Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit des
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Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften der Tierärztlichen Hochschule Hannover __________________________________________________ Entwicklung von mikroverkapselten Probiotika-Präparaten zum Einsatz als Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Julia Nina Jähne aus Bremen Hannover 2007
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<strong>Aus</strong> <strong>dem</strong> <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Lebensmittelqualität</strong> <strong>und</strong> -<strong>sicherheit</strong><br />
<strong>des</strong> Zentrums <strong>für</strong> Lebensmittelwissenschaften<br />
der Tierärztlichen Hochschule Hannover<br />
__________________________________________________<br />
Entwicklung von mikroverkapselten<br />
Probiotika-Präparaten<br />
zum Einsatz als Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen<br />
INAUGURAL-DISSERTATION<br />
Zur Erlangung <strong>des</strong> Gra<strong>des</strong> einer<br />
Doktorin der Veterinärmedizin<br />
(Dr. med. vet.)<br />
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover<br />
Vorgelegt von<br />
Julia Nina Jähne<br />
aus Bremen<br />
Hannover 2007
Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek<br />
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;<br />
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.<br />
1. Auflage 2007<br />
© 2007 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen<br />
Printed in Germany<br />
ISBN 978-3-939902-35-5<br />
Verlag: DVG Service GmbH<br />
Frankfurter Straße 89<br />
35392 Gießen<br />
0641/24466<br />
geschaeftsstelle@dvg.net<br />
www.dvg.net
<strong>Aus</strong> <strong>dem</strong> <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Lebensmittelqualität</strong> <strong>und</strong> -<strong>sicherheit</strong><br />
<strong>des</strong> Zentrums <strong>für</strong> Lebensmittelwissenschaften<br />
der Tierärztlichen Hochschule Hannover<br />
___________________________________________________________<br />
Entwicklung von mikroverkapselten<br />
Probiotika-Präparaten<br />
zum Einsatz als Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen<br />
INAUGURAL-DISSERTATION<br />
Zur Erlangung <strong>des</strong> Gra<strong>des</strong> einer<br />
Doktorin der Veterinärmedizin<br />
(Dr. med. vet.)<br />
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover<br />
Vorgelegt von<br />
Julia Nina Jähne<br />
aus Bremen<br />
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. G. Klein<br />
PD Dr. M. Kühne<br />
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Klein<br />
PD Dr. M. Kühne<br />
2. Gutachter: Prof. Dr. G. Breves<br />
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Mai 2007<br />
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Fritz-Ahrberg-Stiftung, Hannover.
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis<br />
1 Einleitung 15<br />
2 Wissenschaftliches Schrifttum 17<br />
2.1 Probiotika ................................................................................................... 17<br />
2.1.1 Genus Lactobacillus............................................................................ 22<br />
2.1.1.1 L. acidophilus-Gruppe.................................................................. 25<br />
2.1.1.2 L. casei-Gruppe ........................................................................... 27<br />
2.1.1.3 L. reuteri/L. fermentum-Gruppe.................................................... 28<br />
2.1.2 Probiotische Wirkungen ...................................................................... 29<br />
2.1.3 Sicherheit <strong>und</strong> ges<strong>und</strong>heitliche Unbedenklichkeit ............................... 35<br />
2.2 Fleischerzeugnisse <strong>und</strong> Gewürze .............................................................. 42<br />
2.2.1 Begriffsdefinitionen im Zusammenhang mit Fleischerzeugnissen....... 42<br />
2.2.2 Gewürze.............................................................................................. 44<br />
2.2.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Gewürzen........................................ 46<br />
2.2.3 Einsatz von Probiotika in Fleischerzeugnissen ................................... 50<br />
2.3 Technologische Verfahren zur Bakterienbearbeitung................................. 55<br />
2.3.1 Fermentation....................................................................................... 55<br />
2.3.2 Lyophilisation ...................................................................................... 57<br />
2.3.3 Mikroverkapselung .............................................................................. 59<br />
2.3.3.1 Aufbau <strong>und</strong> Materialien ................................................................ 59<br />
2.3.3.2 Verfahren ..................................................................................... 62<br />
2.3.3.3 Freisetzung <strong>des</strong> Kapselinhaltes ................................................... 67<br />
2.3.3.4 Ziele ............................................................................................. 67<br />
2.4 Zusammenfassende <strong>Aus</strong>wertung <strong>des</strong> wissenschaftlichen Schrifttums....... 70<br />
3 Eigene Untersuchungen 71<br />
3.1 Material ...................................................................................................... 71<br />
3.1.1 Verwendete Bakterien......................................................................... 71<br />
3.1.1.1 Lyophilisate .................................................................................. 72<br />
3.1.1.2 Mikroverkapselte Bakterien.......................................................... 72
3.1.2 Nährmedien......................................................................................... 74<br />
3.1.2.1 Lösungen ..................................................................................... 76<br />
3.1.3 Lagerungsmaterial .............................................................................. 76<br />
3.1.3.1 Gelatine........................................................................................ 77<br />
3.1.3.2 Zusätze ........................................................................................ 77<br />
3.2 Methoden ................................................................................................... 78<br />
3.2.1 Isolierung, Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung der Stämme ........................... 78<br />
3.2.1.1 L. reuteri (S 24) <strong>und</strong> L. rhamnosus (S 25).................................... 79<br />
3.2.1.2 L. paracasei (S 26)....................................................................... 80<br />
3.2.1.3 L. gasseri (S 28)........................................................................... 82<br />
3.2.2 Vorversuche........................................................................................ 84<br />
3.2.2.1 Einfluss Gewürze ......................................................................... 85<br />
3.2.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration ................................................... 87<br />
3.2.3 Lyophilisation ...................................................................................... 90<br />
3.2.4 Mikroverkapselung .............................................................................. 90<br />
3.2.5 Einlagerung der Proben <strong>und</strong> Lagerungsbedingungen......................... 92<br />
3.2.5.1 Befüllung der Probenröhrchen <strong>und</strong> Lagerungsbedingungen........ 92<br />
3.2.5.2 Probenschlüssel........................................................................... 94<br />
3.2.5.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze.............................. 97<br />
3.2.6 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch.................................. 98<br />
3.3 <strong>Aus</strong>wertung .............................................................................................. 100<br />
4 Ergebnisse 103<br />
4.1 Vorversuche ............................................................................................. 103<br />
4.1.1 Vergleich von Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren.............................. 104<br />
4.1.2 Einfluss Gewürze <strong>und</strong> Kochsalzkonzentration .................................. 104<br />
4.1.2.1 Einfluss Gewürze ....................................................................... 105<br />
4.1.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration ................................................. 108<br />
4.1.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze................................... 110<br />
4.2 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch....................................... 111<br />
4.2.1 Lagerung der Lyophilisate................................................................. 111<br />
4.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24)................. 113
4.2.2.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 113<br />
4.2.2.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 114<br />
4.2.2.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 116<br />
4.2.2.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 116<br />
4.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25) ......... 117<br />
4.2.3.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 118<br />
4.2.3.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 119<br />
4.2.3.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 121<br />
4.2.3.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 122<br />
4.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26) ........... 123<br />
4.2.4.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 124<br />
4.2.4.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 125<br />
4.2.4.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 126<br />
4.2.4.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 126<br />
4.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28) ............... 127<br />
4.2.5.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 128<br />
4.2.5.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 129<br />
4.2.5.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 130<br />
4.2.5.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 130<br />
5 Diskussion 133<br />
5.1 Verwendete Bakterien .............................................................................. 133<br />
5.2 Vorversuche ............................................................................................. 135<br />
5.2.1 Vergleich von Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren.............................. 135<br />
5.2.2 Einfluss Gewürze .............................................................................. 136<br />
5.2.3 Einfluss Kochsalzkonzentration......................................................... 138<br />
5.3 Lyophilisation ........................................................................................... 138<br />
5.4 Mikroverkapselung ................................................................................... 139<br />
5.5 Lagerungsversuch.................................................................................... 140<br />
5.5.1 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze................................... 140<br />
5.5.2 Einlagerung <strong>und</strong> Untersuchung der Proben ...................................... 141<br />
5.5.2.1 Lagerung der Lyophilisate.......................................................... 143
5.5.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24) ......... 144<br />
5.5.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25).. 146<br />
5.5.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26) .... 147<br />
5.5.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28) ........ 148<br />
5.6 Zusammenfassende Diskussion <strong>und</strong> <strong>Aus</strong>blick ......................................... 149<br />
6 Schlussfolgerungen 153<br />
7 Zusammenfassung 155<br />
8 Summary 157<br />
9 Schrifttumsverzeichnis 159<br />
10 Anhang 189<br />
10.1 Ergebnistabellen....................................................................................... 189<br />
10.2 Nährmedien.............................................................................................. 198<br />
10.2.1 Nährmedien <strong>für</strong> Laktobazillen............................................................ 198<br />
10.2.2 Weitere Nährmedien <strong>für</strong> die Untersuchung der Gewürze.................. 200<br />
10.3 Technische Geräte <strong>und</strong> Verbrauchsmaterialien ....................................... 202<br />
10.4 Abbildungsverzeichnis.............................................................................. 206<br />
10.5 Tabellenverzeichnis.................................................................................. 208
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden in einem Posterbeitrag im Rahmen der 47.<br />
Arbeitstagung <strong>des</strong> Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG e. V. vorgestellt<br />
(Garmisch-Partenkirchen, 26. bis 29. September 2006).
Abkürzungsverzeichnis<br />
|∆ Kz| Betrag der Differenz der Keimzahlen<br />
∆ Kz Differenz der Keimzahlen<br />
® eingetragenes Warenzeichen<br />
° C Grad Celsius<br />
µg Mikrogramm<br />
µl Mikroliter<br />
µm Mikrometer<br />
ABAS <strong>Aus</strong>schuss <strong>für</strong> Biologische Arbeitsstoffe<br />
Abb. Abbildung<br />
ABl. Amtsblatt<br />
Aqua <strong>des</strong>t. Aqua <strong>des</strong>tillata<br />
ATCC American Type Culture Collection<br />
B. Bifidobacterium<br />
BAnz. B<strong>und</strong>esanzeiger<br />
BArbBl. B<strong>und</strong>esarbeitsblatt<br />
BfR B<strong>und</strong>esinstitut <strong>für</strong> Risikobewertung<br />
BG Berufsgenossenschaft<br />
BGBl. B<strong>und</strong>esgesetzblatt<br />
BuGBl. B<strong>und</strong>esges<strong>und</strong>heitsblatt<br />
BVL B<strong>und</strong>esamt <strong>für</strong> Verbraucherschutz <strong>und</strong><br />
Lebensmittel<strong>sicherheit</strong><br />
C. Candida<br />
comb. nov. combinatio nova<br />
DG SANCO Directorate General for Health and Consumer Protection<br />
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen <strong>und</strong> Zellkulturen<br />
Ec. Enterococcus<br />
EFSA The European Food Safety Authority<br />
EG Europäische Gemeinschaft
EU Europäische Union<br />
EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft<br />
FDA Food and Drug Administration<br />
g Gramm<br />
GMBl. Gemeinsames Ministerialblatt<br />
GRAS Generally Recognized as Safe<br />
h St<strong>und</strong>e<br />
KbE Kolonie bildende Einheiten<br />
Kz Keimzahl<br />
l Liter<br />
L. Lactobacillus<br />
L. lateinisch<br />
Lc. Leuconostoc<br />
LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- <strong>und</strong><br />
Futtermittelgesetzbuch<br />
lg Logarithmus zur Basis 10/Zehner-/dekadischer Logarithmus<br />
Merr. Merrill<br />
Min. Minute<br />
ml Milliliter<br />
NCDO National Collection of Dairy Organisms<br />
NCFB National Collection of Food Bacteria<br />
NCIMB National Collection of Industrial and Marine Bacteria<br />
P. Pediococcus<br />
pH negativer dekadischer Logarithmus der<br />
Wasserstoffionenkonzentration<br />
PRODEMO Program Demonstration of Nutritional Functionality of<br />
Probiotic Foods<br />
QPS Qualified Presumption of Safety of Micro-organisms in Food<br />
and Feed<br />
RL Richtlinie<br />
S Stamm aus institutseigener Stammsammlung<br />
Sc. Streptococcus
sp. species<br />
sp. nov. species nova<br />
subsp. subspecies<br />
Tab. Tabelle<br />
TRBA Technische Regeln <strong>für</strong> Biologische Arbeitsstoffe<br />
eingetragenes Warenzeichen<br />
VO Verordnung
1 Einleitung<br />
Einleitung<br />
Probiotika werden immer häufiger zur diätetischen Aufwertung von Lebensmitteln<br />
eingesetzt. Bei den Probiotika handelt es sich um Mono- <strong>und</strong> Mischkulturen lebender<br />
Mikroorganismen. Die Milchsäurebakterien sind mit weitem Abstand die wichtigsten<br />
Vertreter unter den probiotischen Mikroorganismen. In Lebensmitteln werden v. a.<br />
Stämme der Gattungen Lactobacillus <strong>und</strong> Bifidobacterium eingesetzt.<br />
Der Einsatz probiotischer Kulturen in Milcherzeugnissen ist weit verbreitet <strong>und</strong><br />
technologisch unproblematisch.<br />
Bei der Herstellung von Fleischerzeugnissen werden die Probiotika bisher nur als<br />
Starterkulturen <strong>für</strong> Rohwürste eingesetzt, wobei technologische Einflüsse während<br />
der Herstellung (z. B. Temperatur, Luftsauerstoff, Zusatzstoffe) die<br />
Überlebensfähigkeit der Probiotika negativ beeinflussen bzw. diese unmöglich<br />
machen.<br />
Ein möglicher Ansatz könnte die Mikroverkapselung der probiotischen<br />
Mikroorganismen sein.<br />
Ziel ist es, die technologischen <strong>und</strong> mikrobiologischen Gr<strong>und</strong>lagen <strong>für</strong> den Einsatz<br />
mikroverkapselter Probiotika in Fleischerzeugnissen unterschiedlicher Technologien,<br />
in Fleischzubereitungen <strong>und</strong> in Convenience-Erzeugnissen zu erarbeiten.<br />
<strong>Aus</strong>gewählte Laktobazillen mit probiotischer Wirkung werden verschiedenen<br />
Mikroverkapselungsverfahren unterzogen. In einem sich anschließenden<br />
Lagerungsversuch werden die mikroverkapselten Bakterien unterschiedlichen<br />
Lagerungsbedingungen ausgesetzt <strong>und</strong> der Einfluss verschiedener Zusatzstoffe, wie<br />
Kochsalz <strong>und</strong> Gewürze, getestet.<br />
In einer Verlaufskontrolle, die sich über den Lagerungszeitraum erstreckt, wird die<br />
Lebensfähigkeit der mikroverkapselten Bakterien überprüft. Auf diese Weise wird<br />
untersucht, ob die mikroverkapselten Laktobazillen <strong>für</strong> einen Einsatz u. a. in<br />
Gewürzmischungen <strong>und</strong> essbaren Hüllen in den oben genannten Produkten geeignet<br />
sind.<br />
15
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
2 Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Das wissenschaftliche Schrifttum gliedert sich im Wesentlichen in drei Abschnitte.<br />
Der erste Teil befasst sich mit den Probiotika im Allgemeinen <strong>und</strong> speziell mit den<br />
Laktobazillen. Es werden Herkunft, Wirkungen, Taxonomie <strong>und</strong> physiologische<br />
Eigenschaften, sowie Sicherheit <strong>und</strong> ges<strong>und</strong>heitliche Unbedenklichkeit von<br />
Laktobazillen besprochen. Der zweite Teil beschäftigt sich mit Fleischerzeugnissen<br />
<strong>und</strong> Gewürzen. Ferner wird der Einsatz von probiotischen Bakterien in<br />
Fleischerzeugnissen dargestellt. Der dritte Abschnitt erläutert die verschiedenen<br />
Verfahren zur Bearbeitung von Bakterien mit <strong>dem</strong> Schwerpunkt der<br />
Mikroverkapselung.<br />
2.1 Probiotika<br />
Probiotika kommen traditionell schon lange in Lebensmitteln, Futtermitteln <strong>und</strong><br />
Arzneimitteln (<strong>für</strong> Mensch <strong>und</strong> Tier) zum Einsatz. FULLER (1989) bezeichnete mit<br />
<strong>dem</strong> Begriff Probiotikum ein Futtersupplement in Form lebender Mikroorganismen,<br />
welches die Ges<strong>und</strong>heit <strong>des</strong> Wirtstieres günstig beeinflusst, in<strong>dem</strong> es das<br />
Gleichgewicht der Intestinalflora verbessert. Die ARBEITSGRUPPE<br />
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN LEBENSMITTELN“ AM<br />
BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND<br />
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) (2000) bestimmte Probiotika als definierte lebende<br />
Mikroorganismen, die in ausreichender Menge in aktiver Form in den Darm gelangen<br />
<strong>und</strong> hierbei positive ges<strong>und</strong>heitliche Effekte erzielen. Im Gegensatz dazu, sind<br />
Prebiotika spezifische unverdauliche Stoffe, die selektiv Mikroorganismen in ihrem<br />
Wachstum im Darm fördern <strong>und</strong> dadurch positive ges<strong>und</strong>heitliche Wirkungen<br />
erzielen. Synergistisch vereint werden die Vorteile von Pro- <strong>und</strong> Prebiotika in den<br />
sogenannten Synbiotika, bei denen es sich um eine Kombination aus beiden handelt.<br />
17
18<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
In probiotischen Lebensmitteln sind Probiotika in einer Menge enthalten, mit der die<br />
probiotischen Wirkungen nach <strong>dem</strong> Verzehr eines derartigen Lebensmittels erzielt<br />
werden.<br />
Die empfohlene täglich aufzunehmende, minimale therapeutische Dosis <strong>für</strong><br />
probiotische Bakterien liegt bei 10 8 bis 10 9 KbE. Die Empfehlung <strong>für</strong> das probiotische<br />
Produkt am Ende <strong>des</strong> Min<strong>des</strong>thaltbarkeitsdatums liegt bei 10 6 KbE pro ml (SHAH<br />
2000, KAILASAPATHY u. CHIN 2000). Allerdings können 10 6 KbE/ml unter<br />
Umständen nicht ausreichend sein, wenn man berücksichtigt, dass nicht alle<br />
Bakterien den Darm lebend erreichen. Auf der Basis von In-vitro-Studien erscheint<br />
eine täglich aufzunehmende Dosis probiotischer Bakterien von 10 9 bis 10 10 KbE<br />
notwendig, um probiotische Effekte zu erzielen (SANDERS u. HUIS IN’T VELD<br />
1999).<br />
Nach DE VRESE <strong>und</strong> SCHREZENMEIER (2000) sind im Produkt<br />
Probiotikakonzentrationen von 10 6 bis 10 9 KbE/g Lebensmittel technisch möglich,<br />
<strong>und</strong> bis zum Ablauf <strong>des</strong> Min<strong>des</strong>thaltbarkeitsdatums kann eine Keimkonzentration von<br />
≥ 10 6 KbE/g Produkt garantiert werden.<br />
Probiotische Kulturen können sowohl als Bestandteil von Lebensmitteln <strong>des</strong><br />
allgemeinen Verzehrs als auch in diätetischen Lebensmitteln in den Verkehr<br />
gebracht werden. In isolierter Angebotsform werden sie dagegen in Deutschland<br />
nicht als Lebensmittel angesehen <strong>und</strong> sind daher auch keine<br />
Nahrungsergänzungsmittel. Die meisten probiotischen Lebensmittel findet man unter<br />
den Milchprodukten, aber auch zunehmend in Nicht-Milchprodukten, wie z. B.<br />
Getreideprodukten, Süßwaren <strong>und</strong> Rohwürsten (ARBEITSGRUPPE<br />
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN LEBENSMITTELN“ AM<br />
BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND<br />
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000). Probiotische Kulturen werden auch in<br />
Futtermitteln <strong>und</strong> Arzneimitteln (<strong>für</strong> Mensch <strong>und</strong> Tier) (REUTER 2001), z. B. als<br />
lyophilisierte oder suspendierte Kulturen zur oralen Einnahme, eingesetzt.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Mikroorganismen, die als Probiotika verwendet werden sollen, müssen besondere<br />
funktionelle <strong>und</strong> physiologische Eigenschaften aufweisen (HOLZAPFEL 2001).<br />
Geeignete Stämme müssen die Magen-Passage lebend passieren <strong>und</strong> in der Lage<br />
sein, sich im Darm zu vermehren. Diese Eigenschaften sind unter den<br />
Milchsäurebakterien weit verbreitet (REUTER 2001). KALANTZOPOULOS (1997)<br />
wies zusätzlich darauf hin, dass gute probiotische Mikroorganismen lagerungsstabil<br />
sein sollen, bei niedrigen Magen-pH-Werten überleben sollen, in der Lage sein sollen<br />
das Magen-Darmepithel zu besiedeln, nicht pathogen sein dürfen, <strong>und</strong> imstande sein<br />
sollen einen inhibitorischen Effekt gegenüber <strong>dem</strong> Wachstum <strong>und</strong> der<br />
Toxinproduktion von pathogenen Keimen oder Verderbniserregern auszuüben.<br />
SAXELIN (1999) zeigte, dass ausgewählte probiotische Stämme eine Lagerung bei<br />
niedrigen Temperaturen gut überleben können.<br />
Probiotische Lebensmittel sind „Functional Food“ (funktionelle Lebensmittel). Die<br />
Bezeichnung Functional Food wurde als Marketing-<strong>Aus</strong>druck Ende der 1980er-Jahre<br />
in Japan geschaffen, um mit ges<strong>und</strong>heitsfördernden Inhaltsstoffen angereicherte<br />
Lebensmittel zu beschreiben. ERBERSDOBLER (2000) fasst unter Functional Food<br />
Lebensmittel <strong>und</strong> entsprechend neuentwickelte Produkte zusammen, denen<br />
aufgr<strong>und</strong> besonderer Inhaltsstoffe mehr als nur der reine Nähr- <strong>und</strong> Genusswert<br />
zukommt. Im Mittelpunkt stehen die aktive <strong>und</strong> positive Beeinflussung der<br />
Ges<strong>und</strong>heit <strong>und</strong> das Erzielen von spezifischen präventiven Wirkungen durch die<br />
Ernährung.<br />
Probiotische Produkte, v. a. Milchprodukte mit den Spezies Lactobacillus <strong>und</strong><br />
Bifidobacterium, machen einen großen Anteil von Functional Food aus (STANTON<br />
2001).<br />
Die Popularität <strong>und</strong> die Vermarktungserfolge von Probiotika führten dazu, dass<br />
Entwicklungen <strong>für</strong> probiotische Lebensmittel auch außerhalb <strong>des</strong> Molkereisektors<br />
vorangetrieben wurden. Voraussetzung ist, dass die probiotischen Stämme sich<br />
unter industriellen Bedingungen produzieren lassen, <strong>und</strong> anschließend als gefrorene<br />
oder gefriergetrocknete Kulturen überleben <strong>und</strong> ihre Funktionalität wieder erlangen.<br />
19
20<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Dasselbe gilt <strong>für</strong> die probiotischen Lebensmittel, in die die Stämme dann letztendlich<br />
verbracht werden. Wichtig ist auch, dass die Probiotika in <strong>dem</strong> jeweiligen<br />
Lebensmittel keine negativen Geruchs-, Geschmacks- oder Textureindrücke<br />
bewirken (MATTILA-SANDHOLM et al. 2002).<br />
Milchsäurebakterien sind die wichtigsten Vertreter der probiotischen<br />
Mikroorganismen. Daneben werden aber auch Nicht-Milchsäurebakterien als<br />
Probiotika eingesetzt, wie z. B. Bacillus (KLEIN 2001).<br />
Nach AXELSSON (2004) gehören zu den hauptsächlich in der<br />
Lebensmitteltechnologie eingesetzten Milchsäurebakterien die Gattungen<br />
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,<br />
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,<br />
Vagococcus <strong>und</strong> Weissella, wobei insgesamt zu den Milchsäurebakterien mehr als<br />
zwanzig Gattungen zählen. Die Gattung Bifidobacterium wird nach AXELSSON<br />
(2004) häufig auch zu den echten Milchsäurebakterien gezählt, ist aber streng<br />
genommen mit diesen phylogenetisch nicht verwandt, auch wenn einige<br />
Charakteristika übereinstimmen.<br />
Stämme, die in Europa als Probiotika Verwendung finden, gehören überwiegend den<br />
Genera Lactobacillus, Enterococcus <strong>und</strong> Bifidobacterium an (KLEIN 2001). Die<br />
nachfolgende Tabelle 1 gibt eine Übersicht über wichtige technologisch genutzte<br />
Genera <strong>und</strong> probiotisch eingesetzte Spezies der Milchsäurebakterien.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Tabelle 1: Wichtige technologisch genutzte Genera <strong>und</strong> probiotisch<br />
eingesetzte Spezies der Milchsäurebakterien (KLEIN 2001)<br />
Genus Spezies<br />
Lactobacillus L. acidophilus-Gruppe<br />
(L. acidophilus, L. crispatus,<br />
L. gasseri, L. johnsonii)<br />
L. casei-Gruppe<br />
(L. casei, L. paracasei,<br />
L. rhamnosus)<br />
Anwendung 1<br />
P S M F TE H<br />
● ● ● ● ●<br />
● ● ● ● ●<br />
L. reuteri/L. fermentum ● ● ● ● ● ●<br />
L. sakei/L. curvatus ●<br />
Bifidobacterium B. longum, B. animalis, B. infantis,<br />
B. breve<br />
● ● ● ● ●<br />
Enterococcus Ec. faecium, Ec. faecalis ● ● ● ● ●<br />
Lactococcus L. lactis subsp. lactis ● ●<br />
Pediococcus P. acidilactici, P. damnosus,<br />
P. pentosaceus<br />
● ●<br />
Leuconostoc Lc. mesenteroi<strong>des</strong>, Lc. lactis ● ●<br />
Streptococcus Sc. salivarius subsp. thermophilus ● ●<br />
Carnobacterium C. piscicola ● ●<br />
1 hauptsächlicher Anwendungsbereich,<br />
P Probiotikum<br />
S Starterkultur<br />
M Milchtechnologie<br />
F Fleischtechnologie<br />
TE Tierernährung<br />
H Humanmedizin<br />
Milchsäurebakterien sind grampositive Kokken oder Stäbchen, die keine Sporen<br />
ausbilden <strong>und</strong> die aus Kohlenhydraten Milchsäure fermentieren. Die Einteilung der<br />
Milchsäurebakterien in die verschiedenen Genera erfolgt aufgr<strong>und</strong> der Morphologie,<br />
der Art der Glukosefermentation, <strong>des</strong> Wachstums bei verschiedenen Temperaturen,<br />
21
22<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
der Konfiguration der produzierten Milchsäure, der Fähigkeit bei hohen<br />
Salzkonzentrationen zu wachsen <strong>und</strong> der Toleranz bezüglich <strong>des</strong> pH-Wertes.<br />
Chemotaxonomische Marker wie die Zusammensetzung der Fettsäuren sowie die<br />
Bestandteile der Zellwände wurden ebenfalls zur Klassifikation herangezogen.<br />
Zusätzlich werden in der gegenwärtigen Taxonomie phylogenetische Beziehungen<br />
mit berücksichtigt. In den meisten Fällen bilden die Gattungen eigene<br />
phylogenetische Gruppen. Es gibt jedoch auch <strong>Aus</strong>nahmen, bei denen die<br />
phylogenetischen Muster nicht mit den gegenwärtigen Klassifizierungen aufgr<strong>und</strong> der<br />
phänotypischen Eigenschaften übereinstimmen. Dies ist zum Beispiel der Fall <strong>für</strong> die<br />
Gattungen Lactobacillus <strong>und</strong> Pediococcus (AXELSSON 2004).<br />
2.1.1 Genus Lactobacillus<br />
Laktobazillen kommen in vielen verschiedenen Bereichen der Umwelt vor. Sie sind<br />
physiologische Bewohner der M<strong>und</strong>höhle, <strong>des</strong> Intestinaltraktes <strong>und</strong> der Vagina <strong>des</strong><br />
Menschen. Außer<strong>dem</strong> kommen Laktobazillen auch in Pflanzen <strong>und</strong> Pflanzenmaterial<br />
vor. Ebenso sind sie Bestandteil von Erdboden, Wasser, Silage, Abwasser <strong>und</strong><br />
Gülle. Ein großes Einsatzgebiet <strong>für</strong> Laktobazillen ist die Lebensmittelherstellung<br />
(z. B. Fermentationen). Hier werden Laktobazillen z. B. bei der Herstellung von<br />
Milcherzeugnissen, aber auch als Starterkulturen bei der Rohwurstherstellung<br />
verwendet. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet sind die Probiotika. Andererseits<br />
können Laktobazillen aber auch <strong>für</strong> den Verderb von Lebensmitteln, wie z. B. Milch<br />
<strong>und</strong> Milcherzeugnissen, Fleisch <strong>und</strong> Fleischerzeugnissen, Fischmarinaden oder Bier,<br />
verantwortlich sein (STILES u. HOLZAPFEL 1997).<br />
Die Gattung Lactobacillus umfasst derzeit 135 anerkannte Spezies <strong>und</strong> 27<br />
Subspezies (EUZÉBY 2006). Vertreter der Gattung Lactobacillus sind grampositive,<br />
kurze bis lange, z. T. auch kokkoide Stäbchen. Einige Stämme <strong>und</strong> Spezies bilden in<br />
Abhängigkeit vom pH-Wert <strong>und</strong> der Zusammensetzung <strong>des</strong> Mediums Ketten.<br />
Kokkoide Formen kommen unter den obligat heterofermentativen Laktobazillen <strong>und</strong>
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
bei L. sakei vor. Laktobazillen sind mikroaerophil oder anaerob. Das<br />
Oberflächenwachstum wird bei reduzierter Sauerstoffspannung <strong>und</strong> einem CO2-<br />
Gehalt von 5 - 10 % gefördert. Einige Stämme bilden bipolare Körper <strong>und</strong> Granula,<br />
die bei der Gram- <strong>und</strong> Methylenblaufärbung erkennbar sind. Der Stoffwechsel der<br />
Laktobazillen ist fermentativ. Sie sind obligat saccharolytisch <strong>und</strong> meist Katalase-<br />
negativ. Laktobazillen können sich bei Temperaturen zwischen 2 °C <strong>und</strong> 55 °C<br />
vermehren, wobei das Optimum je nach Gruppe bei 30 °C bis 40 °C liegt. Der<br />
optimale pH-Wert-Bereich <strong>für</strong> das Wachstum liegt bei 5,5 bis 6,2 (BAUMGART u.<br />
BECKER 2003). Laktobazillen bilden keine Sporen <strong>und</strong> sind nicht beweglich<br />
(HAMMES u. VOGEL 1995).<br />
Die Einteilung in verschiedene Spezies erfolgt sowohl nach klassischen<br />
phänotypischen Eigenschaften, als auch mit weitergehenden molekularbiologischen<br />
Methoden. Eine Kombination der Methoden ist sinnvoll. Die klassische Einteilung der<br />
Gattung Lactobacillus in die drei Subgenera „Thermobacterium“, „Betabacterium“<br />
<strong>und</strong> „Streptobacterium“ geht zurück auf ORLA-JENSEN (1919) <strong>und</strong> wurde auch von<br />
KANDLER <strong>und</strong> WEISS (1986) beschrieben. Gr<strong>und</strong>lage <strong>für</strong> diese Einteilung waren die<br />
biochemischen <strong>und</strong> physiologischen Eigenschaften, vor allem Fermentationswege<br />
<strong>und</strong> Wachstumstemperaturen. Es wird zwischen einem homofermentativen <strong>und</strong><br />
einem heterofermentativen Fermentationsweg unterschieden. Bei der<br />
homofermentativen Fermentation entsteht beim Abbau von Glukose kein Gas. Im<br />
Gegensatz dazu kommt es beim heterofermentativen Fermentationsweg zur<br />
Gasbildung bei der Verwertung von Glukose. SCHLEIFER <strong>und</strong> LUDWIG (1995)<br />
konnten durch den Einsatz neuerer phylogenetischer <strong>und</strong> molekularbiologischer<br />
Methoden zeigen, dass es Überschneidungen zwischen den genannten Subgenera<br />
gibt. Die aktuelle Einteilung unterscheidet zwischen fakultativ <strong>und</strong> obligat<br />
heterofermentativen Organismen (Tab. 2).<br />
23
24<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Tabelle 2: Einteilung <strong>des</strong> Genus Lactobacillus in Subgenera (nicht mehr<br />
gültig) bzw. in phänotypische/molekularbiologische Untergruppen<br />
(KLEIN 2001)<br />
Einteilung Fermentationsweg Wachstums-<br />
Subgenera 1<br />
temperatur<br />
„Thermobacterium“ homofermentativ 2 15 °C neg.,<br />
45 °C pos.<br />
„Streptobacterium“ homofermentativ 2 15 °C pos.,<br />
45 °C neg.<br />
Typische<br />
biotechnologisch<br />
genutzte Vertreter<br />
L. acidophilus-Gruppe<br />
L. casei-Gruppe 4 ,<br />
L. sakei/L. curvatus<br />
„Betabacterium“ heterofermentativ 2 uneinheitlich L. reuteri/L. fermentum<br />
phänotypisch/molekularbiologische Untergruppe 3<br />
Gruppe A obligat<br />
homofermentativ,<br />
Pentosen werden<br />
nicht fermentiert<br />
Gruppe B fakultativ<br />
heterofermentativ<br />
(Gas von Pentosen)<br />
Gruppe C obligat<br />
heterofermentativ<br />
(Gas aus Glukose<br />
<strong>und</strong> Pentosen)<br />
entfällt L. acidophilus-Gruppe<br />
entfällt L. casei-Gruppe,<br />
L. sakei/L. curvatus<br />
entfällt L. reuteri/L. fermentum<br />
1<br />
nach KANDLER <strong>und</strong> WEISS (1986)<br />
2<br />
bei Verwertung von Glukose (homofermentativ: keine Gasbildung; heterofermentativ: Gasbildung)<br />
3<br />
zusammengefasst von HAMMES <strong>und</strong> VOGEL (1995)<br />
4<br />
Vertreter der L. casei-Gruppen sind in der Lage, bei 45 °C zu wachsen<br />
Obligat homofermentative Laktobazillen fermentieren Hexosen zu Milchsäure,<br />
Pentosen werden hingegen nicht fermentiert. Fakultativ heterofermentative<br />
Laktobazillen fermentieren Hexosen entweder zu Milchsäure oder zu Milchsäure,
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Essigsäure, Ethanol <strong>und</strong> Ameisensäure. Pentosen werden zu Milchsäure <strong>und</strong><br />
Essigsäure fermentiert, <strong>und</strong> aus Glucose wird kein CO2 gebildet. Obligat<br />
heterofermentative Laktobazillen fermentieren Hexosen zu Milchsäure, Essigsäure,<br />
Ethanol <strong>und</strong> CO2, Pentosen hingegen zu Milchsäure <strong>und</strong> Essigsäure (BAUMGART u.<br />
BECKER 2003).<br />
Ebenso wie die Fermentation sind auch weitere Eigenschaften der Laktobazillen<br />
abhängig von der Spezies. Dazu gehören zum Beispiel das Wachstumsverhalten<br />
unterhalb von 10 °C <strong>und</strong> oberhalb von 45 °C, sowie das Wachstum in Gegenwart von<br />
6,5 % NaCl <strong>und</strong> bei pH 4,4. Für alle Lactobacillus-Spezies gilt hingegen, dass bei<br />
18 % NaCl bzw. einem pH-Wert größer als 9,6 kein Wachstum mehr stattfindet.<br />
Speziesabhängig ist auch, ob D- oder L-Milchsäure, bzw. beide produziert werden<br />
(AXELSSON 2004).<br />
Typische Vertreter der drei aufgr<strong>und</strong> <strong>des</strong> Fermentationsverhaltens eingeteilten<br />
Gruppen A (L. acidophilus-Gruppe), B (L. casei-Gruppe) <strong>und</strong> C<br />
(L. reuteri/L. fermentum-Gruppe) (siehe Tab. 2) sollen im Folgenden näher<br />
besprochen werden.<br />
2.1.1.1 L. acidophilus-Gruppe<br />
JOHNSON et al. (1980) führten umfassende Studien zur Taxonomie der<br />
L. acidophilus-Gruppe durch. Untersucht wurden u. a. die physiologischen<br />
Eigenschaften, die Art der Milchsäureproduktion, die Zuckerzusammensetzung der<br />
Zellwände <strong>und</strong> die DNA-Strukturen. Aufgr<strong>und</strong> der Ergebnisse kam es zur<br />
taxonomischen Neuordnung der L. acidophilus-Gruppe. Neben L. acidophilus<br />
gehören fünf weitere Spezies zur L. acidophilus-Gruppe: L. crispatus, L. amylovorus,<br />
L. gallinarum, L. gasseri <strong>und</strong> L. johnsonii. Vertreter der L. acidophilus-Gruppe<br />
fermentieren obligat homofermentativ.<br />
Die Tabelle 3 gibt einen Überblick über Referenzen zu der jeweiligen Spezies, sowie<br />
über die nach EUZÉBY (2006) u. a. verwendeten Stammbezeichnungen <strong>für</strong> die<br />
25
26<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Typstämme durch die ATCC <strong>und</strong> die DSM. In Probiotika kommen aus der<br />
L. acidophilus-Gruppe lediglich L. gasseri, L. johnsonii <strong>und</strong> zum Teil auch<br />
L. acidophilus <strong>und</strong> L. crispatus zum Einsatz (KLEIN 1998).<br />
Tabelle 3: L. acidophilus-Gruppe, Referenzen <strong>und</strong> Typstämme<br />
Spezies Referenzen Typstämme<br />
L. acidophilus MORO (1900);<br />
HANSEN u. MOCQUOT (1970);<br />
JOHNSON et al. (1980)<br />
ATCC 4356 T , DSM 20079 T<br />
L. crispatus BRYGOO u. ALADAME (1953);<br />
CATO et al. (1983)<br />
ATCC 33820 T , DSM 20584 T<br />
L. amylovorus NAKAMURA (1981) ATCC 33620 T , DSM 20531 T<br />
L. gallinarum FUJISAWA et al. (1992) ATCC 33199 T , DSM 10532 T<br />
L. gasseri LAUER u. KANDLER (1980) ATCC 33323 T , DSM 20243 T<br />
L. johnsonii FUJISAWA et al. (1992) ATCC 33200 T , DSM 10533 T<br />
L. = Lactobacillus<br />
ATCC = American Type Culture Collection<br />
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen <strong>und</strong> Zellkulturen<br />
T<br />
= Typstamm<br />
Ein wichtiger Vertreter der L. acidophilus-Gruppe ist L. gasseri. L. gasseri wurde<br />
benannt nach F. Gasser, der bahnbrechende Studien über die Laktat-<br />
Dehydrogenasen von Lactobacillus-Spezies durchführte. L. gasseri stellt sich<br />
mikroskopisch als Stäbchen mit abger<strong>und</strong>eten Enden dar, mit einer Größe von<br />
0,6 - 0,8 µm x 3,0 - 5,0 µm <strong>und</strong> kommt einzeln oder in Ketten vor. Makroskopisch<br />
sind die Kolonien rau <strong>und</strong> flach. Das Wachstum wird unter anaeroben Bedingungen<br />
<strong>und</strong> bei 5 % CO2 gefördert. Stämme wurden aus der M<strong>und</strong>höhle, <strong>dem</strong> Darm, Kot <strong>und</strong><br />
der Vagina <strong>des</strong> Menschen isoliert (LAUER u. KANDLER 1980; HAMMES u. VOGEL<br />
1995).
2.1.1.2 L. casei-Gruppe<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Die L. casei-Gruppe, deren Vertreter fakultativ heterofermentativ sind, umfasst vier<br />
Spezies: L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus <strong>und</strong> L. zeae. Die drei erst genannten<br />
Spezies werden als Probiotika eingesetzt (KLEIN et al.1998). Historisch bestand die<br />
L. casei-Gruppe zunächst nur aus einer Spezies mit fünf Subspezies. COLLINS et al.<br />
(1989) schlugen die Reklassifizierung vor. Die Tabelle 4 stellt Referenzen, sowie<br />
Typstämme der Spezies dar (EUZÉBY 2006).<br />
Tabelle 4: L. casei-Gruppe, Referenzen <strong>und</strong> Typstämme<br />
Spezies Referenzen Typstämme<br />
L. casei ORLA-JENSEN (1916); ATCC 393<br />
HANSEN u. LESSEL (1971)<br />
T , DSM 20011 T ,<br />
NCIMB 11970 T (= NCDO 161 T )<br />
L. paracasei COLLINS et al. (1989) ATCC 25302 T , DSM 5622 T ,<br />
NCIMB 700151 T (= NCDO 151 T )<br />
L. rhamnosus HANSEN (1968);<br />
ATCC 7469<br />
COLLINS et al. (1989)<br />
T , DSM 20021 T ,<br />
NCIMB 6375 T (= NCDO 243 T )<br />
L. zeae DICKS et al. (1996) ATCC 15820 T , DSM 20178 T ,<br />
NCIMB 9537 T<br />
L. = Lactobacillus<br />
ATCC = American Type Culture Collection<br />
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen <strong>und</strong> Zellkulturen<br />
NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria<br />
NCDO = National Collection of Dairy Organisms<br />
T<br />
= Typstamm<br />
Zwei technologisch bedeutsame Vertreter der L. casei-Gruppe sind L. paracasei <strong>und</strong><br />
L. rhamnosus (HAMMES u. VOGEL 1995).<br />
L. paracasei trägt den Namen aufgr<strong>und</strong> der Ähnlichkeit zu L. casei. Mikroskopisch<br />
erscheint L. paracasei stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm groß, häufig mit<br />
breiten Enden, einzeln oder in Ketten, nicht beweglich.<br />
27
28<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
L. paracasei wächst bei 10 °C bis 40 °C, einige Stämme auch zwischen 5 °C <strong>und</strong><br />
45 °C. Es gibt zwei anerkannte Subspezies: L. paracasei subsp. paracasei<br />
(ATCC 25302 T , DSM 5622 T , NCIMB 700151 T bzw. früher NCDO 151 T ) <strong>und</strong><br />
L. paracasei subsp. tolerans (ATCC 25599 T , DSM 20258 T , NCIMB 9709 T bzw.<br />
früher NCFB 2774 T ).<br />
Stämme von L. paracasei subsp. paracasei wachsen bei 10 °C bis 40 °C, einige<br />
auch bei 5 °C bis 45 °C. Isoliert wurden die Stämme aus Molkereiprodukten (z. B.<br />
Käse, pasteurisierte Milch), Abwasser, Silage, sowie aus M<strong>und</strong>höhle, Speichel <strong>und</strong><br />
Karies von Menschen.<br />
Die Bezeichnung L. paracasei subsp. tolerans steht da<strong>für</strong>, dass diese Subspezies<br />
sehr tolerant gegenüber bestimmten Umgebungsbedingungen ist, d. h. es wird z. B.<br />
die Pasteurisierung der Milch überstanden. Wachstum findet zwischen 10 °C <strong>und</strong><br />
37 °C statt, nicht mehr bei 40 °C. Hingegen wird ein Erhitzen auf 72 °C <strong>für</strong> 40 s von<br />
diesen Keimen überlebt. Isoliert wurden die Stämme aus Molkereiprodukten (z. B.<br />
Käse, Sauermilch), aber auch aus menschlichem Blut <strong>und</strong> Lungenabzessen<br />
(COLLINS et al. 1989; HAMMES u. VOGEL 1995)<br />
L. rhamnosus bezieht sich auf die Rhamnose, ein 6-Desoxy-Monosaccharid.<br />
Mikroskopisch ist L. rhamnosus ebenfalls stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm<br />
groß, häufig mit breiten Enden, einzeln oder in Ketten, nicht beweglich. Wachstum<br />
erfolgt zwischen 15 °C <strong>und</strong> 45 °C, die meisten Stämme wachsen auch noch bei<br />
10 °C <strong>und</strong> einige Stämme ebenfalls bei 48 °C. Die Stämme wurden aus<br />
Molkereiprodukten, Abwasser, menschlichem Speichel, sowie bei klinischen Fällen<br />
aus Lymphknoten <strong>und</strong> Endocard isoliert (HANSEN 1968; COLLINS et al. 1989;<br />
HAMMES u. VOGEL 1995).<br />
2.1.1.3 L. reuteri/L. fermentum-Gruppe<br />
Zu der Untergruppe obligat heterofermentativer Laktobazillen gehören die Spezies<br />
L. reuteri <strong>und</strong> L. fermentum (KLEIN et al. 1998). Der Tabelle 5 können Referenzen
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
<strong>und</strong> Typstämme zu den Spezies dieser Gruppe entnommen werden. Nach KLEIN<br />
(2001) werden beide Spezies auch als Probiotika eingesetzt.<br />
Tabelle 5: L. reuteri/L. fermentum-Gruppe, Referenzen <strong>und</strong> Typstämme<br />
Spezies Referenzen Typstämme<br />
L. reuteri KANDLER et al. (1980) ATCC 23272 T , DSM 20016 T<br />
L. fermentum BEIJERINCK (1901);<br />
DELLAGLIO (2004)<br />
ATCC 14931 T , DSM 20052 T<br />
L. = Lactobacillus<br />
ATCC = American Type Culture Collection<br />
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen <strong>und</strong> Zellkulturen<br />
T<br />
= Typstamm<br />
Lactobacillus reuteri, als ein Vertreter dieser Gruppe, wurde nach <strong>dem</strong> deutschen<br />
Bakteriologen G. Reuter benannt. Mikroskopisch stellt sich L. reuteri ein wenig<br />
irregulär als gekrümmtes Stäbchen, 0,7 - 1,0 µm x 2,0 - 5,0 µm groß, mit<br />
abger<strong>und</strong>eten Enden, einzeln, in Paaren oder kleinen Gruppen, dar. Die Stämme<br />
wurden aus menschlichem <strong>und</strong> tierischem Kot, aus Fleischprodukten <strong>und</strong> Sauerteig<br />
isoliert (KANDLER et al. 1980; HAMMES u. VOGEL 1995).<br />
2.1.2 Probiotische Wirkungen<br />
Ges<strong>und</strong>heitswirkungen müssen durch randomisierte, doppelblinde <strong>und</strong><br />
placebokontrollierte klinische Studien <strong>und</strong> mit klar definierten Studienzielen an<br />
Menschen belegt werden. Ergebnisse sollten von unabhängigen Forschergruppen<br />
bestätigt <strong>und</strong> in kritischen wissenschaftlichen Zeitschriften publiziert oder nach GCP-<br />
Vorschrift („good clinical practice“) dokumentiert sein. In-vitro- <strong>und</strong> tierexperimentelle<br />
Untersuchungen liefern lediglich Hinweise auf mögliche ges<strong>und</strong>heitsrelevante<br />
Wirkungen, können evtl. Wirkmechanismen entschlüsseln oder bei der Suche nach<br />
neuen Probiotika helfen. Beweise <strong>für</strong> ges<strong>und</strong>heitliche Effekte gelten nur <strong>für</strong> genau die<br />
29
30<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
probiotischen Lebensmittel, die Probiotika, die Keimkonzentrationen <strong>und</strong> die<br />
Verzehrsmenge <strong>und</strong> -dauer, mit denen die jeweiligen Studien durchgeführt worden<br />
sind. Auch nah verwandte Bakterienstämme der gleichen Spezies können<br />
unterschiedliche physiologische Wirkungen haben, die also stammspezifisch sind.<br />
Allerdings sind Studienergebnisse auf ähnliche Lebensmittel übertragbar, bei denen<br />
nach <strong>dem</strong> Stand <strong>des</strong> Wissens keine unterschiedlichen Matrixeffekte zu erwarten<br />
sind. Wichtig <strong>für</strong> eindeutige Studienergebnisse ist, dass die verwendeten<br />
Bakterienstämme gut charakterisiert <strong>und</strong> eindeutig identifiziert sind. Erforderlich sind<br />
nicht nur Untersuchungen zu Dosis-Wirkungsbeziehungen, sondern auch<br />
Langzeitstudien zur Dauer der Wirkung (DE VRESE u. SCHREZENMEIR 2000).<br />
Aufgr<strong>und</strong> der Tatsache, dass jeder Mensch eine individuelle, äußerst komplexe<br />
Darmflora besitzt, die taxonomisch nicht ausreichend charakterisiert ist, ergeben sich<br />
durchaus Schwierigkeiten beim Nachweis von Ges<strong>und</strong>heitseffekten. Für den<br />
einzelnen Verbraucher lässt sich eine Ges<strong>und</strong>heitswirkung von Probiotika also nicht<br />
individuell vorhersagen (TEUBER 1998).<br />
Die Tabelle 6 gibt eine Übersicht über die nach DE VRESE <strong>und</strong> SCHREZENMEIR<br />
(2000) gesicherten <strong>und</strong> möglichen Ges<strong>und</strong>heitseffekte von Pro- <strong>und</strong> Prebiotika.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Tabelle 6: Gesicherte <strong>und</strong> mögliche Ges<strong>und</strong>heitseffekte von Pro- <strong>und</strong><br />
Prebiotika (DE VRESE u. SCHREZENMEIR 2000)<br />
Gesicherte Effekte Mögliche Effekte<br />
• Geringere Häufigkeit <strong>und</strong> Dauer • Förderung oder Erhalt einer<br />
verschiedener<br />
optimalen Darmflora,<br />
Durchfallerkrankungen<br />
Motilitätsregulierung bei Obstipation<br />
• Einsetzbar bei Vaginitis<br />
• Senkung der Konzentration<br />
ges<strong>und</strong>heitsschädlicher<br />
Stoffwechselprodukte <strong>und</strong><br />
krebspromovierender Enzyme im<br />
Dickdarm<br />
• Verhinderung von Krebs<br />
• Immunmodulation • Stärkung <strong>des</strong> Immunsystems,<br />
Verhinderung von<br />
Infektionskrankheiten, Reduktion von<br />
Allergien <strong>und</strong><br />
Autoimmunerkrankungen,<br />
Einsatzmöglichkeiten als Adjuvans<br />
• Senkung <strong>des</strong> Cholesterolspiegels,<br />
Beeinflussung <strong>des</strong><br />
Lipidstoffwechsels<br />
• Förderung der Laktoseverdauung bei • Steigerung der<br />
Laktosemalabsorbern<br />
Mineralstoffresorption,<br />
Osteoporoseprävention<br />
Die in klinischen Studien als probiotisch wirksam eingestuften Bakterien gehören<br />
hauptsächlich zu den Gattungen Lactobacillus <strong>und</strong> Bifidobacterium, welche auch<br />
natürlicherweise im menschlichen Intestinaltrakt gef<strong>und</strong>en werden (VAUGHAN<br />
1999).<br />
31
32<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Das Konzept, die Darmflora zu stabilisieren <strong>und</strong> positive ges<strong>und</strong>heitliche Wirkungen<br />
von Milchsäurebakterien auszunutzen, besteht bereits seit langer Zeit (HAWLEY et<br />
al. 1959, SANDERS 1993; STEER et al. 2000; KOPP-HOOLIHAN 2001;<br />
MCNAUGHT u. MACFIE 2001). Die Darmflora kann durch die Zufuhr von lebenden<br />
Mikroorganismen zumin<strong>des</strong>t kurzfristig modifiziert werden (DEUTSCHE<br />
GESELLSCHAFT FÜR ERNÄHRUNG 2004). Klinische Studien belegen, dass<br />
zahlreiche Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, Schwere <strong>und</strong> Dauer bestimmter<br />
Durchfallerkrankungen günstig zu beeinflussen (MARTEAU et al. 2001).<br />
In einer doppelblinden, placebokontrollierten, randomisierten, klinischen Studie<br />
konnten KOEBNICK et al. (2001) nachweisen, dass die regelmäßige Aufnahme<br />
eines fermentierten Getränks (Yakult ® ) mit <strong>dem</strong> Stamm Lactobacillus casei Shirota<br />
(LcS) bei obstipierten <strong>und</strong> ansonsten ges<strong>und</strong>en Personen gastrointestinale<br />
Parameter, insbesondere die Stuhlabsatzfrequenz <strong>und</strong> -konsistenz, verbesserte.<br />
Eine Verbesserung gastrointestinaler Symptome nach Zufuhr von LcS weist auf<br />
Veränderungen der Darmflora <strong>und</strong> <strong>des</strong> intestinalen Milieus hin. Zusätzlich wurde<br />
auch das allgemeine Wohlbefinden gesteigert.<br />
Nach KRAMMER et al. (2005) <strong>und</strong> SPILLER <strong>und</strong> CAMPBELL (2006) gehören<br />
Probiotika nach ersten Studienergebnissen zu den neuen hoffnungsvollen<br />
Therapieansätzen bei postinfektiösem Reizdarm. Außer<strong>dem</strong> zeigen einige<br />
probiotische Stämme Erfolg bei der Unterstützung der medikamentösen Therapie<br />
von Colitis ulcerosa <strong>und</strong> Pouchitis.<br />
Zu den Wirkungen von Probiotika bei der Therapie von Morbus Crohn liegen<br />
widersprüchliche Beobachtungen vor (GIONCHETTI 2005).<br />
Erste Ergebnisse von ISHIKAWA (2005) sprechen da<strong>für</strong>, dass <strong>dem</strong> Wiederauftreten<br />
von colorectalen Tumoren durch Probiotika vorgebeugt werden kann.<br />
Mehrere Studien belegen, dass Probiotika geeignet sind, Antibiotika assoziierte<br />
Diarrhoen zu verhindern oder zumin<strong>des</strong>t zu verkürzen. Ebenfalls können probiotische<br />
Stämme bei Säuglingen <strong>und</strong> Kleinkindern mit Rotavirus-Enteritiden die<br />
Durchfalldauer verkürzen (MARTEAU et al. 2001).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Es gibt zahlreiche Beweise da<strong>für</strong>, dass Milchsäurebakterien bei<br />
Laktosemalabsorbern Durchfälle <strong>und</strong> andere Intoleranzsymptome nach<br />
Laktoseverzehr verhindern, in<strong>dem</strong> sie die Laktoseverdauung fördern, wobei es sich<br />
jedoch nicht um eine spezifisch probiotische Wirkung handelt. Probiotische Bakterien<br />
haben zum Teil eine niedrigere ß-Galaktosidaseaktivität <strong>und</strong> fördern die<br />
Laktoseverdauung weniger als andere Joghurtkulturen (SUHR et al. 1995).<br />
Weiterhin konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass bestimmte probiotische<br />
Stämme, wenn diese in ausreichender Menge verzehrt werden, in der Lage sind, die<br />
angeborene <strong>und</strong> erworbene Immunantwort zu beeinflussen. Überexprimierte<br />
Immunantworten werden reguliert <strong>und</strong> andere gefördert (GILL u. GUARNER 2004).<br />
Die Modulation einzelner immunologischer Parameter ist nicht automatisch mit einer<br />
Stärkung der Immunabwehr gleichzusetzen. Vielmehr müssen Wirkmechanismen<br />
untersucht, sowie positive Ges<strong>und</strong>heitseffekte durch kontrollierte klinische Studien<br />
nachgewiesen werden, d. h. eine Verhinderung, Verkürzung oder Linderung von<br />
Infektionskrankheiten oder positive Wirkungen bei Immunstörungen. Die Tabelle 7<br />
fasst die immunmodulatorischen Effekte von Probiotika zusammen (DE VRESE u.<br />
SCHREZENMEIR 2000).<br />
33
34<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Tabelle 7: Immunmodulatorische Effekte von Probiotika (DE VRESE u.<br />
SCHREZENMEIR 2000)<br />
Beeinflussung von Parametern der spezifischen <strong>und</strong> unspezifischen<br />
Immunabwehr:<br />
• Anregung der Zellteilung in Organen <strong>des</strong> Lymphsystems<br />
• Steigerung der Aktivität von Phagozyten/Makrophagen, Lymphozyten, natürl.<br />
Killerzellen<br />
• Anregung der Produktion unspezifischer <strong>und</strong> spezifischer Antikörper<br />
• Freisetzung von nicht pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukinen,<br />
Interferonen, TNF-α<br />
Beeinflussung von Immunantworten auf verschiedene Antigene:<br />
• Anregung der Produktion spez. Antikörper (IgA, IgG) gegen mitverabreichte<br />
Viren, Bakterien <strong>und</strong> Bakterientoxine<br />
• Erhöhte Widerstandskraft <strong>und</strong> – im Tierversuch – längeres Überleben bei viralen<br />
<strong>und</strong> bakteriellen Infektionen<br />
• Möglicher Einsatz als Adjuvans bei Impfungen<br />
• Förderung der Entwicklung von oraler Toleranz; Abschwächung allergischer<br />
Reaktionen<br />
Wirkungen bei verschiedenen Erkrankungen:<br />
• Weniger Dickdarmentzündungen <strong>und</strong> gesteigerte Immunität bei Älteren<br />
• Geringere Anfälligkeit gegen Candida-Infektionen bei chemotherapierten<br />
Leukämiekranken<br />
• Weniger <strong>und</strong> spätere Rückfälle bei operativ entferntem Gallenblasenkrebs<br />
• Bei Atopikern keine Verschlechterung immunologischer Reaktionen durch<br />
Joghurtverzehr<br />
• Weniger klinische Symptome <strong>und</strong> erniedrigtes TNF-α bei Kindern mit atopischer<br />
Dermatitis<br />
• Weniger klinische Symptome bei nasaler Allergie
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Nach SIEBER <strong>und</strong> DIETZ (1998) gibt es Hinweise da<strong>für</strong>, dass Laktobazillen bei<br />
lokalem <strong>und</strong> oralem Einsatz durch Stabilisierung <strong>des</strong> Biofilms, Hemmung der<br />
Anheftung <strong>und</strong> Invasion von Pathogenen <strong>und</strong> Erleichterung <strong>des</strong> Eindringens von<br />
Antibiotika zu einer Verbesserung von Prophylaxe <strong>und</strong> Therapie urogenitaler Infekte<br />
(z. B. Vaginitis) beitragen.<br />
2.1.3 Sicherheit <strong>und</strong> ges<strong>und</strong>heitliche Unbedenklichkeit<br />
Die Biostoffverordnung (ANONYM 1999) regelt gemeinsam mit den Technischen<br />
Regeln <strong>für</strong> Biologische Arbeitsstoffe (TRBA) (ANONYM 2006) den Umgang mit<br />
Mikroorganismen. Die Biostoffverordnung wurde aufgr<strong>und</strong> der Umsetzung der EG-<br />
Richtlinie 90/679/EWG (ANONYM 1990) erlassen, die inzwischen von der Richtlinie<br />
2000/54/EG (ANONYM 2000) abgelöst wurde. In dieser Richtlinie wird das Genus<br />
Lactobacillus generell in die Risikogruppe 1 eingestuft <strong>und</strong> es erfolgt keine<br />
weitergehende Unterscheidung. Nach § 3 der Biostoffverordnung werden vier<br />
Risikogruppen <strong>für</strong> biologische Arbeitsstoffe unterschieden (Tab. 8).<br />
Tabelle 8: Risikogruppen <strong>für</strong> biologische Arbeitsstoffe nach § 3<br />
Biostoffverordnung (ANONYM 1999)<br />
Risikogruppe Beschreibung<br />
1 – kein Risiko Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es unwahrscheinlich<br />
ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen.<br />
2 – geringes Risiko Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim<br />
Menschen hervorrufen können <strong>und</strong> eine Gefahr <strong>für</strong><br />
Beschäftigte darstellen können; eine Verbreitung <strong>des</strong><br />
Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich; eine<br />
wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise<br />
möglich.<br />
35
36<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Risikogruppe Beschreibung<br />
3 – mäßiges Risiko Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim<br />
Menschen hervorrufen können <strong>und</strong> eine ernste Gefahr <strong>für</strong><br />
Beschäftigte darstellen können; die Gefahr einer<br />
Verbreitung in der Bevölkerung kann bestehen, doch ist<br />
normalerweise eine wirksame Vorbeugung oder<br />
4 – hohes Risiko<br />
Behandlung möglich.<br />
Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim<br />
Menschen hervorrufen <strong>und</strong> eine ernste Gefahr <strong>für</strong><br />
Beschäftigte darstellen; die Gefahr einer Verbreitung in der<br />
Bevölkerung ist unter Umständen groß; normalerweise ist<br />
eine Vorbeugung oder Behandlung nicht möglich.<br />
Der <strong>Aus</strong>schuss <strong>für</strong> Biologische Arbeitsstoffe (ABAS) stellt die Technischen Regeln<br />
<strong>für</strong> Biologische Arbeitstoffe (TRBA), die den Stand der <strong>sicherheit</strong>stechnischen,<br />
arbeitsmedizinischen, hygienischen sowie arbeitswissenschaftlichen Anforderungen<br />
bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitstoffen wiedergeben, auf. Der Fachausschuss<br />
Chemie hat die BG-Information BGI 633 „Sichere Biotechnologie – Einstufung<br />
biologischer Arbeitsstoffe: Prokaryonten (Bacteria <strong>und</strong> Archaea)“ erarbeitet. Der<br />
ABAS hat in Anwendung <strong>des</strong> Kooperationsmodells (BArbBl. 5/2001, S. 61) die<br />
Einstufungsliste der Bakterien <strong>und</strong> Archaebakterien aus dieser BG-Information in<br />
sein technisches Regelwerk als TRBA 466 (ANONYM 2006) übernommen. Darin<br />
enthalten ist eine Liste der Einstufung von Bakterien <strong>und</strong> Archaebakterien. Die<br />
meisten Vertreter <strong>des</strong> Genus Lactobacillus werden in die Risikogruppe 1<br />
eingeordnet, wobei einige von ihnen mit einem Zusatz versehen sind, dass sie in<br />
Einzelfällen, überwiegend bei erheblich abwehrgeminderten Menschen, als<br />
Krankheitserreger nachgewiesen oder vermutet wurden. Einige wenige Spezies <strong>des</strong><br />
Genus Lactobacillus werden hingegen auch in die Risikogruppe 2 eingeordnet. Von<br />
diesen Vertretern der Risikogruppe 2 wiederum sind einige mit <strong>dem</strong> Zusatz<br />
versehen, dass z. T. Stämme langjährig sicher in der technischen Anwendung<br />
gehandhabt wurden, <strong>und</strong> daher als bewährte Stämme in die Risikogruppe 1 fallen
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
können. Die nachfolgende Tabelle 9 zeigt die Zuordnung einiger Lactobacillus-<br />
Spezies zu Risikogruppen nach TRBA 466 (ANONYM 2006).<br />
Tabelle 9: Risikogruppen der in Tab. 3 - 5 genannten Laktobazillen nach<br />
TRBA 466 (ANONYM 2006)<br />
Spezies Risikogruppe nach TRBA 466 (2006)<br />
L. acidophilus 1+<br />
L. amylovorus 1<br />
L. casei 1<br />
L. crispatus 1+<br />
L. fermentum 1<br />
L. gallinarum 1<br />
L. gasseri 1+<br />
L. johnsonii 1+<br />
L. paracasei 1<br />
L. reuteri 1<br />
L. rhamnosus 2TA<br />
L. zeae 1<br />
TRBA Technische Regeln <strong>für</strong> Biologische Arbeitsstoffe<br />
1 kein Risiko<br />
2 geringes Risiko<br />
+ in Einzelfällen als Krankheitserreger nachgewiesen oder vermutet, überwiegend bei erheblich<br />
abwehrgeminderten Menschen; Identifizierung der Art oft nicht zuverlässig<br />
TA Arten, von denen Stämme bekannt sind, die langjährig sicher in der technischen Anwendung<br />
gehandhabt wurden; diese bewährten Stämme können daher nach den Einstufungskriterien in<br />
die Risikogruppe 1 fallen<br />
Zu berücksichtigen ist, dass sich die Eingruppierung in Risikogruppen auf<br />
Sicherungsmaßnahmen <strong>und</strong> Ges<strong>und</strong>heitsschutz bei Tätigkeiten mit diesen<br />
Mikroorganismen am Arbeitsplatz bezieht. Es wird durch die genannten<br />
Risikogruppen nicht das potentielle Risiko <strong>für</strong> den Verbraucher, zum Beispiel durch<br />
den Verzehr von probiotischen Lebensmitteln, ausgedrückt.<br />
37
38<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Nach DE VRESE <strong>und</strong> SCHREZENMEIER (2000) haben Mikroorganismen der<br />
Risikogruppe 1, die seit langer Zeit ohne Ges<strong>und</strong>heitsrisiken eingesetzt werden, den<br />
sog. GRAS-Status („Generally Recognized as Safe“).<br />
„Generally Recognized as Safe“ ist eine Bezeichnung der amerikanischen FDA<br />
(Food and Drug Administration) <strong>für</strong> jede Substanz, die Lebensmitteln zugesetzt<br />
werden kann, <strong>und</strong> von Experten als sicher eingestuft wurde (FDA 2004).<br />
Das sog. QPS-Konzept der EFSA (European Food Safety Authority) ist in Konzeption<br />
<strong>und</strong> Zweck ähnlich der in den USA verwendeten GRAS-Definition. QPS steht <strong>für</strong><br />
„Qualified Presumption of Safety of Micro-organisms in Food and Feed“. Das QPS-<br />
Konzept ist speziell an die in Europa geltenden Rechtsnormen angepasst.<br />
Um festzustellen, welche Möglichkeiten es gibt, ein System einzuführen, das mit <strong>dem</strong><br />
Konzept <strong>und</strong> der Zielsetzung der in den USA verwendeten GRAS-Definition<br />
vergleichbar wäre, hatten die früheren wissenschaftlichen <strong>Aus</strong>schüsse der DG<br />
SANCO (Directorate General for Health and Consumer Protection, European<br />
Commission) <strong>für</strong> Lebensmittel, Futtermittel <strong>und</strong> Pflanzen 2003 gemeinsam ein<br />
Arbeitspapier zur öffentlichen Beratung ausgearbeitet. Das Dokument zeigte einen<br />
möglichen Weg auf, wie die Ansätze <strong>für</strong> die Sicherheitsbewertung von<br />
Mikroorganismen in der Lebensmittel- <strong>und</strong> Futtermittelproduktion harmonisiert<br />
werden könnten. Im Rahmen <strong>des</strong> zweiten wissenschaftlichen Kolloquiums der EFSA<br />
im Dezember 2004 wurde über die wissenschaftlichen Gr<strong>und</strong>sätze, die der „Qualified<br />
Presumption of Safety“ zugr<strong>und</strong>e liegen, offen diskutiert.<br />
Das QPS-Konzept stellt einen möglichen Weg dar, die Einschätzungen der<br />
Sicherheit von Mikroorganismen, die in Lebensmitteln <strong>und</strong> Futtermitteln Verwendung<br />
finden, über die <strong>Aus</strong>schüsse der EFSA hinaus zu harmonisieren. QPS erlaubt es, die<br />
<strong>für</strong> eine adäquate Sicherheitsbewertung von Lebensmitteln <strong>und</strong> Futtermitteln<br />
erforderlichen Elemente zu identifizieren. Auf diese Weise sollen Ressourcen besser<br />
genutzt werden, in<strong>dem</strong> sich auf solche Organismen konzentriert werden kann, die die<br />
größten Risiken oder Un<strong>sicherheit</strong>en darstellen (EFSA 2005).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Laktobazillen werden gelegentlich mit klinischen Erkrankungen in Zusammenhang<br />
gebracht. Es handelt sich bei ihnen aber um opportunistische Erreger, die nur bei<br />
Patienten mit schweren Gr<strong>und</strong>erkrankungen klinisch in Erscheinung treten. Sie<br />
können selbst nicht die Barrieren <strong>des</strong> Gastrointestinaltraktes oder anderer<br />
Schleimhäute überwinden, d. h. sie sind nicht obligat pathogen (KLEIN et al. 1992,<br />
AGUIRRE u. COLLINS 1993, GASSER 1994).<br />
Trotz <strong>des</strong> GRAS-Status konnte vereinzelt bei Milchsäurebakterien ein<br />
Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern beobachtet werden (GASSER<br />
1994). Nach KLEIN et al. (1992) <strong>und</strong> AGUIRRE <strong>und</strong> COLLINS (1993) ist das<br />
allgemeine Infektionsrisiko bei Milchsäurebakterien aber als sehr niedrig einzustufen.<br />
Klinische Infektionen, die durch Milchsäurebakterien verursacht wurden, konnten<br />
nicht bei ges<strong>und</strong>en Personen beobachtet werden. In allen Fällen lagen<br />
prädisponierende Faktoren <strong>für</strong> eine Infektion vor (ADAMS u. MARTEAU 1995).<br />
Bei alten <strong>und</strong> immunsupprimierten Patienten, vor allem bei solchen, die<br />
Breitspektrumantibiotika therapeutisch einnahmen, konnten z. B. durch Laktobazillen<br />
bedingte infektiöse Endokarditiden, Septikämien, rheumatische Gefäßerkrankungen<br />
sowie Zahnfäule diagnostiziert werden (HARTY et al. 1994). Speziell <strong>für</strong> die<br />
infektiöse Endokarditis prädisponieren auch abnorme Herzklappenbef<strong>und</strong>e (ADAMS<br />
u. MARTEAU 1995). <strong>Aus</strong> klinischen Proben von Patienten wurden als Laktobazillen<br />
vor allem die Spezies L. paracasei <strong>und</strong> L. rhamnosus nachgewiesen (GASSER<br />
1994). Nach KIRJAVAINEN et al. (1999) gelten die Fähigkeit zur<br />
Blutplättchenaggregation <strong>und</strong> die Produktion bestimmter Endopeptidasen <strong>und</strong><br />
Glykosidasen durch Laktobazillen als Risikofaktoren. HARTY et al. (1994) <strong>und</strong><br />
KORPELA et al. (1997) zeigten, dass probiotisch genutzte Bakterien Eigenschaften,<br />
wie z. B. Blutplättchenaggregation als spezifischen Pathogenitätsfaktor, nicht<br />
besitzen.<br />
Auch wenn Probiotika als „Generally Recognized as Safe“ angesehen werden,<br />
können unter bestimmten Bedingungen Risiken <strong>für</strong> den Menschen auftreten. <strong>Aus</strong><br />
diesem Gr<strong>und</strong> wurde 1996 das sog. PRODEMO-Projekt von der Europäischen Union<br />
39
40<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
gefördert. PRODEMO CT96-1028 (Program Demonstration of Nutritional<br />
Functionality of Probiotic Foods) wurde mit <strong>dem</strong> Ziel initiiert, <strong>für</strong> die Wirkungen von<br />
probiotischen Produkten wissenschaftliche Beweise zu liefern bzw. diese zu<br />
überprüfen. Außer<strong>dem</strong> wurde eine Liste mit Sicherheitskriterien <strong>für</strong> probiotische<br />
Lebensmittel festgelegt (DONOHUE 2004).<br />
Die ARBEITSGRUPPE „PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN<br />
LEBENSMITTELN“ AM BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN<br />
VERBRAUCHERSCHUTZ UND VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) (2000) sieht die<br />
ges<strong>und</strong>heitliche Unbedenklichkeit bei den traditionell in Lebensmitteln eingesetzten<br />
Milchsäurebakterien als ausreichend belegt an. Eine Unterscheidung in „sicher“ <strong>und</strong><br />
„nicht sicher“ muss <strong>dem</strong>nach stammspezifisch <strong>und</strong> nicht speziesspezifisch getroffen<br />
werden. Infektionen mit Milchsäurebakterien durch den Verzehr von probiotischen<br />
Lebensmitteln konnten laut dieser Arbeitsgruppe nicht nachgewiesen werden. Seit<br />
Jahrzehnten eingesetzte Mikroorganismen sind als sicher anzusehen. Neu<br />
eingeführte Stämme müssen geprüft werden. Speziell sind die in Tabelle 10<br />
aufgeführten Kriterien zu überprüfen.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Tabelle 10: Physiologische Kriterien von probiotischen Mikroorganismen, die<br />
einer Unbedenklichkeitsprüfung bedürfen (ARBEITSGRUPPE<br />
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN<br />
LEBENSMITTELN“ AM BUNDESINSTITUT FÜR<br />
GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND<br />
•<br />
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000)<br />
Kriterien<br />
Bildung von biogenen Aminen (insbes. Tyramin, Histamin, Phenylethylamin)<br />
• Aktivierung von Prokanzerogenen (mit Hilfe von Azoreduktase, Nitroreduktase,<br />
ß-Glucuronidase)<br />
• Induktion bzw. Abbau von Thromben mit Hilfe spezifischer Hydrolasen<br />
• Aktivierung der Thrombozytenaggregation<br />
• Bindung an Fibrinogen <strong>und</strong> Fibronektin<br />
• Mucinabbau (wurde in bestimmten Bifidobakterien nachgewiesen <strong>und</strong> kann als<br />
Voraussetzung <strong>für</strong> eine Invasionstätigkeit der Mikroorganismen gewertet<br />
werden)<br />
• Hämolytische Aktivität<br />
• Übertragbare Antibiotikaresistenzen<br />
41
42<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
2.2 Fleischerzeugnisse <strong>und</strong> Gewürze<br />
Es gibt eine Vielzahl von Fleischzubereitungen <strong>und</strong> Fleischerzeugnissen, denen die<br />
unterschiedlichsten Gewürze zugesetzt werden. Im Folgenden sollen die<br />
verschiedenen Begriffsdefinitionen in diesem Zusammenhang geklärt werden <strong>und</strong><br />
auf Gewürze, speziell deren antimikrobielle Wirkung, näher eingegangen werden.<br />
Abschließend wird der Einsatz von Probiotika in Fleischerzeugnissen dargestellt.<br />
2.2.1 Begriffsdefinitionen im Zusammenhang mit Fleischerzeugnissen<br />
Die Begriffsbestimmungen, die im Zusammenhang mit Fleischerzeugnissen<br />
festzulegen sind, sind in der Verordnung (EG) Nr. 853/2004 über spezifische<br />
Hygienevorschriften <strong>für</strong> Lebensmittel tierischen Ursprungs (ANONYM 2004) im<br />
Anhang I enthalten.<br />
Nach dieser Verordnung sind „Fleisch“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 1.1)<br />
alle genießbaren Teile einschließlich <strong>des</strong> Blutes von „Huftieren“, „Geflügel“,<br />
„Hasentieren“, „frei leben<strong>dem</strong> Wild“, „Farmwild“, „Kleinwild“ <strong>und</strong> „Großwild“. „Frisches<br />
Fleisch“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 1.10) wurde zur Haltbarmachung<br />
ausschließlich gekühlt, gefroren oder schnellgefroren, kann vakuumverpackt oder in<br />
kontrollierter Atmosphäre umhüllt sein.<br />
„Fleischzubereitungen“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 1.15): Frisches<br />
Fleisch, einschließlich Fleisch, das zerkleinert wurde, <strong>dem</strong> Lebensmittel, Würzstoffe<br />
oder Zusatzstoffe zugegeben wurden oder das einem Bearbeitungsverfahren<br />
unterzogen wurde, das nicht ausreicht, die innere Muskelfaserstruktur <strong>des</strong> Fleisches<br />
zu verändern <strong>und</strong> so die Merkmale <strong>des</strong> frischen Fleisches zu beseitigen.<br />
„Fleischerzeugnisse“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 7.1) sind verarbeitete<br />
Erzeugnisse, die aus der Verarbeitung von Fleisch oder der Weiterverarbeitung<br />
solcher verarbeiteter Erzeugnisse so gewonnen werden, dass bei einem Schnitt
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
durch den Kern die Schnittfläche die Feststellung erlaubt, dass die Merkmale von<br />
frischem Fleisch nicht mehr vorhanden sind.<br />
„Gelatine“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 7.7) ist ein natürliches, lösliches<br />
Protein, gelierend oder nichtgelierend, das durch die teilweise Hydrolyse von<br />
Kollagen aus Knochen, Häuten <strong>und</strong> Fellen, Sehnen <strong>und</strong> Bändern von Tieren<br />
gewonnen wird.<br />
Nach § 2 Abs. 3 <strong>des</strong> Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- <strong>und</strong><br />
Futtermittelgesetzbuches (ANONYM 2005) sind Lebensmittel-Zusatzstoffe Stoffe mit<br />
oder ohne Nährwert, die in der Regel weder selbst als Lebensmittel verzehrt noch als<br />
charakteristische Zutat eines Lebensmittels verwendet werden, <strong>und</strong> die einem<br />
Lebensmittel aus technologischen Gründen beim Herstellen oder Behandeln<br />
zugesetzt werden, wodurch sie selbst oder ihre Abbau- oder Reaktionsprodukte<br />
mittelbar oder unmittelbar zu einem Bestandteil <strong>des</strong> Lebensmittels werden oder<br />
werden können. Den Lebensmittel-Zusatzstoffen stehen gleich<br />
1. Stoffe mit oder ohne Nährwert, die üblicherweise weder selbst als Lebensmittel<br />
verzehrt noch als charakteristische Zutat eines Lebensmittels verwendet werden <strong>und</strong><br />
die einem Lebensmittel aus anderen als technologischen Gründen beim Herstellen<br />
oder Behandeln zugesetzt werden, wodurch sie selbst oder ihre Abbau- oder<br />
Reaktionsprodukte mittelbar oder unmittelbar zu einem Bestandteil <strong>des</strong><br />
Lebensmittels werden oder werden können; ausgenommen sind Stoffe, die<br />
natürlicher Herkunft oder den natürlichen chemisch gleich sind <strong>und</strong> nach allgemeiner<br />
Verkehrsauffassung überwiegend wegen ihres Nähr-, Geruchs- oder<br />
Geschmackswertes oder als Genussmittel verwendet werden,<br />
2. Mineralstoffe <strong>und</strong> Spurenelemente sowie deren Verbindungen außer Kochsalz,<br />
3. Aminosäuren <strong>und</strong> deren Derivate <strong>und</strong><br />
4. Vitamine A <strong>und</strong> D sowie deren Derivate.<br />
43
2.2.2 Gewürze<br />
44<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Die Leitsätze <strong>für</strong> Gewürze <strong>und</strong> andere würzende Zutaten (ANONYM 1998) werden<br />
nach § 15 LFGB (ANONYM 2005) von der Deutschen Lebensmittelbuch-Kommission<br />
beschlossen <strong>und</strong> in das Deutsche Lebensmittelbuch aufgenommen. Die Leitsätze<br />
beschreiben die Herstellung, Beschaffenheit oder sonstigen Merkmale von<br />
Lebensmitteln, die <strong>für</strong> die Verkehrsfähigkeit der Lebensmittel von Bedeutung sind.<br />
Die Leitsätze <strong>für</strong> Gewürze <strong>und</strong> andere würzende Zutaten (ANONYM 1998) definieren<br />
Gewürze <strong>und</strong> Kräuter als Pflanzenteile, die wegen ihres Gehaltes an natürlichen<br />
Inhaltsstoffen als geschmacks- <strong>und</strong>/oder geruchsgebende Zutaten zu Lebensmitteln<br />
bestimmt sind.<br />
Gewürze sind Blüten, Früchte, Knospen, Samen, Rinden, Wurzeln, Wurzelstöcke,<br />
Zwiebeln oder Teile davon, meist in getrockneter Form.<br />
Kräuter sind frische oder getrocknete Blätter, Blüten, Sprosse oder Teile davon.<br />
Gewürzmischungen sind ausschließlich aus Gewürzen bestehende Mischungen.<br />
Man bezeichnet Gewürze nach ihrer Art. Sofern der Zerkleinerungsgrad von<br />
Bedeutung ist, wird dieser zusätzlich angegeben.<br />
Nach den Leitsätzen <strong>für</strong> Gewürze <strong>und</strong> andere würzende Zutaten (ANONYM 1998)<br />
werden bei Gewürzen die Verkehrsbezeichnungen kursiv geschrieben.<br />
Bei Nelken/Gewürznelken handelt es sich z. B. um die kurz vor <strong>dem</strong> Aufblühen<br />
gesammelten, getrockneten Blütenknospen von Syzygium aromaticum (L.) Merr. et<br />
Perry aus der Familie der Myrtengewächse (Myrtaceae).<br />
Schwarzer Pfeffer bezeichnet die noch nicht völlig reif geernteten, getrockneten<br />
Früchte von Piper nigrum (L.) aus der Familie der Pfeffergewächse (Piperaceae). Sie<br />
riechen kräftig aromatisch <strong>und</strong> scharf.<br />
Wertbestimmende Inhaltsstoffe von Gewürzen, welche Geruch, Geschmack <strong>und</strong><br />
Farbe wesentlich bestimmen, sind neben ätherischen Ölen, Scharfstoffe (z. B.<br />
Senföle), Bitterstoffe <strong>und</strong> Farbstoffe (TEUSCHER 2003).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Gewürze können auf verschiedene Art <strong>und</strong> Weise Verunreinigungen aufweisen, wie<br />
z. B. Mikroorganismen sowie deren toxische Stoffwechselprodukte, Schwermetalle,<br />
Pflanzenschutzmittel, Herbizide, Düngemittel, radioaktive Substanzen, Umweltgifte,<br />
Insekten, Sand, Erde, Staub <strong>und</strong> fremde Pflanzenteile (TEUSCHER 2003). Die<br />
Keimzahl von Kräutern <strong>und</strong> Gewürzen ist mit bis 10 7 KbE/g vergleichsweise hoch<br />
(BECKMANN et al. 1996). Die kontaminierenden Mikroorganismen sind häufig<br />
aerobe Sporenbildner <strong>und</strong> Schimmelpilze. Trotz relativ hoher Keimbelastungen sind<br />
die Infektionsgefahren <strong>für</strong> den Menschen als gering einzuschätzen, da<br />
Mikroorganismen in der Regel während der Herstellungs- <strong>und</strong> Kochprozesse<br />
abgetötet werden (TEUSCHER 2003).<br />
Während der Lagerung getrockneter Gewürze können Qualitätsminderungen wie<br />
z. B. Verdunsten von flüchtigen Inhaltsstoffen, Abbau von Farbstoffen, Anreicherung<br />
von Mikroorganismen <strong>und</strong> deren Toxinen auftreten (TEUSCHER 2003).<br />
Gewürze können eine Vielzahl verschiedener pharmakologischer Wirkungen haben:<br />
• appetitanregende <strong>und</strong> verdauungsfördernde (PLATEL u. SRINIVASAN 1996,<br />
2000),<br />
• antimikrobielle (YOUSEF u. TAWIL 1980, KNOBLOCH et al. 1986, KNOBLOCH<br />
et al. 1989, TABAK et al. 1996, DORMAN u. DEANS 2000, NIELSEN u. RIOS<br />
2000, INOUYE et al. 2001),<br />
• karminative (SCHILCHER 1986),<br />
• antioxidative <strong>und</strong> radikalfangende (ZITTERMANN 1994, ASAI et al. 1999,<br />
ÖZCAN 2003, MORENO et al. 2006, YANISHLIEVA et al. 2006),<br />
• antikarzinogene <strong>und</strong> antitumorale (FIALA et al. 1985, HECHT et al. 1995, CAI et<br />
al. 1997, SUAEYUN et al. 1997, MARTÍNEZ et al. 1998, CHUANG et al. 2000),<br />
• hepatoprotektive (YOUDIM u. DEANS 1999),<br />
• antihypercholesterolämische <strong>und</strong> antiarteriosklerotische (TEUSCHER 2003),<br />
• östrogene <strong>und</strong> gestagene (ZAVA et al. 1998),<br />
• sowie zahlreiche sonstige Wirkungen (TEUSCHER 2003).<br />
45
46<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Unter Umständen können Gewürze auch toxische Wirkungen haben oder sogar<br />
kanzerogen <strong>und</strong> hepatotoxisch sein, wobei in den zum Würzen üblichen Dosen<br />
normalerweise keine Gefahr besteht (LAKE 1999). Allergische Reaktionen, die durch<br />
Gewürze ausgelöst werden, können auch bei geringen Mengen vorkommen<br />
(WÜTHRICH u. HOFER 1984, STAGER et al. 1991, WÜTHRICH u. ETESAMIFAR<br />
1998, WÜTHRICH u. BLÖTZER 2004).<br />
Gewürze dienen nicht nur der Verbesserung von Geruch, Geschmack <strong>und</strong> <strong>Aus</strong>sehen<br />
von Speisen, sondern können auch aufgr<strong>und</strong> der antioxidativen <strong>und</strong> antimikrobiellen<br />
Wirkungen zur Verbesserung der Haltbarkeit der Lebensmittel führen (TSAI et al.<br />
1999, TEUSCHER 2003).<br />
2.2.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Gewürzen<br />
Alle Gewürze mit ätherischen Ölen <strong>und</strong> isolierte ätherische Öle wirken mehr oder<br />
weniger stark antimikrobiell. Die Komponenten ätherischer Öle lagern sich aufgr<strong>und</strong><br />
ihrer Lipophilität in die Zellmembranen der Mikroorganismen ein <strong>und</strong> hemmen u. a.<br />
den membrangeb<strong>und</strong>enen Elektronenfluss bei der oxidativen Phosphorylierung <strong>und</strong><br />
damit den Energiestoffwechsel. Hohe Konzentrationen an ätherischen Ölen führen<br />
auch zur Lyse der Zellmembranen <strong>und</strong> zur Denaturierung der Cytoplasmaproteine.<br />
Viele ätherische Öle oder ihre Komponenten haben eine mit der von Phenol<br />
vergleichbare oder diese sogar übertreffende Desinfektionswirkung. Der sog.<br />
Phenolkoeffizient beschreibt die abtötende Wirkung auf ein bestimmtes<br />
Testbakterium im Vergleich zu Phenol (Phenol = 1) (TEUSCHER 2003).<br />
Die antimikrobiell wirksamen Inhaltsstoffe von Gewürzen werden als Phytonzide<br />
bezeichnet. Phytonzide sind pflanzliche Stoffwechselprodukte (GERHARDT 1990).<br />
Bei zahlreichen Gewürzen sind die ätherischen Öle Träger der antimikrobiellen<br />
Wirksamkeit (NARAHIMSARAO u. NIGAM 1970).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Ätherische Öle sind sek<strong>und</strong>äre Pflanzeninhaltsstoffe, leicht flüchtig, <strong>und</strong> stellen meist<br />
komplizierte Gemische verschiedener, oft nahe verwandter Stoffe dar, die auch in<br />
sehr großen Verdünnungen durch Geruch <strong>und</strong> Geschmack zu erkennen sind. Der<br />
Gehalt an ätherischen Ölen in verschiedenen Gewürzen variiert. Ätherische Öle<br />
lassen sich durch organische Lösungsmittel, wie Alkohol, aus der Pflanze<br />
extrahieren. Unter Luft- <strong>und</strong> Lichteinwirkung unterliegen die ätherischen Öle leicht<br />
der Autoxidation, sie „verharzen“ <strong>und</strong> nehmen artfremden Geruch an; verschiedene<br />
Inhaltsstoffe können auch polymerisieren. Ätherische Öle sind aus den<br />
Gr<strong>und</strong>elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, eventuell noch aus Sauerstoff, Stickstoff<br />
<strong>und</strong> Schwefel aufgebaut. Man unterscheidet aliphatische, aromatische <strong>und</strong><br />
alicyclische Stoffgruppen (GERHARDT 1990).<br />
In der Gewürzbranche werden die ätherischen Öle auch als Gewürzöle bezeichnet<br />
(TEUSCHER 2003). Die Zusammensetzung <strong>des</strong> ätherischen Öls einer Pflanze ist<br />
sehr komplex. Der Dampfdruck eines flüchtigen Stoffes bei Zimmer- oder<br />
Körpertemperatur bestimmt wie stark dieser zum Aroma eines Gewürzes beiträgt.<br />
Durch AEDA (aroma extract dilution analysis) werden die FD-Faktoren (flavour<br />
dilution-Faktoren) bestimmt, die angeben, bei welcher Verdünnung der abgetrennte<br />
Stoff noch geruchlich wahrgenommen werden kann (GROSCH 1993, 1994).<br />
Gewürznelken enthalten 15 bis 21 % ätherisches Öl. Die Hauptkomponenten, die<br />
etwa 99 % ausmachen, sind Eugenol (70 bis 90 %), Acetyleugenol/Eugenylacetat<br />
(bis 17 %) <strong>und</strong> ß-Caryophyllen (5 bis 12 %). In sehr geringen Mengen kommen<br />
zahlreiche weitere Komponenten vor, davon sind Heptan-2-on (Methylamylketon)<br />
<strong>und</strong> Octan-2-on (Methylheptylketon) maßgeblich am Geruch beteiligt (WALTER<br />
1972, KOLLER 1981, GOPALAKRISHNAN et al. 1990, TEUSCHER 2003). Längere<br />
Lagerung hat zur Folge, dass bedingt durch die Bildung von Methylacetat aus der<br />
Seitenkette <strong>des</strong> Acetyleugenols, unerwünschte Aromaveränderungen auftreten<br />
(KOLLER 1979). Extrakte aus Gewürznelken <strong>und</strong> Nelkenöl besitzen gute<br />
antimikrobielle Wirkung (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et al. 1989, BEUCHAT<br />
1994, DORMAN u. DEANS 2000). Auch das Wachstum von Helicobacter pylori wird<br />
47
48<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
gehemmt, <strong>des</strong>sen Urease-Aktivität jedoch nicht beeinflusst (BAE et al. 1998). An der<br />
gegen pathogene M<strong>und</strong>bakterien gerichteten antibakteriellen Wirkung sind auch die<br />
Flavone Kämpferol <strong>und</strong> Myricetin beteiligt (CAI u. WU 1996). Das Wachstum<br />
mycotoxigener Pilze <strong>und</strong> deren Mycotoxinbildung wird bereits durch 0,1 %<br />
Nelkenpulver im Substrat völlig unterdrückt (MABROUK u. EL-SHAYEP 1980).<br />
Im Schwarzen Pfeffer liegt der Gehalt an ätherischen Ölen zwischen 1,2 <strong>und</strong> 3,9 %.<br />
Hauptkomponenten können ß-Caryophyllen (12 bis 47 %), α-Pinen (2 bis 25 %),<br />
Sabinen (0 bis 25 %), (+)-Limonen (9 bis 23 %), ∆ 3 -Caren (0,1 bis 20 %), ß-Pinen<br />
(2 bis 15 %), α-Phellandren (0,1 bis 10%) <strong>und</strong> Myrcen (0 bis 8%) sein<br />
(DEBRAUWERE u. VERZELE 1976, SUMATHYKUTTY et al. 1999, TEWTRAKUL et<br />
al. 2000, TEUSCHER 2003). Ethanolische Pfefferextrakte oder ätherisches Pfefferöl<br />
wirken antibakteriell (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP 1980, ISMAIEL<br />
u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS 2000). Das<br />
Wachstum mycotoxigener Schimmelpilze wird aber offenbar nicht beeinflusst, da<br />
Pfeffer hohe Konzentrationen an Aflatoxinen enthalten kann (ROY et al. 1988,<br />
EL-KADY et al. 1995).<br />
COVENTRY <strong>und</strong> HICKEY (1993) beschrieben, dass Gewürze die Entwicklung<br />
bestimmter Mikroorganismen fördernd oder hemmend beeinflussen können.<br />
Demnach kann eine angemessene Konzentration von Mangan-Ionen im Gewürz die<br />
Fermentationsprozesse verstärken; im Gegensatz dazu werden<br />
fermentationshemmende Effekte auf das Wirken von in Gewürzextrakten<br />
vorhandenen antimikrobiellen Verbindungen zurückgeführt.<br />
ÖZCAN <strong>und</strong> ERKMEN (2001) untersuchten die Wirkung der ätherischen Öle<br />
verschiedener Gewürze auf unterschiedliche Testbakterien. Die ätherischen Öle<br />
variierten in ihrer antimikrobiellen Aktivität. Einzelne oder Kombinationen von<br />
ätherischen Ölen könnten effizient <strong>für</strong> die Inaktivierung von pathogenen<br />
Mikroorganismen <strong>und</strong> Verderbniserregern sein, um so eine ausreichende<br />
Lagerfähigkeit von Lebensmitteln zu erreichen.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Ingwer, Roter Pfeffer, Senf, Muskat, Zimt <strong>und</strong> Nelken wurden untersucht, um ihre<br />
Effekte auf das Wachstum <strong>und</strong> die Säureproduktion einer Starterkultur, bestehend<br />
aus L. plantarum <strong>und</strong> P. cerevisiae, in einem flüssigen Medium festzustellen. 4,0 g/l,<br />
8,0 g/l <strong>und</strong> 12,0 g/l aller Gewürze, mit <strong>Aus</strong>nahme von Nelken, stimulierten die<br />
Säureproduktion durch die Starterkultur, führten aber nicht zu Zunahmen in der<br />
Bakterienpopulation. Nelken hemmten die Starterkultur ab 4,0 g/l, niedrigere<br />
Konzentrationen (0,5 - 2,0 g/l) stimulierten die Säureproduktion. Hohe<br />
Zimtkonzentrationen (8,0 - 12,0 g/l) verzögerten die Säureproduktion, aber die<br />
Bakterienzahl war mit der der Kontrolle vergleichbar (ZAIKA u. KISSINGER 1979).<br />
ZAIKA et al. (1983) bewiesen, dass zunehmende Konzentrationen (0,5 - 8,0 g/l) an<br />
Oregano, Rosmarin, Salbei <strong>und</strong> Thymian progressiv das Wachstum <strong>und</strong> die<br />
Säureproduktion von L. plantarum <strong>und</strong> P. acidilactici in einem flüssigen Medium<br />
verzögern. Nach Überwinden der bakteriostatischen Aktivität, stimulierten alle vier<br />
Gewürze heftig die Säureproduktion. Für den relativen inhibitorischen Effekt der<br />
Gewürze gegenüber beiden Mikroorganismen konnte folgende Reihenfolge<br />
festgelegt werden: Oregano >> Rosmarin = Salbei > Thymian. L. plantarum erwies<br />
sich gegenüber der toxischen Effekte der Gewürze resistenter als P. acidilactici.<br />
ZAIKA <strong>und</strong> KISSINGER (1981) konnten zeigen, dass der inhibitorische Effekt von<br />
Oregano durch Extraktion mit Lösungsmitteln oder Autoklavieren beseitigt werden<br />
kann.<br />
Die Wirkungen von Kümmel <strong>und</strong> Oregano sowie ihrer ätherischen Öle untersuchten<br />
KIVANÇ et al. (1991). Kümmel in Konzentrationen von 0,5 %, 1,0 % <strong>und</strong> 2,0 %<br />
stimulierte das Wachstum <strong>und</strong> die Säureproduktion von L. plantarum <strong>und</strong><br />
Leuconostoc mesenteroi<strong>des</strong> in flüssigem Medium. Das ätherische Öl von Kümmel<br />
hemmte in hohen Konzentrationen (300 <strong>und</strong> 600 ppm) Wachstum <strong>und</strong><br />
Säureproduktion von L. plantarum. Nach einer bestimmten Zeit konnte Wachstum<br />
von Leuconostoc mesenteroi<strong>des</strong> beobachtet werden, <strong>und</strong> <strong>des</strong>sen Säureproduktion<br />
wurde bei 600 ppm stimuliert. Oregano <strong>und</strong> seine ätherischen Öle hemmten in allen<br />
49
50<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Konzentrationen das Wachstum beider Kulturen. Die Säureproduktion von<br />
L. plantarum wurde hingegen durch Oregano stimuliert.<br />
GONZALEZ-FANDOS et al. (1996) konnten nachweisen, dass Knoblauch <strong>und</strong><br />
Oregano in Konzentrationen über 2 % eine antimikrobielle Wirkung auf in der<br />
Wurstfermentation eingesetzte Laktobazillen (L. plantarum DSM 20174, L. curvatus<br />
DSM 20019, L. sakei DSM 20017) <strong>und</strong> Pediokokken (P. damnosus DSM 20031)<br />
ausüben. Ähnliche Verhältnisse ergaben sich bei Paprika <strong>und</strong> Pfeffer in<br />
Konzentrationen von 5 %.<br />
Nach GROHS et al. (2000) verzögert die Anwendung zweier Gewürzmischungen das<br />
bakterielle Wachstum auf Schweinefleisch, unterbindet es jedoch nicht vollständig.<br />
Von Pseudomonaden, Enterobacteriazeen <strong>und</strong> Milchsäurebakterien als potentielle<br />
<strong>und</strong> häufig anzutreffende Verderbniserreger auf Frischfleisch, konnte die Zunahme<br />
der Keimzahlen von Pseudomonaden <strong>und</strong> Enterobacteriazeen durch die Anwendung<br />
der Gewürzmischungen verlangsamt werden. Somit war das Fleisch im<br />
Wesentlichen mikrobiell stabil. Die Vermehrung der Milchsäurebakterien blieb<br />
weitgehend unbeeinflusst.<br />
2.2.3 Einsatz von Probiotika in Fleischerzeugnissen<br />
Die Idee, Lebensmittel eher gezielt <strong>für</strong> ges<strong>und</strong>heitsfördernde Zwecke zu nutzen, als<br />
aus ernährungsphysiologischen Gründen, eröffnete ein ganz neues Feld <strong>für</strong> die<br />
Fleischindustrie. Zusätzlich zu traditionellen Produkten könnten sog. „<strong>des</strong>ign“-<br />
Lebensmitel mit bestimmten Eigenschaften <strong>und</strong> funktionellen Inhaltsstoffen, wie z. B.<br />
Probiotika, produziert werden. Die kontinuierliche Bioverfügbarkeit der funktionellen<br />
Inhaltsstoffe ist während der verschiedenen Stadien der Herstellung <strong>und</strong> der<br />
Lagerung sicherzustellen (JIMÉNEZ-COLMENERO 2001).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Obwohl Milchsäure produzierende Bakterien als Starterkulturen in der Herstellung<br />
von fermentierten Fleischprodukten weit verbreitet sind, wurde bisher wenig Wert auf<br />
deren Eignung als Probiotika in Fleischprodukten gelegt, im Gegensatz zu der<br />
Situation bei Milcherzeugnissen (ARIHARA 2004). INCZE (2002) nennt als Ursache<br />
<strong>für</strong> diese Verspätung gr<strong>und</strong>sätzliche Unterschiede zwischen diesen beiden<br />
Produktgruppen. Bei Fleischerzeugnissen gibt es <strong>dem</strong>nach keine Möglichkeit, die<br />
Anfangskeimzahl <strong>des</strong> Wurstbrätes drastisch zu senken, wie dies bei der<br />
Milchpasteurisierung der Fall ist. Außer<strong>dem</strong> liegt der aw-Wert einer fertigen Rohwurst<br />
wesentlich niedriger als der von probiotischen Molkereiprodukten, was nur wenige<br />
probiotische Bakterien vertragen (INCZE 2002). Dennoch erscheint es möglich,<br />
Fleischerzeugnisse zu entwickeln, die nützlich <strong>für</strong> die Ges<strong>und</strong>heit sind, in<strong>dem</strong><br />
probiotische Bakterien verwendet werden (ARIHARA 2004).<br />
Starterkulturen sind reine Bakterienkulturen, die, allein oder zusammen mit anderen<br />
reinen Kulturen, bei der Herstellung von Wurstwaren zugefügt werden, mit <strong>dem</strong> Ziel<br />
eine kontrollierte Fermentation herbeizuführen. Die Starterkulturmischung ist je nach<br />
Hersteller gefroren oder gefriergetrocknet, mit oder ohne Trägerstoff. Die Einzeloder<br />
Mischkulturen ausgewählter Stämme lebender Mikroorganismen haben<br />
bestimmte lebensmitteltechnologisch bedeutsame enzymatische Eigenschaften.<br />
Hierdurch sollen Aroma, Farbe <strong>und</strong> Konsistenz positiv beeinflusst werden, <strong>und</strong> somit<br />
eine gleichbleibende Qualität, sowie in mikrobiologischer Hinsicht stabile, sichere<br />
Produkte erzielt werden (CORETTI 1977, METZ 1993, GEISEN et al. 1992, KNAUF<br />
1998, RUST 2004). Mikroorganismen, die als Starterkulturen eingesetzt werden<br />
sollen, müssen in der Lage sein, in <strong>dem</strong> entsprechenden Milieu zu wachsen bzw. zu<br />
überleben (KNAUF 1997).<br />
Nach RUST (2004) häufig in der Fleischindustrie eingesetzte Starterkulturen sind in<br />
Tabelle 11 dargestellt.<br />
51
52<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Tabelle 11: Häufig in der Fleischindustrie eingesetzte Starterkulturen<br />
(RUST 2004)<br />
Gruppe Spezies<br />
Milchsäurebakterien Lactobacillus sakei/curvatus<br />
Lactobacillus plantarum<br />
Pediococcus cerevisiae<br />
Pediococcus acidilactici<br />
Pediococcus pentosaceus<br />
Nitrat reduzierende Bakterien Kocuria varians<br />
Staphylococcus carnosus<br />
Staphylococcus xylosus<br />
Hefen Debaryomyces hansenii<br />
Schimmelpilze Penicillium nalgiovense<br />
Penicillium camemberti<br />
Penicillium chrysogenum<br />
Die aus Fleisch isolierten Lactobacillus-Stämme erwiesen sich als geeignete<br />
Starterkulturen <strong>für</strong> die Herstellung von fermentierten Rohwürsten <strong>und</strong> produzierten<br />
zufriedenstellende Produkte, stärker abhängig vom verwendeten Stamm als von der<br />
Spezies (GARRIGA et al. 1996).<br />
Zwischen verschiedenen Bakterienspezies kommt es zu Konkurrenz, vorausgesetzt,<br />
dass die physikalischen Umgebungsbedingungen, wie z. B. Temperatur <strong>und</strong> pH-<br />
Wert, ein Wachstum ermöglichen. Das schnellere Wachstum von<br />
Milchsäurebakterien <strong>und</strong> die Verringerung <strong>des</strong> pH-Wertes aufgr<strong>und</strong> der Produktion<br />
von Milchsäure führen in mikrobiologischer Hinsicht zu stabilen fermentierten<br />
Produkten. Dieses Basisphänomen der Bakterienökologie wird <strong>für</strong> die Herstellung<br />
von Fleischprodukten, wie z. B. Wurstwaren, benutzt. Für die Wurstherstellung wird<br />
mit Starterkulturen, wie z. B. L. plantarum, beimpft. Die erste Inkubationsperiode<br />
ermöglicht es den Bakterien zu wachsen, wobei Zeit <strong>und</strong> Temperatur an die jeweilige<br />
Technologie angepasst werden, <strong>und</strong> die Verringerung <strong>des</strong> pH-Wertes wird
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
gemessen. Anschließend werden die Produkte gekühlt <strong>und</strong> <strong>für</strong> die Reifung gelagert,<br />
um das Endprodukt zu erhalten (MÄYRÄ-MÄKINEN u. BIGRET 2004).<br />
Nach HAMMES <strong>und</strong> HALLER (1998) können Mikroorganismen mit Lebensmitteln<br />
verzehrt <strong>und</strong> probiotisch wirksam werden. Hier<strong>für</strong> ist gr<strong>und</strong>sätzlich je<strong>des</strong><br />
Lebensmittel geeignet, das die definierten Keime am Leben hält. Allerdings muss der<br />
Einfluss <strong>des</strong> Lebensmittels auf das Überleben <strong>und</strong> die Erhaltung der probiotischen<br />
Wirksamkeit bekannt sein, wobei nach HAMMES <strong>und</strong> HALLER (1998) <strong>für</strong> Rohwürste<br />
noch keine relevanten wissenschaftlichen Untersuchungsergebnisse vorlagen. Es ist<br />
nicht sicher, ob ein Stamm, <strong>des</strong>sen probiotische Wirkung in Milcherzeugnissen<br />
nachgewiesen wurde, diese auch in Fleischerzeugnissen besitzt (HAMMES u.<br />
HALLER 1998, HAMMES u. HERTEL 1998).<br />
ARIHARA et al. (1998) untersuchten probiotische Stämme aus der Lactobacillus<br />
acidophilus-Gruppe (L. acidophilus, L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum,<br />
L. gasseri, L. johnsonii) hinsichtlich ihrer Anwendung bei der Fermentation von<br />
Fleisch. Von sechs Stämmen zeigte L. gasseri JCM1131 T die größte<br />
Fermentationsleistung. Dieser Stamm war gegen Magen- <strong>und</strong> Gallensäure resistent<br />
<strong>und</strong> sollte so keine nachteiligen Einflüsse auf die Intestinalflora haben. Außer<strong>dem</strong><br />
konnte durch diesen Stamm die Vermehrung von S. aureus <strong>und</strong> <strong>des</strong>sen<br />
Enterotoxinbildung herabgesetzt werden. ARIHARA et al. (1998) kamen zu <strong>dem</strong><br />
Schluss, dass Milchsäurebakterien effektiv in der Fleischfermentation eingesetzt<br />
werden können, um ges<strong>und</strong>heitsfördernde Produkte herzustellen.<br />
ERKKILÄ et al. (2001 a, b) untersuchten die Fähigkeit dreier probiotischer<br />
Lactobacillus rhamnosus Stämme (GG, E-97800 <strong>und</strong> LC-705), sowie als Kontrolle<br />
die Fähigkeit einer kommerziell erhältlichen Starterkultur, Pediococcus pentosaceus,<br />
Rohwürste zu fermentieren. Während der Fermentation stiegen die Konzentrationen<br />
der Milchsäurebakterien von 7 lg KbE/g auf 8 - 9 lg KbE/g an, <strong>und</strong> die pH-Werte<br />
sanken von 5,6 auf 4,9 - 5,0. Die eingesetzten Starterkulturen stellten jeweils die<br />
dominierenden Mikroorganismen im Produkt dar. Sensorisch betrachtet war der<br />
53
54<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
naso-orale Gesamteindruck (Flavour) bei den Produkten, die von GG <strong>und</strong> E-97800<br />
fermentiert wurden, vergleichbar mit <strong>dem</strong> der als Kontrollstamm eingesetzten<br />
Starterkultur, bei LC-705 hingegen minderwertiger. Die ausgewählten Stämme<br />
produzierten keine biogenen Amine. ERKKILÄ et al. (2001 a, b) kamen zu der<br />
Erkenntnis, dass die untersuchten probiotischen Stämme Lactobacillus rhamnosus<br />
GG, E-97800 <strong>und</strong> LC-705 <strong>für</strong> die Rohwurstherstellung geeignet erscheinen. Wie aber<br />
auch schon HAMMES <strong>und</strong> HALLER (1998) postulierten, können auch nach ERKKILÄ<br />
et al. (2001 a, b) positive ges<strong>und</strong>heitliche Wirkungen von Probiotika in<br />
Milcherzeugnissen nicht pauschal auf Fleischerzeugnisse übertragen werden.<br />
Klinische Studien zur Bestimmung der Wirkungen von probiotischen Rohwürsten<br />
wären notwendig.<br />
Außer<strong>dem</strong> konnten ERKKILÄ <strong>und</strong> PETÄJÄ (2000) <strong>und</strong> ERKKILÄ (2001) zeigen, dass<br />
gewöhnlich in Fleisch eingesetzte kommerzielle Starterkulturen in-vitro die<br />
Einwirkung von Magen- <strong>und</strong> Gallensäure überlebten. Stämme von Lactobacillus<br />
sakei (RM 10) <strong>und</strong> Pediococcus acidilactici (P 2) zeigten dabei die besten<br />
Überlebensraten bei niedrigen pH-Werten <strong>und</strong> hohen Konzentrationen an<br />
Gallensäure (ERKKILÄ u. PETÄJÄ 2000, ERKKILÄ 2001).<br />
Nach TYÖPPÖNEN et al. (2003) können Milchsäurebakterien sowohl als Probiotika,<br />
als auch als bioprotektive Kulturen <strong>und</strong> als fermentierende Substanzen in<br />
Fleischprodukten, wie z. B. Rohwürsten, eingesetzt werden.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
2.3 Technologische Verfahren zur Bakterienbearbeitung<br />
Die Stabilität von Mikronährstoffen bzw. bioaktiven Komponenten, z. B. Probiotika,<br />
variiert bei unterschiedlichen Milieubedingungen. Dies ist bei der Anreicherung in<br />
Lebensmitteln zu berücksichtigen, <strong>und</strong> somit sind u. U. spezielle technologische<br />
Maßnahmen zur Verbesserung <strong>des</strong> Erhaltungsgra<strong>des</strong> notwendig. Es sind negative<br />
äußere wie innere Einflüsse zu vermeiden. Bei den technologischen Maßnahmen ist<br />
zu berücksichtigen, dass die entsprechenden Inhaltsstoffe ggf. unterschiedlich<br />
freigesetzt werden sollen, z. B. in bestimmten Abschnitten <strong>des</strong> Verdauungstraktes.<br />
Die Herstellung von Functional Food erfordert daher nicht nur bestimmte<br />
Maßnahmen zur Absicherung <strong>des</strong> deklarierten Gehaltes an biologisch wirksamen<br />
Inhaltsstoffen, sondern auch die Absicherung <strong>des</strong> ausgelobten<br />
ges<strong>und</strong>heitsbezogenen Effektes. Somit gewinnen Verfahrensschritte eine besondere<br />
Bedeutung, wenn diese einerseits zur Erhaltung empfindlicher Inhaltsstoffe führen<br />
<strong>und</strong> andererseits die Einstellung einer kontrollierten Freisetzung bestimmter<br />
Inhaltsstoffe im Verdauungstrakt ermöglichen sollen (MUSCHIOLIK u. NAUMANN<br />
2002).<br />
Im Folgenden werden als technologische Verfahren die Fermentation sowie die<br />
Lyophilisation kurz angesprochen <strong>und</strong> die Mikroverkapselung ausführlich dargestellt.<br />
2.3.1 Fermentation<br />
Der Begriff Fermentation wird in der Mikrobiologie, Mykologie, Pharmazie <strong>und</strong><br />
Fütterung gebraucht, steht aber auch allgemein <strong>für</strong> jegliche technische Bioreaktion.<br />
Eine Fermentation ist eine enzymkatalysierte biologische Stoffumwandlung. Als<br />
Biokatalysatoren werden Enzyme, Mikroorganismen, pflanzliche <strong>und</strong> tierische<br />
55
56<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
(humane) Zellkulturen verwendet. Sie können aggregiert oder immobilisiert vorliegen<br />
(DELLWEG et al. 1992).<br />
Jeder Fermentationsprozess ist durch die Fermentationsparameter (z. B.<br />
Temperatur, pH-Wert, Wasseraktivität), die Art <strong>und</strong> Zusammensetzung <strong>des</strong><br />
Substrates (fest, flüssig, gasförmig), die Verfügbarkeit von Sauerstoff <strong>und</strong> die Art <strong>des</strong><br />
Stofftransportes charakterisiert. Der Stoffaustausch zwischen Mikroorganismus <strong>und</strong><br />
Umgebung steht in unmittelbarem Zusammenhang mit <strong>dem</strong> Stofftransport, der<br />
diffusiv oder konvektiv erfolgen kann (KUNZ 1988).<br />
Für ein allgemeingültiges Klassifikationssystem der Fermentationsprozesse ist die<br />
Formulierung eindeutig definierter Kriterien, die die Relationen zwischen<br />
Biokatalysator <strong>und</strong> umgebenden Phasen charakterisieren, notwendig.<br />
Klassifikationskriterien <strong>für</strong> Fermentationsprozesse sind die Art <strong>des</strong> dispersen<br />
Systems im Bilanzraum, die Verteilung zwischen Biokatalysator <strong>und</strong> Substrat, die Art<br />
<strong>des</strong> Stofftransportes, die Verfügbarkeit <strong>des</strong> Sauerstoffes, charakteristische<br />
limitierende Faktoren, Bindungsformen <strong>des</strong> Wassers, Bindungsformen <strong>des</strong><br />
Biokatalysators, der Stoffwechseltyp <strong>des</strong> Biokatalysators <strong>und</strong> die Viskosität der<br />
charakteristischen Phasen (KUNZ et al. 2005).<br />
Die Fermentationsprozesse lassen sich gr<strong>und</strong>sätzlich in Abhängigkeit <strong>des</strong><br />
Verteilungszustan<strong>des</strong> der beteiligten Phasen in disperse Fermentationsprozesse<br />
(homogene Fermentationsprozesse) <strong>und</strong> Oberflächen-Fermentationsprozesse<br />
(heterogene Fermentationsprozesse) unterteilen. Zu den dispersen<br />
Fermentationsprozessen gehören die Submersfermentation, die Slurry-Fermentation<br />
<strong>und</strong> die Solid-State-Fermentation. Den Oberflächen-Fermentationsprozessen ordnet<br />
man die Solid-Phase-Fermentation, gasförmig (Emersfermentation), die Solid-Phase-<br />
Fermentation, flüssig, <strong>und</strong> die Liquid-Phase-Fermentation zu (KUNZ et al. 2005).<br />
Die Submersfermentation bezeichnet alle Fermentationsprozesse, bei der<br />
Biokatalysatoren <strong>und</strong> evtl. feste Substratpartikel sich in einer Nährlösung homogen<br />
verteilt befinden (KUNZ et al. 2005).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Der Slurry-Fermentation werden alle Fermentationsprozesse zugeordnet, bei denen<br />
sich Feststoffpartikel in einer kontinuierlichen flüssigen Phase befinden <strong>und</strong> der<br />
Stofftransport überwiegend durch Diffusion erfolgt (KUNZ et al. 2005).<br />
Die Solid-State-Fermentation wird gekennzeichnet durch das Fehlen der freien<br />
(makroskopischen) Wasserphase <strong>und</strong> die Immobilisierung <strong>des</strong> Biokatalysators auf<br />
einem festen Trägermaterial (KUNZ et al. 2005).<br />
Die Solid-Phase-Fermentation, gasförmig (Emersfermentation), ist dadurch<br />
charakterisiert, dass der Biokatalysator auf einer festen Oberfläche immobilisiert <strong>und</strong><br />
von einer Gasphase umgeben ist, wobei beide Phasen als makroskopische Phasen<br />
getrennt voneinander vorliegen (KUNZ et al. 2005).<br />
Bei der Solid-Phase-Fermentation, flüssig, ist der Biokatalysator auf einem festen<br />
Substrat oder inerten Träger immobilisiert, <strong>und</strong> der Stoffaustausch mit der flüssigen<br />
Phase erfolgt diffusiv oder konvektiv (KUNZ et al. 2005).<br />
Die Liquid-Phase-Fermentation ist dadurch gekennzeichnet, dass der Biokatalysator<br />
auf einer flüssigen Oberfläche immobilisiert <strong>und</strong> von einer Gasphase umgeben ist.<br />
Beide Phasen liegen als makroskopische Phasen getrennt voneinander vor (KUNZ et<br />
al. 2005).<br />
Neben den aufgeführten Fermentationsprozessen gibt es auch solche, bei denen<br />
sich verschiedene Fermentationsprozesse überschneiden. Es können in <strong>dem</strong> Fall<br />
nicht alle Fermentationsprozesse einer Fermentationsart eindeutig zugeordnet<br />
werden (KUNZ et al. 2005).<br />
2.3.2 Lyophilisation<br />
Die Lyophilisation (auch Lyophilisieren oder Gefriertrocknung) ist in vielen<br />
Industriezweigen etabliert. Zum Einsatz kommt die Lyophilisation z. B. in der<br />
pharmazeutischen Industrie <strong>und</strong> in der Lebensmittelindustrie. Bei der Herstellung von<br />
Lebensmitteln steht vor allem die Aroma- <strong>und</strong> Geschmackserhaltung im Vordergr<strong>und</strong><br />
(HARTUNG 1993).<br />
57
58<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Die Lyophilisation stellt ein besonders schonen<strong>des</strong> Verfahren dar, um thermolabile<br />
Stoffe von Wasser zu befreien. Bei der Gefriertrocknung wird ein Feststoff produziert,<br />
in <strong>dem</strong> die molekulare Mobilität nahezu vollständig eingeschränkt ist. Es werden<br />
somit physikalische <strong>und</strong> chemische Verfahren verhindert <strong>und</strong> kinetische<br />
Umbauprozesse durch den Entzug von Wasser verlangsamt (PIKAL 1999).<br />
Durch die Gefriertrocknung entstehen hochporöse, oftmals amorphe Kuchen mit<br />
einer großen Oberfläche, die sich sehr schnell wieder auflösen. Bei der Lyophilisation<br />
nutzt man aus, dass Wasser in gefrorenem Zustand über einen Dampfdruck verfügt,<br />
der es vom festen direkt in den gasförmigen Zustand übergehen lässt (Sublimation).<br />
Die Sublimationsfähigkeit von Eis bildet die Gr<strong>und</strong>lage der Gefriertrocknung. Die<br />
Lyophilisation beinhaltet das Einfrieren einer Lösung, das Sublimieren <strong>des</strong><br />
Lösungsmittels im Vakuum <strong>und</strong> die Entfernung von non-frozen Wasser<br />
(ZIMMERMANN 1998).<br />
Der Ablauf der Lyophilisation wird in drei Abschnitte unterteilt: 1. Einfrieren,<br />
2. Primär- oder Haupttrocknung <strong>und</strong> 3. Sek<strong>und</strong>är- oder Nachtrocknung (ECKHARDT<br />
1993, RUPPRECHT 1993).<br />
Beim Einfrieren wird die Lösung in den festen Zustand überführt. Die Temperatur<br />
wird abgesenkt. Unterhalb <strong>des</strong> Gefrierpunktes kristallisiert Wasser als Eis aus <strong>und</strong><br />
die Lösung konzentriert auf (ECKHARDT 1993).<br />
Bei der Primär- oder Haupttrocknung wird ein Vakuum angelegt. Unter vermindertem<br />
Druck sublimieren die in der Einfrierphase entstandenen Eiskristalle, wobei durch<br />
beheizte Stellflächen die dazu nötige Energie bereitgestellt wird (ECKHARDT 1993).<br />
Die Sek<strong>und</strong>är- oder Nachtrocknung sorgt da<strong>für</strong>, dass das Restwasser (5 - 30 %), das<br />
physikalisch oder chemisch in Form von Hydrat-, Quellungs- oder<br />
Konstitutionswasser adsorbiert ist, entfernt <strong>und</strong> das Produkt auf die gewünschte<br />
Endfeuchte getrocknet wird. Dazu wird das Vakuum <strong>und</strong> die Stellflächentemperatur<br />
erhöht. Praktisch lässt sich der Restwassergehalt auf bis zu 0,1 % absenken, bei<br />
komplexen Materialien ist es jedoch notwendig, dass eine bestimmte Restfeuchte<br />
von ca. 2 - 5 % erhalten bleibt um die Strukturen zu stabilisieren (ECKHARDT 1993).
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Unter Umständen müssen den zu lyophilisierenden Lösungen sog. Hilfsstoffe<br />
zugesetzt werden, um eine ausreichende Konzentration <strong>und</strong> Aktivität der Stoffe im<br />
Lyophilisat zu erreichen.<br />
Eine wichtige Hilfsstoffgruppe stellen die „Bulking Agents“ dar, welche bei geringen<br />
Konzentrationen <strong>des</strong> zu lyophilisierenden Stoffes, lediglich als Füllstoffe eingesetzt<br />
werden. Diese Zusatzstoffe müssen keine Schutzfunktionen erfüllen, sollen lediglich<br />
<strong>für</strong> einen mechanisch stabilen Kuchen sorgen (JENNINGS 1997).<br />
Man unterscheidet unter den stabilisierenden Zusätzen die sog. Kryoprotektoren <strong>und</strong><br />
die sog. Lyoprotektoren. Die Kryoprotektoren wirken während der Einfrierphase, die<br />
Lyoprotektoren hingegen während der Trocknungsphase schützend (ECKHARDT<br />
1993).<br />
2.3.3 Mikroverkapselung<br />
KUNZ et al. (2003) definieren als Mikroverkapselung einen Prozess zum<br />
vollständigen oder partiellen Einschluss kleiner Feststoffpartikel, Flüssigkeitstropfen<br />
oder Gasen in Kapseln, die ihren Inhalt in kontrollierten Raten unter spezifischen<br />
Bedingungen freisetzen können. Zweck der Mikroverkapselung ist nach KUNZ et al.<br />
(2003) im Zusammenhang mit Lebensmitteln der Schutz <strong>des</strong> verkapselten Materials<br />
oder <strong>des</strong> aufnehmenden Lebensmittels vor verschiedenen schädlichen Einflüssen.<br />
2.3.3.1 Aufbau <strong>und</strong> Materialien<br />
Die Umhüllung von festen, flüssigen <strong>und</strong> gasförmigen Stoffen wird allgemein als<br />
Verkapselung bezeichnet. Der Kapselinhalt wird von einer festen Hülle umgeben<br />
(HOBEIN u. LUTZ 1989).<br />
59
60<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Je nach Partikelgröße werden die Kapseln als Makrokapseln (> 5000 µm),<br />
Mikrokapseln (0,2 - 5000 µm bzw. im engeren Sinne 0,2 - 1000 µm) oder<br />
Nanokapseln (< 0,2 µm) bezeichnet (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).<br />
Bei der Morphologie der verkapselten Teilchen sind nach RUNGE (2001)<br />
gr<strong>und</strong>sätzlich fünf verschiedene Typen zu unterscheiden (Abb. 1).<br />
Kernmaterial<br />
Kapselmaterial<br />
a) b) c) d) e)<br />
a) einfache Mikrokapsel, b) zwiebelschalenartige Mikrokapsel, c) Multi-Kern Mikrokapsel,<br />
d) Matrixteilchen, e) irregulär geformte Mikrokapsel<br />
Abbildung 1: Morphologie mikroverkapselter Teilchen nach RUNGE (2001)<br />
Nach RUNGE (2001) kommen <strong>für</strong> die Mikroverkapselung verschiedene<br />
Materialgruppen zum Einsatz. Gr<strong>und</strong>sätzlich lassen sich die Materialien einteilen in<br />
hydrophile <strong>und</strong> hydrophobe Substanzen. Zu den hydrophilen Materialien gehören<br />
Kohlenhydrate <strong>und</strong> Proteine. Die Kohlenhydrate lassen sich in unmodifizierte <strong>und</strong><br />
modifizierte Kohlenhydrate unterteilen, sowie in Gummi. Es ist zwischen pflanzlichen<br />
<strong>und</strong> tierischen Proteinen zu unterscheiden. Zu den hydrophoben Materialien gehören<br />
Wachse, Lipide <strong>und</strong> Polymere.<br />
Als Matrix- <strong>und</strong> Verkapselungsmaterialien stehen z. B. folgende Rohstoffe zur<br />
Verfügung (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).
• Zucker<br />
o Saccharose<br />
o Laktose<br />
o Sprühgetrockneter Glukosesirup<br />
• Polysaccharide<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
o Stärke (Stärke, Amylose oder Amylopektin modifiziert)<br />
o Maltodextrin mit unterschiedlichem Dextroseäquivalent (DE < 20)<br />
o Na-Alginat<br />
o Pektin (hoch- <strong>und</strong> niedrigverestert, amidiert)<br />
o Agar-Agar<br />
o Gellan<br />
• Proteine<br />
o К-Carrageenan<br />
o Zellulosederivate<br />
o Cyclodextrine<br />
o Pflanzengummi<br />
o Gelatine<br />
o Gliadin<br />
� Gummi arabicum<br />
o Milchproteine<br />
� Milchpulver (Mager-, Buttermilchpulver)<br />
� Caseinate<br />
� Molkenproteine<br />
• Poly-L-Lysinhydrochlorid<br />
• Lipide<br />
o Pflanzliche Öle, Triglyceride fraktionierter Pflanzenfettsäuren C 8<br />
o Pflanzliche Öle gehärtet, essbare Fette<br />
o Essbare Wachse<br />
o Modifizierte Lipide (Fettsäureester)<br />
o Phospholipide (insbesondere Phosphatidylcholin <strong>für</strong> Liposomen)<br />
61
62<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Je nach Verkapselungsmethode können Mikrokapseln einzeln oder als<br />
Kaspelagglomerate anfallen <strong>und</strong> als trockenes, frei fließen<strong>des</strong> Pulver oder als<br />
Kapselsuspension (= Kapselslurry) weiterverwendet werden. Verkleben die<br />
Kapselwände miteinander, so wird die Kapselmasse in Form von Briketts eingesetzt.<br />
Die Wahl der Verkapselungsmethode richtet sich, ebenso wie die <strong>Aus</strong>wahl der<br />
Materialien, nach der Verwendungsform <strong>und</strong> <strong>dem</strong> Anwendungsbereich (HOBEIN u.<br />
LUTZ 1989).<br />
Je nach Herstellungs- <strong>und</strong> Anwendungsprofil der Mikrokapseln unterscheiden sich<br />
die Kapseln in Kapselform, -aufbau, -größe, in der Zusammensetzung von<br />
Wandmaterial <strong>und</strong> Kapselinhalt sowie bezüglich der physikalischen, chemischen <strong>und</strong><br />
physikochemischen Eigenschaften der Wandmaterialien. Die <strong>Aus</strong>wahl <strong>des</strong><br />
angewendeten Verfahrens ist abhängig von den chemischen <strong>und</strong> physikalischen<br />
Eigenschaften <strong>des</strong> Kern- <strong>und</strong> Kapselmaterials, <strong>dem</strong> Freisetzungsmechanismus <strong>des</strong><br />
Inhaltes, der bevorzugten Partikelgröße, den bestehenden technischen sowie<br />
technologischen Möglichkeiten <strong>und</strong> Anforderungen (KUNZ et al. 2003).<br />
2.3.3.2 Verfahren<br />
Gr<strong>und</strong>sätzlich lassen sich die Verfahren der Mikroverkapselung einteilen in<br />
physikalische (z. B. Sprühtrocknung, Gefriertrocknung, Wirbelschicht-Coating,<br />
Extrusion <strong>und</strong> Co-Kristallisation), chemische (z. B. Grenzflächenpolymerisation,<br />
molekularer Einschluss) <strong>und</strong> physikochemische Verfahren (z. B. Koazervation,<br />
liposomaler Einschluss) (KUNZ et al. 2003).<br />
Nach THIES (2001) existieren viele verschiedene Verkapselungstechniken <strong>und</strong> auch<br />
bei der Art der Klassifizierung gibt es unterschiedliche Möglichkeiten. THIES (2001)<br />
unterteilt die Verkapselungstechniken in sog. Typ A <strong>und</strong> Typ B Prozesse. Hierbei<br />
können die Typ A Prozesse, die eigentlich chemische Prozesse darstellen, auch auf
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
physikalische Phänomene angewiesen sein, <strong>und</strong> die mechanischen Typ B Prozesse<br />
entsprechend chemische Reaktionen beinhalten.<br />
VILSTRUP (2001) unterschied zwischen der einfachen Kernverkapselung <strong>und</strong><br />
andererseits der multiplen Kernverkapselung.<br />
Im Vergleich zur begrenzten Zahl chemischer bzw. physikochemischer Methoden<br />
existieren zahlreiche physikalische Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln. Bei<br />
den physikalischen Verfahren wird das Kernmaterial (Core) mit Hilfe mechanischer<br />
Mittel entweder mit <strong>dem</strong> Kapselmaterial ummantelt (Coating) oder in eine Matrix<br />
eingebettet. Zur Verkapselung von Lebensmittelinhaltsstoffen werden hauptsächlich<br />
die Sprühtrocknung, Gefriertrocknung, Extrusion <strong>und</strong> Wirbelschichttrocknung<br />
angewendet (KUNZ et al. 2003).<br />
Das Verkapselungsverfahren der Wahl <strong>für</strong> einen schonenden, relativ einfachen<br />
kontinuierlichen Prozess in der Lebensmittelindustrie zur Verarbeitung <strong>und</strong><br />
Umhüllung hitzeempfindlicher Substanzen ist die Sprühtrocknung. Die zu<br />
verkapselnden Materialien werden in einer Flüssigkeit, die das Kapselmaterial<br />
enthält, dispergiert <strong>und</strong> über den Trocknungsprozess vom flüssigen Zustand in eine<br />
trockene, partikuläre Form überführt. Der Verkapselungseffekt ist abhängig von den<br />
molekularen <strong>und</strong> partikularen Wechselwirkungen an den sich bildenden<br />
Phasengrenzflächen. Das Verfahren ist trotz der hohen Trocknungstemperaturen<br />
auch <strong>für</strong> hitzeempfindliche Substanzen geeignet, da die Verweilzeit sehr kurz ist <strong>und</strong><br />
die Kerntemperaturen somit wenig beeinflusst werden (KUNZ et al. 2003).<br />
Bei der Gefriertrocknung wird das Kernmaterial in eine wässrige Lösung <strong>des</strong><br />
Kapselmaterials gebracht. Die konventionelle Gefriertrocknung ist dadurch<br />
gekennzeichnet, dass der Kapselmateriallösung das Wasser entzogen wird, <strong>und</strong> das<br />
Kernmaterial dadurch verkapselt. Charakteristisch ist dabei die Überführung <strong>des</strong><br />
gefrorenen Wassers unter Umgehung <strong>des</strong> flüssigen in den gasförmigen<br />
Aggregatzustand. Es findet also eine Sublimation statt (KUNZ et al. 2003).<br />
63
64<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Die sog. Extrusion zählt zu den Formgebungsverfahren <strong>und</strong> ermöglicht die<br />
Verkapselung von hoch viskösen Dispersionen bei relativ niedrigen Temperaturen.<br />
Bei der Zentrifugal-Extrusion werden das Kapsel- <strong>und</strong> Kernmaterial unter hohem<br />
Druck durch eine rotierende Doppeldüse gepresst. An der <strong>Aus</strong>trittsstelle wird das<br />
Kernmaterial mit <strong>dem</strong> noch flüssigen Kapselmaterial umhüllt. Die Zentrifugalkraft der<br />
rotierenden Düse treibt den <strong>Aus</strong>trittsstrahl nach außen <strong>und</strong> verursacht das<br />
Abbrechen in Form winziger Partikel. Aufgr<strong>und</strong> der Oberflächenspannung umhüllt<br />
das Kapselmaterial die Kernsubstanz <strong>und</strong> die Kapselbildung erfolgt (KUNZ et al.<br />
2003).<br />
Das Wirbelschicht-Coating (Fließbett-Beschichtung) schließt fluidisierende Partikel<br />
durch Besprühen mit Kapselmaterial in der Wirbelschicht ein. Die Luftströmung kann<br />
entweder im Gleich- oder Gegenstrom erfolgen <strong>und</strong> ermöglicht eine gleichmäßige<br />
Umhüllung der zu verkapselnden Partikel mit <strong>dem</strong> Wandmaterial. Es erfolgt eine<br />
Suspension der Kernmaterialien in heißer oder kalter Wirbelschicht. Durch Ventile<br />
wird das geschmolzene bzw. in einem leicht flüchtigen Lösungsmittel gelöste<br />
Wandmaterial über die Wirbelschicht in die Kammer gesprüht. Gleichzeitig werden<br />
die umhüllten Partikel durch die Wirbelschicht in Suspension gehalten, wodurch sich<br />
ein gleichmäßiger, dünner Film auf der Oberfläche ausbilden kann. Erreichen die<br />
Partikel das Ende <strong>des</strong> oberen Luftstromes, ist die äußere Umhüllung nahezu<br />
getrocknet, <strong>und</strong> die Partikel werden erneut der Wirbelschicht zugeführt. Je nach<strong>dem</strong><br />
wie oft die Partikel diesen Zyklus durchlaufen, kann die Partikelgröße bestimmt<br />
werden (KUNZ et al. 2003).<br />
Kleine Tropfen <strong>und</strong> eine niedrige Viskosität <strong>des</strong> Sprühmediums sichern einen<br />
gleichmäßigen Produktauftrag. Man unterscheidet, wie in Abbildung 2 dargestellt, je<br />
nach Technologie, das Top-Spray-Coating, das Bottom-Spray-Coating (Wurster-<br />
Coating) <strong>und</strong> das Tangential-Spray-Coating (Rotor-Pellet-Coating) (GLATT ® 2006).
a)<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
a) Top-Spray-Coating, b) Bottom-Spray-Coating, c) Tangential-Spray-Coating<br />
Abbildung 2: Prinzipien Wirbelschicht-Coating (GLATT ® 2006)<br />
b)<br />
Beim sog. Top-Spray-Coating in der Wirbelschicht (Abb. 3) werden Partikel im Strom<br />
der erwärmten Zuluft, die über eine Bodenplatte in den Produktbehälter eingetragen<br />
wird, fluidisiert. Die Coatingflüssigkeit wird über eine Düse gegen den Luftstrom<br />
(countercurrent) von oben herab in das Wirbelbett eingesprüht. Bei der weiteren<br />
Aufwärtsbewegung der Teilchen im Luftstrom erfolgt die Trocknung. Kleine Tropfen<br />
<strong>und</strong> eine niedrige Viskosität <strong>des</strong> Sprühmediums sichern eine gleichmäßige<br />
Verteilung. Dieses Verfahren eignet sich <strong>für</strong> allgemeine Überzüge bis hin zum<br />
Enteric-Coating (GLATT ® 2006).<br />
Abbildung 3: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -<br />
Fließbett Top-Spray (GLATT ® 2006)<br />
Das Bottom-Spray-Coating (Wurster-Coating) eignet sich besonders <strong>für</strong> eine<br />
gesteuerte Wirkstofffreisetzung (controlled release). Im sog. Wurster-Prozess kann<br />
ein vollständiger Verschluss der Oberfläche mit geringem Einsatz von Coating-<br />
C)<br />
65
66<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
Substanz erreicht werden. Die Sprührichtung der Coatingflüssigkeit ist mit der der<br />
Zuluft gleichgerichtet (concurrent), wobei sich die Sprühdüse in der Bodenplatte<br />
befindet. Durch den Einsatz eines Wurster-Zylinders <strong>und</strong> der Bodenplatte mit<br />
unterschiedlicher Perforation werden die zu überziehenden Teilchen im Inneren <strong>des</strong><br />
Wurster-Rohres beschleunigt <strong>und</strong> im Gleichstrom durch den Sprühkegel geleitet. Bei<br />
der weiteren Aufwärtsbewegung trocknen die Teilchen <strong>und</strong> fallen außerhalb <strong>des</strong><br />
Wusterrohres wieder in Richtung Bodenplatte zurück. Sie werden von der<br />
Außenseite wieder zur Innenseite <strong>des</strong> Rohres geleitet, wo sie erneut durch den<br />
Sprühstrahl beschleunigt werden. Es entstehen dadurch sehr homogene Filme <strong>und</strong><br />
unterschiedlich große Partikel können gleichmäßig befilmt werden (GLATT ® 2006).<br />
Beim sog. Bottom-Spray-Coating im kontinuierlichen Fließbett (Abb. 4) wird das<br />
Produkt auf der einen Seite der Verkapselungsanlage von unten kontinuierlich<br />
zugegeben <strong>und</strong> durch den Luftstrom über den Siebboden weiter transportiert. Die<br />
trockenen Teilchen werden kontinuierlich ausgetragen. Dieses Verfahren eignet sich<br />
besonders <strong>für</strong> Schutzüberzüge/Farbüberzüge bei hoher Produktdurchsatzrate<br />
(GLATT ® 2006).<br />
Abbildung 4: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -<br />
Fließbett Bottom-Spray (GLATT ® 2006)<br />
Für Überzüge mit hohem Feststoffanteil ist das Tangential-Spray-Coating (Rotor-<br />
Pellet-Coating) optimal geeignet. Dabei wird das Produkt durch eine rotierende<br />
Bodenplatte, an deren Rand die Zuluft ins Pulverbett geleitet wird, in eine helikale<br />
Bewegung gebracht. Die Sprühdüse ist tangential zur Rotorscheibe angeordnet <strong>und</strong>
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
sprüht ebenfalls gleichgerichtet (concurrent) in das Pulverbett. Durch das Rotor-<br />
Verfahren lassen sich sehr dicke Filmschichten auftragen (GLATT ® 2006).<br />
2.3.3.3 Freisetzung <strong>des</strong> Kapselinhaltes<br />
Die Freisetzung von verkapselten Substanzen wird beeinflusst durch physikalische<br />
Kräfte (z. B. mechanische Zerstörung beim Kauvorgang), chemische <strong>und</strong><br />
enzymatische Abläufe, Auflösen <strong>des</strong> Wandmaterials, Schmelzen <strong>des</strong> Wandmaterials,<br />
Erhitzen über die Siedetemperatur <strong>des</strong> Kernmaterials (Zerstörung durch Überdruck),<br />
Diffusion <strong>des</strong> Kernmaterials (bei permeablen Kapseln) <strong>und</strong> Diffusion der<br />
umgebenden Substanzen in die Kapsel (Konzentrationsgradient; Zerstörung durch<br />
Überdruck bei semipermeablen Kapseln) (HOBEIN u. LUTZ 1989). Außer<strong>dem</strong><br />
beeinflussen osmotische Verhältnisse, pH-Wert-Änderungen sowie<br />
Druckveränderungen die Freisetzung eingeschlossener Komponenten. Ebenfalls zu<br />
beachten ist, dass auch Rissbildungen an Grenzflächen (z. B. durch Trocknung) die<br />
Freisetzung der Substanzen verändern können (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).<br />
2.3.3.4 Ziele<br />
MUSCHIOLIK u. NAUMANN (2002) fassen die Effekte, die mit einer Verkapselung<br />
oder einem Matrixeinschluss verfolgt werden, wie folgt zusammen. Es sollen<br />
stoffliche Veränderungen bei den eingeschlossenen Komponenten vermieden<br />
(Schutz vor Licht, Luft, Feuchtigkeit, pH-Änderung) <strong>und</strong> so die gewünschte<br />
biologische Wirkung gesichert <strong>und</strong> die Haltbarkeit verlängert werden. Des Weiteren<br />
soll die Abnahme der Bioverfügbarkeit der Komponenten während der<br />
Lebensmittelherstellung (z. B. Oxidation oder Ligandenbildung der Mineralstoffe)<br />
vermieden werden. Weiterhin ist es das Ziel, den Stofftransport in die äußere<br />
Umgebung zu vermeiden (in Lebensmittelemulsionen z. B. aus der dispersen in die<br />
67
68<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
kontinuierliche Phase). Auch eine leichtere Handhabbarkeit in der<br />
Lebensmittelherstellung (Einbringen in eine Matrix zur besseren Dosierbarkeit oder<br />
Mischbarkeit, geringere Stauberzeugung durch Partikelvergrößerung z. B. durch<br />
Aggregation kleiner Partikel auf > 150 µm usw.) soll sichergestellt werden. Wichtig ist<br />
auch die Möglichkeit, durch die Verkapselung eine negative sensorische<br />
Veränderung <strong>des</strong> Lebensmittels durch bioaktive Zusätze zu verhindern, wie z. B.<br />
eine Maskierung <strong>des</strong> Eigengeschmacks oder -geruchs (z. B. Fischöl, Vitamine,<br />
Pflanzenextrakte) oder Vermeidung der Reaktion mit anderen<br />
Lebensmittelbestandteilen (z. B. Kaffeesäure, Tannine mit Proteinen, Peptide mit<br />
reduzierenden Zuckern, Enzymreaktionen). Speziell <strong>für</strong> probiotische Lebensmittel<br />
erscheint es von Interesse, inwieweit der Einschluss der Mikroorganismen in eine<br />
Matrix diese vor technologischen Einflüssen (z. B. Gefrierprozess) <strong>und</strong> nach <strong>dem</strong><br />
Verzehr während der Magenpassage schützt (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).<br />
KUNZ et al. (2003) konnten zeigen, dass eine gezielte Kombination von<br />
Kapselmaterialien zu einer hohen Stabilität probiotischer L. acidophilus-Kulturen<br />
führt.<br />
Nach DESMOND et al. (2002 a) überlebte der L. paracasei NFBC 338 Stamm,<br />
betrachtet über einen Lagerungszeitraum von vier Wochen bei 4 - 30 °C, in<br />
sprühgetrocknetem Pulver mit Gummi arabicum besser als ohne diesen Zusatz.<br />
DESMOND et al. (2002 b) konnten außer<strong>dem</strong> zeigen, dass an Hitze <strong>und</strong> Salz<br />
adaptierte L. paracasei NFBC 338 Stämme im Vergleich zur Kontrolle eine bessere<br />
Lebensfähigkeit nach einer Sprühtrocknung aufwiesen.<br />
L. rhamnosus in Alginat-Kapseln erwies sich in Untersuchungen von DEMBCZYNSKI<br />
<strong>und</strong> JANKOWSKI (2002) während einer 60-stündigen Fermentation als stabil <strong>und</strong><br />
wurde nicht freigesetzt. Im Vergleich zu den nicht verkapselten Proben zeigten die<br />
mit den Alginat-Kapseln höhere Konzentrationen, aber auch eine geringere<br />
Produktivität.
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
GARDINER et al. (2000) untersuchten das Überleben von zwei Lactobacillus<br />
Stämmen menschlicher Herkunft mit probiotischem Potential, L. paracasei NFBC 338<br />
<strong>und</strong> L. salivarius UCC 118, während Hitzebehandlung <strong>und</strong> Sprühtrocknung. Der<br />
L. paracasei-Stamm erwies sich als hitzestabiler <strong>und</strong> zeigte auch eine bessere<br />
Überlebensfähigkeit während der Sprühtrocknung. Während der ersten zwei Monate<br />
der Lagerung bei 4 °C blieb die Konzentration <strong>des</strong> verkapselten L. paracasei nahezu<br />
konstant. Im Gegensatz dazu nahm die Konzentration bei <strong>dem</strong> zweiten Stamm,<br />
L. salivarius, <strong>und</strong> identischen Lagerungsbedingungen um ca. eine log-Stufe ab.<br />
Während der Lagerung stand das Überleben der beiden pulverförmigen Stämme in<br />
umgekehrter Beziehung zur Lagerungstemperatur.<br />
69
70<br />
Wissenschaftliches Schrifttum<br />
2.4 Zusammenfassende <strong>Aus</strong>wertung <strong>des</strong> wissenschaftlichen<br />
Schrifttums<br />
Die zusammenfassende <strong>Aus</strong>wertung <strong>des</strong> wissenschaftlichen Schrifttums ergab, dass<br />
bisher keine Studien mit mikroverkapselten probiotischen Bakterien durchgeführt<br />
wurden, in denen diese zusammen mit Kochsalz <strong>und</strong> Gewürzen gelagert wurden <strong>und</strong><br />
hinsichtlich ihrer Stabilität bei verschiedenen Temperaturen über die Zeit überprüft<br />
wurden.<br />
Probiotika <strong>und</strong> deren Einsatz bei der Herstellung von Milcherzeugnissen sind gut<br />
erforscht, bei Fleischerzeugnissen gibt es hingegen bisher nur Versuche mit<br />
Starterkulturen. Neue Verkapselungstechnologien könnten den Einsatz in<br />
Fleischerzeugnissen ermöglichen.<br />
Es wurde bereits die Stabilität von mikroverkapselten probiotischen Bakterien<br />
untersucht, ebenso das Überleben von probiotischen Bakterien in<br />
Fleischerzeugnissen<br />
Starterkulturen.<br />
<strong>und</strong> die antimikrobielle Wirkung von Gewürzen auf<br />
In der vorliegenden Arbeit sollen verschiedene Einflüsse, u. a. die antimikrobielle<br />
Wirkung von Gewürzen, auf mikroverkapselte probiotische Bakterien in einem<br />
Lagerungsversuch untersucht werden, mit <strong>dem</strong> Ziel diese zukünftig auch in<br />
Fleischerzeugnissen einsetzen zu können.
3 Eigene Untersuchungen<br />
3.1 Material<br />
3.1.1 Verwendete Bakterien<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Bei den verwendeten Bakterienstämmen handelte es sich um Re-Isolate aus<br />
verschiedenen probiotischen Produkten.<br />
Im Einzelnen handelte es sich um folgende in Tabelle 12 aufgeführte<br />
Bakterienstämme.<br />
Tabelle 12: Verwendete Bakterienstämme<br />
Eigene<br />
Bezeichnung<br />
Genus Spezies Bezugsquelle Herkunft<br />
S 24 Lactobacillus reuteri Wien 1 Probiotisches<br />
Milcherzeugnis<br />
S 25 Lactobacillus rhamnosus Wien 1 Probiotisches<br />
Milcherzeugnis<br />
S 26 Lactobacillus paracasei Eigenisolat 2<br />
Probiotisches<br />
Milcherzeugnis<br />
S 28 Lactobacillus gasseri Eigenisolat 2 Probiotikum,<br />
Humanmedizin<br />
1<br />
Universität <strong>für</strong> Bodenkultur Wien, Department <strong>für</strong> Lebensmittelwissenschaften <strong>und</strong> -technologie,<br />
Abteilung Lebensmittelmikrobiologie <strong>und</strong> -hygiene<br />
2<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Lebensmittelqualität</strong> <strong>und</strong> -<strong>sicherheit</strong>, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover<br />
71
3.1.1.1 Lyophilisate<br />
72<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Die Lyophilisation der Stämme S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 erfolgte durch die Firma<br />
THT SA, Gembloux, Belgien. Die Zusammensetzung der Lyophilisate ist der<br />
Tabelle 13 zu entnehmen.<br />
Tabelle 13: Zusammensetzung Lyophilisate, THT SA 1<br />
Gefriergetrocknetes Ferment 10 %<br />
Maltodextrin 90 %<br />
1 THT SA, Gembloux, Belgien<br />
3.1.1.2 Mikroverkapselte Bakterien<br />
Die Mikroverkapselung der von THT SA gelieferten lyophilisierten Stämme S 24,<br />
S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 erfolgte durch die Firma Micap ® GmbH, Bremerhaven,<br />
Deutschland. Die Verkapselung erfolgte sowohl mit einem wasserlöslichen als auch<br />
mit einem wasserunlöslichen Coating.<br />
Rohstoffe <strong>für</strong> wasserlösliches Coating:<br />
• Maltodextrin<br />
• Native Maisstärke<br />
Rohstoffe <strong>für</strong> wasserunlösliches Coating:<br />
• Gehärtetes, raffiniertes Pflanzenfett auf der Basis von laurinfreien Fetten<br />
• Zuckerester<br />
• Methylcellulose<br />
Die genaue Musterübersicht der mikroverkapselten Bakterien ist in der Tabelle 14<br />
aufgeführt.
Eigene Untersuchungen<br />
Tabelle 14: Musterübersicht der mikroverkapselten Bakterien, Micap ® GmbH 1<br />
Micap ® -Muster-Nr. Micap ® -Beschreibung<br />
015.005 S 24 – 10 % Maltodextrincoating<br />
015.006 S 24 – 30 % Maltodextrincoating<br />
015.007 S 24 – 50 % Maltodextrincoating<br />
015.008 S 25 – 10 % Maltodextrincoating<br />
015.009 S 25 – 30 % Maltodextrincoating<br />
015.010 S 25 – 50 % Maltodextrincoating<br />
015.011 S 26 – 10 % Maltodextrincoating<br />
015.012 S 26 – 30 % Maltodextrincoating<br />
015.013 S 26 – 50 % Maltodextrincoating<br />
015.014 S 28 – 10 % Maltodextrincoating<br />
015.015 S 28 – 30 % Maltodextrincoating<br />
015.016 S 28 – 50 % Maltodextrincoating<br />
015.017 S 24 – 10 % Fettcoating<br />
015.018 S 24 – 30 % Fettcoating<br />
015.019 S 24 – 50 % Fettcoating<br />
015.020 S 25 – 10 % Fettcoating<br />
015.021 S 25 – 30 % Fettcoating<br />
015.022 S 25 – 50 % Fettcoating<br />
015.023 S 26 – 10 % Fettcoating<br />
015.024 S 26 – 30 % Fettcoating<br />
015.025 S 26 – 50 % Fettcoating<br />
015.026 S 28 – 10 % Fettcoating<br />
015.027 S 28 – 30 % Fettcoating<br />
015.028 S 28 – 50 % Fettcoating<br />
1 Micap ® GmbH, Bremerhaven, Deutschland<br />
S 24: L. reuteri, S 25: L. rhamnosus, S 26: L. paracasei, S 28: L. gasseri<br />
73
3.1.2 Nährmedien<br />
74<br />
Eigene Untersuchungen<br />
In der Tabelle 15 sind die verwendeten Nährmedien <strong>für</strong> die Kultivierung der<br />
Laktobazillen sowie <strong>für</strong> die Untersuchung der Gewürze aufgeführt. Weitere<br />
Informationen zu den Nährmedien <strong>und</strong> auch über die technischen Geräte <strong>und</strong><br />
Verbrauchsmaterialien sind im Anhang (Kap. 10.2 <strong>und</strong> 10.3) zu finden.<br />
Tabelle 15: Nährmedienübersicht<br />
Nährmedium Artikel-Nr.,<br />
Hersteller<br />
Agar-Nr. 1, neutral<br />
LP 11, Oxoid,<br />
(Bakteriologischer Agar) Wesel,<br />
Deutschland<br />
CASO-Agar<br />
(Caseinpepton-Sojamehlpepton-<br />
Agar)<br />
MRS-Bouillon<br />
(Lactobacillus-Bouillon nach de<br />
Man, Rogosa <strong>und</strong> Sharp)<br />
MRS-Nährboden<br />
(Lactobacillus-Agar nach de Man,<br />
Rogosa <strong>und</strong> Sharpe)<br />
105458, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
CM 359, Oxoid,<br />
Wesel,<br />
Deutschland<br />
CM 361, Oxoid,<br />
Wesel,<br />
Deutschland<br />
RAMBACH ® -Agar 107500, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
Untersuchungsparameter<br />
Milchsäurebakterien/<br />
Laktobazillen<br />
Aerobe Sporenbildner<br />
Milchsäurebakterien/<br />
Laktobazillen<br />
Milchsäurebakterien/<br />
Laktobazillen<br />
Salmonellen
Salmonella-<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Nährmedium Artikel-Nr.,<br />
Anreicherungsbouillon nach<br />
RAPPAPORT zur selektiven<br />
Anreicherung von Salmonella<br />
Standard I-Nähragar<br />
TBG-Bouillon, modifiziert<br />
(Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-<br />
Anreicherungsbouillon)<br />
TSC-Agar<br />
(Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar)<br />
VRBD-Agar<br />
(Kristallviolett-Neutralrot-Galle-<br />
Glucose-Agar nach MOSSEL)<br />
XLD-Agar<br />
YGC-Agar<br />
(Hefeextrakt-Glucose-<br />
Chloramphenicol-Agar FIL-IDF)<br />
Hersteller<br />
110236, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
107881, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
105178, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
111972, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
110275, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
105287, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
116000, Merck,<br />
Darmstadt,<br />
Deutschland<br />
Untersuchungs-<br />
parameter<br />
Salmonellen<br />
Aerobe<br />
Gesamtkeimzahl<br />
Salmonellen<br />
Mesophile<br />
sulfitreduzierende<br />
Clostridien<br />
Enterobacteriazeen<br />
Salmonellen<br />
Hefen <strong>und</strong><br />
Schimmelpilze<br />
75
76<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Für die eigenen Untersuchungen wurde ein modifizierter MRS-Nährboden<br />
eingesetzt. Für Herstellung <strong>des</strong> modifizierten MRS-Nährbodens wurden 62 g MRS-<br />
Nährboden <strong>und</strong> 5 g Agar-Nr. 1, neutral (Bakteriologischer Agar) in 1 l Aqua <strong>des</strong>t.<br />
suspendiert, bis zum vollständigen Lösen erhitzt <strong>und</strong> anschließend bei 121 °C <strong>für</strong><br />
15 Minuten autoklaviert. Im Folgenden wird dieser modifizierte MRS-Nährboden nur<br />
noch als MRS-Nährboden bezeichnet.<br />
3.1.2.1 Lösungen<br />
Die folgenden Lösungen wurden als Verdünnungslösung bzw. zur Voranreicherung<br />
verwendet.<br />
NaCl-Pepton-Lösung<br />
8,5 g Natriumchlorid (106400, Merck, Darmstadt, Deutschland) <strong>und</strong> 1 g Pepton aus<br />
Casein, „granuliert“, pankreatisch verdaut (107213, Merck, Darmstadt, Deutschland)<br />
in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen <strong>und</strong> in Reagenzgläser à 9 ml abfüllen, 15 Minuten bei 121 °C<br />
autoklavieren.<br />
Peptonwasser (gepuffert) nach ISO 6579<br />
107228, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
25,5 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 7,0 ± 0,2 bei<br />
25 °C.<br />
3.1.3 Lagerungsmaterial<br />
Als Lagerungsmaterialien wurden Gelatine <strong>und</strong> verschiedene Zusätze verwendet.
3.1.3.1 Gelatine<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Als Lagerungsmedium <strong>für</strong> die mikroverkapselten Stämme wurde GELITA ®<br />
Speisegelatine, 240 Bloom 20 mesh PS (Artikel-Nr.: 111 240 030 01,<br />
LOT-Nr.: 621 138, Produktionsdatum 29.08.2005) der GELITA ® AG, Eberbach,<br />
Deutschland, verwendet.<br />
3.1.3.2 Zusätze<br />
Als Zusätze zum Lagerungsmedium wurden einerseits Kochsalz <strong>und</strong> andererseits<br />
verschiedene Gewürze verwendet.<br />
Als Kochsalz wurde NaCl <strong>für</strong> die Bakteriologie, LP 05, Oxoid, Wesel, Deutschland<br />
verwendet.<br />
Die verschiedenen Gewürze wurden von der Hannoverschen Gewürzmühle,<br />
Hannover, Deutschland, bezogen. Eine Übersicht über die verschiedenen Gewürze<br />
gibt die Tabelle 16.<br />
77
78<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Tabelle 16: Übersicht über die verwendeten Gewürze <strong>und</strong> deren Einsatz<br />
Gewürz Verwendung<br />
Nelken, gemahlen Vorversuch, Lagerungsversuch<br />
Schwarzer Pfeffer, gemahlen Vorversuch, Lagerungsversuch<br />
Knoblauchgranulat Vorversuch<br />
Oregano, gerebelt Vorversuch<br />
Ingwer, gemahlen Vorversuch<br />
Senfkörner Vorversuch<br />
Basilikum, gerebelt Vorversuch<br />
Rosen-Paprika, gemahlen Vorversuch<br />
Paprika edelsüß, gemahlen Vorversuch<br />
Majoran, gemahlen Vorversuch<br />
Zwiebelgranulat Vorversuch<br />
Kümmel, gemahlen Vorversuch<br />
3.2 Methoden<br />
3.2.1 Isolierung, Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung der Stämme<br />
Die Kultivierung der Laktobazillen erfolgte in Anlehnung an die in der Amtlichen<br />
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB<br />
vorgeschriebene Methode (L 06.00-35).<br />
Die anaerobe Bebrütungsatmosphäre wurde entweder im Anaerobiertopf mit<br />
AnaeroGen (Oxoid) oder im CO2-Brutschrank (Binder) erzeugt. Die Atmosphäre im<br />
Brutschrank wurde analog zu der Atmosphäre im Anaerobiertopf mit AnaeroGen TM<br />
(Oxoid) auf 0,9 % O2, 10 % CO2 <strong>und</strong> 89,1 % N2 eingestellt. Die<br />
Bebrütungstemperatur betrug 37 °C ± 0,5 °C.
Eigene Untersuchungen<br />
3.2.1.1 L. reuteri (S 24) <strong>und</strong> L. rhamnosus (S 25)<br />
Bei S 24, Lactobacillus reuteri, <strong>und</strong> S 25, Lactobacillus rhamnosus, handelte es sich<br />
um Produkt-Re-Isolate, isoliert aus probiotischen Milcherzeugnissen durch die<br />
Universität <strong>für</strong> Bodenkultur Wien, Department <strong>für</strong> Lebensmittelwissenschaften <strong>und</strong><br />
-technologie, Abteilung Lebensmittelmikrobiologie <strong>und</strong> -hygiene, geliefert als<br />
Kryokulturen.<br />
Jeweils 200 µl verflüssigte Kryokultur wurden in 10 ml MRS-Bouillon (BI) überführt.<br />
Die Bebrütung erfolgte im Anaerobiertopf <strong>für</strong> 24 h ± 2 h. Nach 24 h ± 2 h erfolgte eine<br />
Überimpfung von 200 µl aus BI in 10 ml neue MRS-Bouillon (BII) <strong>und</strong> eine weitere<br />
Bebrütung <strong>für</strong> 24 h ± 2 h. Nach 24 h ± 2 h wurden fraktionierte <strong>Aus</strong>striche auf MRS-<br />
Agarplatten (AI) im Doppelansatz durchgeführt <strong>und</strong> diese <strong>für</strong> 48 h ± 2 h bebrütet.<br />
Nach 48 h ± 2 h wurden die Ansätze makroskopisch <strong>und</strong> nach Gramfärbung auch<br />
mikroskopisch kontrolliert <strong>und</strong> jeweils eine Kolonie in neue MRS-Bouillon (BIII)<br />
überimpft. Diese Bouillon (BIII) wurde 24 h ± 2 h bebrütet. Nach 24 h ± 2 h wurde die<br />
Bouillon im Doppelansatz auf MRS-Agarplatten (AII) fraktioniert ausgestrichen <strong>und</strong><br />
<strong>für</strong> 48 h ± 2 h bebrütet. Nach 48 h ± 2 h wurden die Ansätze makroskopisch <strong>und</strong><br />
mikroskopisch kontrolliert. Die Stämme S 24 <strong>und</strong> S 25 wurden anschließend als<br />
Reinkulturen in das Microbank-System nach Anweisung <strong>des</strong> Herstellers überführt.<br />
Der Schraubverschluss <strong>des</strong> Microbank-Röhrchens wurde unter sterilen<br />
Bedingungen geöffnet. Der im Röhrchen enthaltene Kryopuffer wurde mit Kolonien<br />
aus der Reinkultur inokuliert. Das Inokulum sollte nach Microbank einem<br />
McFarland Standard von 3 - 4 entsprechen. Anschließend wurde das Kryoröhrchen<br />
fest verschlossen <strong>und</strong> 4- bis 5-mal durch Umdrehen gemischt. Durch den<br />
Mischvorgang wurden die Organismen an die porösen Perlen geb<strong>und</strong>en. Der<br />
überschüssige Kryopuffer wurde anschließend weitgehend abpipettiert, so dass die<br />
Perlen weitgehend frei von Flüssigkeit waren. Anschließend wurde das Röhrchen<br />
fest verschlossen <strong>und</strong> bei -80 °C ± 0,5 °C gelagert. Es wurden jeweils zwei solcher<br />
Microbank-Röhrchen angefertigt.<br />
79
80<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Die nachfolgende Abbildung 5 gibt eine schematische Übersicht über die Isolierung<br />
<strong>und</strong> Kultivierung von Lactobacillus reuteri (S 24) <strong>und</strong> Lactobacillus rhamnosus (S 25).<br />
Abbildung 5: L. reuteri (S 24) <strong>und</strong> L. rhamnosus (S 25): Isolierung,<br />
3.2.1.2 L. paracasei (S 26)<br />
200 µl Kryokultur S 24 bzw. S 25<br />
MRS-Bouillon (BI)<br />
MRS-Bouillon (BII)<br />
MRS-Agarplatte (AI)<br />
MRS-Bouillon (BIII)<br />
MRS-Agarplatte (AII)<br />
Microbank<br />
Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung der Stämme<br />
S 26, Lactobacillus paracasei, wurde aus einem probiotischen Milcherzeugnis<br />
isoliert. Dabei handelte es sich um ein fermentiertes Getränk aus Magermilch mit<br />
<strong>dem</strong> Stamm Lactobacillus casei Shirota <strong>und</strong> laut Herstellerangaben folgenden
Eigene Untersuchungen<br />
Zutaten: Wasser, Magermilch, Glukosesirup, Zucker, Aroma, Lactobacillus casei<br />
Shirota.<br />
Für die Isolierung <strong>des</strong> Stammes S 26, Lactobacillus paracasei, wurde eine dezimale<br />
Verdünnungsreihe angelegt. Dazu wurden 90 ml NaCl-Pepton-Lösung mit 10 ml <strong>des</strong><br />
probiotischen Milcherzeugnisses versetzt <strong>und</strong> homogenisiert. 1 ml aus diesem<br />
Ansatz entsprach einer Verdünnung von 10 -1 . 0,1 ml aus diesem Ansatz entsprachen<br />
einer Verdünnung von 10 -2 . Für die Herstellung der nächsthöheren<br />
Verdünnungsstufe wurde jeweils 1 ml der niedrigeren Verdünnungsstufe mit 9 ml<br />
NaCl-Pepton-Lösung versetzt <strong>und</strong> homogenisiert, usw. Es erfolgte eine Verdünnung<br />
bis 10 -7 . Jeweils 0,1 ml der sechs Verdünnungsstufen 10 -2 bis 10 -7 wurden im<br />
Doppelansatz auf eine MRS-Agarplatte (AI) pipettiert <strong>und</strong> ausgespatelt. Die<br />
Bebrütung erfolgte im Anaerobiertopf <strong>für</strong> 48 h ± 2 h. Nach 48 h ± 2 h wurden die<br />
Agarplatten makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch hinsichtlich <strong>des</strong> Wachstums<br />
kontrolliert. Jeweils eine Kolonie wurde in 10 ml MRS-Bouillon (BI) überimpft <strong>und</strong> <strong>für</strong><br />
24 h ± 2 h bebrütet. Nach 24 h ± 2 h wurden fraktionierte <strong>Aus</strong>striche im Doppelansatz<br />
auf MRS-Agarplatten (AII) angefertigt <strong>und</strong> <strong>für</strong> 48 h ± 2 h bebrütet. Eine Kontrolle <strong>des</strong><br />
Wachstums erfolgte nach 48 h ± 2 h makroskopisch sowie mikroskopisch. Die<br />
Reinkultur <strong>des</strong> Stammes wurde in das Microbank-System, wie oben <strong>für</strong> S 24 <strong>und</strong><br />
S 25 beschrieben, überführt. Es wurden jeweils zwei Microbank-Röhrchen<br />
angefertigt <strong>und</strong> diese dann bei -80 °C ± 0,5 °C gelagert.<br />
Die Abbildung 6 zeigt schematisch die Isolierung <strong>und</strong> Kultivierung von Lactobacillus<br />
paracasei (S 26).<br />
81
82<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Abbildung 6: L. paracasei (S 26): Isolierung, Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung<br />
3.2.1.3 L. gasseri (S 28)<br />
<strong>des</strong> Stammes<br />
Probiotisches Milcherzeugnis<br />
Verdünnungsreihe<br />
MRS-Agarplatte (AI)<br />
MRS-Bouillon (BI)<br />
MRS-Agarplatte (AII)<br />
Microbank<br />
S 28, Lactobacillus gasseri, wurde aus einem humanmedizinischen Probiotikum<br />
isoliert. Dabei handelte es sich um ein traditionelles Arzneimittel <strong>und</strong><br />
darmspezifisches Probiotikum aus lebensfähigen Milchsäurebakterien. Folgende<br />
arzneilich wirksame Bestandteile waren laut Beipackzettel pro Hartkapsel enthalten:<br />
25 mg Lyophilisat aus Lactobacillus gasseri entsprechend 8 x 10 9 KbE/g mit Rest-<br />
Kulturmedium, sowie 25 mg Lyophilisat aus Bifidobacterium longum entsprechend<br />
8 x 10 9 KbE/g mit Rest-Kulturmedium. Die sonstigen Bestandteile waren Gelatine,<br />
Laktose, gefälltes Siliciumdioxid, Natriumdodecylsulfat. <strong>Aus</strong>gangsstoffe der Rest-
Eigene Untersuchungen<br />
Kulturmedien sind: H-Vollmilch, Pepton, Natriumhydroxid, Natriumcarbonat,<br />
Calciumcarbonat, Ascorbinsäure, Lactose-Monohydrat, Sucrose (Saccharose) <strong>und</strong><br />
Gelatine.<br />
Für die Isolierung <strong>des</strong> Stammes wurde der Inhalt einer Hartkapsel in 10 ml MRS-<br />
Bouillon (BI) überführt <strong>und</strong> homogenisiert. Die Inkubation erfolgte im Anaerobiertopf<br />
<strong>für</strong> 24 h. Nach 24 h ± 2 h wurden 200 µl aus BI in eine neue MRS-Bouillon (BII)<br />
überführt <strong>und</strong> <strong>für</strong> 24 h ± 2 h bebrütet. Nach 24 h ± 2 h wurden fraktionierte <strong>Aus</strong>striche<br />
auf MRS-Agarplatten (AI) im Doppelansatz durchgeführt <strong>und</strong> dann 48 h ± 2 h<br />
inkubiert. Nach 48 h ± 2 h wurde das Wachstum makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch<br />
kontrolliert <strong>und</strong> jeweils eine Kolonie in neue MRS-Bouillon (BIII) überimpft.<br />
Anschließend wurde erneut <strong>für</strong> 24 h ± 2 h inkubiert. Nach 24 h ± 2 h erfolgte<br />
fraktioniertes <strong>Aus</strong>streichen im Doppelansatz auf MRS-Agarplatten mit nachfolgender<br />
Inkubation der Platten <strong>für</strong> 48 h ± 2 h. Nach Ablauf der Inkubationszeit von 48 h ± 2 h<br />
wurde das Wachstum makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch kontrolliert <strong>und</strong><br />
anschließend der Stamm in das Microbank-System, wie oben <strong>für</strong> S 24 <strong>und</strong> S 25<br />
beschrieben überführt. Es wurden zwei Microbank-Röhrchen der Reinkultur<br />
angefertigt <strong>und</strong> diese bei -80 °C ± 0,5 °C gelagert.<br />
Schematisch dargestellt ist die Isolierung <strong>und</strong> Kultivierung von Lactobacillus gasseri<br />
(S 28) in der Abbildung 7.<br />
83
84<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Abbildung 7: L. gasseri (S 28): Isolierung, Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung <strong>des</strong><br />
3.2.2 Vorversuche<br />
Humanmedizinisches Probiotikum<br />
Stammes<br />
MRS-Bouillon (BI)<br />
MRS-Bouillon (BII)<br />
MRS-Agarplatte (AI)<br />
MRS-Bouillon (BIII)<br />
MRS-Agarplatte (AII)<br />
Microbank<br />
Im Rahmen der Vorversuche wurden die Bedingungen <strong>für</strong> den Lagerungsversuch<br />
ermittelt. Untersucht wurde der Einfluss von zwölf verschiedenen Gewürzen sowie<br />
von Kochsalz in drei verschiedenen Konzentrationen auf das Wachstum der vier<br />
Bakterienstämme. Die Vorversuche wurden in zwei Untersuchungsgängen<br />
durchgeführt: Gewürze 1 - 6 <strong>und</strong> Kochsalzkonzentrationen 1 %, 2 % <strong>und</strong> 5 %, sowie<br />
Gewürze 7 - 12.
3.2.2.1 Einfluss Gewürze<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Der Einfluss der unter 3.1.3.2 genannten Gewürze (Tab. 16), Nelken (gemahlen),<br />
Schwarzer Pfeffer (gemahlen), Knoblauchgranulat, Oregano (gerebelt), Ingwer<br />
(gemahlen), Senfkörner, Basilikum (gerebelt), Rosen-Paprika (gemahlen), Paprika<br />
edelsüß (gemahlen), Majoran (gemahlen), Zwiebelgranulat <strong>und</strong> Kümmel (gemahlen),<br />
auf die vier Bakterienstämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei<br />
(S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) wurde im ersten Teil der Vorversuche untersucht.<br />
Zunächst wurden die im Microbank-System konservierten Stämme wieder<br />
angezüchtet. Dazu wurde jeweils eine poröse Perle aus <strong>dem</strong> Microbank-Röhrchen<br />
der Stämme S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 in jeweils 10 ml MRS-Bouillon (BI) gegeben<br />
<strong>und</strong> <strong>für</strong> 24 h ± 2 h St<strong>und</strong>en bei 37 °C ± 0,5 °C im Anaerobiertopf inkubiert. Nach<br />
24 h ± 2 h erfolgte eine Überimpfung von jeweils 10 µl aus BI in jeweils 10 ml neue<br />
MRS-Bouillon (BII) <strong>und</strong> anschließend wurde <strong>für</strong> 24 h ± 2 h inkubiert. Nach 24 h ± 2 h<br />
wurden fraktionierte <strong>Aus</strong>striche auf MRS-Agarplatten angefertigt <strong>und</strong> die Platten <strong>für</strong><br />
48 h ± 2 h bebrütet. Nach der genannten Inkubationszeit wurde jeweils eine Kolonie<br />
in 10 ml neue MRS-Bouillon, die sogenannte Arbeitsbouillon (B1), überimpft <strong>und</strong><br />
24 h ± 2 h inkubiert.<br />
Von dieser Arbeitsbouillon B1 wurde die Keimzahl in 200 µl nach einer Inkubation<br />
von 24 h ± 2 h bestimmt. Dazu wurde eine dezimale Verdünnungsreihe angelegt. Für<br />
die Verdünnungsstufe 10 -1 wurde 1 ml aus B1 zu 9 ml NaCl-Pepton-Lösung gegeben<br />
<strong>und</strong> homogenisiert. 1 ml aus dieser 10 -1 -Verdünnung wurde zu 9 ml NaCl-Pepton-<br />
Lösung gegeben <strong>und</strong> homogenisiert, um die Verdünnungsstufe 10 -2 zu erreichen. Auf<br />
diese Weise wurde fortgefahren bis zu einer Verdünnungsstufe von 10 -8 . Untersucht<br />
wurde jeweils im Doppelansatz mittels Spatelverfahren (100 µl pro Platte), sowie<br />
mittels Tropfplattenverfahren (50 µl pro Sektor, vier Sektoren pro Platte) auf MRS-<br />
Agarplatten (AI). Die Inkubation erfolgte <strong>für</strong> 48 h ± 2 h bei 37 °C ± 0,5 °C im CO2-<br />
Brutschrank. Nach der Inkubation erfolgte eine makroskopische sowie<br />
mikroskopische Kontrolle der Kolonien.<br />
85
86<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Bei der <strong>Aus</strong>wertung <strong>des</strong> Spatelverfahrens wurden die zwei Verdünnungsstufen<br />
berücksichtigt, bei denen auf den Platten 1 bis 150 gut abgesetzte Kolonien (ggf.<br />
auch mehr, wenn gut auswertbar) auszählbar waren. Dabei sollte die niedrigere<br />
Verdünnungsstufe min<strong>des</strong>tens 15 Kolonien aufweisen.<br />
Bei der <strong>Aus</strong>wertung <strong>des</strong> Tropfplattenverfahrens wurden die Verdünnungsstufen<br />
berücksichtigt, bei denen innerhalb der Sektoren auf den Platten zwischen 1 <strong>und</strong> 50<br />
klar voneinander abgesetzte Kolonien (ggf. auch mehr, wenn gut auswertbar)<br />
auszählbar waren. Die niedrigere Verdünnungsstufe sollte min<strong>des</strong>tens 5 Kolonien<br />
aufweisen.<br />
<strong>Aus</strong> den Koloniezahlen der niedrigsten <strong>und</strong> der nächsthöheren auswertbaren<br />
Verdünnungsstufe wurde der gewichtete Mittelwert mit der nachfolgenden Formel<br />
berechnet.<br />
∑ c<br />
c =<br />
n ⋅1+<br />
n ⋅0,<br />
1<br />
1<br />
2<br />
c gewichteter Mittelwert der Koloniezahlen<br />
∑c Summe der Koloniezahlen aller Platten beider Verdünnungsstufen, die<br />
zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste <strong>und</strong> nächsthöhere<br />
auswertbare Verdünnungsstufe)<br />
n 1 Anzahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe<br />
n 2 Anzahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe<br />
Anschließend wurde c mit 10 multipliziert, um die Verdünnung von 1 : 10<br />
(100 µl/Platte) beim Spatelverfahren bzw. mit 20 multipliziert, um die Verdünnung<br />
von 1 : 20 (50 µl/Sektor) beim Topfplattenverfahren zu berücksichtigen. Das Ergebnis
Eigene Untersuchungen<br />
wurde mit <strong>dem</strong> Kehrwert der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe<br />
(Verdünnungsfaktor) multipliziert, um die Keimzahl pro ml zu errechnen. Das<br />
Ergebnis wurde als Zahl zwischen 1,0 <strong>und</strong> 9,9 multipliziert mit der entsprechenden<br />
Zehnerpotenz angegeben.<br />
Die Ergebnisse aus Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren wurden hinsichtlich ihrer<br />
Vergleichbarkeit überprüft.<br />
Im Folgenden wurden jeweils 10 ml MRS-Bouillon (B2) mit Zusatz von 1 g ± 0,1 g<br />
(entspricht 10 % Gewürzzusatz) der oben genannten Gewürze (GX), sowie als<br />
Kontrolle auch 10 ml MRS-Bouillon (B2) ohne Zusätze mit 200 µl aus B1 beimpft.<br />
Parallel dazu wurden als Negativkontrollen jeweils 10 ml MRS-Bouillon (B0) nur mit<br />
Zusatz von 1 g ± 0,1 g der genannten Gewürze angesetzt. Inkubiert wurde anaerob<br />
<strong>für</strong> 24 h ± 2 h. Nach 24 h ± 2 h wurde von je<strong>dem</strong> Ansatz eine mikroskopische<br />
Kontrolle durchgeführt <strong>und</strong> eine dezimale Verdünnungsreihe bis 10 -8 wie oben<br />
beschrieben angelegt. Es folgte eine Untersuchung im Doppelansatz mittels<br />
Tropfplattenverfahren wie oben beschrieben. Die anaerobe Inkubation erfolgte <strong>für</strong><br />
48 h ± 2 h. Nach 48 h ± 2 h erfolgte makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch die<br />
<strong>Aus</strong>wertung der Platten <strong>und</strong> Berechnung <strong>des</strong> gewichteten Mittelwertes <strong>und</strong> der<br />
Keimzahl pro ml wie oben beschrieben.<br />
Nun erfolgte ein Vergleich der Keimzahlen von B2 mit Zusätzen mit den Keimzahlen<br />
von B2 ohne Zusätze, um eine Beeinflussung der gestesteten Gewürze auf das<br />
Bakterienwachstum ausmachen zu können. Die B0 wurden ebenfalls hinsichtlich<br />
eines Wachstums untersucht, um festzustellen, ob ggf. in den Gewürzen vorhandene<br />
Keime unter den genannten Bedingungen wachsen bzw. die Testkeime beeinflussen.<br />
3.2.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration<br />
Im zweiten Teil der Vorversuche wurde analog zum ersten Teil, in <strong>dem</strong> die<br />
verschiedenen Gewürze getestet wurden, der Einfluss von Kochsalz in drei<br />
87
88<br />
Eigene Untersuchungen<br />
unterschiedlichen Konzentrationen auf die Bakterienstämme S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong><br />
S 28 untersucht.<br />
Das Anlegen der Arbeitsbouillon (B1) erfolgte wie beim Testen der verschiedenen<br />
Gewürze (siehe Kap. 3.2.2.1).<br />
Für diesen Teil der Vorversuche wurden als B2 drei verschiedene MRS-Bouillons<br />
zubereitet. Die MRS-Bouillon wurde nach Rezept gekocht, jedoch mit Zusatz von<br />
1 %, 2 % bzw. 5 % NaCl. Die MRS-Bouillon wurde dann nach Zusatz der jeweiligen<br />
Kochsalzmenge <strong>und</strong> Homogenisierung à 10 ml in Reagenzgläser abgefüllt <strong>und</strong><br />
anschließend autoklaviert.<br />
Die Beimpfung der B2 bzw. B2SX <strong>und</strong> die anschließende <strong>Aus</strong>wertung erfolgten<br />
wiederum wie bei der Untersuchung der Gewürze.<br />
Der folgenden Abbildung (Abb. 8) kann der Versuchsaufbau der Vorversuche<br />
schematisch entnommen werden.
B2<br />
B2G1<br />
B2G2<br />
B2G3<br />
B2G4<br />
B2G5<br />
B2G6<br />
B2G7<br />
B2G8<br />
B2G9<br />
B2G10<br />
B2G11<br />
B2G12<br />
Eigene Untersuchungen<br />
MRS-Bouillon (BI)<br />
MRS-Bouillon (BII)<br />
MRS-Agarplatte (AI)<br />
MRS-Bouillon = Arbeitsbouillon (B1)<br />
B0<br />
B0G1<br />
B0G2<br />
B0G3<br />
B0G4<br />
B0G5<br />
B0G6<br />
B0G7<br />
B0G8<br />
B0G9<br />
B0G10<br />
B0G11<br />
B0G12<br />
MRS-Agarplatte (AII)<br />
B2 = MRS-Bouillon = Kontrolle, B0 = MRS-Bouillon = Negativkontrolle, B2(B0)GX = MRS-Bouillon<br />
B2 (B0) mit Zusatz von Gewürz GX, G1 = Senfkörner, G2 = Paprika edelsüß, G3 = Nelken<br />
(gemahlen), G4 = Schwarzer Pfeffer (gemahlen), G5 = Knoblauchgranulat, G6 = Ingwer (gemahlen),<br />
G7 = Rosenpaprika; G8 = Majoran (gemahlen), G9 = Kümmel (gemahlen); G10 = Zwiebelgranulat,<br />
G11 = Basilikum (gerebelt), G12 = Oregano (gerebelt), B2(B0)SX = MRS-Bouillon B2 (B0) mit Zusatz<br />
von NaCl SX, S1 = 1 % NaCl-Zusatz, S2 = 2 % NaCl-Zusatz , S5 = 5 % NaCl-Zusatz<br />
Abbildung 8: Versuchsaufbau Vorversuche<br />
B2<br />
B2S1<br />
B2S2<br />
B2S5<br />
B0<br />
B0S1<br />
B0S2<br />
B0S5<br />
89
3.2.3 Lyophilisation<br />
90<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Die Stämme S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 wurden der Firma THT SA, Gembloux,<br />
Belgien jeweils in einem Microbank-Röhrchen zur Lyophilisation geliefert. Die<br />
Firma THT produzierte von S 24 2,5 kg, von S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 jeweils 4,0 kg<br />
Lyophilisat (Zusammensetzung siehe Kap. 3.1.1.1, Tab. 13). Als Produktionsdatum<br />
wurde der 20.01.2006 angegeben. Die Lyophilisate waren feine, weiße Pulver <strong>und</strong><br />
wurden durch THT SA mikrobiologisch analysiert, um deren Konformitätskriterien zu<br />
überprüfen. Im Einzelnen wurden die in Tabelle 17 aufgeführten Parameter<br />
analysiert.<br />
Tabelle 17: Analysedaten der lyophilisierten Stämme, THT SA 1<br />
Parameter Methode Norm<br />
S 24, S 25, S 26 bzw. S 28 MRS-Agar, 37 °C/72 h min. 10 10 KbE/g<br />
Coliforme Keime Petrifilm, 37 °C/24 h negativ in 1 g<br />
Enterobacteriaceae Petrifilm 3 M, 37 °C/24 h < 10 1 KbE/g<br />
Hefen <strong>und</strong> Schimmelpilze Petrifilm 3 M, 30 °C/48 h < 10 1 KbE/g<br />
1 THT SA, Gembloux, Belgien<br />
3.2.4 Mikroverkapselung<br />
Die Mikroverkapselung der von THT SA gelieferten lyophilisierten Stämme erfolgte<br />
durch die Firma Micap ® GmbH, Bremerhaven, Deutschland.<br />
Die Mikroverkapselung wurde mittels der diskontinuierlichen Wirbelschichtanlage<br />
GPCG/1.1 (Glatt ® ) durchgeführt (Abb. 9).
Eigene Untersuchungen<br />
Abbildung 9: Darstellung einer Wirbelschichtanlage GPCG (GLATT ® )<br />
Beim Coating in der Wirbelschicht wurde das Lyophilisat in einem temperierten<br />
Luftstrom fluidisiert <strong>und</strong> in eine Wirbelschicht überführt. Die Temperatur der<br />
Prozessluft betrug 55 - 60 °C. Die Produkttemperatur während <strong>des</strong> gesamten<br />
Prozesses lag bei 34 - 37 °C. Die Coatingflüssigkeit (Zusammensetzung <strong>des</strong><br />
wasserlöslichen <strong>und</strong> <strong>des</strong> wasserunlöslichen Coatings siehe Kap. 3.1.1.2, Tab. 14)<br />
wurde über eine Sprühdüse mit einer Sprührate von ca. 11 g/Min. gegen den<br />
aufströmenden Luftstrom von oben herab auf die Lyophilisate im Wirbelbett<br />
eingesprüht, hierbei wurde ein Sprühdruck von ca. 2 bar erreicht (Abb. 10). Durch die<br />
zugeführte Prozessluft verdunstete die Flüssigkeit <strong>und</strong> trocknete die Filmschicht auf<br />
den Partikeln. Die entstandene Filmschicht umhüllte die Lyophilisate <strong>und</strong> bildete den<br />
erwünschten Verkapselungs- bzw. Coatingeffekt. Die Sprühflüssigkeit wurde bis zu<br />
der gewünschten Konzentration an Kapselmaterial auf das Lyophilisat gesprüht.<br />
Danach konnte die Probennahme erfolgen.<br />
91
92<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Abbildung 10: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -<br />
Fließbett Top-Spray (GLATT ® )<br />
Jeder der Stämme S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 wurde wasserlöslich mit einem<br />
Maltodextrincoating <strong>und</strong> wasserunlöslich mit einem Fettcoating verkapselt. Bei je<strong>dem</strong><br />
der beiden Coatingverfahren wurden drei unterschiedliche Formulierungen erstellt:<br />
10 %, 30 % bzw. 50 % Kapselanteil. Die genaue Beschreibung der Muster ist in<br />
Kapitel 3.1.1.2 (Tab. 14) aufgeführt. Die jeweils erstellten Muster wurden in PE-<br />
Flachbeuteln verpackt <strong>und</strong> bei 7 - 10 °C gelagert.<br />
3.2.5 Einlagerung der Proben <strong>und</strong> Lagerungsbedingungen<br />
Für die Lagerung der mikroverkapselten Stämme S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 bei zwei<br />
verschiedenen Temperaturen <strong>und</strong> unter <strong>dem</strong> Einfluss von Kochsalz <strong>und</strong> Gewürzen<br />
wurden Probenröhrchen vorbereitet.<br />
3.2.5.1 Befüllung der Probenröhrchen <strong>und</strong> Lagerungsbedingungen<br />
Die Lyophilisate der vier Stämme wurden in den Lagerungsversuch mit einbezogen.<br />
Dazu wurden 1 g ± 0,1 g der Lyophilisate in autoklavierte Röhrchen steril<br />
eingewogen.
Eigene Untersuchungen<br />
GELITA ® Speisegelatine, 240 Bloom 20 mesh PS wurde in einer Verdünnung 100 g<br />
pro 900 ml Aqua. <strong>des</strong>t. angesetzt <strong>und</strong> gelöst. Je 10 ml wurden in die<br />
Lagerungsröhrchen abgefüllt <strong>und</strong> bei 121 °C ± 0,5 °C <strong>für</strong> 15 Minuten autoklaviert<br />
(Lagerungsmedium Nr. 1).<br />
Nach <strong>Aus</strong>wertung der Vorversuche (siehe Kap. 3.2.2) wurden <strong>für</strong> den<br />
Lagerungsversuch als Zusätze 5 % NaCl, 10 % Nelken bzw. 10 % Schwarzer Pfeffer<br />
ausgewählt.<br />
Da<strong>für</strong> wurde einem Ansatz der Gelatineverdünnung 5 % Kochsalz zugesetzt <strong>und</strong><br />
homogenisiert. Anschließend wurde die Lösung ebenfalls zu 10 ml in die<br />
Lagerungsröhrchen abgefüllt <strong>und</strong> bei 121 °C ± 0,5 °C <strong>für</strong> 15 Minuten autoklaviert<br />
(Lagerungsmedium Nr. 2).<br />
In einem weiteren Ansatz wurden zu jeweils 10 ml der autoklavierten Gelatinelösung<br />
1,00 g ± 0,1 g Nelken (gemahlen) steril in je<strong>des</strong> Lagerungsröhrchen eingewogen <strong>und</strong><br />
mit der Gelatine homogenisiert (Lagerungsmedium Nr. 3).<br />
Als Lagerungsmedium Nr. 4 wurde zu 10 ml Gelatineverdünnung 1,00 g ± 0,1 g<br />
Schwarzer Pfeffer (gemahlen) unter sterilen Bedingungen eingewogen.<br />
Damit ergaben sich vier Arten von Lagerungsmedien: 1. Gelatineverdünnung ohne<br />
Zusätze, 2. Gelatineverdünnung mit 5 % Kochsalz, 3. Gelatineverdünnung mit 10 %<br />
Nelken (gemahlen) <strong>und</strong> 4. Gelatineverdünnung mit 10 % Schwarzem Pfeffer<br />
(gemahlen).<br />
Jede der 24 verschiedenen von der Micap ® GmbH gelieferten Proben (siehe<br />
Kap. 3.1.1.2, Tab. 14, Muster-Nr. 015.005 bis 015.028) wurde steril à 1,00 g ± 0,1 g<br />
in die vier verschiedenen Lagerungsmedien eingewogen <strong>und</strong> dann mit <strong>dem</strong> Medium<br />
homogenisiert. Hierzu wurde die Gelatinelösung im Wasserbad bei 30 °C ± 0,5 °C<br />
gelöst. Es wurden jeweils mehrere Röhrchen hergestellt.<br />
Die Probenröhrchen wurden bei zwei Temperaturen gelagert: gekühlt bei<br />
2 °C ± 0,5 °C (Proben-Nr. 1 - 100), sowie bei einer Raumtemperatur von<br />
20 °C ± 0,5 °C (Proben-Nr. 101 - 200). Hieraus ergab sich der nachfolgend unter<br />
3.2.5.2 aufgeführte Probenschlüssel (Tab. 18).<br />
93
3.2.5.2 Probenschlüssel<br />
94<br />
Eigene Untersuchungen<br />
In der folgenden Tabelle 18 ist der Probenschlüssel mit den Probenbezeichnungen<br />
<strong>für</strong> den Lagerungsversuch aufgeführt.<br />
Tabelle 18: Probenschlüssel<br />
Proben-<br />
Nr.<br />
Micap-<br />
Muster-<br />
Nr.<br />
Micap-<br />
Beschreibung<br />
Lagerungs-<br />
art<br />
Lagerungs-<br />
temperatur<br />
1 101 015.005 S 24 -10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
2 102 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
3 103 + 10 % Nelken<br />
4 104<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
5 105 015.006 S 24 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
6 106 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
7 107 + 10 % Nelken<br />
8 108<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
9 109 015.007 S 24 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
10 110 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
11 111 + 10 % Nelken<br />
12 112<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
13 113 015.008 S 25 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
14 114 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
15 115 + 10 % Nelken<br />
16 116<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
17 117 015.009 S 25 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
18 118 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
19 119 + 10 % Nelken<br />
20 120<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
21 121 015.010 S 25 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
22 122 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
23 123 + 10 % Nelken<br />
24 124<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
25 125 015.011 S 26 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
26 126 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
27 127 + 10 % Nelken<br />
28 128<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
29 129 015.012 S 26 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
30 130 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
31 131 + 10 % Nelken<br />
32 132<br />
+ 10 % Pfeffer
Proben-<br />
Nr.<br />
Micap-<br />
Muster-<br />
Nr.<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Micap-<br />
Beschreibung<br />
Lagerungs-<br />
art<br />
Lagerungs-<br />
temperatur<br />
33 133 015.013 S 26 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
34 134 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
35 135 + 10 % Nelken<br />
36 136<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
37 137 015.014 S 28 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
38 138 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
39 139 + 10 % Nelken<br />
40 140<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
41 141 015.015 S 28 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
42 142 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
43 143 + 10 % Nelken<br />
44 144<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
45 145 015.016 S 28 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
46 146 Maltodextrincoating + 5 % NaCl<br />
47 147 + 10 % Nelken<br />
48 148<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
49 149 015.017 S 24 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
50 150 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
51 151 + 10 % Nelken<br />
52 152<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
53 153 015.018 S 24 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
54 154 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
55 155 + 10 % Nelken<br />
56 156<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
57 157 015.019 S 24 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
58 158 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
59 159 + 10 % Nelken<br />
60 160<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
61 161 015.020 S 25 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
62 162 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
63 163 + 10 % Nelken<br />
64 164<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
65 165 015.021 S 25 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
66 166 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
67 167 + 10 % Nelken<br />
68 168<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
69 169 015.022 S 25 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
70 170 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
71 171 + 10 % Nelken<br />
72 172<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
95
96<br />
Proben-<br />
Nr.<br />
Micap-<br />
Muster-<br />
Nr.<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Micap-<br />
Beschreibung<br />
Lagerungs-<br />
art<br />
Lagerungs-<br />
temperatur<br />
73 173 015.023 S 26 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
74 174 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
75 175 + 10 % Nelken<br />
76 176<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
77 177 015.024 S 26 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
78 178 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
79 179 + 10 % Nelken<br />
80 180<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
81 181 015.025 S 26 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
82 182 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
83 183 + 10 % Nelken<br />
84 184<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
85 185 015.026 S 28 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
86 186 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
87 187 + 10 % Nelken<br />
88 188<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
89 189 015.027 S 28 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
90 190 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
91 191 + 10 % Nelken<br />
92 192<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
93 193 015.028 S 28 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C<br />
94 194 Fettcoating + 5 % NaCl<br />
95 195 + 10 % Nelken<br />
96 196<br />
+ 10 % Pfeffer<br />
97 197 S 24 - Lyophilisat 2 °C 20 °C<br />
98 198 S 25 - Lyophilisat 2 °C 20 °C<br />
99 199 S 26 - Lyophilisat 2 °C 20 °C<br />
100 200 S 28 - Lyophilisat 2 °C 20 °C<br />
S 24: L. reuteri, S 25: L. rhamnosus, S 26: L. paracasei, S 28: L. gasseri
Eigene Untersuchungen<br />
3.2.5.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze<br />
Die <strong>für</strong> die Einlagerung der Proben verwendeten Gewürze, Nelken (gemahlen) <strong>und</strong><br />
Schwarzer Pfeffer (gemahlen), wurden zuvor mikrobiologisch untersucht.<br />
Der Umfang der Untersuchungen richtete sich nach den Empfehlungen <strong>für</strong> die<br />
Untersuchung von getrockneten Lebensmitteln von BAUMGART <strong>und</strong> BECKER<br />
(2003). Bestimmt wurden die aerobe Gesamtkeimzahl, sowie Enterobacteriazeen,<br />
Hefen <strong>und</strong> Schimmelpilze, aerobe Sporenbildner, sulfitreduzierende Clostridien,<br />
Salmonellen <strong>und</strong> Milchsäurebakterien.<br />
Die Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl erfolgte im Spatelverfahren auf<br />
Standard-I-Nähragar nach der vorgeschriebenen Methode (L 06.00-18) der<br />
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB.<br />
Auf Enterobacteriazeen wurden die Gewürze im Spatelverfahren mit Überschichtung<br />
auf VRBD-Agar mit der vorgeschriebenen Methode (L 06.00-24) gemäß Amtlicher<br />
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB untersucht.<br />
Zum Nachweis von Hefen <strong>und</strong> Schimmelpilzen wurde im Plattengussverfahren auf<br />
YGC-Agar mittels der vorgeschriebenen Methode (L 01.00-37) der Amtlichen<br />
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB untersucht.<br />
In Anlehnung an die vorgeschriebene Methode (L 06.00-39) der Amtlichen<br />
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB wurde im<br />
Plattengussverfahren auf mesophile sulfitreduzierende Clostridien untersucht. Als<br />
Nährmedium wurde Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar (TSC-Agar) verwendet.<br />
Zum Nachweis von Salmonellen wurde aus der Amtlichen Sammlung von<br />
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB die vorgeschriebene Methode<br />
(L 00.00.20) angewendet. Die Voranreicherung erfolgte in gepuffertem<br />
Peptonwasser, die selektive Anreicherung in Salmonella-Anreicherungsbouillon nach<br />
97
98<br />
Eigene Untersuchungen<br />
RAPPAPORT sowie in modifizierter TBG-Bouillon, das <strong>Aus</strong>streichen auf<br />
RAMBACH ® -Agar sowie auf XLD-Agar. Eine Bestätigung erfolgte nach Überimpfung<br />
<strong>und</strong> Bebrütung charakteristischer Kolonien auf Standard-I-Nähragar mittels<br />
serologischer Bestätigung. Nach <strong>Aus</strong>schluss selbstagglutinierender Stämme wurden<br />
Einzelkolonien hinsichtlich ihrer Agglutination mit Serum I (A-E) <strong>und</strong> Serum II (F67)<br />
überprüft.<br />
Aerobe Sporenbildner wurden im Spatelverfahren mit den folgenden<br />
Kultivierungsbedingungen untersucht: CASO-Agar, 30 °C ± 0,5 °C, 72 h ± 2 h<br />
(BAUMGART u. BECKER 2003).<br />
Auf Milchsäurebakterien wurde wie im Lagerungsversuch in Anlehnung an die in der<br />
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB<br />
vorgeschriebene Methode (L 06.00-35) untersucht, d. h. MRS-Agar, Spatelverfahren,<br />
37 °C ± 0,5 °C, 48 h ± 2 h <strong>und</strong> ein anaerobes Milieu wurden verwendet.<br />
3.2.6 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch<br />
Alle 200 verschiedenen Proben wurden zu Beginn der Lagerung <strong>und</strong> dann in<br />
vierwöchigem Abstand über ein halbes Jahr untersucht.<br />
Die Proben wurden jeweils in zwei Chargen, Proben-Nr. 1 - 100, sowie 101 - 200<br />
untersucht (Tab.19).
Tabelle 19: Untersuchungszeitpunkte<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Untersuchungs-Nr. Woche Datum Proben-Nr.<br />
1 0 08.03.2006 1 - 100 = 101 - 200<br />
2 4 04.04.2006 1 - 100<br />
5 10.04.2006 101 - 200<br />
3 8 03.05.2006 1 - 100<br />
9 09.05.2006 101 - 200<br />
4 12 31.05.2006 1 - 100<br />
13 07.06.2006 101 - 200<br />
5 16 27.06.2006 1 - 100<br />
17 04.07.2006 101 - 200<br />
6 20 25.07.2006 1 - 100<br />
21 01.08.2006 101 - 200<br />
7 24 23.08.2006 1 - 100<br />
25 30.08.2006 101 - 200<br />
Für die Untersuchung wurden die Proben im Wasserbad bei 30 °C ± 0,5 °C bis zur<br />
Verflüssigung erwärmt <strong>und</strong> anschließend homogenisiert.<br />
Von jeder homogenisierten Probe wurde, wie in Kapitel 3.2.2.1 beschrieben, eine<br />
dezimale Verdünnungsreihe mit NaCl-Pepton-Lösung bis zu einer Verdünnung von<br />
10 -8 angelegt. Die Untersuchung erfolgte im Doppelansatz mittels<br />
Tropfplattenverfahren, wobei jede MRS-Agarplatte in maximal vier Sektoren unterteilt<br />
wurde. Pro Sektor wurden 50 µl aufgetragen. Die Platten wurden 48 h ± 2 h bei<br />
37 °C ± 0,5 °C im CO2-Brutschrank anaerob inkubiert. Nach 48 h ± 2 h erfolgte<br />
makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch die <strong>Aus</strong>wertung der Platten <strong>und</strong> Berechnung <strong>des</strong><br />
gewichteten Mittelwertes <strong>und</strong> der Keimzahl pro ml bzw. g wie in Kapitel 3.2.2.1<br />
beschrieben.<br />
99
3.3 <strong>Aus</strong>wertung<br />
100<br />
Eigene Untersuchungen<br />
Jede Untersuchung zur Bestimmung der Keimzahl einer Probe wurde im<br />
Doppelansatz durchgeführt, d. h. jede Verdünnungsstufe wurde auf zwei Platten<br />
aufgetragen. Nach den festgelegten Bebrütungsdauern wurden die Kolonien<br />
ausgezählt.<br />
Um ein vali<strong>des</strong> Ergebnis zu erhalten, wurde aus den Koloniezahlen der niedrigsten<br />
<strong>und</strong> der nächsthöheren auswertbaren Verdünnungsstufe der gewichtete Mittelwert<br />
mit der nachfolgenden Formel berechnet.<br />
∑ c<br />
c =<br />
n ⋅1+<br />
n ⋅0,<br />
1<br />
1<br />
2<br />
c gewichteter Mittelwert der Koloniezahlen<br />
∑c Summe der Koloniezahlen aller Platten beider Verdünnungsstufen, die<br />
zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste <strong>und</strong> nächsthöhere<br />
auswertbare Verdünnungsstufe)<br />
n 1 Anzahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe<br />
n 2 Anzahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe<br />
Die Keimzahl je g bzw. ml der Probe wurde durch Multiplikation <strong>des</strong> c -Wertes mit<br />
den Verdünnungsfaktoren (Verdünnung <strong>und</strong> Plattenverdünnung) erhalten. Das<br />
Ergebnis wurde auf eine Dezimalstelle nach <strong>dem</strong> Komma ger<strong>und</strong>et <strong>und</strong> als eine Zahl<br />
zwischen 1,0 <strong>und</strong> 9,9 multipliziert mit der entsprechenden Zehnerpotenz angegeben.<br />
Alle ermittelten Keimzahlen (KbE/ml bzw. KbE/g) wurden <strong>für</strong> die Darstellung der<br />
Ergebnisse zur Basis Zehn logarithmiert (lg KbE/ml bzw. lg KbE/g) <strong>und</strong> auf zwei<br />
Dezimalstellen nach <strong>dem</strong> Komma ger<strong>und</strong>et.
Eigene Untersuchungen<br />
Die niedrigste Verdünnungsstufe lag bei 1,00 x 10 -1 . Dies entsprach beim<br />
Tropfplattenverfahren einer niedrigsten Plattenverdünnungsstufe von 5,00 x 10 -3<br />
(0,05 ml pro Plattensektor). Damit ergab sich durch Kehrwertbildung (1 ⁄ [5,00 x 10 -3 ])<br />
eine Nachweisgrenze von 2,00 x 10 2 KbE/ml = 2,30 lg KbE/ml. Für Proben, bei<br />
denen die Keimzahl unterhalb dieser Nachweisgrenze lag, wurde als absoluter Wert<br />
die Hälfte von 2,00 x 10 2 KbE/ml, also 1,00 x 10 2 KbE/ml, angenommen.<br />
1,00 x 10 2 KbE/ml wurde zur Basis Zehn logarithmiert, womit sich ein Wert von<br />
2,00 lg KbE/ml ergab.<br />
Beim Spatelverfahren lag die Nachweisgrenze bei<br />
1,00 x 10 2 KbE/ml = 2,00 lg KbE/ml. Für Keimzahlen kleiner als die Nachweisgrenze<br />
wurde mit 5,00 x 10 1 KbE/ml = 1,70 lg KbE/ml die halbe Nachweisgrenze festgelegt.<br />
Die Nachweisgrenze im Gussplattenverfahren lag bei<br />
1,00 x 10 1 KbE/ml = 1,00 lg KbE/ml. Werte, die unterhalb der Nachweisgrenze lagen,<br />
wurden mit <strong>dem</strong> halben Wert, also 5,00 x 10 0 KbE/ml = 0,70 lg KbE/ml, angegeben.<br />
Nach HILDEBRANDT <strong>und</strong> WICHMANN-SCHAUER (2005) sind wie alle<br />
Analyseergebnisse auch die Resultate mikrobiologischer Keimzählverfahren mit<br />
Messun<strong>sicherheit</strong>en behaftet. Die Messun<strong>sicherheit</strong> steht <strong>für</strong> die Präzision einer<br />
Analyse.<br />
Keimzahldifferenzen von min<strong>des</strong>tens |∆ KZ| = 0,70 lg KbE/ml galten bei den eigenen<br />
Untersuchungen als eindeutige, also als methodenunabhängige Abweichungen.<br />
Gr<strong>und</strong>lage <strong>für</strong> die Festlegung dieses Wertes waren Präzisionsdaten aus<br />
Ringversuchen, die in der Methode L 00.00-88 „Horizontales Verfahren <strong>für</strong> die<br />
Zählung von Mikroorganismen“ der Amtlichen Sammlung von<br />
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB (= Norm DIN EN ISO 4833)<br />
dargelegt sind.<br />
Präzisionsdaten hängen von der Zusammensetzung der Keimflora <strong>und</strong> der Matrix der<br />
Untersuchungsprobe ab. Die in der genannten Methode vorgelegten Daten wurden<br />
aus Ringversuchen abgeleitet <strong>und</strong> <strong>für</strong> Rohmilch <strong>und</strong> pasteurisierte Milch validiert. Für<br />
die Bestimmung der Koloniezahlen anderer Produkte dürfen diese als Schätzwerte<br />
101
102<br />
Eigene Untersuchungen<br />
verwendet werden. Es wird unterschieden zwischen der Wiederholpräzision <strong>und</strong> der<br />
Vergleichspräzision.<br />
Die Wiederholpräzision bezeichnet die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen<br />
voneinander unabhängigen Untersuchungsergebnissen, die der gleiche Bearbeiter<br />
mit den gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial im gleichen Labor<br />
mit der gleichen Geräteausstattung innerhalb einer kurzen Zeitspanne erhält. Der<br />
Grenzwert <strong>für</strong> die Wiederholpräzision wird in der Methode L 00.00-88 „Horizontales<br />
Verfahren <strong>für</strong> die Zählung von Mikroorganismen“ der Amtlichen Sammlung von<br />
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB mit r = 0,25 lg KbE/ml<br />
angegeben.<br />
Die Vergleichspräzision beschreibt die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen<br />
voneinander unabhängigen Untersuchungsergebnissen, die verschiedene Bearbeiter<br />
mit <strong>dem</strong> gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen<br />
Labors mit unterschiedlichen Geräteausstattungen erhalten. Gemäß der Methode<br />
L 00.00-88 „Horizontales Verfahren <strong>für</strong> die Zählung von Mikroorganismen“ der<br />
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB ist<br />
die Vergleichspräzision mit R = 0,45 lg KbE/ml anzunehmen.<br />
Fasst man die genannten Werte <strong>für</strong> Wiederhol- <strong>und</strong> Vergleichspräzision (r <strong>und</strong> R)<br />
zusammen, ergibt sich ein Wert von r + R = 0,70 lg KbE/ml. Auf diese Weise konnte<br />
sicher gestellt werden, dass es sich bei Keimzahldifferenzen von min<strong>des</strong>tens<br />
|∆ KZ| = 0,70 lg KbE/ml der eigenen Untersuchungen auf jeden Fall um eindeutige,<br />
methodenunabhängige Abweichungen handelte. Es wurde durch die<br />
Wiederholpräzision (r) der Personen-Methodenfehler, als auch durch die<br />
Vergleichspräzision (R) der Interlabor-Methodenfehler berücksichtigt, obwohl alle<br />
Ergebnisse von <strong>dem</strong> gleichen Bearbeiter durchgeführt worden sind.<br />
Die weitere <strong>Aus</strong>wertung der Ergebnisse <strong>des</strong> Lagerungsversuches, insbesondere die<br />
Beschreibung der Unterschiede zwischen den Proben, erfolgte ausschließlich<br />
<strong>des</strong>kriptiv.
4 Ergebnisse<br />
Ergebnisse<br />
In den Vorversuchen wurden zwölf verschiedene Gewürze sowie drei<br />
Kochsalzkonzentrationen bezüglich ihres Einflusses auf das Wachstum der vier<br />
verschiedenen probiotischen Bakterien L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) untersucht. Es wurden die zwei Gewürze<br />
<strong>und</strong> die Kochsalzkonzentration mit den größten Einflüssen auf das<br />
Bakterienwachstum <strong>für</strong> den angeschlossenen Lagerungsversuch ausgewählt. In <strong>dem</strong><br />
Lagerungsversuch wurden die genannten Einflüsse auf die Bakterien bei zwei<br />
Lagerungstemperaturen untersucht. Die Bakterien wurden <strong>für</strong> die Lagerung<br />
mikroverkapselt. Als Mikroverkapselungen wurden wasserlösliche wie auch<br />
wasserunlösliche Coatingmaterialien, jeweils in drei unterschiedlichen<br />
Kapselwandstärken, ausgewählt.<br />
4.1 Vorversuche<br />
<strong>Aus</strong> zwölf Gewürzen <strong>und</strong> drei Kochsalzkonzentrationen sollten in den Vorversuchen<br />
zwei Gewürze sowie eine Kochsalzkonzentration <strong>für</strong> den angeschlossenen<br />
Lagerungsversuch ausgewählt werden.<br />
Makroskopisch betrachtet waren L. reuteri (S 24) glatte bis raue, mittelgroße,<br />
wachsig-weiße, zentral hellere, leicht gewölbte Kolonien, L. rhamnosus (S 25) glatte,<br />
große, strahlend-weiße, gewölbte Kolonien, L. paracasei (S 26) glatte, mittelgroße,<br />
gewölbte Kolonien <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) raue bis glatte, kleine, wachsig-weiße, sehr<br />
feine, leicht gewölbte Kolonien.<br />
Mikroskopisch stellten sich die Laktobazillen als grampositive Stäbchen dar. Bei<br />
L. reuteri (S 24) handelte es sich um mittellange, bei L. rhamnosus (S 25) um kurze<br />
103
104<br />
Ergebnisse<br />
bis mittellange Stäbchen, bei L. paracasei (S 26) um sehr schlanke, mittellange<br />
Stäbchen <strong>und</strong> bei L. gasseri (S 28) um mittellange bis lange Stäbchen.<br />
4.1.1 Vergleich von Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren<br />
Im ersten Abschnitt der Vorversuche wurde zunächst die Vergleichbarkeit der<br />
Ergebnisse aus Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren überprüft. Die gewichteten<br />
arithmetischen Mittelwerte der Keimzahlen der Arbeitsbouillon (B1) von S 24, S 25,<br />
S 26 <strong>und</strong> S 28 lagen in <strong>dem</strong>selben Zehnerpotenzbereich. Die Abweichungen lagen<br />
zwischen minimal 0,05 lg KbE/ml <strong>für</strong> S 26 (L. paracasei) <strong>und</strong> maximal 0,39 lg KbE/ml<br />
<strong>für</strong> S 28 (L. gasseri). Für S 24 (L. reuteri) betrug die Abweichung 0,23 lg KbE/ml <strong>und</strong><br />
<strong>für</strong> S 25 (L. rhamnosus) 0,28 lg KbE/ml. Dabei ergaben sich aus <strong>dem</strong><br />
Tropfplattenverfahren jeweils die niedrigeren Werte. Es bestanden keine<br />
methodenunabhängigen Unterschiede zwischen den beiden angewendeten<br />
mikrobiologischen Verfahren, <strong>und</strong> eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse konnte<br />
nachgewiesen werden. In den nachfolgenden Versuchen wurde zwecks Kosten- <strong>und</strong><br />
Materialersparnis nur noch das Tropfplattenverfahren angewendet.<br />
4.1.2 Einfluss Gewürze <strong>und</strong> Kochsalzkonzentration<br />
<strong>Aus</strong> zwölf verschiedenen Gewürzen <strong>und</strong> drei Kochsalzkonzentrationen sollten zwei<br />
Gewürze <strong>und</strong> eine Kochsalzkonzentration, die die größten Einflüsse auf das<br />
Bakterienwachstum zeigten, ausgewählt werden.<br />
Die aus der Arbeitsbouillon B1 erstellte MRS-Bouillon B2 diente als Kontrolle. Für<br />
den ersten Untersuchungsgang (Gewürze 1 - 6 <strong>und</strong> Kochsalzkonzentrationen 1 %,<br />
2 % <strong>und</strong> 5 %) ergaben sich im Tropfplattenverfahren folgende Keimzahlen <strong>für</strong> B1:<br />
L. reuteri (S 24) 7,67 lg KbE/ml, L. rhamnosus (S 25) 8,98 lg KbE/ml, L. paracasei
Ergebnisse<br />
(S 26) 9,46 lg KbE/ml <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) 9,00 lg KbE/ml. Für B2 konnten folgende<br />
Keimzahlen bestimmt werden: L. reuteri (S 24) 7,94 lg KbE/ml, L. rhamnosus (S 25)<br />
7,99 lg KbE/ml, L. paracasei (S 26) 8,41 lg KbE/ml <strong>und</strong> L. gasseri (S 28)<br />
9,74 lg KbE/ml.<br />
Für den zweiten Untersuchungsgang (Gewürze 7 - 12) ergaben sich im<br />
Tropfplattenverfahren folgende Keimzahlen <strong>für</strong> B1: L. reuteri (S 24) 8,00 lg KbE/ml,<br />
L. rhamnosus (S 25) 8,96 lg KbE/ml, L. paracasei (S 26) 9,15 lg KbE/ml <strong>und</strong><br />
L. gasseri (S 28) 8,96 lg KbE/ml. Für B2 konnten folgende Keimzahlen bestimmt<br />
werden: L. reuteri (S 24) 8,18 lg KbE/ml, L. rhamnosus (S 25) 8,56 lg KbE/ml,<br />
L. paracasei (S 26) 9,81 lg KbE/ml <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) 8,97 lg KbE/ml.<br />
In den Negativkontrollen (B0) konnte makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch kein<br />
Wachstum festgestellt werden.<br />
4.1.2.1 Einfluss Gewürze<br />
Von zwölf untersuchten Gewürzen sollten die zwei Gewürze mit den größten<br />
Einflüssen auf die Keimzahlen <strong>für</strong> den Lagerungsversuch ausgewählt werden. Die<br />
Differenzen der Keimzahlen (∆ Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) mit <strong>und</strong> ohne Gewürz lagen zwischen -7,74<br />
<strong>und</strong> 1,14. Die Tabellen 20 <strong>und</strong> 21 zeigen die Entwicklungen der Keimzahlen im<br />
Einzelnen.<br />
105
106<br />
Ergebnisse<br />
Tabelle 20: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Gewürzen 1 - 6<br />
L. reuteri<br />
(S 24)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. rhamnosus<br />
(S 25)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. paracasei<br />
(S 26)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. gasseri<br />
(S 28)<br />
[lg KbE/ml]<br />
Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz<br />
B2 7,94 7,99 8,41 9,74<br />
B2G1 8,77 0,83 7,79 -0,20 8,84 0,43 8,58 -1,16<br />
B2G2 8,62 0,68 8,79 0,80 8,93 0,52 9,81 0,07<br />
B2G3 2,00 -5,94 2,00 -5,99 2,00 -6,41 2,00 -7,74<br />
B2G4 8,54 0,60 8,04 0,05 6,30 -2,11 8,11 -1,63<br />
B2G5 7,78 -0,16 7,53 -0,46 7,68 -0,73 7,54 -2,20<br />
B2G6 9,00 1,06 7,90 -0,09 6,23 -2,18 6,56 -3,18<br />
B2 = MRS-Bouillon B2 (s. Abb. 8) = Kontrolle, B2GX = MRS-Bouillon B2 mit Zusatz von Gewürz GX,<br />
G1 = Senfkörner, G2 = Paprika edelsüß, G3 = Nelken (gemahlen), G4 = Schwarzer Pfeffer<br />
(gemahlen), G5 = Knoblauchgranulat, G6 = Ingwer (gemahlen), Kz = Keimzahl,<br />
∆ Kz = Kz(B2GX) – Kz(B2), mit X = {1, 2, 3, 4, 5, 6}
Ergebnisse<br />
Tabelle 21: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Gewürzen 7 - 12<br />
L. reuteri<br />
(S 24)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. rhamnosus<br />
(S 25)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. paracasei<br />
(S 26)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. gasseri<br />
(S 28)<br />
[lg KbE/ml]<br />
Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz<br />
B2 8,18 8,56 9,81 8,97<br />
B2G7 8,08 -0,10 8,60 0,04 8,99 -0,82 8,97 0,00<br />
B2G8 8,26 0,18 7,49 -0,69 8,85 -0,96 9,48 0,51<br />
B2G9 8,18 0,00 8,18 -0,38 8,56 -1,25 10,11 1,14<br />
B2G10 9,15 0,97 8,72 0,16 8,98 -0,83 8,97 0,00<br />
B2G11 9,08 0,90 8,88 0,32 8,80 -1,01 9,97 1,00<br />
B2G12 8,23 0,05 7,45 -1,11 8,71 -1,10 7,32 -1,65<br />
B2 = MRS-Bouillon B2 (s. Abb. 8) = Kontrolle, B2GX = MRS-Bouillon B2 mit Zusatz von Gewürz GX,<br />
G7 = Rosenpaprika; G8 = Majoran (gemahlen), G9 = Kümmel (gemahlen); G10 = Zwiebelgranulat,<br />
G11 = Basilikum (gerebelt), G12 = Oregano (gerebelt), Kz = Keimzahl, ∆ Kz = Kz(B2GX) – Kz(B2),<br />
mit X = {7, 8, 9, 10, 11, 12}<br />
In den Fällen, in denen ∆ Kz negativ war, waren die Keimzahlen der Bouillons mit<br />
Gewürzzusatz (B2GX) kleiner als in der Kontrolle B2. Der Zusatz der Gewürze führte<br />
in diesen Fällen zu einer Reduzierung <strong>des</strong> Keimwachstums. Ein erhöhtes<br />
Keimwachstums im Vergleich zur Kontrolle B2 konnte im Falle von positiven ∆ Kz-<br />
Werten festgestellt werden. ∆ Kz = 0 bedeutete, dass keine messbare gegenseitige<br />
Beeinflussung zwischen Gewürzzusatz <strong>und</strong> Keimwachstum nachgewiesen werden<br />
konnte. Eine Differenz von min<strong>des</strong>tens |∆ Kz| = 0,70 lg KbE/ml galt als eindeutig.<br />
Nelken (gemahlen) führten im Vorversuch bei allen vier Stämmen zu einer<br />
vollständigen Hemmung <strong>des</strong> Keimwachstums. Bei allen vier Stämmen lagen die<br />
Keimzahlen der B2 mit Nelkenzusatz unterhalb der Nachweisgrenze. Es kam zu<br />
eindeutigen Abnahmen der Keimzahlen. Folglich wurden Nelken als eines der beiden<br />
Gewürze <strong>für</strong> den Lagerungsversuch ausgewählt. Auf diese Weise sollte der „worst<br />
107
108<br />
Ergebnisse<br />
case“ simuliert werden, auch wenn Nelken als Gewürz eher selten in der Herstellung<br />
von Fleischerzeugnissen zum Einsatz kommen.<br />
Schwarzer Pfeffer (gemahlen) führte bei S 26 (L. paracasei) <strong>und</strong> S 28 (L. gasseri) zur<br />
eindeutigen Reduzierung der Keimzahlen. Die Keimzahl von S 26 wurde unter <strong>dem</strong><br />
Einfluss von Schwarzem Pfeffer um 2,11 lg KbE/ml, die von S 28 um 1,63 lg KbE/ml<br />
reduziert. Das Wachstum von S 24 (L. reuteri) <strong>und</strong> S 25 (L. rhamnosus) wurde durch<br />
Schwarzen Pfeffer nicht eindeutig beeinflusst. ∆ Kz betrug <strong>für</strong> S 24 0,60 lg KbE/ml<br />
<strong>und</strong> <strong>für</strong> S 25 0,05 lg KbE/ml. Schwarzer Pfeffer (gemahlen) wurde aufgr<strong>und</strong> der<br />
eindeutigen, hemmenden Wirkung auf zwei der Bakterien, aber auch aufgr<strong>und</strong> <strong>des</strong><br />
häufigen Einsatzes in der Produktion von Fleischerzeugnissen, als zweites Gewürz<br />
<strong>für</strong> die weiteren Versuche ausgewählt.<br />
Die weiteren untersuchten Gewürze kamen <strong>für</strong> den Lagerungsversuch nicht in Frage,<br />
da die Abnahmen der Keimzahlen im Vergleich zu Nelken <strong>und</strong> Schwarzem Pfeffer<br />
geringer waren.<br />
4.1.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration<br />
Die drei Kochsalzkonzentrationen 1 %, 2 % <strong>und</strong> 5 % wurden hinsichtlich eines<br />
Einflusses auf die Keimzahlen von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) untersucht. Es sollte die Konzentration mit<br />
<strong>dem</strong> größten Einfluss auf das Bakterienwachstum ausgewählt werden. Die<br />
Ergebnisse sind der Tabelle 22 zu entnehmen.
Ergebnisse<br />
Tabelle 22: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Kochsalz in verschiedenen Konzentrationen<br />
L. reuteri<br />
(S 24)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. rhamnosus<br />
(S 25)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. paracasei<br />
(S 26)<br />
[lg KbE/ml]<br />
L. gasseri<br />
(S 28)<br />
[lg KbE/ml]<br />
Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz<br />
B2 7,94 7,99 8,41 9,74<br />
B2S1 7,72 -0,22 8,26 0,27 8,04 -0,37 8,60 -1,14<br />
B2S2 6,30 -1,64 8,08 0,09 8,64 0,23 8,46 -1,28<br />
B2S5 4,85 -3,09 7,65 -0,34 6,90 -1,51 7,54 -2,20<br />
B2 = MRS-Bouillon B2 (s. Abb. 8) = Kontrolle, B2SX = MRS-Bouillon B2 mit Zusatz von NaCl SX,<br />
S1 = 1 % NaCl-Zusatz, S2 = 2 % NaCl-Zusatz , S5 = 5 % NaCl-Zusatz, Kz = Keimzahl,<br />
∆ Kz = Kz(B2SX) – Kz(B2), mit X = {1, 2, 5}<br />
Für ∆ Kz < 0 waren die Keimzahlen der Bouillons mit Kochsalzzusatz (B2SX) kleiner<br />
als in der Kontrolle B2, so dass der Zusatz von NaCl zu einer Reduzierung <strong>des</strong><br />
Keimwachstums führte. Eine Erhöhung der Keimzahlen im Vergleich zur Kontrolle B2<br />
konnte <strong>für</strong> ∆ Kz > 0 festgestellt werden. ∆ Kz = 0 bedeutete wiederum, dass keine<br />
messbare gegenseitige Beeinflussung zwischen Kochsalzzusatz <strong>und</strong> Keimwachstum<br />
nachgewiesen werden konnte. Eine Differenz von min<strong>des</strong>tens<br />
|∆ Kz| = 0,70 lg KbE/ml galt als methodenunabhängige Abweichung.<br />
L. rhamnosus (S 25) zeigte sich gegenüber Kochsalz besonders resistent <strong>und</strong> 5 %<br />
führten hier lediglich zu einer Reduzierung der Keimzahl um 0,34 lg KbE/ml. Die<br />
Keimzahl von S 24 (L. reuteri) wurde durch 5 % NaCl-Zusatz um 3,09 lg KbE/ml, die<br />
Keimzahl von S 26 (L. paracasei) um 1,51 lg KbE/ml <strong>und</strong> die Keimzahl von S 28<br />
(L. gasseri) um 2,20 lg KbE/ml reduziert. 5 % Kochsalzzusatz führte also bei allen<br />
vier Stämmen zu einer Reduzierung der Keimzahl, welche außer <strong>für</strong> S 25<br />
(L. rhamnosus) auch methodenunabhängig war.<br />
109
110<br />
Ergebnisse<br />
Die Einflüsse auf die Keimzahlen durch 1 % bzw. 2 % NaCl waren im Vergleich zu<br />
5 % NaCl geringer, so dass in einem Versuchsansatz <strong>des</strong> Hauptversuches <strong>dem</strong><br />
Lagerungsmedium 5 % Kochsalz zugesetzt wurde.<br />
4.1.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze<br />
Die beiden Gewürze, die <strong>für</strong> den Lagerungsversuch verwendet werden sollten,<br />
wurden zuvor hinsichtlich ihres Keimstatus untersucht. Eine Übersicht der<br />
Keimbelastungen gibt Tabelle 23.<br />
Tabelle 23: Keimbelastung der Gewürze Nelken <strong>und</strong> Schwarzer Pfeffer<br />
Keimzahl [lg KbE/g Gewürz]<br />
Untersuchter<br />
Nelken<br />
Schwarzer Pfeffer<br />
Parameter<br />
(gemahlen)<br />
(gemahlen)<br />
Aerobe GKZ<br />
3,00 6,00<br />
Enterobacteriaceae<br />
Hefen <strong>und</strong><br />
Schimmelpilze<br />
Sulfitreduzierende<br />
Clostridien<br />
Salmonella spp.<br />
3,00 4,76<br />
negativ in 10 g 3,00<br />
1,00 3,18<br />
negativ in 25 g negativ in 25 g<br />
Aerobe Sporenbildner 3,00 6,00<br />
Milchsäurebakterien nicht nachweisbar (< 1,70) nicht nachweisbar (< 1,70)<br />
GKZ = Gesamtkeimzahl
Ergebnisse<br />
Die Untersuchung der beiden Gewürze, die <strong>für</strong> die Einlagerung Verwendung finden<br />
sollten, ergab eine nicht unerhebliche Belastung mit mehreren Keimen. Die<br />
Belastung war bei Schwarzem Pfeffer (gemahlen) im Vergleich zu Nelken<br />
(gemahlen) sehr viel höher. Milchsäurebakterien konnten in keiner der beiden<br />
Proben nachgewiesen werden, wobei die Nachweisgrenze bei 2,00 lg KbE/g lag, <strong>und</strong><br />
als absoluter Wert hier die halbe Nachweisgrenze, also 1,70 lg KbE/g, angenommen<br />
wurde.<br />
4.2 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch<br />
Die Proben (Probenschlüssel siehe Kap. 3.2.5.2, Tab. 18) wurden zum Zeitpunkt 0,<br />
<strong>und</strong> anschließend zu sechs weiteren Untersuchungszeitpunkten in vierwöchigem<br />
Abstand untersucht. Damit ergaben sich <strong>für</strong> jede Probe sieben Werte (U1 bis U7).<br />
Makroskopisch <strong>und</strong> mikroskopisch stellten sich die Laktobazillen wie in den<br />
Vorversuchen (siehe Kap. 4.1) dar.<br />
Die Ergebnistabellen zu <strong>dem</strong> Lagerungsversuch mit den Keimzahlen der einzelnen<br />
Untersuchungen sind im Anhang zu finden (siehe Kap. 10.1, Tab. 24 - 28).<br />
4.2.1 Lagerung der Lyophilisate<br />
Die Einzelergebnisse über den Verlauf der Keimzahlen der bei 2 °C (Nr. 97, 98, 99<br />
<strong>und</strong> 100) <strong>und</strong> auch bei 20 °C (Nr. 197, 198, 199 <strong>und</strong> 200) gelagerten Lyophilisate<br />
sind im Anhang (Kap. 10.1) in Tabelle 24 aufgeführt.<br />
Die Lagerung der Proben bei 2 °C führte zu geringeren Abnahmen der Keimzahlen<br />
als bei 20 °C. Die Keimzahlen von L. paracasei (S 26, Nr. 99) <strong>und</strong> L. gasseri<br />
(S 28, Nr. 100) pro g Lyophilisat, gelagert bei 2 °C, blieben über den gesamten<br />
Lagerungszeitraum sehr konstant. Es kam zu keinen eindeutigen Abnahmen der<br />
111
112<br />
Ergebnisse<br />
Keimzahlen, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/g. Die Keimzahlen der anderen<br />
Lyophilisatproben haben sich während <strong>des</strong> Lagerungszeitraumes eindeutig, aber<br />
ebenfalls nur geringgradig verringert. Bei Raumtemperatur gelagerte Proben zeigten<br />
im Vergleich zu den gekühlt gelagerten Proben deutlich höhere Abnahmen der<br />
Keimzahlen über die Zeit. Am größten war hier die Abnahme mit 7,00 lg KbE/g bei<br />
L. paracasei (S 26, Nr. 199), am kleinsten mit 2,38 lg KbE/g bei L. rhamnosus<br />
(S 25, Nr. 198).<br />
Insgesamt erwiesen sich die Lyophilisate bei einer gekühlten Lagerung über den<br />
gesamten Zeitraum als sehr stabil, bei Raumtemperatur als relativ stabil. Die<br />
Abbildung 11 stellt die Entwicklungen der Keimzahlen der Lyophilisate grafisch dar.<br />
Keimzahl in lgKbE/g<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 97-100, Lagerung bei 20 °C: Nr. 197-200, L. reuteri (S 24): Nr. 97, 197,<br />
L. rhamnosus (S 25): Nr. 98, 198, L. paracasei (S 26): Nr. 99, 199, L. gasseri (S 28): Nr. 100, 200<br />
Abbildung 11: Keimzahlen der Lyophilisate von L. reuteri (S 24),<br />
97<br />
98<br />
99<br />
100<br />
197<br />
198<br />
199<br />
200<br />
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri<br />
(S 28)
Ergebnisse<br />
4.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24)<br />
Die mikroverkapselten Proben von L. reuteri (S 24) wurden nur in Gelatine, mit<br />
Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von Schwarzem Pfeffer bei<br />
zwei Temperaturen gelagert, <strong>und</strong> im Laufe der Lagerung zu sieben<br />
Untersuchungszeitpunkten untersucht. Die Tabelle 25 im Anhang (Kap. 10.1) zeigt<br />
die Entwicklung der Keimzahlen der Proben von L. reuteri (S 24).<br />
4.2.2.1 Ohne Zusätze<br />
Für Proben von L. reuteri (S 24) nur in Gelatine ohne Zusätze gelagert (Nr. 1, 5, 9,<br />
49, 53, 57, 101, 105, 109, 149, 153 <strong>und</strong> 157) ergaben sich im Wesentlichen<br />
Unterschiede zwischen den bei verschiedenen Temperaturen gelagerten Proben<br />
(siehe Abb. 12). Unabhängig von der Verkapselungsart kam es bei den bei 20°C<br />
gelagerten Proben (Nr. 101, 105, 109, 149, 153 <strong>und</strong> 157) zu keinen eindeutigen<br />
Abnahmen der Keimzahlen (<strong>Aus</strong>nahme: Nr. 105 mit ∆ Kz = -0,89). Unter den gekühlt<br />
gelagerten Proben (Nr. 1, 5, 9, 49, 53 <strong>und</strong> 57) kam es im Vergleich zu den<br />
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 1, 5 <strong>und</strong> 9) bei den wasserunlöslich<br />
verkapselten Proben (Nr. 49, 53 <strong>und</strong> 57) zu deutlich höheren Abnahmen der<br />
Keimzahlen. Hierbei waren bei den wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 49, 53<br />
<strong>und</strong> 57) die Abnahmen umso geringer, je dicker die Kapsel war, d. h. bei der<br />
50%igen Kapsel am geringsten. Bei den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 1, 5<br />
<strong>und</strong> 9) konnte dieser Bef<strong>und</strong> nicht festgestellt werden.<br />
113
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
114<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
Ergebnisse<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 1, 5, 9, 49, 53, 57, Lagerung bei 20 °C: Nr. 101, 105, 109, 149, 153, 157,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 1, 5, 9, 101, 105, 109, wasserunlösliches Coating: Nr. 49, 53, 57, 149,<br />
153, 157, 10 % Coating: Nr. 1, 49, 101, 149, 30 % Coating: Nr. 5, 53, 105, 153, 50 % Coating: Nr. 9,<br />
57, 109, 157<br />
Abbildung 12: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) ohne den Einfluss von<br />
Zusätzen<br />
4.2.2.2 Zusatz NaCl<br />
Unter den Proben von L. reuteri (S 24), die in Gelatine mit <strong>dem</strong> Zusatz von 5 % NaCl<br />
gelagert wurden, zeigten ebenfalls die bei 2 °C gelagerten Proben (Nr. 2, 6, 10, 50,<br />
54 <strong>und</strong> 58) höhere eindeutige Abnahmen, als die bei 20 °C gelagerten Proben<br />
(Nr. 102, 106, 110, 150, 154 <strong>und</strong> 158), was aus Abbildung 13 ersichtlich wird.<br />
Auffällig ist, dass bereits zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung die Keimzahlen der<br />
Proben mit der 10%igen wasserunlöslichen Kapsel (Nr. 50 <strong>und</strong> 150), unabhängig von<br />
der Lagerungstemperatur, unter die Nachweisgrenze gesunken waren, so dass sich<br />
in diesen Fällen ∆ Kz = 0 ergab. Des Weiteren gilt <strong>für</strong> die bei 2 °C gelagerten Proben,<br />
1<br />
5<br />
9<br />
49<br />
53<br />
57<br />
101<br />
105<br />
109<br />
149<br />
153<br />
157
Ergebnisse<br />
dass die Abnahmen bei den wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 50, 54 <strong>und</strong><br />
58) im Vergleich zu den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 2, 6 <strong>und</strong> 10) geringer<br />
waren. Für beide Verkapselungsarten ergaben sich bei dieser Lagerungstemperatur<br />
umso geringere Abnahmen, je dicker die Kapsel war. Bei den bei 20 °C gelagerten<br />
Proben kam es bei 30%iger <strong>und</strong> 50%iger wasserlöslicher (Nr. 106 <strong>und</strong> 110) sowie<br />
wasserunlöslicher Kapsel (Nr. 154 <strong>und</strong> 158) zu methodenunabhängigen Zunahmen<br />
der Keimzahlen über die Zeit, d. h. ∆ Kz war positiv.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 2, 6, 10, 50, 54, 58, Lagerung bei 20 °C: Nr. 102, 106, 110, 150, 154, 158,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 2, 6, 10, 102, 106, 110, wasserunlösliches Coating: Nr. 50, 54, 58, 150,<br />
154, 158, 10 % Coating: Nr. 2, 50, 102, 150, 30 % Coating: Nr. 6, 54, 106, 154, 50 % Coating: Nr. 10,<br />
58, 110, 158<br />
Abbildung 13: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
NaCl<br />
2<br />
6<br />
10<br />
50<br />
54<br />
58<br />
102<br />
106<br />
110<br />
150<br />
154<br />
158<br />
115
4.2.2.3 Zusatz Nelken<br />
116<br />
Ergebnisse<br />
Nelken (gemahlen) als Zusatz zum Lagerungsmedium führten, unabhängig von der<br />
Verkapselungsart, bei L. reuteri (S 24) dazu, dass bereits zum Zeitpunkt der ersten<br />
Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der Proben, die Keimzahlen unter<br />
die Nachweisgrenze gesunken waren (Nr. 3, 7, 11, 51, 55, 59, 103,107,111,151,155<br />
<strong>und</strong> 159). An diesen Bef<strong>und</strong>en änderte sich im weiteren Verlauf der Lagerung nichts,<br />
so dass sich in diesen Fällen ∆ Kz = 0 ergab. Auf eine grafische Darstellung wurde in<br />
diesem Fall verzichtet.<br />
4.2.2.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer<br />
Proben von L. reuteri (S 24) mit <strong>dem</strong> Zusatz von Schwarzem Pfeffer gelagert (Nr. 4,<br />
8, 12, 52, 56, 60, 104, 108, 112, 152, 156 <strong>und</strong> 160) zeigten, bis auf die Probe<br />
Nr. 112, methodenunabhängige Abnahmen der Keimzahlen über die Zeit. Unter den<br />
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 4, 8, 12, 104, 108 <strong>und</strong> 112) zeigten die bei<br />
20 °C gelagerten Proben (Nr. 104, 108 <strong>und</strong> 112) deutlich geringere Abnahmen als<br />
die vergleichbaren Proben, die bei 2 °C gelagert wurden (Nr. 4, 8 <strong>und</strong> 12). Für beide<br />
Lagerungstemperaturen waren in diesen Fällen die Abnahmen umso geringer, je<br />
dicker die Kapsel war (<strong>Aus</strong>nahme Nr. 8). Unter den wasserunlöslich verkapselten<br />
Proben (Nr. 52, 56, 60, 152, 156 <strong>und</strong> 160) gab es bei der 10%igen Kapsel keine<br />
Unterschiede zwischen den Lagerungstemperaturen. Bei den 30%igen <strong>und</strong> 50%igen<br />
wasserunlöslichen Kapseln kam es bei den bei 20 °C gelagerten Proben zu höheren<br />
Abnahmen als bei den bei 2 °C gelagerten Proben. Eine Übersicht über die Lagerung<br />
mit Schwarzem Pfeffer gibt die Abbildung 14.
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
Ergebnisse<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 4, 8, 12, 52, 56, 60, Lagerung bei 20 °C: Nr. 104, 108, 112, 152, 156, 160,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 4, 8, 12, 104, 108, 112, wasserunlösliches Coating: Nr. 52, 56, 60, 152,<br />
156, 160, 10 % Coating: Nr. 4, 52, 104, 152, 30 % Coating: Nr. 8, 56, 108, 156, 50 % Coating: Nr. 12,<br />
60, 112, 160<br />
Abbildung 14: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer<br />
4.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25)<br />
Die mikroverkapselten Proben von L. rhamnosus (S 25) wurden ebenfalls nur in<br />
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von<br />
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen gelagert, <strong>und</strong> im Laufe der Lagerung zu<br />
sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht. Der Verlauf der Keimzahlen von<br />
L. rhamnosus (S 25) kann aus Tabelle 26 im Anhang (Kap. 10.1) ersehen werden.<br />
4<br />
8<br />
12<br />
52<br />
56<br />
60<br />
104<br />
108<br />
112<br />
152<br />
156<br />
160<br />
117
4.2.3.1 Ohne Zusätze<br />
118<br />
Ergebnisse<br />
Bei allen Proben von L. rhamnosus (S 25), die ohne Zusätze in Gelatine gelagert<br />
wurden (Nr. 13, 17, 21, 61, 65, 69, 113, 117, 121, 161, 165 <strong>und</strong> 169), kam es von der<br />
ersten bis zur letzten Untersuchung zu methodenunabhängigen Abnahmen der<br />
Keimzahlen. Unter den wasserlöslich verkapselten Proben waren die Abnahmen der<br />
Keimzahlen der bei 20 °C gelagerten Proben (Nr. 113, 117 <strong>und</strong> 121) höher, als bei<br />
den gekühlt gelagerten Proben (Nr. 13, 17 <strong>und</strong> 21). Im Falle der bei 20 °C gelagerten<br />
Proben (Nr. 113, 117 <strong>und</strong> 121) waren die Abnahmen der Keimzahlen umso geringer,<br />
je dickwandiger die Kapsel war, d. h. bei der 50%igen Kapsel (Nr. 121) am<br />
geringsten. Unter den gekühlt gelagerten Proben zeigten die wasserunlöslich<br />
verkapselten Proben (Nr. 61, 65 <strong>und</strong> 69) geringere Abnahmen als die wasserlöslich<br />
verkapselten Proben (Nr. 13, 17 <strong>und</strong> 21). Außer<strong>dem</strong> waren die Abnahmen bei den<br />
wasserunlöslichen Proben (Nr. 61, 65 <strong>und</strong> 69) umso geringer, je dicker die Kapsel<br />
war. Hingegen zeigten die entsprechend verkapselten Proben bei 20 °C (Nr. 161,<br />
165 <strong>und</strong> 169) eine Entwicklung in umgekehrter Richtung, d. h. die Abnahmen wurden<br />
umso größer, je dicker die Kapsel wurde. Im Vergleich zu den ebenfalls bei 20 °C<br />
gelagerten wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 113, 117 <strong>und</strong> 121), waren<br />
zumin<strong>des</strong>t <strong>für</strong> die 10%ig (Nr. 161) <strong>und</strong> 30%ig verkapselten Proben (Nr. 163) die<br />
Abnahmen geringer. Eine Übersicht gibt die Abbildung 15, die jedoch noch mal<br />
grafisch veranschaulicht, dass die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben<br />
gering waren.
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
Ergebnisse<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 13, 17, 21, 61, 65, 69, Lagerung bei 20 °C: Nr. 113, 117, 121, 161, 165, 169,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 13, 17, 21, 113, 117, 121, wasserunlösliches Coating: Nr. 61, 65, 69,<br />
161, 165, 169, 10 % Coating: Nr. 13, 61, 113, 161, 30 % Coating: Nr. 17, 65, 117, 165, 50 % Coating:<br />
Nr. 21, 69, 121, 169<br />
Abbildung 15: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) ohne den Einfluss von<br />
Zusätzen<br />
4.2.3.2 Zusatz NaCl<br />
Bei den Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit Zusatz von Kochsalz zur Gelatine<br />
gelagert wurden (Nr. 14, 18, 22, 62, 66, 70, 114, 118, 122, 162, 166 <strong>und</strong> 170), kam<br />
es bei den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 14, 18, 22, 114, 118 <strong>und</strong> 122),<br />
sowohl bei einer Lagerungstemperatur von 2 °C als auch von 20 °C, zu umso<br />
geringeren Abnahmen der Keimzahlen, je dicker die Kapsel wurde. Im Fall der 50%ig<br />
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 22 <strong>und</strong> 122) kam es zu keinen eindeutigen<br />
Veränderungen der Keimzahlen mehr. Die Abnahmen der Keimzahlen der<br />
wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 62, 66, 70, 162, 166 <strong>und</strong> 170) wurden<br />
13<br />
17<br />
21<br />
61<br />
65<br />
69<br />
113<br />
117<br />
121<br />
161<br />
165<br />
169<br />
119
120<br />
Ergebnisse<br />
ebenso umso geringer, je dicker die Kapsel wurde. Hierbei waren die Abnahmen der<br />
Keimzahlen der gekühlt gelagerten Proben geringer, als der Proben bei 20 °C-<br />
Lagerung. Unter den bei 20 °C gelagerten Proben (Nr. 114, 118, 122, 162, 166 <strong>und</strong><br />
170) waren die Abnahmen bei den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 114, 118<br />
<strong>und</strong> 122) eindeutig geringer, als bei den wasserunlöslich verkapselten Proben<br />
(Nr. 162, 166 <strong>und</strong> 170). In der nachfolgenden Abbildung 16 sind diese Ergebnisse<br />
dargestellt.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 14, 18, 22, 62, 66, 70, Lagerung bei 20 °C: Nr. 114, 118, 122, 162, 166, 170,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 14, 18, 22, 114, 118, 122, wasserunlösliches Coating: Nr. 62, 66, 70,<br />
162, 166, 170, 10 % Coating: Nr. 14, 62, 114, 162, 30 % Coating: Nr. 18, 66, 118, 166, 50 % Coating:<br />
Nr. 22, 70, 122, 170<br />
Abbildung 16: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
NaCl<br />
14<br />
18<br />
22<br />
62<br />
66<br />
70<br />
114<br />
118<br />
122<br />
162<br />
166<br />
170
4.2.3.3 Zusatz Nelken<br />
Ergebnisse<br />
Nelken (gemahlen) als Zusatz zum Lagerungsmedium führten auch bei den Proben<br />
von L. rhamnosus (S 25) (Nr. 15, 19, 23, 71, 115, 119, 123, <strong>und</strong> 171) unabhängig<br />
von der Verkapselungsart <strong>und</strong> der Lagerungstemperatur dazu, dass die Keimzahlen<br />
zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der<br />
Proben, bereits unterhalb der Nachweisgrenze lagen. <strong>Aus</strong>nahmen bildeten die<br />
Proben Nr. 63 <strong>und</strong> 67, sowie 163 <strong>und</strong> 167, d. h. die mit 10%iger <strong>und</strong> 30%iger<br />
wasserunlöslicher Kapsel, bei 2 °C <strong>und</strong> auch bei 20 °C. Bei diesen Proben sanken<br />
die Keimzahlen erst ab der dritten bzw. <strong>für</strong> Nr. 63 sogar erst ab der vierten<br />
Untersuchung unter die Nachweisgrenze. Die Abbildung 17 stellt dies grafisch dar.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 63, 67, Lagerung bei 20 °C: Nr. 163, 167, wasserunlösliches Coating: Nr. 63,<br />
67, 163, 167, 10 % Coating: Nr. 63, 163, 30 % Coating: Nr. 67, 167<br />
Abbildung 17: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Nelken<br />
63<br />
67<br />
163<br />
167<br />
121
4.2.3.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer<br />
122<br />
Ergebnisse<br />
Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit einem Zusatz von Schwarzem Pfeffer<br />
gelagert wurden (Nr. 16, 20, 24, 64, 68, 72, 116, 120, 124, 164, 168 <strong>und</strong> 172), ließen<br />
hinsichtlich der Entwicklung der Keimzahlen keine so eindeutigen Trends erkennen.<br />
Unter den wasserunlöslich verkapselten Proben zeigten die bei 2 °C gelagerten<br />
Proben (Nr. 64, 68 <strong>und</strong> 72) geringere Abnahmen der Keimzahlen auf, als die bei<br />
20 °C gelagerten Proben (Nr. 164, 168 <strong>und</strong> 172). In beiden Fällen waren die<br />
Abnahmen jedoch umso geringer, je dickwandiger die Kapseln waren. Unter den<br />
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 16, 20, 24, 116, 120 <strong>und</strong> 124) gab es bei<br />
einer 20 °C-Lagerung keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Proben mit<br />
unterschiedlichen Kapselwandstärken; bei der 2 °C-Lagerung nahmen die<br />
Abnahmen der Keimzahlen mit zunehmender Kapselwandstärke zu. Die Abbildung<br />
18 verdeutlicht diese Ergebnisse.
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
Ergebnisse<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 16, 20, 24, 64, 68, 72, Lagerung bei 20 °C: Nr. 116, 120, 124, 164, 168, 172,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 16, 20, 24, 116, 120, 124, wasserunlösliches Coating: Nr. 64, 68, 72,<br />
164, 168, 172, 10 % Coating: Nr. 16, 64, 116, 164, 30 % Coating: Nr. 20, 68, 120, 168, 50 % Coating:<br />
Nr. 24, 72, 124, 172<br />
Abbildung 18: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer<br />
4.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26)<br />
Die Lagerung der mikroverkapselten Proben von L. paracasei (S 26) erfolgte nur in<br />
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von<br />
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen. Die Proben wurden im Laufe der<br />
Lagerung zu sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht. Eine Übersicht über die<br />
Keimzahlentwicklungen der Proben von L. paracasei (S 26) zeigt die Tabelle 27 im<br />
Anhang (Kap. 10.1).<br />
16<br />
20<br />
24<br />
64<br />
68<br />
72<br />
116<br />
120<br />
124<br />
164<br />
168<br />
172<br />
123
4.2.4.1 Ohne Zusätze<br />
124<br />
Ergebnisse<br />
Ohne Zusätze in Gelatine bei 2 °C gelagerte Proben von L. paracasei (S 26) (Nr. 25,<br />
29, 33, 73, 77 <strong>und</strong> 81) zeigten keine methodenunabhängigen Änderungen der<br />
Keimzahlen, unabhängig von der Verkapselungsart (<strong>Aus</strong>nahmen: Nr. 25 <strong>und</strong> 81). Die<br />
entsprechenden bei 20 °C gelagerten Proben (Nr. 125, 129, 133, 173, 177 <strong>und</strong> 181)<br />
zeigten hingegen methodenunabhängige Abnahmen auf (siehe Abb. 19), wobei bei<br />
den wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 173, 177 <strong>und</strong> 181) umso geringere<br />
Abnahmen festgestellt wurden, je dickwandiger die Kapseln waren.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 25, 29, 33, 73, 77, 81, Lagerung bei 20 °C: Nr. 125, 129, 133, 173, 177, 181,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 25, 29, 33, 125, 129, 133, wasserunlösliches Coating: Nr. 73, 77, 81,<br />
173, 177, 181, 10 % Coating: Nr. 25, 73, 125, 173, 30 % Coating: Nr. 29, 77, 129, 177, 50 % Coating:<br />
Nr. 33, 81, 133, 181<br />
Abbildung 19: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) ohne den Einfluss von<br />
Zusätzen<br />
25<br />
29<br />
33<br />
73<br />
77<br />
81<br />
125<br />
129<br />
133<br />
173<br />
177<br />
181
4.2.4.2 Zusatz NaCl<br />
Ergebnisse<br />
Proben von L. paracasei (S 26), die mit <strong>dem</strong> Zusatz von NaCl zur Gelatine gelagert<br />
wurden (Nr. 26, 30, 34, 74, 78, 82, 126, 130, 134, 174, 178 <strong>und</strong> 182), wiesen unter<br />
den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 26, 30, 34, 126, 130 <strong>und</strong> 134) nur <strong>für</strong> die<br />
Proben mit 10%igen Kapseln methodenunabhängige Abnahmen auf, welche bei<br />
20 °C Lagerungstemperatur größer waren. Für wasserunlöslich verkapselte Proben<br />
mit Zusatz von NaCl (Nr. 74, 78, 82, 174, 178 <strong>und</strong> 182) konnten lediglich <strong>für</strong> Proben<br />
mit 30%igen Kapseln (Nr. 78 <strong>und</strong> 178), unabhängig von der Lagerungstemperatur,<br />
sowie <strong>für</strong> Proben mit 50%igen Kapseln <strong>und</strong> einer Lagerungstemperatur von 2 °C<br />
(Nr. 82), eindeutige Abnahmen festgestellt werden. Die nachfolgende Abbildung 20<br />
gibt eine Übersicht über die Entwicklung der Keimzahlen.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 26, 30, 34, 74, 78, 82, Lagerung bei 20 °C: Nr. 126, 130, 134, 174, 178, 182,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 26, 30, 34, 126, 130, 134, wasserunlösliches Coating: Nr. 74, 78, 82,<br />
174, 178, 182, 10 % Coating: Nr. 26, 74, 126, 174, 30 % Coating: Nr. 30, 78, 130, 178, 50 % Coating:<br />
Nr. 34, 82, 134, 182<br />
Abbildung 20: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
NaCl<br />
26<br />
30<br />
34<br />
74<br />
78<br />
82<br />
126<br />
130<br />
134<br />
174<br />
178<br />
182<br />
125
4.2.4.3 Zusatz Nelken<br />
126<br />
Ergebnisse<br />
Proben von L. paracasei (S 26), die mit einem Zusatz von Nelken zum<br />
Lagerungsmedium (Nr. 27, 31, 35, 75, 79, 83, 127, 131, 135, 175, 179 <strong>und</strong> 183)<br />
gelagert wurden, wiesen, unabhängig von der Verkapselungsart <strong>und</strong> der<br />
Lagerungstemperatur, zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach der<br />
Einlagerung der Proben, bereits Keimzahlen auf, die unterhalb der Nachweisgrenze<br />
lagen. An dieser Tatsache änderte sich im Verlauf der weiteren Untersuchungen<br />
nichts mehr, weshalb auch auf eine grafische Darstellung verzichtet wurde.<br />
4.2.4.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer<br />
Schwarzer Pfeffer als Zusatz zum Lagerungsmedium von L. paracasei (S 26) führte<br />
bei den nicht gekühlt gelagerten Proben (Nr. 128, 132, 136, 176, 180 <strong>und</strong> 184)<br />
unabhängig von der Verkapselungsart zu sehr viel höheren methodenunabhängigen<br />
Abnahmen der Keimzahlen, als bei den entsprechenden gekühlt gelagerten Proben<br />
(Nr. 28, 32, 36, 76, 80 <strong>und</strong> 84). Unter den gekühlt gelagerten Proben gab es keine<br />
methodenunabhängigen Unterschiede zwischen den Proben mit unterschiedlichen<br />
Verkapselungsarten (siehe Abb. 21).
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
Ergebnisse<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 28, 32, 36, 76, 80, 84, Lagerung bei 20 °C: Nr. 128, 132, 136, 176, 180, 184,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 28, 32, 36, 128, 132, 136, wasserunlösliches Coating: Nr. 76, 80, 84,<br />
176, 180, 184, 10 % Coating: Nr. 28, 76, 128, 176, 30 % Coating: Nr. 32, 80, 132, 180, 50 % Coating:<br />
Nr. 36, 84, 136, 184<br />
Abbildung 21: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer<br />
4.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28)<br />
Die mikroverkapselten Proben von L. gasseri (S 28) wurden ebenfalls nur in<br />
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von<br />
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen gelagert, <strong>und</strong> im Laufe der Lagerung zu<br />
sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht. Die Tabelle 28 im Anhang (Kap. 10.1)<br />
gibt eine Übersicht über die Entwicklung der Keimzahlen von L. gasseri (S 28).<br />
28<br />
32<br />
36<br />
76<br />
80<br />
84<br />
128<br />
132<br />
136<br />
176<br />
180<br />
184<br />
127
4.2.5.1 Ohne Zusätze<br />
128<br />
Ergebnisse<br />
Die Proben von L. gasseri (S 28), die nur in Gelatine ohne weitere Zusätze (Nr. 37,<br />
41, 45, 85, 89, 93, 137, 141, 145, 185, 189 <strong>und</strong> 193) gelagert wurden, zeigten bei der<br />
2 °C-Lagerung deutlich höhere Abnahmen als bei einer Lagerungstemperatur von<br />
20 °C (siehe Abb. 22). Dies galt <strong>für</strong> die wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 37,<br />
41, 45, 137, 141 <strong>und</strong> 145), wie auch <strong>für</strong> die wasserunlöslich verkapselten Proben<br />
(Nr. 85, 89, 93, 185, 189, 193). Im Fall der wasserunlöslich verkapselten <strong>und</strong> bei<br />
20 °C gelagerten Proben (Nr. 185, 189 <strong>und</strong> 193) kam es sogar zur Zunahme der<br />
Keimzahlen.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 37, 41, 45, 85, 89, 93, Lagerung bei 20 °C: Nr. 137, 141, 145, 185, 189, 193,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 37, 41, 45, 137, 141, 145, wasserunlösliches Coating: Nr. 85, 89, 93,<br />
185, 189, 193, 10 % Coating: Nr. 37, 85, 137, 185, 30 % Coating: Nr. 41, 89, 141, 189, 50 % Coating:<br />
Nr. 45, 93, 145, 193<br />
Abbildung 22: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) ohne den Einfluss von<br />
Zusätzen<br />
37<br />
41<br />
45<br />
85<br />
89<br />
93<br />
137<br />
141<br />
145<br />
185<br />
189<br />
193
4.2.5.2 Zusatz NaCl<br />
Ergebnisse<br />
Die Lagerung von L. gasseri-Proben (S 28) mit <strong>dem</strong> Zusatz von NaCl zum<br />
Lagerungsmedium (siehe Abb. 23) führte bei einer Lagerungstemperatur von 20 °C<br />
(Nr. 138, 142, 146, 186, 190 <strong>und</strong> 194) zu geringeren Abnahmen der Keimzahlen als<br />
bei 2 °C (Nr. 38, 42, 46, 86, 90, 94). Die wasserunlöslich verkapselten Proben mit<br />
10%igen (Nr. 86 <strong>und</strong> 186) <strong>und</strong> 50%igen (Nr. 94 <strong>und</strong> 194) Kapseln zeigten bereits<br />
zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der<br />
Proben, Keimzahlen unterhalb der Nachweisgrenze auf. Für die 30%ig wasserlöslich<br />
verkapselten Proben ergab sich bei 2 °C-Lagerung (Nr. 90) eine deutliche Abnahme<br />
der Keimzahl; bei 20 °C-Lagerung (Nr. 190) kam es zu keinen<br />
methodenunabhängigen Abnahmen.<br />
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 38, 42, 46 86, 90, 94, Lagerung bei 20 °C: Nr. 138, 142, 146, 186, 190, 194,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 38, 42, 46, 138, 142, 146, wasserunlösliches Coating: Nr. 86, 90, 94,<br />
186, 190, 194, 10 % Coating: Nr. 38, 86, 138, 186, 30 % Coating: Nr. 42, 90, 142, 190, 50 % Coating:<br />
Nr. 46, 94, 146, 194<br />
Abbildung 23: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
NaCl<br />
38<br />
42<br />
46<br />
86<br />
90<br />
94<br />
138<br />
142<br />
146<br />
186<br />
190<br />
194<br />
129
4.2.5.3 Zusatz Nelken<br />
130<br />
Ergebnisse<br />
Unabhängig von der Verkapselungsart <strong>und</strong> der Lagerungstemperatur lagen die<br />
Keimzahlen aller Proben von L. gasseri (S 28) mit Zusatz von Nelken zum<br />
Lagerungsmedium (Nr. 39, 43, 47, 87, 91, 95, 139, 143, 147, 187, 191 <strong>und</strong> 195)<br />
bereits zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. unmittelbar nach Einlagerung<br />
der Proben, unterhalb der Nachweisgrenze. Im Laufe der weiteren Untersuchungen<br />
änderte sich darin nichts mehr, weshalb auch auf eine grafische Darstellung der<br />
Ergebnisse verzichtet wurde.<br />
4.2.5.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer<br />
Die Proben von L. gasseri (S 28), die mit Zusatz von Schwarzem Pfeffer gelagert<br />
wurden (Nr. 40, 44, 48, 88, 92, 96, 140, 144, 148, 188, 192 <strong>und</strong> 196), zeigten bei der<br />
gekühlten Lagerung geringere Abnahmen der Keimzahlen, als bei 20 °C gelagert.<br />
Bei allen Proben kam es zu geringeren Abnahmen, je dickwandiger die Kapseln<br />
waren (<strong>Aus</strong>nahmen: Nr. 96, 192). Die Abbildung 24 stellt diese Ergebnisse grafisch<br />
dar.
Keimzahl in lgKbE/ml<br />
11,00<br />
10,00<br />
9,00<br />
8,00<br />
7,00<br />
6,00<br />
5,00<br />
4,00<br />
3,00<br />
2,00<br />
1,00<br />
0,00<br />
Ergebnisse<br />
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)<br />
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)<br />
Lagerung bei 2 °C: Nr. 40, 44, 48, 88, 92, 94, Lagerung bei 20 °C: Nr. 140, 144, 148, 188, 192, 196,<br />
wasserlösliches Coating: Nr. 40, 44, 48, 140, 144, 148, wasserunlösliches Coating: Nr. 88, 92, 96,<br />
188, 192, 196, 10 % Coating: Nr. 40, 88, 140, 188, 30 % Coating: Nr. 44, 92, 144, 192, 50 % Coating:<br />
Nr. 48, 96, 148, 196<br />
Abbildung 24: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer<br />
40<br />
44<br />
48<br />
88<br />
92<br />
96<br />
140<br />
144<br />
148<br />
188<br />
192<br />
196<br />
131
5 Diskussion<br />
Diskussion<br />
Ziel dieser Studie war es, die technologischen <strong>und</strong> mikrobiologischen Gr<strong>und</strong>lagen <strong>für</strong><br />
den Einsatz mikroverkapselter Probiotika in Fleischerzeugnissen unterschiedlicher<br />
Technologien, in Fleischzubereitungen <strong>und</strong> in Convenience-Erzeugnissen zu<br />
erarbeiten.<br />
<strong>Aus</strong>gewählte Laktobazillen mit probiotischer Wirkung wurden verschiedenen<br />
Mikroverkapselungsverfahren unterzogen. In einem sich anschließenden<br />
Lagerungsversuch wurden die mikroverkapselten Bakterien unterschiedlichen<br />
Lagerungsbedingungen ausgesetzt <strong>und</strong> der Einfluss von Kochsalz <strong>und</strong> Gewürzen,<br />
untersucht.<br />
In einer Verlaufskontrolle, die sich über den Lagerungszeitraum erstreckte, wurde die<br />
Lebensfähigkeit der mikroverkapselten Bakterien überprüft. Auf diese Weise wurde<br />
untersucht, ob die mikroverkapselten Laktobazillen <strong>für</strong> einen Einsatz u. a. in<br />
Gewürzmischungen <strong>und</strong> essbaren Hüllen in den oben genannten Produkten geeignet<br />
sind.<br />
5.1 Verwendete Bakterien<br />
Bei den verwendeten Bakterienstämmen handelte es sich um Re-Isolate aus<br />
verschiedenen probiotischen Produkten, d. h. um definierte lebende<br />
Mikroorganismen, die in ausreichender Menge in aktiver Form in den Darm gelangen<br />
<strong>und</strong> hierbei positive ges<strong>und</strong>heitliche Effekte erzielen. In probiotischen Lebensmitteln<br />
sind die Probiotika in einer Menge enthalten, bei der die probiotischen Wirkungen<br />
nach <strong>dem</strong> Verzehr eines derartigen Lebensmittels erzielt werden (ARBEITSGRUPPE<br />
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN LEBENSMITTELN“ AM<br />
BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND<br />
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000).<br />
133
134<br />
Diskussion<br />
Es wurden Re-Isolate aus Produkten ausgewählt. Auf diese Weise konnte man<br />
davon ausgehen, dass die probiotischen Wirkungen der Bakterien bereits<br />
nachgewiesen wurden. Als Stämme wurden vier weit verbreitete Laktobazillen<br />
ausgewählt.<br />
Speziell handelte es sich um die probiotischen Stämme L. reuteri (S 24),<br />
L. rhamnosus (S 25) <strong>und</strong> L. paracasei (S 26), alle isoliert aus probiotischen<br />
Milcherzeugnissen, <strong>und</strong> L. gasseri (S 28), isoliert aus einem humanmedizinischen<br />
Probiotikum in Kapselform.<br />
Wie erwartet stellten sich die Stämme entsprechend den Beschreibungen in der<br />
Literatur dar. Vertreter der Gattung Lactobacillus sind grampositive kurze bis lange,<br />
z. T. auch kokkoide Stäbchen (BAUMGART u. BECKER 2003).<br />
KANDLER et al. (1980) <strong>und</strong> HAMMES <strong>und</strong> VOGEL (1995) beschreiben L. reuteri als<br />
ein wenig irregulär gekrümmtes Stäbchen, 0,7 - 1,0 µm x 2,0 - 5,0 µm groß, mit<br />
abger<strong>und</strong>eten Enden, einzeln, in Paaren oder kleinen Gruppen. L. reuteri (S 24) als<br />
mittellanges Stäbchen konnte in den eigenen Untersuchungen bestätigt werden.<br />
Nach COLLINS et al. (1989) sowie HAMMES <strong>und</strong> VOGEL (1995) erscheint<br />
L. paracasei stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm groß, häufig mit breiten<br />
Enden, einzeln oder in Ketten, nicht beweglich. L. rhamnosus ist ebenfalls<br />
stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm groß, häufig mit breiten Enden, einzeln<br />
oder in Ketten, nicht beweglich. Entsprechend konnten in den eigenen<br />
Untersuchungen L. rhamnosus (S 25) als kurze bis mittellange Stäbchen <strong>und</strong><br />
L. paracasei (S 26) als sehr schlanke, mittellange Stäbchen nachgewiesen werden.<br />
L. gasseri stellt sich nach LAUER <strong>und</strong> KANDLER (1980) <strong>und</strong> HAMMES <strong>und</strong> VOGEL<br />
(1995) mikroskopisch als Stäbchen mit abger<strong>und</strong>eten Enden dar, mit einer Größe<br />
von 0,6 - 0,8 µm x 3,0 - 5,0 µm <strong>und</strong> kommt einzeln oder in Ketten vor. In den eigenen<br />
Untersuchungen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass es sich bei L. gasseri (S 28)<br />
um mittellange bis lange Stäbchen handelte.<br />
Makroskopisch betrachtet waren L. reuteri (S 24) glatte bis raue, mittelgroße,<br />
wachsig-weiße, zentral hellere, leicht gewölbte Kolonien, L. rhamnosus (S 25) glatte,<br />
große, strahlend-weiße, gewölbte Kolonien, L. paracasei (S 26) glatte, mittelgroße,
Diskussion<br />
gewölbte Kolonien <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) raue bis glatte, kleine, wachsig-weiße, sehr<br />
feine, leicht gewölbte Kolonien.<br />
5.2 Vorversuche<br />
In den Vorversuchen wurden die Bedingungen <strong>für</strong> den Lagerungsversuch<br />
ausgetestet. Untersucht wurde der Einfluss von zwölf verschiedenen Gewürzen,<br />
Nelken (gemahlen), Schwarzer Pfeffer (gemahlen), Knoblauchgranulat, Oregano<br />
(gerebelt), Ingwer (gemahlen), Senfkörner, Basilikum (gerebelt), Rosen-Paprika<br />
(gemahlen), Paprika edelsüß (gemahlen), Majoran (gemahlen), Zwiebelgranulat <strong>und</strong><br />
Kümmelgranulat (gemahlen), sowie von Kochsalz in drei verschiedenen<br />
Konzentrationen (1 %, 2 % bzw. 5 %) auf das Wachstum der vier verschiedenen<br />
Bakterienstämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong><br />
L. gasseri (S 28).<br />
5.2.1 Vergleich von Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren<br />
Im ersten Abschnitt der Vorversuche wurde die Vergleichbarkeit der Ergebnisse aus<br />
Spatel- <strong>und</strong> Tropfplattenverfahren überprüft. Die gewichteten Mittelwerte der<br />
Keimzahlen der Arbeitsbouillon (B1) von S 24, S 25, S 26 <strong>und</strong> S 28 lagen in<br />
<strong>dem</strong>selben Zehnerpotenzbereich. Es bestanden also keine eindeutigen Unterschiede<br />
zwischen den beiden angewendeten mikrobiologischen Verfahren, <strong>und</strong> eine<br />
Vergleichbarkeit der Ergebnisse konnte nachgewiesen werden. Dies war insofern zu<br />
erwarten, da beide Verfahren nach der Amtlichen Sammlung von<br />
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB zugelassen sind. Die Qualität<br />
der eigenen Arbeitsweise <strong>und</strong> der Laborbedingungen konnte so noch einmal<br />
bestätigt werden. In den nachfolgenden Versuchen wurde zwecks Kosten- <strong>und</strong><br />
Materialersparnis nur noch das Tropfplattenverfahren angewendet.<br />
135
5.2.2 Einfluss Gewürze<br />
136<br />
Diskussion<br />
Alle Gewürze mit ätherischen Ölen <strong>und</strong> isolierte ätherische Öle wirken mehr oder<br />
weniger stark antimikrobiell (TEUSCHER 2003). Bei zahlreichen Gewürzen sind die<br />
ätherischen Öle Träger der antimikrobiellen Wirksamkeit (NARAHIMSARAO u.<br />
NIGAM 1970).<br />
Die antimikrobielle Wirksamkeit von Gewürzen auf vier probiotische<br />
Bakterienstämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong><br />
L. gasseri (S 28) sollte in den Vorversuchen untersucht werden. Von zwölf<br />
untersuchten Gewürzen sollten die zwei Gewürze mit den größten Einflüssen auf die<br />
Keimzahlen <strong>für</strong> den Lagerungsversuch ausgewählt werden.<br />
Nelken (gemahlen) führten im Vorversuch bei allen vier Stämmen zu einer<br />
vollständigen Hemmung <strong>des</strong> Keimwachstums. Bei allen vier Stämmen lagen die<br />
Keimzahlen der MRS-Bouillon (B2) mit Nelkenzusatz unterhalb der Nachweisgrenze<br />
von 2,30 lg KbE/ml. Es kam zu methodenunabhängigen Abnahmen der Keimzahlen,<br />
weshalb Nelken als eines der beiden Gewürze <strong>für</strong> den Lagerungsversuch<br />
ausgewählt wurde. Auf diese Weise sollte der „worst case“ simuliert werden, auch<br />
wenn Nelken als Gewürz eher selten in der Herstellung von Fleischerzeugnissen<br />
zum Einsatz kommen.<br />
Die gute antimikrobielle Wirkung von Extrakten aus Gewürznelken <strong>und</strong> Nelkenöl<br />
zeigten auch HITOKOTO et al. (1980), BRIOZZO et al. (1989), BEUCHAT (1994)<br />
sowie DORMAN <strong>und</strong> DEANS (2000). Nach MABROUK <strong>und</strong> EL-SHAYEP (1980) wird<br />
das Wachstum mycotoxigener Pilze <strong>und</strong> deren Mycotoxinbildung bereits durch 0,1 %<br />
Nelkenpulver im Substrat völlig unterdrückt. ZAIKA u. KISSINGER (1979) konnten<br />
nachweisen, dass Nelken eine Starterkultur, bestehend aus L. plantarum <strong>und</strong><br />
P. cerevisiae, ab 4,0 g/l hemmten, niedrigere Konzentrationen (0,5 - 2,0 g/l) die<br />
Säureproduktion stimulierten. Für die Laktobazillen-Spezies mit den untersuchten<br />
Stämmen L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri<br />
(S 28) lagen bezüglich der Wirkung von Nelken noch keine Ergebnisse in der<br />
Literatur vor.
Diskussion<br />
Schwarzer Pfeffer (gemahlen) führte bei L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) zur<br />
methodenunabhängigen Reduzierung der Keimzahlen. Die Keimzahl von<br />
L. paracasei (S 26) wurde unter <strong>dem</strong> Einfluss von Schwarzem Pfeffer um<br />
2,11 lg KbE/ml, die von L. gasseri (S 28) um 1,63 lg KbE/ml reduziert. Das<br />
Wachstum von L. rhamnosus (S 25) wurde durch Schwarzen Pfeffer nicht eindeutig<br />
beeinflusst, obwohl L. rhamnosus wie L. paracasei zu der L. casei-Gruppe gehört<br />
(KLEIN et al. 1998). Das Wachstum von L. reuteri (S 24) wurde ebenfalls nicht<br />
beeinflusst. Schwarzer Pfeffer (gemahlen) wurde aufgr<strong>und</strong> der<br />
methodenunabhängigen, hemmenden Wirkung auf zwei der Bakterien, aber auch<br />
aufgr<strong>und</strong> <strong>des</strong> häufigen Einsatzes in der Produktion von Fleischerzeugnissen, als<br />
zweites Gewürz <strong>für</strong> die weiteren Versuche ausgewählt.<br />
HUHTANEN (1980), MABROUK <strong>und</strong> EL-SHAYEP (1980), ISMAIEL <strong>und</strong> PIERSON<br />
(1990), PEREZ <strong>und</strong> ANESINI (1994) <strong>und</strong> DORMAN <strong>und</strong> DEANS (2000) wiesen<br />
ebenso nach, dass ethanolische Pfefferextrakte oder ätherisches Pfefferöl<br />
antibakteriell wirken. Nach ROY et al. (1988) <strong>und</strong> EL-KADY et al. (1995) wird das<br />
Wachstum mycotoxigener Schimmelpilze aber offenbar nicht beeinflusst, da Pfeffer<br />
hohe Konzentrationen an Aflatoxinen enthalten kann.<br />
Für die Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong><br />
L. gasseri (S 28), die in den eigenen Untersuchungen eingesetzt wurden, lagen<br />
bezüglich der Wirkung von Schwarzem Pfeffer keine Vergleiche in der Literatur vor.<br />
GONZALEZ-FANDOS et al. (1996) konnten jedoch zeigen, dass Schwarzer Pfeffer in<br />
Konzentrationen von 5 %, wobei in den eigenen Untersuchungen 10 % eingesetzt<br />
wurden, eine antimikrobielle Wirkung auf in der Wurstfermentation eingesetzte<br />
Laktobazillen (L. plantarum DSM 20174, L. curvatus DSM 20019, L. sakei DSM<br />
20017) <strong>und</strong> Pediokokken (P. damnosus DSM 20031) ausübt.<br />
Die weiteren untersuchten Gewürze kamen <strong>für</strong> den Lagerungsversuch nicht in Frage,<br />
da die Abnahmen der Keimzahlen im Vergleich zu Nelken <strong>und</strong> Schwarzem Pfeffer<br />
geringer waren.<br />
137
5.2.3 Einfluss Kochsalzkonzentration<br />
138<br />
Diskussion<br />
In den Vorversuchen wurde der Einfluss von 1 %, 2 % <strong>und</strong> 5 % NaCl auf die<br />
Keimzahlen von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong><br />
L. gasseri (S 28) untersucht, wobei 5 % als Zusatz in Fleischerzeugnissen oder<br />
sonstigen Produkten schon vergleichsweise hoch ist.<br />
L. rhamnosus (S 25) zeigte sich gegenüber Kochsalz besonders resistent <strong>und</strong> 5 %<br />
führten hier lediglich zu einer Reduzierung der Keimzahl um 0,34 lg KbE/ml. Die<br />
Keimzahl von L. reuteri (S 24) wurde durch 5 % NaCl-Zusatz um 3,09 lg KbE/ml, die<br />
Keimzahl von L. paracasei (S 26) um 1,51 lg KbE/ml <strong>und</strong> die Keimzahl von L. gasseri<br />
(S 28) um 2,20 lg KbE/ml reduziert. 5 % Kochsalzzusatz führte also bei allen vier<br />
Stämmen zu einer Reduzierung der Keimzahl, welche außer <strong>für</strong> L. rhamnosus (S 25)<br />
auch methodenunabhängig war. Obwohl L. paracasei (S 26) wie L. rhamnosus<br />
(S 25) zur L. casei-Gruppe gehört (KLEIN et al. 1998) wurde dieser durch 5 % NaCl-<br />
Zusatz eindeutig im Wachstum beeinträchtigt.<br />
Nach AXELSSON (2004) gilt <strong>für</strong> alle Lactobacillus-Spezies, dass bei 18 % NaCl kein<br />
Wachstum mehr stattfindet, das Wachstum in Gegenwart von 6,5 % NaCl ist<br />
hingegen speziesabhängig. Die speziesspezifische Eigenschaft der Toleranz<br />
gegenüber NaCl konnte in den Vorversuchen bestätigt werden. Konkrete <strong>Aus</strong>sagen<br />
darüber, wie viel Kochsalz, welche Lactobacillus-Spezies toleriert, lagen in der<br />
Literatur nicht vor.<br />
Die Einflüsse auf die Keimzahlen durch 1 % bzw. 2 % NaCl waren im Vergleich zu<br />
5 % NaCl geringer, weshalb <strong>für</strong> den Lagerungsversuch einer Charge <strong>des</strong><br />
Lagerungsmediums 5 % Kochsalz zugesetzt wurde.<br />
5.3 Lyophilisation<br />
Die probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26)<br />
<strong>und</strong> L. gasseri (S 28) wurden durch die Firma THT SA lyophilisiert. Die Lyophilisate
Diskussion<br />
wurden mit einer Konzentration von min<strong>des</strong>tens 10 10 KbE/g hergestellt. Diese<br />
Konzentration erschien sinnvoll aufgr<strong>und</strong> der Tatsache, dass die empfohlene täglich<br />
aufzunehmende, minimale therapeutische Dosis <strong>für</strong> probiotische Bakterien bei<br />
10 8 bis 10 9 KbE liegt, um probiotische Effekte zu erzielen, wobei die Empfehlung <strong>für</strong><br />
das probiotische Produkt am Ende <strong>des</strong> Min<strong>des</strong>thaltbarkeitsdatums bei 10 6 KbE pro<br />
ml liegt (SHAH 2000, KAILASAPATHY u. CHIN 2000). Nach SANDERS u. HUIS IN’T<br />
VELD (1999) erscheint auf der Basis von In-vitro-Studien sogar eine täglich<br />
aufzunehmende Dosis von 10 9 bis 10 10 KbE probiotischer Bakterien notwendig, um<br />
probiotische Effekte zu erzielen.<br />
Durch die Qualitätssicherung von THT SA am Ende der Lyophilisation wurde<br />
sichergestellt, dass es zu keiner Kontamination <strong>des</strong> Probenmaterials kam. Es wurde<br />
auf coliforme Keime, Enterobacteriaceae sowie Hefen <strong>und</strong> Schimmelpilze untersucht.<br />
5.4 Mikroverkapselung<br />
Die Mikroverkapselung der lyophilisierten Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus<br />
(S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) erfolgte durch die Firma Micap ®<br />
GmbH, Bremerhaven, Deutschland. Zweck der Mikroverkapselung ist im<br />
Zusammenhang mit Lebensmitteln der Schutz <strong>des</strong> verkapselten Materials oder <strong>des</strong><br />
aufnehmenden Lebensmittels vor verschiedenen schädlichen Einflüssen (KUNZ et<br />
al. 2003).<br />
Die Wahl der Verkapselungsmethode richtet sich, ebenso wie die <strong>Aus</strong>wahl der<br />
Materialien (hydrophile bzw. hydrophobe Substanzen), nach der Verwendungsform<br />
<strong>und</strong> <strong>dem</strong> Anwendungsbereich (HOBEIN u. LUTZ 1989).<br />
Um möglichst verschiedene Verwendungsformen <strong>und</strong> Anwendungsbereiche<br />
abdecken zu können, erfolgte die Verkapselung der probiotischen Stämme sowohl<br />
mit einem wasserlöslichen (Maltodextrin, native Maisstärke), als auch mit einem<br />
wasserunlöslichen (gehärtetes, raffiniertes Pflanzenfett auf der Basis von laurinfreien<br />
Fetten, Zuckerester, Methylcellulose) Coating. Je<strong>des</strong> der beiden Coatingverfahren<br />
139
140<br />
Diskussion<br />
wurde in drei unterschiedlichen Formulierungen, die auch industriell üblich sind,<br />
erstellt, d. h. mit 10 %, 30 % bzw. 50 % Kapselanteil. Als Verkapselungsverfahren<br />
wurde das <strong>für</strong> die Firma Micap ® GmbH Verfahren der Wahl angewendet. Das sog.<br />
Wirbelschicht-Coating (Fließbett-Beschichtung) schließt fluidisierende Partikel durch<br />
Besprühen mit Kapselmaterial in der Wirbelschicht ein (KUNZ et al. 2003).<br />
Es wurde durch die Firma Micap ® GmbH garantiert, dass die Produkttemperatur<br />
während <strong>des</strong> gesamten Prozesses bei 34 - 37 °C lag, um die eingesetzten Stämme<br />
nicht negativ zu beeinträchtigen. Mit 34 - 37 °C wurde der optimale<br />
Temperaturbereich bezüglich <strong>des</strong> Wachstums der Laktobazillen nicht überschritten<br />
(BAUMGART u. BECKER 2003).<br />
Die Verkapselung erfolgte unter sterilen Bedingungen, so dass eine Kontamination<br />
während <strong>des</strong> Herstellungsprozesses nahezu ausgeschlossen werden kann. Eine<br />
Qualitätssicherung diesbezüglich, wie bei den Lyophilisaten, erfolgte durch die<br />
Micap ® GmbH nicht.<br />
Auch konnten seitens der Firma Micap ® GmbH keine Angaben über Konzentrationen<br />
im verkapselten Produkt gemacht werden. