� Quidel ® 

Quantifizierung des C3a-Fragments 


Tests: 96 



Bereich: 0,05 – 5 ng/ml 


Inkubationszeit: 2 hours 15 minutes 


Probentyp:�� 

Probenvorbereitung: Die korrekte Probenabnahme ist unbedingt erforderlich, um eine C3a-Bildung in der Probe zu 

vermeiden. Für Plasma Dinatrium-EDTA als Antikoagulanz verwenden und bei 2000xg und 

2 – 8 °C zentrifugieren. Sofort testen oder bis zu 4 Stunden auf Eis lagern. Bei längerer 

Lagerung sollte die Probe bei -70 °C mit Stabilisierungslösung eingefroren werden. 

Referenzwerte: Serum 71,0 – 589,2 ng/ml 

EDTA Plasma 33,5 – 268,1 ng/ml 

Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch C3a des-Arg. 

Spezies: Human, Cynomolgus-Makake, Pavian, Rhesusaffe, Schwein 

Anwendung: 

Der C3a Enzymimmunoassay dient der quantitativen Bestimmung von C3a des-Arg in menschlichem EDTA-Plasma, Serum 

sowie anderen experimentellen Proben. 

Unter normalen Bedingungen führt die Aktivierung des klassischen, alternativen oder Lektin-Weges zur Bildung der C3- 

Konvertase, einem Enzym, das fähig ist, C3 in C3a und C3b zu spalten. C3a ist ein niedermolekulares Proteinfragment 

(etwa 9 kD), das aus 77 Aminosäuren besteht. C3a wird durch das Serumenzym Carboxypeptidase N rasch zu der stabileren 

76-Aminosäuren-Form C3a des-Arg metabolisiert. Die Quantifizierung von C3a des-Arg ermöglicht es, zuverlässige 

Rückschlüsse in Bezug auf die Komplementaktivierung in der Probe zu ziehen.

C5a �� Quidel ® 

Messung der Aktivierung des terminalen Komplementwegs in experimentellen Proben 


Tests: 96 


Bereich: 0,1 – 1 ng/ml 


Inkubationszeit: 2 Stunden 15 Minuten 


Probentyp:� �� 

Probenvorbereitung: Die korrekte Abnahme, Lagerung und der vorschriftsmäßige Versand der Proben sind unbedingt 

erforderlich. Sofort testen oder bis zu 4 Stunden bei 2 – 8°C oder auf Eis lagern. Bei längerer 

Lagerung sollten die Proben bei -70 °C mit Stabilisierungslösung (Kat.-Nr. A9576) eingefroren 

werden. Proben mit Stabilisator 1:1 verdünnen. 

Referenzwerte: EDTA Plasma 0,37 – 74,33 ng/ml 

Serum 13,31 – 179,23 ng/ml 

Spezifität: C5a und C5a des-Arg 


Anwendung: 

C5a entsteht durch die Spaltung des terminalen Komplementproteins C5 während der Aktivierung des Komplementsystems 

über den klassischen, alternativen oder den Lektin-Weg. C5a ist ein niedermolekulares Proteinfragment (etwa 9 kD), das 

aus 74 Aminosäuren besteht. C5a wird durch das Serumenzym Carboxypeptidase rasch in die stabilere, weniger aktive 

73-Aminosäuren-Form C5a des-Arg gespalten. 

In Forschungsarbeiten werden erhöhte C5a-Konzentrationen in Flüssigphase und adsorbiertem Zustand mit Hämoinkompatibilität 

einiger Biomaterialien, insbesondere in extrakorporalen Kreisläufen assoziiert. C5a-Konzentrationen werden auch 

mit der Pathogenese verschiedener Krankheitszustände wie Myokardinfarkt, Schlaganfall sowie Vascular Leak Syndrome 

(VLS) und assoziierter Nierenschädigung in Zusammenhang gebracht. Die Rolle des C5a bei der Krankheitsentwicklung 

von Malaria und anderen Infektionskrankheiten sowie Sepsis ist gleichfalls gut dokumentiert. 

35

36 

CH50 Eq �� Quidel ® 

Gesamtaktivität des klassischen Komplementwegs 

/FDA 


Tests: 96 


Bereich: circa 0 - 300 U Eq/ml 



Probentyp: NUR Serum. Plasma KANN NICHT verwendet werden. 

Probenvorbereitung: Die korrekte Abnahme, Lagerung und der vorschriftsmäßige Versand der Proben sind unbedingt 

erforderlich, da Komplement in unsachgemäß gehandhabten Proben aktiviert werden kann. Sofort 

testen oder bis zu 4 Stunden auf Eis lagern. Bei längerer Lagerung sollte die Probe bei -70 °C 

eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. 

Referenzwerte: 133 ± 54 U Eq/ml 

Spezifität: Der monoklonaler Antikörper bindet spezifisch an terminale Komplementkomplexe, die während 

der Aktivierungsstufe des Tests entstehen. 

Spezies: Human, Cynomolgus-Makake 

Anwendung: 

Die Bindung der C1q-Komponente von C1 an Immunkomplexe löst den klassischen Komplementweg aus. Die Aktivierung 

führt zu einer Kaskade enzymatischer und nicht-enzymatischer Reaktionen, die schließlich in der Bildung des terminalen 

Komplementkomplexes (TCC) gipfelt. Unter Standardbedingungen ist die Konzentration an TCC, das in Serum gebildet 

werden kann, ein quantitativer Ausdruck der gesamten klassischen Komplementaktivität im Serum. Der MicroVue CH50 

Eq Enzymimmunoassay dient zur Messung der gesamthämolytischen Aktivität des klassischen Komplementwegs in 

menschlichen Serumproben. Auch ein Mangel an einem oder mehreren Komplementfaktoren (C1 bis C9) kann durch die 

Messung von CH50 nachgewiesen werden.

Ba �� Quidel ® 

Quantifizierung des Ba-Fragments 


Tests: 96 


Bereich: 0,05 – 2,1 ng/ml 

Sensitivität: Obere Bestimmungsgrenze: 3,239 ng/mL 

Untere Bestimmungsgrenze: 0,033 ng/mL 

Nachweisgrenze: 0,011 ng/mL 



Probentyp: EDTA-Plasma, Serum, Urin 

Probenvorbereitung: Serum / Plasma: 

Das Ba-Fragment des Faktors B ist empfindlich gegenüber Proteolyse. Um optimale Ergebnisse mit 

Plasma zu erzielen, sollte K2 EDTA verwendet werden. Die Blutprobe abnehmen und unverzüglich 

bei 2 – 8 °C zentrifugieren. Sofort testen, nicht länger als 2 Stunden bei 2 – 8 °C aufbewahren. 

Eine längere Lagerung kann bei -70 °C erfolgen. 

Urin: Ersten oder zweiten Morgenurin ohne Konservierungsmittel vor 10.00 Uhr sammeln. Probe gekühlt 

bei 2 – 8 °C weniger als 24 Stunden aufbewahren. Für eine längere Lagerung die Probe bei -70 °C 

einfrieren. Maximal 5 Gefrier-Auftau-Zyklen möglich. 

Referenzwerte: 

Spezifität: Monoklonaler Maus-Antikörper, bindet spezifisch das Ba-Fragment 

Spezies: Human, afrikanischer Grünaffe, Cynomolgus-Affe, Rhesusaffe, Hund 

Anwendung: 

Durch die Quantifizierung der Menge an Ba kann das Ausmaß der Aktivierung des alternativen Komplementweges zum 

Zeitpunkt der Probengewinnung bestimmt werden. 

Die Aktivierung des alternativen Weges wird mit unterschiedlichen Krankheitszuständen wie SLE, chronischer Glomerulonephritis, 

rheumatoider Arthritis, Sichelzellanämie und Gram-negativen bakteriellen Infektionen in Zusammenhang 

gebracht.Die Aktivierung des alternativen Komplementweges kann durch eine Vielzahl von Substanzen, darunter mikro- 

�� 

Parasiten, viral infizierte Mastzellen und Krebszellen ausgelöst werden. Bei Autoimmunerkrankungen kann die Aktivierung 

des alternativen Komplementweges direkt zu Gewebeschäden führen. 

Zudem kann die Aktivierung dieses Weges ein Indikator für die Hämoinkompabilität von Biomaterialien sein. 

Applikation: 

• Nierenerkrankungen 

chronische Glomerulonephritis 

Lupusnephritis 

• Hauterkrankungen 

Dermatitis herpetiformis 

Pemphigus vulgaris 

�� 

�� 

�� 

�� 

Probe n Mittelwert �� 

EDTA Plasma 35 658 226 – 2153 

Serum 29 1642 436 – 3362 

Urin 16 7,7 0,6 – 27,0 

37

38 

8.1.1 Kreuzreaktionen von Komplementfragmenten im ELISA 

mit Proben von Primaten 

Zusammenfassung der Ergebnisse: 

Die Spezies-Kreuzreaktion aus verschiedenen Plasma- und Serumproben von Primaten wurde sowohl mit den QUIDEL® 

��noassay 

bestimmt. Von den untersuchten Proben zeigten C3a, Bb, C4d, SC5b-9 und CH50 alle in hohem Grade eine 

Spezies-Kreuzreaktion mit Proben von Pavian und Altweltaffe. Die Ergebnisse von normalen und aktivierten Seren waren 

mit menschlichen Kontrollproben vergleichbar. 

