Metaphase- chromatin - (GFID) eV
Metaphase- chromatin - (GFID) eV Metaphase- chromatin - (GFID) eV
Immunfluoreszenzmuster nicht organspezifischer Autoantikörper - Versuch einer Klassifikation - Karsten Conrad Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus
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- Seite 32 und 33: Sm/U1-RNP-Ak > A1-V/A2-I/B1-I A A1
- Seite 34 und 35: NuMA-Ak > A1-V/A2-I/B1-I/B3-II A A1
- Seite 36 und 37: ACA > A1-VIII/B1-VIII A A1 NUKLEOPL
- Seite 38 und 39: CENP-F > A4-II/B1-VIII A A1 NUKLEOP
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Immunfluoreszenzmuster<br />
nicht organspezifischer<br />
Autoantikörper<br />
- Versuch einer Klassifikation -<br />
Karsten Conrad<br />
Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus
Färbemuster<br />
an Hep-2-<br />
Zellen<br />
Problemstellung<br />
AAk-Spezifität Diagnose
Vorteile des Screenings auf nospAAk<br />
mittels IIF an HEp-2-Zellen<br />
Hochsensitives Screening auf ca. 30 klinisch<br />
relevante AAK-Spezifitäten<br />
ACA, Aktin, AMA-M2, dsDNA, Fibrillarin, gp210,<br />
Histon, Jo1, Ku, La, LBR, Mi-2, Nukleosom, PCNA, PMscl,<br />
PL7, PL12, Proteasom, Rib-P, RNAP, Ro52, Ro60, Scl-<br />
70, Sm, Sp100, SRP, Th/To, U1-RNP, ...<br />
Einfacher und kosteneffektiver<br />
multiparametrischer Assay
Vorteile des Screenings auf nospAAk<br />
mittels IIF an HEp-2-Zellen<br />
Hochsensitives Screening auf ca. 30 klinisch<br />
relevante AAK-Spezifitäten<br />
Spezifischer Nachweis von an ihrem<br />
Bindungsmuster erkennbaren AAK<br />
ACA, AMA, PCNA, Sp100, CENP-F<br />
Kosteneffektiver Einsatz nachfolgender<br />
Untersuchungen je nach Immunfluoreszenzmuster<br />
und diagnostischer Fragestellung
Vorteile des Screenings auf nospAAk<br />
mittels IIF an HEp-2-Zellen<br />
Möglichkeit des Nachweises seltener, aber<br />
diagnostisch relevanter AAK, für welche<br />
keine kommerziellen Assays zur Verfügung<br />
stehen Th/To<br />
seltene Anti-tRNA-Synthetase-Ak<br />
PCNA<br />
Möglichkeit des Nachweises von seltenen<br />
AAK unbekannter Feinspezifität, aber<br />
potenzieller klinischer Relevanz
Vorteile des Screenings auf nospAAk<br />
mittels IIF an HEp-2-Zellen<br />
Erhöhung der diagnostischen Sicherheit:<br />
Hinweis auf potentiell falsch positive<br />
Ergebnisse in den „spezifischen“ Assays<br />
ANA negativ dsDNA-Ak pos.<br />
Sm-Ak. pos.
Ideale Screeningmöglichkeit auf<br />
nospAAK<br />
PROBLEME:<br />
• Subjektive Befundung<br />
• Fehlende Standarisierung<br />
• Fehlende Automatisierung
IIF an Hep-2-Zellen<br />
nukleär (ANA) zytoplasmatisch negativ<br />
dsDNA<br />
Nukleosom<br />
U1-RNP/Sm<br />
PM/Scl<br />
Ku<br />
Mi-2<br />
Spezifische Immunoassays<br />
Jo-1<br />
Rib-P<br />
AMA<br />
??<br />
??<br />
Auschluss<br />
-eines bestimmtem AAK<br />
-einer bestimmten<br />
Erkrankung
1.<br />
2.<br />
Probleme/Fragen<br />
Welche AAk (>Erkrankungen) können bei<br />
einem neg. IIF-Befund ausgeschlossen<br />
werden?<br />
Wie zuverlässig sind Assoziationen zwischen<br />
IIF-Muster und AAK-Spezifität?
ANA-Titer / ENA-Ak<br />
Literatur<br />
• Je höher der Titer, desto mehr ENA/dsDNA-Ak<br />
• Assoziation homogenes Muster mit dsDNA-Ak<br />
(CLIFT, ELISA)<br />
• Keine sign. Assoziation zwischen Grundmuster<br />
und Mehrzahl der ENA-AK<br />
I. KANG et al., Clin Rheumatol. 2004; 23: 509-515<br />
I. Peene et al.: Ann Rheum Dis 2001; 60:1131–1136
Routinediagnostik<br />
Institut für Immunologie der TU Dresden<br />
2001-2008
ANA < 1:160 und <strong>Metaphase</strong><strong>chromatin</strong> negativ<br />
> Keine weitere Untersuchung erforderlich<br />
AUSNAHMEN:<br />
• gran. zytoplasmatisches Muster > Jo-1<br />
• Pat. mit Myositis > Jo-1, Myositis-LIA<br />
• Pat. mit V. a. SLE oder Sjögren > Ro-Ak
<strong>Metaphase</strong><strong>chromatin</strong> positiv<br />
> immer dsDNA-Ak<br />
(auch bei niedrigen IIF-Titern)<br />
> wenn dsDNA-Ak negativ > Nukleosom-Ak
HEp-2-Zellmonolayer<br />
INTERPHASE<br />
Nukleoli<br />
Zytoplasma<br />
Chromatin<br />
Zellkern<br />
METAPHASE<br />
Mixoplasma
HEp-2: AAK binden zelluläre<br />
Organellen und Strukturen<br />
Kernmembran Kernmatrix Kernkörperchen<br />
Mitosespindel Ribosomen Golgiapparat
nukleär zytoplasmatisch Zellzyklus<br />
assoziiert<br />
•Homogen<br />
•Granulär<br />
•Feingranulär<br />
•Peripher<br />
•Nukleolär<br />
•Nukleäre Dots<br />
•Homogen<br />
•Granulär<br />
•Mitochondrien<br />
•Golgi<br />
•Dots<br />
•Zytoskelett<br />
•<strong>Metaphase</strong><strong>chromatin</strong><br />
•Spindelapparat<br />
•„pleomorph“
AAk-Stufendiagnostik bei Kollagenosen<br />
I. Screening auf nichtorganspezifische AAk<br />
Zytoplasma positiv<br />
feingran.<br />
II. Bestimmung der AAk-Spezifitäten<br />
u.a.<br />
Jo-1<br />
homogen<br />
ribosomale<br />
Phosphoproteine<br />
u.a.<br />
Scl70<br />
RNAP-I<br />
PM-Scl<br />
PCNA<br />
dsDNA<br />
Nukleosom<br />
Histon<br />
Fluoreszenz<br />
Zellkerne positiv (= ANA)<br />
Nukleoli pleohomogrobfeinmorphgengranulärgranulär Sm<br />
U1-RNP<br />
Ro/SS-A<br />
La/SS-B
Indirekte Immunfluoreszenz an Hep-2-Zellen<br />
Zellkerne positiv (= ANA)<br />
dsDNA<br />
Fluoreszenz<br />
HEp-2-Zellen<br />
Homogen + Meta<strong>chromatin</strong><br />
AAk-Spezifitätsbestimmung
ANA homogen<br />
PROMETAPHASE Chromatin<br />
METAPHASE<br />
positiv<br />
INTERPHASE<br />
homogene Kernfärbung<br />
TELOPHASE
Färbung in METAPHASE
Färbung in später ANAPHASE und TELOPHASE
Indirekte Immunfluoreszenz an Hep-2-Zellen<br />
AAk-Spezifitätsbestimmung<br />
Zellkerne positiv (= ANA)<br />
Fluoreszenz<br />
• Nukleosomen<br />
• Histone<br />
• (andere <strong>chromatin</strong>assoz.<br />
Proteine)<br />
HEp-2-Zellen<br />
Homogen/gran. + Meta<strong>chromatin</strong>
05_4005<br />
aNukleosom
05_4005<br />
aNukleosom
08_3100<br />
aNukleosom
08_3171<br />
aHiston
08_4557<br />
Histon + dsDNA-AK
A A1 NUKLEOPLASMA<br />
Zellkern A2 NUKLEOLI<br />
A3 KERNMEMBRAN<br />
A4 PLEOMORPH<br />
B B1 META-CHROMATIN<br />
Mitosen B2 TRENNZONE<br />
B3 SPINDEL<br />
B4 ZENTRIOL<br />
C C1 ZYTOPLASMA<br />
Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT<br />
C3 MITOCHONDRIEN<br />
C4 GOLGI<br />
Klassifikation von HEp-2-Mustern<br />
I II III IV V VI VII VIII<br />
ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots<br />
30
dsDNA > A1-III/B1-III<br />
Histon/Nukleosom > A1-IV/B1-IV<br />
A A1 NUKLEOPLASMA<br />
Zellkern A2 NUKLEOLI<br />
A3 KERNMEMBRAN<br />
A4 PLEOMORPH<br />
B B1 META-CHROMATIN<br />
Mitosen B2 TRENNZONE<br />
B3 SPINDEL<br />
B4 ZENTRIOL<br />
C C1 ZYTOPLASMA<br />
Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT<br />
C3 MITOCHONDRIEN<br />
C4 GOLGI<br />
I II III IV V VI VII VIII<br />
ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots<br />
30
Indirekte Immunfluoreszenz an Hep-2-Zellen<br />
Zellkerne positiv (= ANA)<br />
granulär<br />
AAk-Spezifitätsbestimmung<br />
Fluoreszenz<br />
HEp-2-Zellen<br />
• Sm<br />
• U1-RNP<br />
• (andere spliceosomale Proteine)
INTERPHASE<br />
Nukleoplasma granulär<br />
Nukleoli negativ<br />
ANA granulär<br />
METAPHASE<br />
Chromatin negativ<br />
Mixoplasma granulär
Sm/U1-RNP-Ak > A1-V/A2-I/B1-I<br />
A A1 NUKLEOPLASMA<br />
Zellkern A2 NUKLEOLI<br />
A3 KERNMEMBRAN<br />
A4 PLEOMORPH<br />
B B1 META-CHROMATIN<br />
Mitosen B2 TRENNZONE<br />
B3 SPINDEL<br />
B4 ZENTRIOL<br />
C C1 ZYTOPLASMA<br />
Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT<br />
C3 MITOCHONDRIEN<br />
C4 GOLGI<br />
I II III IV V VI VII VIII<br />
ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots<br />
30
INTERPHASE<br />
Nukleoplasma granulär<br />
Nukleoli negativ<br />
NuMA<br />
METAPHASE<br />
Mitot. Spindel pos
NuMA-Ak > A1-V/A2-I/B1-I/B3-II<br />
A A1 NUKLEOPLASMA<br />
Zellkern A2 NUKLEOLI<br />
A3 KERNMEMBRAN<br />
A4 PLEOMORPH<br />
B B1 META-CHROMATIN<br />
Mitosen B2 TRENNZONE<br />
B3 SPINDEL<br />
B4 ZENTRIOL<br />
C C1 ZYTOPLASMA<br />
Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT<br />
C3 MITOCHONDRIEN<br />
C4 GOLGI<br />
I II III IV V VI VII VIII<br />
ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots<br />
30
ANA dots > 30<br />
METAPHASEN<br />
INTERPHASEN
ACA > A1-VIII/B1-VIII<br />
A A1 NUKLEOPLASMA<br />
Zellkern A2 NUKLEOLI<br />
A3 KERNMEMBRAN<br />
A4 PLEOMORPH<br />
B B1 META-CHROMATIN<br />
Mitosen B2 TRENNZONE<br />
B3 SPINDEL<br />
B4 ZENTRIOL<br />
C C1 ZYTOPLASMA<br />
Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT<br />
C3 MITOCHONDRIEN<br />
C4 GOLGI<br />
I II III IV V VI VII VIII<br />
ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots<br />
30
Centromerprotein-F-Antikörper<br />
Fluoreszenz der Centromeren nur in METAPHASEN<br />
variable Färbungen in den<br />
INTERPHASEN
CENP-F > A4-II/B1-VIII<br />
A A1 NUKLEOPLASMA<br />
Zellkern A2 NUKLEOLI<br />
A3 KERNMEMBRAN<br />
A4 PLEOMORPH<br />
B B1 META-CHROMATIN<br />
Mitosen B2 TRENNZONE<br />
B3 SPINDEL<br />
B4 ZENTRIOL<br />
C C1 ZYTOPLASMA<br />
Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT<br />
C3 MITOCHONDRIEN<br />
C4 GOLGI<br />
I II III IV V VI VII VIII<br />
ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots<br />
30
Antinukleoläre Antikörper: granuläre Fluoreszenz<br />
Nukleoli<br />
granulär / punktiert<br />
Nukleoplasma negativ
Antinukleoläre Antikörper: homogene Fluoreszenz<br />
<strong>Metaphase</strong><strong>chromatin</strong> teilw.pos.<br />
Nukleoli homogen<br />
Nukleoplasma schwach granulär
Anti-Topoisomerase-Antikörper (Scl-70)<br />
Nukleoplasma granulär<br />
Nukleoli prominent<br />
<strong>Metaphase</strong><strong>chromatin</strong> teilw.pos.
8<br />
SP-100-Antikörper + AMA<br />
multiple nukleäre Dots<br />
7<br />
>10
zytoplasmatische<br />
Granula<br />
tRNA-Synthetase-Antikörper
Mitotische Spindel
Centrosom/Centriol-Antikörper<br />
Centriol<br />
METAPHASE<br />
INTERPHASEN<br />
Centrosom<br />
Procentriol
METAPHASE<br />
Färbung des Chromatins<br />
Midbody-Antikörper<br />
INTERPHASE<br />
variable granuläre Färbung<br />
Färbung der<br />
Zellzeilungsfurche<br />
(„Midbody“)<br />
TELOPHASE
Das vorgeschlagene Klassifikationsschema ist<br />
geeignet, die klinisch relevanten AAK-<br />
Spezifitäten an Hand von 1-4 Kriterien zu<br />
charakterisieren, wenn die entsprechenden<br />
AAk monospezifisch oder dominant vorliegen.<br />
= Grundlage für die weitere Entwicklung von<br />
Software-Algorithmen zur automatischen<br />
Musterdifferenzierung an Hep-2-Zellen
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