Experiment I: 

Die Proben wurden auf die Fähigkeit hin geprüft, die Bindung von aktiviertem humanen Komplement an neoantigen-spezifischen 

monoklonalen Fangantikörpern im ELISA-Inhibitionsassay zu blockieren. Die monoklonalen Fangantikörper sind 

�� 

Blockierfähigkeit wurde definiert als eine mehr als 80%ige Reduktion des Signals gegenüber einer Standardverdünnung 

von aktiviertem menschlichen Serum mit einem Endpunktsignal (Extinktion bei 405) zwischen 1,2 und 1,4 Einheiten. Die 

Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt. 

Abbildung 19: 

Ergebnisse der EIA-Inhibition 

Pavian Cynomolgus- 

Makake 

Experiment II: 

Spezies-Kreuzreaktionen in den ELISAs wurden durch die Verwendung von verschiedenen komplementaktivierenden 

Substanzen (CVF, Zymosan und hitzeaggregiertes Gammaglobulin) nachgewiesen. Diese Produkte aktivieren spezifische 

Proteine und Wege des Komplementsystems. Normale Ergebnisse sind in der Tabelle II aufgeführt. Eine positive Kreuzreaktion 

wurde definiert als ein mehr als zehnfacher Anstieg in Fragmentebenen nach der Aktivierung. Dieser Schwellenwert 

basiert auf vergleichbarem menschlichen Ansprechverhalten. Von den geprüften Proben zeigten Cynomolgus-, 

Pavian- und Rhesusaffenproben eine deutliche Kreuzreaktion in den Bb, C4d, C3a, SC5b-9 und CH50 EIA Testkits. Keine 

spezifische Reaktion konnte bei Verwendung von Seidenäffchenserum oder anderen nicht-menschlichen Seren in dem 

IC3b-Enzymimmunoassay aufgezeigt werden. 

Abbildung 20: 

Kreuzreaktion von ausgewählten Primatenseren mit den CSP-Assay-Testkits 

Rhesus Lemur Seidenäffchen 

Totenkopfäffchen 

Afrikanische 

grüne 

Meerkatze 

Hund Schwein 

BA A034 - + + - - - + + - 

Bb (neo) A252 + + + - - - - N/T N/T 

iC3b (neo) A209 N/T - - - - - - - - 

SC5b-9 (neo) A239 + + + - - - - - - 

C4d (neo) A251 + + + - - - - - - 

C3a (neo) A015 + + + - - - - N/T + 

C5a (neo) A025 - - - - - - - - - 

�� C4D (��) �� C3a (ng/ml) SC5b-9 (ng/ml) CH50 (U Eq/ml) 

Human (N = 5) 1,5 ± 0,975 4,1251 ± 2,55 51,0 ± 1,5 1209 ± 177 237 ± 28 110,3 ± 6,3 

Cynomolgus- 

Makake (N = 10) 

0,83 ± 0,45 4,065 ± 0,82 NR 879 ± 110 241 ± 28 72,9 ± 13 

Pavian (N = 12) 0,75 ± 0,43 3,75 ± 1,5 NR 900 ± 177 165 ± 57,5 NT 

Seidenäffchen 

(N = 8) 

NR 4,41 ± 1,8 NR NR NR NR

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J Pharm Exp Thera 281, 2810 – 2816. 

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Complement analysis in the 21st century. 

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Heidelberg, pp. 522 – 547. 

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Acute vascular rejection is associated with 

systemic complement activation in a 

pig-to-primate kidney xenograft model. 

Xenotransplantation 7, 186 – 196. 

[6] Mocco J, Tanvir C (2002) 

HuEP5C7 as a humanized monoclonal anti- E/P 

selectin neurovascular protective strategy in a 

blinded placebo controlled trial of nonhuman 

primate stroke. 

Circ Res 91, 907 – 914. 

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Weir (ed), pp. 78.1 – 78.6. 

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Novel anti-factor D monoclonal antibody 

inhibits complement and leukocyte activation in 

a baboon model of cardiopulmonary bypass. 

Ann Thorac Surg 74, 355 – 362. 

39

40 

9. Komplement-Antikörper und Reagenzien 

Depletierte oder Mangelseren 

Mit Ausnahme der C3-dpl-, C3/C4-dpl- und C4-defizienten 

Meerschweinchenseren wurde ein spezifisches Komplementprotein 

immunochemisch aus jedem depletierten 

Humanserumreagenz entfernt. Depletierte Seren sind gut 

geeignet zur Detektion und Quantifizierung der hämolytisch 

aktiven Komplementproteine. Mit Ausnahme der spezifisch 

depletierten Komponente sind klassische und alternative 

Wege intakt. 1,0 ml pro Fläschchen. 

C2 Depleted A500 






Factor B Depleted A506 

C4 Depleted (Meerschweinchen) A507 


C1Q Depleted A509 

Factor P Depleted A512 

C3/C4 Depleted A521 

IgG Depleted 

Komplementreagenzien 

Katalog-Nr. 

Katalog-Nr. 

CVF, Cobra Venom Factor A600 (1,0 ml) 

Human Complement Standard A100 (1,0 ml) 

Normal Guinea Pig Serum 

Complement 

A119 (1.0 ml) 

Normal Human Serum 

Complement 

A112 (2,5 ml) 

Normal Human Serum 

Complement 

A113 (5,0 ml) 

Complement Activator (HAGG) A114 (0,2 ml) 

Complement Sample Panel A115 (10 x 0,025 ml) 

CVF Activated-NHS A116 (0,1 ml) 

CIC Sample Panel A117 (5 Samples) 

Specimen Stabilizing Solution A9576 (25 ml) 

Gereinigte Proteine 

Die Reinheit jedes Komplementproteins (funktionell und 

biochemisch) wurde mit Hilfe von Standardhämolysetests 

und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese geprüft. Die 

Konzentration für jedes Komplementprotein mit Ausnah- 

�� 

pro Fläschchen. 

Katalog-Nr. 

C1q A400 (1,0 ml) 

C3 A401 

C4 A402 

C5 A403 

C6 A404 

C7 A405 

C8 A406 

C9 A407 

Faktor B A408 

Faktor D A409 

Faktor H A410 

Faktor I A411 

Faktor P A412 

C3b �� 

C3a �� 

Polyklonale Antikörper (IgY) vom Huhn 

Jeder polyklonale IgY-Antikörper wurde aus Hühnereidottern 

isoliert, die Reinheit wurde mit Hilfe der SDS-Polyacryl- 

Gelelektrophorese getestet. Spezifität und Aktivität wurden 

mittels Enzymimmunoassay bestimmt. Die Proteinkonzentration 

beträgt ca. 1 mg/ml in phosphatgepufferter physio- 

�� 

Anti Human C3d A800 

Anti Human C4b A801 

Katalog-Nr. 

Anti Human SC5b-9 A802

Monoklonale Antikörper 

Jeder monoklonale Antikörper wurde aus Mäuse-Aszites- 

�� 

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getestet. Die Proteinkonzentration 

beträgt ca. 1 mg/ml in boratgepufferter 

physiologischer Kochsalzlösung mit 0,02 % Natriumazid. 

�� 

C1q A201 

C3a A203 

C3c A205 

C3d A207 

iC3b (Neoantigen) A209 

C4c A211 

C4d A213 

C4 Binding Protein A215 

C5 A217 

C6 A219 

C7 A221 

C8 A249 

C9 A223 

Faktor B (Ba ) 

C3 Proactivator 

Faktor B (Bb) 


Katalog-Nr. 

A225 

A227 

Faktor H #1 A229 

Faktor I #1 A247 

Faktor I #2 A231 

Faktor P #1 (Properdin) A233 

Faktor P #2 (Properdin) A235 

S Protein (Vitronectin) A237 

SC5b-9 

A239 

(TCC-Neoantigen) 

Clusterin 

A241 

(SP40, 40 und APO J) 

C3d (Neoantigen) A250 


Bb (Neoantigen) A252 0,5 ml 




Biotinylierte monoklonale Antikörper 

Biotin-markierte monoklonale Antikörper 

�� 

gereinigt und mit Biotin markiert. Die Proteinkonzentration 

�� 

C1q A700 

C3c A701 

C3d A702 

C4c A703 

C4d A704 

C5 A705 

C6 A706 

C7 A707 

C8 A708 

C9 A709 

iC3b (neoantigen) A710 

SC5b-9 (neoantigen) A711 

Polyklonale Antiseren von der Ziege 

Die QUIDEL Komplementantiseren werden in Ziegen gezüchtet. 

Die Qualitätskontrolle der Spezifität wird durch 

immunochemische Analysen sichergestellt. Jedes Serum 

enthält 0,02 % Natriumazid. 2,0 ml pro Fläschchen. 

C1 Inhibitor A300 

C1q A301 

C1s A302 

Katalog-Nr. 

C2 (Ig Fraction) A303 1,0 ml 

C3 A304 

C4 A305 

C5 A306 

C6 A307 

C7 A308 

C8 A309 

C9 A310 

Factor B A311 

Factor H A312 

Factor I A313 

Katalog-Nr. 

Factor Bb A712 

41

42 

10. Komplement-spezifische Antiseren: Applikationen 

Zubereitung 

Hyperimmune Antiseren werden durch Standard-Immunisierungsverfahren in Ziegen gewonnen. Dabei werden hochreine 

Komplement-Antigene eingesetzt, die aus frisch gewonnenem normalen Humanplasma isoliert wurden. Die Antiserum- 

Absorption wurde, falls erforderlich, mit Hilfe von Festphasen-Adsorptionsverfahren durchgeführt. Die Antiseren wurden 

als monospezifisch eingestuft, nachdem sie mit Hilfe von Doppelimmundiffusion, ein- und zweidimensionaler Immunelektrophorese 

und Rocket-Immunelektrophorese bei unterschiedlichen Konzentrationen gegen frisch gewonnenes, mit 

10 mM EDTA versetztem normalen Humanserum getestet worden waren. Antiseren enthalten 0,02 % Natriumazid als 

Konservierungsstoff. 

Anwendungen 

Die QUIDEL Komplement-Antiseren werden bei einer Vielzahl von Techniken eingesetzt, darunter Doppelimmundiffusion, 

quantitative radiale Immundiffusion (RID), Rocket-Immunelektrophorese, Western Blotting, Immunhistochemie und ELI- 

SA. Es gilt zu beachten, dass es sich bei diesen Produkten um Gesamt-Antiserum handelt und deshalb entsprechende 

Gesamt-Serumkontrollen in einigen Anwendungen erforderlich sein können. 

Doppelimmundiffusion 

Optimale Verdünnungen hängen von der Anwendung ab. Im Allgemeinen liefern QUIDEL Antiseren klare Präzipitin-Linien 

bei einer Verdünnung von 1:8 oder höher unter folgenden Bedingungen: 

�� 

�� 

�� 

�� 

Antigen- oder Antikörperüberschuss kann zu “undeutlichen” Präzipitin-Linien führen. 

Quantitative radiale Immundiffusion 

�� 

�� 

�� 

�� 

�� 

Ist ein größerer Bereich von NHS-Verdünnungen für eine bestimmte Anwendung erforderlich, dann sollte die Menge an 

�� 

Position Antigen Zugabe von Antiserum Optimale Verdünnung 

A300 C1 Inhibitor �� 2 1:2 

A301 C1q �� 2 1:2 

A302 C1s ��cm 2 1:2 

A303 C2 N/T N/T 

A304 C3 �� 2 1:4 

A305 C4 �� 2 1:4 

A306 C5 �� 1:2 

A307 C6 �� 1:2 

A308 C7 �� 2 1:2 

A309 C8 �� 2 1:2 

A310 C9 �� 2 1:2 

A311 Factor B �� 2 1:2 

A312 Factor H �� 2 1:2 

A313 Factor I �� 2 1:2 

Abbildung 21: 

Spezifische Ergebnisse für RID

Immunhistochemie 

Die optimalen Verdünnungen der Antikörper schwanken je nach spezifischem Gewebetyp und den Versuchsbedingungen. 

Im Allgemeinen weisen polyklonale und monoklonale Antiseren von QUIDEL optimale Verdünnungen zwischen 1:1000 und 

1:50000 in histologischen Anwendungen auf. Es wird nachdrücklich empfohlen, die optimale Verdünnung auszutesten und 

diesen Bereich nur als Indikation anzusehen. 

Verschiedene Techniken zur histologischen Auswertung der Komplement-Deposition wurden publiziert unter Verwendung 

von QUIDELs monoklonalen Antikörpern gegen Komplementantigene [1–4]. Das folgende Protokoll (adaptiert von 

Rogers et al.) beschreibt eine Methode, die in verschiedenen Studien exzellente Ergebnisse geliefert hat. Experimentelle 

Verfahren sollten den Probentyp, die Bedingungen, unter denen die Probe gewonnen wurde, die spezifischen Antikörper 

und sekundären Reagenzien sowie andere laborspezifische Phänomene in Betracht ziehen. Dieses Protokoll dient nur als 

Referenz. 

Gewebekonservierung 

Gewebeproben wurden in 4 % (wt/vol) Paraformaldehyd (0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4) 24 Stunden lang fixiert 

und dann in 2 % DMSO/10 % Glycerol, anschließend in 2% DMSO/20 % Glycerol für jeweils 48 Stunden kryogeschützt. 

�� 

(vol/vol) Glycerol, 33 % Polyethylenglycol und 33 % Phosphatpuffer (0,1M, pH 7,4) gelagert. 

Histologie 

Die Sektionen wurden 6 x für jeweils 15 Minuten in TBS (0,01 M Tris-HCl, pH 7,6/0,09 M NaCl) gewaschen. Endogene 

Peroxidase wurde durch Inkubation mit 0,3 % H202 in 50% Methanol (vol/vol) in TBS blockiert, dann 3 x 15 Minuten mit 

TBS/0,5 % Triton X 100 gewaschen. Die Proben wurden eine Stunde mit 3 % BSA blockiert. Die Sektionen wurden über 

Nacht bei 4 °C bei optimaler Verdünnung des primären Antikörpers inkubiert (die Bestimmung des Optimums erfolgte durch 

Inkubieren fortlaufender Verdünnungen der Antikörper von 1:500 bis 1:128000 auf einem stark positiven Kontrollgewebe). 

Die Sektionen wurden dann 3 x mit TBS/0,05 % Triton X-100 gewaschen und mit Biotin-konjugiertem Antikörper gemäß 

den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Der gebundene sekundäre Antikörper konnte mit DAB (Diaminobenziden) wie 

in der Standard-ABC/DAB-Immunhistochemie reagieren. 

Kontrollen 

Empfohlene Negativkontrollen sind unter anderem die Auslassung des primären Antikörpers, die Präabsorption mit gereinigtem 

Komplementantigen und Standard-Negativgewebe. Als Positivkontrollen werden unter anderem Proben von 

pathologischem Nierengewebe (Glomerulonephritis) und Alzheimer-Gehirngewebe empfohlen 

ELISA 

Optimale Verdunnungen fur diese Antiseren sind groser als 1:50000 in einem Antigen-capture ELISA. Spezifische optimale 

Verdunnungen hangen von Charge und Assaytyp ab. 

Allgemeine Hinweise 

Für die QUIDEL polyklonalen Antiseren (A300’s) wird empfohlen, eine Blockierung mit einer entsprechenden Verdünnung 

von normalen Ziegenseren. 

Referenzen 

[1] Rogers, J., Cooper, N. et al. (1992) 

Complement Activation by β-amyloid in 

Alzheimer disease. 

PNAS 89:10016-10020 

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cardiac allograft rejection. 

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transplant biopsies is associated with ischemic 

injury and subsequent rejection episodes. 

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protein found in SC5b-9 complex of complement 

and in immune deposits in glomerulonephritis. 

Clin Invest 81:1858 – 1864k 

43

44 

10.1 Produktinformation zu monoklonalen Antikörpern 

Artikel Nr. Beschreibung (murin anti human) Epitop-Beschreibung Isotype 

A201 C1q bindet an globulären Kopf des C1q IgG1k 

A203 C3a bindet C3 und C3a IgG1k 

A205 C3c bindet C3 und C3c IgG1k 

A207 C3d 

bindet C3 und C3d-enthaltende 

Fragmente 

IgG1k 

A209 iC3b Neoantigen, bindet nur iC3b IgG2bk 

A211 C4c 

bindet C4 und C4c-enthaltende 

Fragmente 

IgG1k 

A213 C4d 

bindet C4 and C4d-enthaltende 

Fragmente 

IgG1k 

A215 C4 Binding Protein IgG2bk 

A217 C5 hemmt die Lyse von Schaf-EA, erkennt 

membrangebundenen MAC nicht 

IgG1k 

A219 C6 erkennt MAC IgG1k 

A221 C7 hemmt die Lyse von Schaf-EA, erkennt 

membran-gebundenen MAC nicht 

IgG1k 

A249 C8 erkennt MAC IgG2ak 

A223 

C9 hemmt die Lyse von Schaf-EA nicht, 

erkennt MAC nicht 

IgG2bk 

A225 Faktor B (Ba) 

hemmt die Funktion von Faktor B; bindet IgG1k 


sowohl den naszierenden Faktor B als 

auch das Ba-Spaltprodukt 

A227 Faktor B (Bb) C3 Proactivator hemmt die Funktion von Faktor B; bindet 

sowohl den naszierenden Faktor B als 

auch das Bb-Spaltprodukt 

IgG1k 

A229 Factor H #1 hemmt die Funktion nicht, Faktor Hähnliches 

Protein wird nicht erkannt 

IgG1k 

A247 Faktor I #1 hemmt die Funktion nicht IgG1k 

A231 Faktor I #2 hemmt die Funktion von Faktor I nicht IgG1k 

A233 Faktor P #1 (Properdin) blockiert die Funktion IgG1k 

A235 Faktor P #2 (Properdin hemmt die Funktion von Faktor P nicht IgG1k 

A237 S Protein (Vitronectin) bindet freies S-Protein (Vitronectin) 

sowie SC5b-9 

IgG1k 

A239 SC5B-9 gerichtet gegen ein Neoantigen auf Poly- 

C9 und denaturiertes C9 

IgG2ak 

A241 Clusterin Clusterin wird auch Apo J und SP40,40 

genannt 

IgG1k 

A250 C3d (Neoantigen) bindet nur an C3d-enthaltende Aktivierungsprodukte 

von C3 

A251 C4d (Neoantigen) bindet nur C4d-Aktivierungsprodukte 

von C4 

A252 Bb (Neoantigen) bindet nur die Bb-Untereinheit 

A253 C4d (Neoantigen) 

bindet C4 und C4d-enthaltende 

Fragmente 

IgG1k 

A254 Faktor H #2 hemmt die Funktion nicht lgG1k 

A255 Faktor H #3 hemmt die Funktion nicht lgG1k 

Anmerkungen: 

Alle monoklonalen Antikörper werden geliefert ab 100 μl pro Flasche – 1,0 mg/ml – in boratgepufferter Kochsalzlösung. Die empfohlene Ausgangsverdünnung 

für alle Antikörper in IHC-Applikationen ist 1:1000; die tatsächliche Applikation und der Gewebetyp bestimmen die korrekte Verdünnung.

Getestet Anwendung 

ELISA RIA IHC W.Blot FACS Funktion 

Verdünnung 

ELISA 

X X N/T N/T X hemmt die Funktion des C1q-Moleküls wahrscheinlich nicht 1:16000 

X X N/A X N/A 

X X X X X 

X X X X X 

X X X X X 

X X X X X 

X X X X X 

X N/T N/T N/T N/T 

C3a bindet sich nicht an Zellen, so dass es deshalb 

in FACS oder IHC normalerweise nicht detektiert wird 

bindet sowohl das Fragment als auch das gesamte Protein 

und ist deshalb nicht für alle EIA-Applikationen geeignet 



nur reaktiv mit dem Aktivierungsprodukt iC3b, nicht mit 

C3b oder anderen Produkten 





1:6200 

1:10500 

1:5400 

1:64000 

X X N/A X N/A 1:10000 

X X X N/T X 

X X N/A X N/A 

X N/T X X X 

X X N/A N/T N/A 

X X X X X 

X X X X X 





X N/T X X X > 1:1000 

X X X X N/T 1:34000 

X X X X N/T 

X X X N/T N/T 

X X X N/T N/T 

X X X X X 

X X X X X 

X X X X X 

X N/T X 

X N/T X 

X N/T X 

X X X X X 



X X X X N/T �� 

X X X N/T N/T �� 

Für IHC hat sich die ABC-Methode als die zuverlässigste Methode für diese Antikörper und Analyten herausgestellt; gefrorenes Gewebe wird bevorzugt. 

Antikörper in Fettdruck werden in den EIA-Kits von QUIDEL verwendet. Empfohlene Ausgangsverdünnung für alle Antikörper in Westernblot 10 ug/ml. 

Empfohlene Verdünnung für FACS 10: 

40 μl/ml, 1:100-Verdünnung, 200 Proben pro Flasche. 

45

46 

10.2 Kreuzreaktionen Tierspezies – Monoklonale 

Antikörper Spezies-Kreuzreaktionen monoklonale Antikörper* 

ANTIHUMAN-ANTIKÖRPER KREUZREAGIERENDE SPEZIES 

PAVIAN 

KATZE 

HUHN 

RIND 

HUND 

C1q A201 - - - - - - - - + slight - N/T - - - 

C3a A203 + - - - - - - - + + - + - - - 

iC3b (neo) A209 N/T - - - - - - - + N/T - N/T - - - 

C3c A205 + + - - - + - + + + - N/T - - - 

C3d A207 - - - - - - - - + - - slight - + - 

C4c A211 + - - - - - - - + + - N/T - - - 

C4d (neo) A251 + N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + + N/T N/T N/T N/T N/T 

C4/C4d A213 + + - + + + - - + - + - + + + 

C5 A217 + - - - - - - - + + - N/T - - - 

C6 A219 N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + N/T N/T N/T N/T N/T N/T 

C7 A221 - + - + + - + + + N/T - + + + - 

C8 A249 N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + N/T N/T N/T N/T N/T N/T 

C9 A223 + - + + - + + + + + - N/T - - - 

SC5b-9 (TCC)(neo) A239 + - - - - - - - + + - N/T - - - 

Factor H (#1) A229 + - - - - - - + + + - N/T - - - 

Factor H (#2) A254 + - - - - - - - + + - N/T - - - 

Factor H (#3) A255 + - - - - - - - + + - N/T - - - 

Factor I (#1) A247 - - - - - - - - + N/T - N/T - - - 

S Protein A237 - - - - - - - - + N/T - N/T - - - 

Clusterin/SP40,40 A241 N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T N/T + + - N/T N/T - N/T 

+ Kreuzreaktion 

| Kreuzreaktion in der Immunhistochemie** 

N/T nicht untersucht 

- keine Kreuzreaktion 

* Die monoklonalen Antikörper wurden bei QUIDEL mittels Inhibitions-ELISA auf Kreuzreaktionen untersucht. Es besteht 

die Möglichkeit, dass ein sensitiver Test Kreuzreaktionen nachweisen könnte, auch wenn sie bei der ELISA-Inhibition 

nicht gefunden wurden. 

** Die Immunhistochemie-Daten stammen aus externen Untersuchungen; diese Experimente wurden nicht bei QUIDEL 

durchgeführt und sind nicht bestätigt. 

MEERSCHW. 

HAMSTER 

PFERD 

HUMAN 

AFFE 

MAUS 

SCHWEIN 

KANINCHEN 

RATTE 

SCHAF

10.3 Kreuzreaktionen Tierspezies – Polyklonale Antikörper 

Spezies-Kreuzreaktionen monoklonale Antikörper 

PAVIAN 

KATZE 

HUHN 

RIND 

HUND 

CROSS-REACTING SPECIES 

Goat anti-human C1-INH A300 +++ - - - + - - - +++ - ++ + - - - 

Goat anti-human C1q A301 +++ +++ - - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ - - 

Goat anti-human C1s A302 +++ - - - - - - - +++ - - - - - - 

Goat anti-human C3 A304 +++ - - - - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - 

Goat anti-human C4 A305 +++ + - - +++ - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ - - 

Goat anti-human C5 A306 +++ + - - +++ +++ + +++ +++ + +++ +++ +++ - - 

Goat anti-human C6 A307 +++ +++ - - +++ - - + +++ - +++ +++ +++ - - 

Goat anti-human C7 A308 +++ +++ - - - +++ + + +++ - ++ +++ - - - 

Goat anti-human C8 A309 +++ + - - +++ +++ + + +++ + +++ +++ + - - 

Goat anti-human C9 A310 +++ - - - - - + +++ +++ - ++ + - - - 

Goat anti-human Factor B A311 +++ +++ - - - +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ - - 

Goat anti-human Factor H A312 +++ +++ - - +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - 

Goat anti-human Factor I A313 +++ - - - - - - - +++ - - - - - - 

Chicken Anti-Human C3d (IgY) A800 +++ - - +++ ++ ++ ++ - +++ +++ ++ ++ +++ ++ ++ 

Chicken Anti-Human C4b (IgY) A801 +++ - - ++ ++ - ++ - +++ ++ ++ ++ ++ + ++ 

Chicken Anti-Human SC5b-9 (IgY) A802 +++ - - ++ +++ - ++ - +++ ++ ++ ++ +++ + ++ 

+++ starke Kreuzreaktion 

++ moderate Kreuzreaktion 

+ schwache Kreuzreaktion 

- keine Kreuzreaktion 

- unbekannt 

MEER- 

SCHWEINN 

Für die Spezies-Kreuzreaktion wurde alle Antiseren durch Doppelimmundiffusion und/oder 

mittels eindimensionaler Immunelektrophorese untersucht. 

HAMSTER 

PFERD 

HUMAN 

MAUS 

SCHWEIN 

KANINCHEN 

RATTE 

SCHAF 

GOAT 

47

48 

Notizen

11 Appendix 

11.1 Assay Protokolle (Beispiele) 

11.1.1 Prüfung auf Aktivierung des Komplementsystems am Beispiel von Liposomenpräparationen 

11.1.2 Messung der Komplementaktivierung in Seren von Nicht Primaten mittels hämolytischem Assay – CxH50 / 

Quantifiying Complement Activation in a Non-human Specimen (CxH50)) 

11.2 Technische Daten Blätter und Analyse Zertifikate (Beispiele) 

Normal human complement serum (A113) 

HAGG Activator (A114) 

Activator Cobra Venom Factor (A600) 

Specimen stabilizer (A9576) 

C3 Depleted Serum (A508) 

Normal human complement Standards (A100) 

49

50 

11.1.1 Protokoll: 

Prüfung auf Aktivierung des Komplementsystems am Beispiel von 

Liposomenpräparationen 

Bestimmung des Aktivierungsprodukts C3a 

Reagenzien und Materialien Lagerung Inhalt Art.-Nr. 

Quidel Complement ELISA 2 – 8 °C 96 wells Axxx 

Quidel Normal Human Serum Complement 

Charge 906680 z. B. C3a 800 ng/ml (siehe Analysenzertifikat) 

EDTA-, Heparin- und rekalzifiziertes Plasma sind nicht geeignet 

Cobra Venom Factor / Aktivierung des alternativen Weges 

Charge 905605 Titer: 686 U/ml (siehe Analysenzertifikat) 8-20 U/ml sind 

ausreichend, um nahezu das gesamte C3 zu C3-Fragmenten zu 

konvertieren, wenn eine Inkubation mit unverdünntem Humanserum 

für 30 - 90 Minuten bei 37 °C erfolgt 

Complement Aktivator Quidel - klassischer Weg: 

HAGG, 10 ul for 1 ml = vollständige Aktivierung nach 30 Minuten bei 37 °C 

Probenstabilisator / Quidel 

Proben verdünnen 1:1 

Komplementinhibitor: EDTA 

EDTA 10 mMol Endkonzentration - eiskalt 

Bitte beachten: 

geeignete Schale mit Eis bereitstellen 

Eppendorf Polypropylen-Röhrchen Proben vorsichtig mischen, aber nicht vortexen 

Reagenzien-Handhabung - Lagerung 

-70 °C 5 ml 

2.5 ml 

A113 

A112 

-70 °C 1 ml A600 

-70 °C 0.2 ml A114 

2 – 20 °C 25 ml A9576 

Cobra Venom schnell bei 37 °C auftauen und unverzüglich auf Eis lagern 

nicht benötigtes Material in Aliquoten bei - 70 °C aufbewahren 

Berechnung der benötigten Menge: z. B. Titer ist 685 Units/1000 ul 

für 1000 ul Serum sind 20 Units zur völligen Aktivierung erforderlich; entspricht 29 ul 

1000/685*20 = 29 ul 

HAGG nicht benötigtes Material sofort wieder bei - 70 °C aufbewahren 

10 ul für 1 ml Serum 

Probenstabilisator bei 37 °C im Wasserbad lösen und mischen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen 

Normalserum = NHS schnell bei 37 °C auftauen und unverzüglich auf Eis aufbewahren 

nicht benötiges Serum in PPE-Röhrchen aliquotiert wieder bei - 70 °C einfrieren 

5 Aliquote zu je 100 ul (50 ul) in Eppendorf-Röhrchen auf Eis vorbereiten 

in 1 Aliquot sofort 100 ul (50 ul) Probenstabilisator geben 

NHS/Puffer entsprechend dem Pufferanteil in den Proben; z. B. 80:20 

davon 5 Aliquote zu je 100 ul (50 ul ) in Eppendorf-Röhrchen auf Eis vorbereiten 

in 1 Aliquot sofort 100 ul (50 ul ) Probenstabilisator geben 

NHS – aktiviert 5 ul Aktivator oder 15 ul CVF zu 500 ul NHS geben und sofort 6 Aliquote zu 

100 ul auf Eis legen 

NHS – inhibiert 500 ul plus EDTA - 5 Aliquote zu je 100 ul auf Eis aufbewahren 

Lipos/NPs 5 Aliquote in verschiedenen Verdünnungen herstellen 

Aliquote zu 100 ul (50 ul) sofort auf Eis legen

Grundsätzlich ist beim Arbeiten mit Komplementaktivierungsassays zu beachten, dass eine Kontamination 

mit Bakterien vermieden werden muss; d.h. Pipettenspitzen und Reaktionsgefässe müssen höchstrein sein, 

um eine nicht erwünschte Aktivierung durch Lipopolysccharide zu vermeiden 

Testdurchführung 

1. Zubehör für den ELISA 

2. Plattenleser, Waschsystem, Mehrkanalpipetten, PP-Röhrchen, sterile Pipettenspitzen 

geeignete Pipetten und Gefässe aus PP für die Verdünnungen 

3. Eisbad vorbereiten 

4. Inkubation bei 37 °C unter Rotation vorbereiten 

5. Materialien / Kontrollen / Reagenzien bereitstellen 

a) Human Normal Serum 

a) Aktivator: HAGG oder Kobragift oder Zymosan 

b) Inhibitor - EDTA 

d) Liposomen / Nanopartikel / Therapeutika-Präparationen 

e) alle Puffer 

f) Probenstabilisator 

6. Proben und Kontrollen für die Inkubation vorbereiten -unbedingt auf Eis durchführen 

a) Kontrolle 1: Human Normal Serum ohne Zusätze - Konzentration siehe Analysenzertifikat 

b) Human Normal Serum plus Aktivator - Anstieg auf 10-fache Konzentration möglich 

c) Human Normal Serum plus EDTA - Inhibitionskontrolle 

d) alle verwendeten Puffer im Verhältnis wie in den Präparationen mit Human Normal Serum herstellen 

e) Liposomen/Nanopartikelpräparationen in geeignetem Verhältnis mit Human Normal Serum (20:80) herstellen 

z.B. je 500 ul herstellen, 5 Aliquote zu je 100 ul auf Eis vorbereiten 

7. Inkubation aller Kontrollen und Proben 

pipettieren Inkubationsintervalle bei 37 °C auf Rotor auf Eis 

15 min 30 min 60 min 120 min 120 min 

NHS �� 

NHS Plus Aktivator �� 

NHS Plus Inhibitor �� 

Puffer �� 

Probe �� 

8. Den Aliquoten nach den Inkubationsintervallen 100 ul Probenstabilisator (1+1) zugeben und auf Eis halten 

9. Proben mit Probendiluent verdünnen entsprechend der Testvorschrift und der erwarteten Reaktion - 

Beispiel C3a: alle Proben sind bereits 1+1 mit Stabilisator verdünnt und bleiben auf EIS 

a) Human Normal Serum ohne Zusätze - Konzentration z. B. C3a 800 ng/ml 

b) Human Normal Serum plus Aktivator - Positivkontrolle der Methode 

c) Human Normal Serum plus EDTA - Inhibitionskontrolle = siehe Kontrolle a 

d) alle verwendeten Puffer im Verhältnis wie in den Präparationen mit Human Normal Serum herstellen 

e) Liposomen/Nanopartikelpräparationen in geeignetem Verhältnis mit Human Normal Serum (z. B. 20:80) 

herstellen und verschiedene Konzentrationen des Therapeutikums austesten 

51

52 

Mit folgenden Verdünnungen wird ein Bereich abgedeckt 

1:500 bis zu 2500 ng (2,5 ng *2*500 = 2,500 ng) 

1:1000 bis zu 5000 ng (2,5 ng *2*1000 = 5,000 ng) 

1:5000 bis zu 25000 ng (2,5 ng *2*5000 = 25,000 ng) 

Verdünnung mit Probendiluent auf Eis 

15 min 30 min 60 min 120 min 120 min 

NHS 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 

NHS plus Aktivator 1:1000 1:1000 1:5000 1:5000 1:5000 

NHS plus Inhibitor 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 

Puffer 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 

Probe Lipos/NPs 1:500 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 

Empfehlung: 

Vorversuche z. B. mit 2 Proben unterschiedlicher Konzentration und mit 3 Inkubationszeiten durchführen. 

Die Aktivierung, Inhibierung und die Puffer in einem separaten Ansatz testen. 

Wenn die optimale Verdünnung und die optimalen Inkubationsintervalle mit der maximalen Aktivierung gefunden, 

sind, dennoch in weiteren Ansätzen mit den Präparationen immer ein Aliquot mit 0 und Max der Kontrollen mitführen. 

Auswertung: 

1. ELISA Kit-Kontrollen im Bereich? 

2. Normal Human Serum entsprechend des Analysenzertifikats in der 0-Probe / Anstieg bei 37 °C 2-3 x 

3. Aktiviertes Normalserum: kann bis zum 10-fachen des Ausgangswertes steigen 

4. Inhibiertes Material: auch während der Inkubation kein Anstieg 

5. Normalserum mit Puffer: Verhältnis beachten (80:20), Zielwert ist demnach nicht 800 sondern 640 ng/ml 

6. Wie verhält sich das Serum mit den Lipos/NPs im Vergleich zum Normalserum?

Auswertung Beispiel C3a 

Serum mit Aktivator zeigt die max. mögliche Aktivierung 18,235 

Serum mit Inhibitor 

Normalserum 

Lipo/Nano Proben 

20 % Probe / 80 % Serum 

Puffer / Serum 

20 % Puffer / 80 % Serum 

Beispiele für geeignete Verdünnungsschritte 

1:500 

1. Step: 240 ul Diluent plus 10 ul Probe – 1:25 

2. Step: 380 ul Diluent plus 20 ul Verdünnung I – 1:20 

1:1000 


2. Step: 380 ul Diluent plus 20 ul Verdünnung I – 1:20 

1:5000 


2. Step 490 ul Diluent plus 10 ul Verdünnung 1 – 1:50 

bestätigt Komplementhemmung, 

die Werte bleiben trotz 

37 °C Inkubation wie beim 0-Wert (Eis) 

0 min 

60 min 

120 min 

Aktivierung wird in Relation zum 

Normalserum beurteilt 

0 min (Eisprobe) 

30 min 

60 min 

120 min 

240 min 

Präparation 2 

0 min (Eisprobe) 

60 min 

120 min 

180 min 

240 min 

< 1000 

0,75 

1,848 

1,98 

0,985 

2,392 

2,716 

4,963 

4,946 

1,142 

2,175 

2,356 

3,013 

3,432 

ergab keine Aktivierung und keine Inhibition < 1000 

Die Verdünnungen wurden so gewählt, dass möglichst wenig Diluent verbraucht wird und die Endmenge 

genügt, um mit der Mehrkanalpipette 2x 100 ul auf die ELISA Platte vozulegen. 

53

54 

11.1.2 Protocol: 

Quantifiying Complement Activation 

in a Non-human Specimen (CxH50) 

Operation Performed by: ......................................... Date: ............................................. 

Reviewed by: .............................................................. Date: ............................................. 

I. Purpose 

To define the procedure and reagents used in the CxH50 assay for serum. 

Materials/Reagents/Equipment required 

Gelatin Veronal Buffer (GVB++) 

5X Veronal Buffer with Ca/Mg 

Gelatin 

Deionized water 

Sheep Erythrocytes in Alsevers Solution 

Hemolysin (Rabbit Anti-Sheep Erythrocyte) 

Bulk, EDTA 0.2M 

Gelatin Veronal Buffer with Ca/Mg (GVB++) 

Hemolysin-Treated Sheep Erythrocytes (EAs) 

On-Test Normal Guinea Pig Serum 

On-Test Complement Activated Guinea Pig Serum 

C3 depleted human serum (Quidel P/N A508) 

Normal human complement standard (Quidel P/N A100) 

Control (as appropriate) 

Materials/Reagents/Equipment required 

Thermometer 

Balance 

Water Bath, 37°C 

Heat Block/Stir Plate 

Stir Bar 

Assorted Glassware 

Pipettes 

Parafilm 

50 mL Conical Tubes (polypropylene) 

Refrigerated Table-Top Centrifuge (e.g., Dupont/Sorval RT6000) 

Spectrophotometer (capable of 540 nm wavelength) 

13 x 100 mm disposable glass test tubes 

12 x 75 mm disposable glass test tubes 

Ice bucket with ice 

Lot Number Expiration Date

II. References 

[1] Mayer, M.M. (1961) Complement and complement fixation. 

In Experimental Immunochemistry, 

edited by E.A. Kabat and M.M. Mayer. 2nd Ed. Charles C. Thomas, Springfield, IL, pp 133-240. 

[2] Nilsson, U.R. and B. Nilsson. 

Simplified Assays of Hemolytic Activity of the Classical and Alternative Complement Pathways. 

Journal of Immunological Methods, 72 (1984), pp 49-59. 

[3] Ruddy, S. (1985) Complement. 

In Laboratory Diagnostic Procedures in the Rheumatic Diseases, 

Grune & Stratton, pp 137-161. 

III. Procedure 

1. Gelatin Veronal Buffer (GVB++) (Makes 1 Liter): 

a. Add 2.0 grams of gelatin to 200 mL of D.I. water in a heat-resistant glass container. 

Heat to boiling to dissolve with const ant stirring. 

b. Measure out 200 mL of 5X VB++ in a clean graduated cylinder. 

Add an additional 500 mL of D.I. water to the cylinder and mix well. 

c. Add 100 mL of the dissolved gelatin and bring to a final volume of one liter with D.I. water. 

Cover with Parafilm ® and mix well by repeated inversion of the container. 

� �� 

Label container with date of preparation, description, your initials, and the expiration date. 

(Note: The GVB++ is good for 3 months when stored at 2-8°C and protected from contamination.) 

2. Sensitized Sheep Erythrocytes (EAs) (Makes about 25 mL of EA stock solution for adjustment; 

can be repeated and pooled for larger volumes): 

Wash SRBCs as follows: 

a. Place 5 mL of SRBCs in a 50 mL conical tube and bring to 50 mL with cold GVB++. Keep the GVB++ on ice 

throughout the procedure. Invert the tubeseveral times to suspend the cells and then spin 900 to 1500 Xs g 

(2000 rpm in QCT#348 centrifuge) at 2 – 8 °C for 10 minutes. Decant supernatant and discard while saving the 

pellet of cells. The pellet should be about 1 mL in volume. Re-suspend the cell pellet into 50 mL of fresh GVB++ 

by gently inverting the tube and spinning again as described above. Continue to wash the cells in this manner 

until the supernatant is clear and colorless. 

b. Re-suspend the pellet into 20 mL of GVB++. In a separate container combine 27 mL of GVB++, 3.0 mL of 0.2M 

EDTA solution, and the optimal dilution of Hemolysin for the assay (usually 1:200 to 1:1000) as determined for 

each lot of Hemolysin (see Section 5 for titration of Hemolysin). Add this second mixture to the suspended 

SRBCs in GVB++ and mix by gentle inversion of the conical tube. (NOTE: The dilution of Hemolysin is based 

upon the total 50 mL mixture volume of GVB++, EDTA, and suspended EAs.) 

c. Incubate the SRBCs, Hemolysin, EDTA mixture at 37 °C for 30 minutes with frequent, gentle mixing 

(e.g., inversion) every 5 minutes. 

d. Spin the cell suspension as described above, and wash at least two times with GVB++ or until the supernatant is 

clear and colorless. Re-suspend the cells in 20 to 25 mL of GVB++ and store at 4 °C. Label this suspension with, 

“EA Stock Solution,” the date of preparation, the expiration date, and your initials. The EA Stock Solution is used 

to make the daily working solution of EAs used in the CxH50 Assay. The EA Stock Solution is good for 10 days 

when stored at 2 – 8 °C and protected from contamination. 

55

56 

e. Adjust a portion of the cells to a final concentration of 6.5 x 10 7 cells per mL to make a daily working solution of 

EAs as described below. The working solution is best made in the morning and can be used throughout the day. 

Make a freshly washed and adjusted working EA solution for each day of testing. 

f. Make sure the cells are washed at least twice or until the supernatant is clear and colorless using GVB++ as the 

washing solution. Using 12 x 75 glass tubes, mix 1.3 mL of water plus 0.2 mL of cell suspension to test the 

concentration of the EAs. Read the O.D. at 540 nm using water as a blank. If the mixture is 1.2 ≤ OD ≤1.6, the 

cells are at 6.5 x 107 cells per mL. Dilute or spin down and re-suspend in an appropriate volume should any 

adjustments become necessary. Only a portion of the EA Stock Solution need be adjusted wto produce the 

working solution for any particular day. 

3. Optimization of CxH50 Assay 

Keep all testing materials on ice. Thaw all materials quickly in a 37° C water bath then place immediately on ice. 

a. Prepare a 1:10 – 1: 1 X 10 6 dilutions of Normal Guinea Pig Serum (NGPS) in GVB++ these will be the initial test 

samples. The amount of NGPS can be altered if necessary. 

� �� 

�� 

thoroughly, but gently. 

Sample �� 

c. Prepare controls and samples in triplicate– Positive control (D.I. water), Background Control (NGPS, GVB++), 

Negative Control (GVB++), and Reference Control (GVB++ + NHS). Add the sample to the tubes last. 

d. Place the tubes in a 37°C water bath for 30 minutes, vortexing very gently every 5 minutes. Handle tubes carefully 

so no water gets inside as this will cause lysis. 

e. Centrifuge the tubes at 900 to 1500 Xg (2000 rpm) for 10 minutes at 2 – 8 °C. 

f. Read supernatants at 540mn using GVB++ as the blank. 

g. Attach printout, and calculate data as described in step 4. 

�� 

serum 

�� 

Test Sample (sample: NGPS) 345 10 120 25 

Reference (sample: NHS: A100) 345 10 120 25 

Positive sample: sterile H20) 0 0 120 380 

Background (sample: NGPS) 355 0 120 25 

Negative (no sample) 380 0 120 25

4. Calculations 

a. Calculate the percent lysis (Y) in decimal form as follows: 

Y= O.D. 540 nm Experimental 

Avg. O.D. 540 nm Positive Control 

b. Next, determine the value of Y/1-Y for each experimental value. 

NOTE: Since the CH50 assay is used to determine the 50 % point of lysis as compared to the Positive Control, 

the point at which Y/1-Y = 1.0, i.e., the 50 % lysis point, must be calculated. 

Example: With an experimental O.D. 540nm = .554, and a Positive Control 

O.D. 540 nm = 1.483, the percent lysis is calculated as follows: 

Y = 0.554 / 1.483 = 0.374 and Y/1-Y - 0.374 / (1-0.374) = 0.597 

c. Determine the volume of serum that corresponds to the 50% point of lysis using either of the following methods: 

� � �� 

per assay tube for each serum tested. Draw a best fit line through the points. Graphically determine the volume 

�� 

or 

II. Using a calculator that is capable of linear regression analysis, enter the values as described above for the 

�� 

the 50 % point of lysis using point-to-point regression. 

III. To calculate the CH50 units/ml present in the original undiluted serum, use the following formula: 

CH50 units/ml= �� 

�� 

5. Hemolysin Titration for the Production of EAs 

A determination of the optimal concentration of hemolysin used for the production of EAs must also be performed using 

the methods described previously. This proceduremust be done for every new lot of hemolysin purchased or when the 

activity of any hemolysin preparation is in question. 

The titration assay will include various concentrations/volumes of hemolysin (e.g., final dilutions of 100-, 200-, 500-, 1000-, 

and 2000-fold) used to produce small lots of EAs. These EAs are then examined against a dilution of serum known to 

generate a high level (80 – 100%) of lysis of EAs as compared to the positive control (EAs plus water). In this manner, 

every lot of hemolysin will be examined for optimal performance. The concentration of hemolysin chosen to produce future 

preparation of EAs should be the concentration that results in maximal lysis using a serum of known CH50 activity. 

IV. Additional Information 

1. If the data points do not fall on a straight line, possible problems include pipetting errors, reaction mixtures were not 

vortexed completely or often enough during the assay, EAs not functioning properly (too old), or contaminated GVB++. 

2. Human plasma can also be examined using these methods since the original dilution of 80- to 100-fold will prevent 

clot formation during the assay. 

3. If the series of tubes for a serum does not afford the presence of a 50 % lysis point somewhere in the series, adjust 

the original serum dilution and repeat the assay using a less concentrated or more concentrated serum dilution as 

appropriate. 

57

58 

V. Determination of optimal Dilution for later Testing 

1. C3H50 is determined by the dilution yielding a 50% lysis of Ea. 

2. The dilution of the normal guinea pig serum at which 50% lysis occurs can then be used as the optimal dilution for all 

future experiments. 

3. Normal human serum can be used as an experimental control for the process. 

4. The positive control sample (DI water only) is used as the 100 % lysis point. 

5. Normal guinea pig serum is a background value. 

6. Once the optimal (50 % lysis) dilution is determined in an unactivated normal control all future assays can be use this 

dilution as 100 %. 

VI. Determination of C3H50 

1. To determine C3H50 in test sera samples are run verus a normal unactivated conrol (100 %) at the optimal dilution 

determined in section V. 

2. Dilute all experimental samples with cold GVB++ to the optimal dilution. For assay controls NGPS (100 % control) and 

NHS (assay control), DI water (100 % lysis control). Perform the hemolytic assay. 

a. Prepare a optimal dilution of Normal Guinea Pig Serum (NGPS) and test specimens in GVB++ these will be samples. 

�� 

�� 

thoroughly, but gently. 

Sample �� 

c. Prepare controls and samples in triplicate– Positive control (D.I. water), Background Control (NGPS, GVB++), 

Negative Control (GVB++), and Reference Control (GVB++ + NHS). Add the sample to the tubes last. 

d. Place the tubes in a 37 °C water bath for 30 minutes, vortexing very gently every 5 minutes. Handle tubes carefully 

so no water gets inside as this will cause lysis. 

e. Centrifuge the tubes at 900 to 1500 X g (2000 rpm) for 10 minutes at 2 – 8 °C. 

f. Read supernatants at 540 mn using GVB++ as the blank. 

g. Read supernatants at 540 mn using GVB++ as the blank. 

�� 

serum 

�� 

100% Normal 

(sample: NGPS@ optimal dilution) 

345 10 120 25 

Reference (sample: NHS: A100) 345 10 120 25 

Positive (sample: sterile H20) 0 0 120 380 

On Test (sample: test GP serum) 345 10 120 25 

Negative (no sample) 380 0 120 0 

h. Use the A540 of NGPS as 100 % control. From the A540 of the test samples calculate % of 100% control and plot 

accordingly.

11.2 Technical Data sheet and certificate of analysis (examples) 

Complement Technical Data Sheet 

Normal Human Serum Complement 

For Research Use Only. Not for use in Diagnostic Procedures. 

Background 

Quidel human serum complement standard is a uniform pool of human serum complement that has been characterized 

for levels of complement activation fragments (complement split products) as well as CH50. Because the anticoagulants 

used in the preparation of plasma (EDTA, ACD and even heparin) can interfere with complement activation in vitro,serum 

has long been used as a human complement source for experimentation. Many commercially available sera, however, 

are not processed appropriately to conserve complement activity. Lyophilization and plasma recalcification can raise 

background levels of complement split products (SC5b-9 or TCC, iC3b,Bb, C4d and particularly the anaphylatoxins C3a, 

C5a and C4a) and decrease CH50. Sera, however, must be processed quickly and correctly to prevent complement turnover. 

For this reason, sera obtained from blood banks and other large pools may not be suitable for many experimental 

procedures. Conversely, in house serum draws are complicated by several factors including the necessity of maintaining 

standardized pools of complement for ongoing experimentation and the confidentiality requirements relating to infectious 

disease testing. Quidel Normal Human Serum Complement is designed to address these specific issues. 

Storage and Handling 

This product should be stored at or below -70 °C.When needed, it should be thawed rapidly at 37 °C and immediately placed 

on ice until use.Any remaining sera should be aliquotted into polypropylene tubes in a convenient volume and re-frozen at 

-70 °C or below. Avoid repeated freeze thaw. Storage at temperatures warmer than -70 °C is not recommended. 

Applications 

Normal human serum complement is suitable for in vitro experiments relating to complement activation. It has been widely 

used in biomaterials research, pharmaceutical development and cytotoxicity assays. It is ideal for experiments and assays 

for which a high level of in vitro complement activity is necessary or a low level of complement activation fragments is 

required. 

Specifications 

Catalog Number: A113 

Volume/Vial: 5.0 ml 

Storage: ≤ – 70°C 

Form: Frozen Liquid 

References 

[1] Idusogie, E. E.,Presta, L., et al. 

Mapping of the C1q binding site on Rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 

FC. J. Immunol 164:4178-4184 (2000). 

[2] Hinton, PR., Xiong, J., et al. 

An Engineered Human IgG1 Antibody with Longer Serum Half-Life. 

J Immunol 176:346-356 (2006). 

[3] Dall’Acqua, W.F., Cook, K.E., et al. 

Modulation of the Effector Functions of a Human IgG1 through Engineering of Its Hinge Region. 

J Immunol 177:1129-1138 (2006). 

59

60 


Guinea Pig Serum Complement 

For Research Use Only in the U.S. Not for use in Diagnostic Procedures. 

Background 

Quidel guinea pig serum complement is a uniform pool of guinea pig serum that has been characterized for both classical 

and alternative pathway activity. Guinea pig serum has been in use from the beginning of the twentieth century to the 

present for the study of complement activity and its relationship to immunity [1-4]. The discovery of guinea pigs deficient 

in specific complement fragments has furthered this research. Guinea pig serum is recommended by both the U.S. and 

European Pharmacopoeia for testing the anticomplementary activity of immunoglobulin. 


This product should be stored at or below -70 °C. When needed, it should be thawed rapidly at 37 °C and immediately placed 

on ice until use. Any remaining sera should be aliquotted into polypropylene tubes in a convenient volume and re-frozen 

at -70 °C or below. Avoid repeated freeze thaw. Storage at temperatures warmer than -70 °C is not recommended. 

Applications 

Guinea pig serum complement is suitable for in vitro experiments relating to complement activation. It has been widely 

used in biomaterials research and pharmaceutical development. It is ideal for experiments and assays for which a high 

level of in vitro complement activity is necessary or a low level of complement activation fragments is required. 




Concentration: >40 mg protein/ml 

Activity: >500 CP50 Units/ml 

>50 AP50 Units/ml 

Storage: ≤ -70°C 

Form: Frozen Liquid 

Origin: Manufactured in the USA 

References 

[1] Moore, H.D. 

Complementary and opsonic functions in their 

relation to immunity: A study of the serum of 

guinea-pigs naturally deficient in complement. 

J. Immunol 4:425-441 (1919). 

[2] Hyde R.R. and Parsons E.I. 

Quantitative interdependence of sensitizer and 

complement in hemolysis. 

Am. J. Epidemiol. 7(1):11-21 (1927). 

[3] Muller F. and Segerling M. 

A factor in guinea-pig serum with accelerating 

effect on immune immobilization of Treponema 

pallidum (IAF): Isolation, purification and 

differentiation from the known haemolytic 

complement components and from lysozyme. 

Immunology 27:33-41 (1974). 

[4] Wooley, R.E. et al. 

Comparison of chicken plasma and guinea pig 

serum in a quantitative microtiter method of 

determining microbial complement resistance. 

Avian Diseases 35(4):897-900 (1991).


Complement Activator (HAGG) Heat Aggregated Gamma Globulin 


Background 

The classical pathway of complement can be triggered by antibody bound to a foreign particle (immune complex, cell or 

other material). Particles of this type interact directly with C1q. C1q can then activate the C1r(2)C1s(2) sub-units of the C1 

complex. The activated C1s cleaves C4 to C4b near the amino terminus of the gamma chain releasing C4a in the process. 

Activation of the Classical Pathway is under stringent control in vivo. C4b is rapidly degraded to iC4b and then to C4c 

and C4d. Because of the short life of the C4b molecule, much of the C4d is free and circulates in serum. As such C4d is 

an excellent marker for classical complement activation in vivo or in vitro and is therefore the basis of the MicroVueTM 

C4d EIA Kit (Item A008). 

Heat Aggregated Gamma Globulin acts as a potent classical complement pathway activator, functioning similarly to naturally 

occurring immune complexes. When activated by a potent activator, such as Quidel’s Complement Activator, nearly 

all the C4 in a given complement source may be converted into cleavage products. 

��ted 

with a referenceserum (Normal Human Serum Complement, Cat. A113) at 37 °C for 90 minutes. At fixed time points, 

samples of the reference serum are taken. Ice cold 20 mM EDTA is added to each sample to block further complement 

activation; the samples are stored on ice until assay. Upon completion of the activation phase, the resulting samples are 

�� 

a rapid increase in C4d concentration followed by a plateau. Quidel’s complement activator will fully activate the classical 

complement pathway of the reference sera within 30 minutes at 37 °C. 



Protein Concentration: ~ 50 mg/ml 

Volume/Vial: 0.2 ml/vial 


Buffer: Phosate Buffered Saline (pH 7.3, 20 mM CaCl and MgCl) 

61

62 


Cobra Venom Factor 


Background 

Cobra Venom Factor (CVF), sometimes referred to as C3b(Cobra), is the non-toxic, complement activating component of 

cobra venom. 1–3 Like naturally occurring C3b, CVF forms a complex with complement components Factor B and Factor D. 

This CVFBbD convertase is capable of activating C3 in a wide variety of species via the alternative complement pathway. 

Unlike the naturally occurring convertase (C3bBbD), the C3b(Cobra)BbD convertase is Factor H resistant and is therefore 

not inactivated by Factor I or CR1. Given appropriate incubation time, CVF will convert nearly 100 % of the C3 to C3 end 

products. Unlike CVF purified from the Naja naja haje species, CVF from Naja naja kaouthia activates the terminal pathway 

directly by forming a C5 convertase. 4,5 This depletes C5 in a manner analogous to that described above for C3. Levels of 

iC3b, C3a, SC5b-9, C5a and the Factor B cleavage product Bb are all extremely high in CVF treated sera. 


Purified CVF may be stored at -70°C until the expiration date listed on the vial and the accompanying Certificate of Analysis. 

CVF should be thawed rapidly at 37°C and immediately placed on ice until use. 

Applications 

Note: When using any CVF in vivo or in vitro,�� 

vary slightly between preparations and suppliers. In general, one unit of CVF is equal to 2 – 6 μg of CVF. 

Quidel’s CVF has been used in a variety of in vitro and in vivo models to deplete complement. For in vitro experiments, 

8 – 20 units/ml of serum is adequate to convert nearly all the available C3 to C3 fragments when incubated with neat 

human serum for 60 – 90 minutes at 37° (data on file at Quidel).This will also convert nearly all the available C5 to C5a 

and SC5b-9. 

Quidel’s CVF has also been used successfully in a variety of animal models, 6 – 8 including mice, rats, guinea pigs, various 

primates, dogs, pigs and sheep to deplete complement in vivo.This application has not been tested or verified at Quidel. 

For a list of studies, please refer to Quidel’s expanded bibliographic references for this product, available upon request 

from Quidel Technical Service. 



Concentration: 1.0 – 1.2 mg/ml 

Purity: ≥ 95 % by SDS PAGE 


Activity/Vial: ≥ 350 units 

Storage: ≤ – 70 °C 

Buffer: Phosphate Buffered Saline 

(pH 7.2 ± 0.2) 

References 

[1] Fritzinger,D.C.,Bredehorst,R.Vogel,C-W 

Molecular cloning and derived primary structure 

of cobra venom factor. 

PNAS 91:26, 12775-12779 (1994). 

[2] O’Keefe, M.C., Caporale, L.H., Vogel, C-W. 

Comparison of the Alpha Chain Fragments 

of C30 and C3c and CVF implications for C3 

convertase formation. 

Complement 4:3-4 (1987). 

[3] Gowda D.C., et al. 

Modulation of the Effector Functions of a Human 

IgG1 through Engineering of Its Hinge Region. 

J Immunol 177:1129-1138 (2006). 

[4] Van Den Berg, C.W., et al. 

In vivo anti complementary activities of cobra 

venom factors from Naja naja and Naja haje. 

J Immunol Meth 12:6,287-294 (1991). 

[5] Bauman, N. 

Lack of complement C5 convertase generating 

activity in Naja haje cobra venom factor. 

J Immunol 120:5, 1763-1764 (1978). 

[6] Till, G.O., et al. 

Activation of C5 by CVF is required in 

nuetrophil-mediated lung injury in the rat. 

Am J Pathol 129:144-53 (1987). 

[7] Rajasinghe, H., et al. 

Key role of the alternative pathway in hyperacute 

rejection of rat hearts transplanted into 

fetal sheep. 

Transplantation 62:3, 407-426, 1996. 

8] Koymada, N., Bach, F. 

Transient complement inhibition plus T-Cell 

immunosuppression induces long term graft 

survival of mouse to rat cardiac xenografts. 

Transplantation 66:9, 1210-1215 (1998).


Specimen Stabilizing Solution 


Background 

The Quidel Specimen Stabilizing Solution, when used in accordance with the procedure described below, will retard the 

generation of complement activation fragments and complexes in human serum and plasma during processing and storage. 

This product extends the stability of the specimens significantly reducing the likelihood of in-vitro generated elevation of 

complement fragments. The Quidel Specimen Stabilizing Solution should be used for stabilizing serum and plasma 

specimens that cannot be tested or stored at or below -70 °C, within four hours after phlebotomy. The Quidel Specimen 

Stabilizing Solution is intended for use with all assays designed to assess complement activation fragments, specifically 

�� 

Preparation 

Warm the bottle containing the Specimen Stabilizing Solution in a 37 °C water bath to dissolve the contents. Mix thoroughly 

until the solution is clear. Allow the contents to return to room temperature prior to use. 

Procedure 

�� 

complement activation; this should be performed on ice. 

�� 

�� 

Specimen Storage 

Stabilized specimens may be stored for up to six days at 4 °C prior to testing or at -20 °C or below for one month. Storage 

of unstabilized specimens at -20 °C or warmer will result in complement activation. 

Use of Stabilized Specimens 

Stabilized specimens should be tested as soon after thawing as possible. As with any complement specimen, thaw at 

37 °C. Remove to ice as soon as the specimen has thawed. Do not leave specimens at 37 °C. Since the specimen is already 

diluted 1:2 in specimen stabilizer, the required assay dilution should be reduced two-fold (e.g., if the required dilution is 1:50, 

make a 1:25 of the stabilized specimen). Normal ranges should be determined for stabilized specimens independently. In 

some assays, the concentration of the analyte will differ slightly between stabilized and unstabilized specimens. 



Volume/Vial: 25 mL 

Storage: 2 – 20 °C 

63

64 


Normal Human Complement Standard 


Background 

Quidel’s human complement standard is a uniform pool of human serum complement that has been characterized for 

levels and activities of a variety of complement proteins. Unlike lyophilized complement sources, Quidel complement 

standard maintains high levels of complement hemolytic activity and antigenic integrity. For this reason it is an ideal external 

standard for a variety of laboratory functional and antigenic assays for specific complement proteins (e.g., CH50, 

APH50, RID, C3 H50, etc.) 

Sera obtained from blood banks and other large pools may not be suitable for many procedures due to high levels of 

background complement activation. Conversely, in house serum draws are complicated by several factors including the 

necessity of maintaining standardized pools of complement for ongoing experimentation and the confidentiality requirements 

with regard to infectious disease testing. 

Characterization and Testing/Analysis and Testing 

Quidel’s Human Complement Standard has been tested for antigenic levels of C1q, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 

Factor B, Factor H and Factor P, by Radial Immuno-Diffusion (RID). Functional levels of the complement proteins 

C1q, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 and Factor B and Factor D have been determined by standard hemolytic assay. 

Classical pathway hemolytic activity (CH50) and alternative pathway hemolytic activity (AH50) have also been measured 

by standard techniques. Levels of the complement fragment iC3b, a measure of C3 cleavage,were assessed using the 

MicroVueTM iC3b EIA kit. 


This product should be stored at or below -70 °C. Storage at temperatures warmer than -70 °C is not recommended. 

When needed, it should be thawed rapidly at 37 °C and immediately placed on ice until use. Refer to the Certificate of 

Analysis for this product for specific handling instructions. Any remaining sera should be aliquotted into polypropylene 

tubes and refrozen at -70 °C or below. Avoid repeated freeze thaw. 

Applications 

This product is intended for use in a research setting as a standard material for complement assays. Protocols for the RID, 

hemolytic and other assays used in the characterization of this product are available from Quidel Technical Service. This 

product should not be used in experiments where measurement of in vitro complement activation (e.g. complement 

biocompatibility) is required. Quidel provides Item A113 expressly for use in these applications. 





Form: Frozen Liquid

Example 

only 

65

66 

Example 

only

Example 

only 

67

68 

Example 

only

Example 

only 

69

Example 

only 

71

Complement System 

Classical 

Pathway 

Factor 

D 

Factor 

P 

Factor 

I 

C4BP 

C1- 

INH 

C1C 

C1q 

C4 

C1s 

C1r 

LPS 

C3 

Tickover 

C3i 

Factor 

B 

Bb 

C2 

C4b 

C2a 

Proteases 

MASP2 

MASP1 

MBL 

-CHO 

Alternative 

Pathway 

Ba 

C3 

Convertase 

C2b 

C4d 

C4c 

C4a 

Lectin 

Pathway 

Amplification 

Loop 

Factor 

I 

Factor 

H 

C3 

C3a 

C3f 

Regulatory Proteins 

C3b 

DAF 

CRI 

Surface 

C3b 

C3c 

CD59 

MCP 

C5 

Convertase 

iC3b 

C5 

C5a 

SProtein 

C3d.g 

= Regulatory Proteins 

Terminal 

Pathway 

C5b 

Clusterin 

= Activators 

C6 

*MicroVue Products 

are indicated in green 

C7 

SC5b-9 

(TCC) 

Complement Receptors 

C8 

C9 

C1qR 

C5aR 

C3aR 

MAC Assembly 

(TCC) 

CR4 

CR3 

CR2 

CR1 

Quidel Corporation • Specialty Products Group • 2981 Copper Road, Santa Clara, CA 95051 • www.quidel.com

74 

Notizen

Notizen 

75

The Specialist for Biochemical Markers 

For further information please contact: / Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an: / Pour plus d’informations, vous pouvez contacter: 

Exclusive Strategic Partnership in Europe: 

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Benelux 

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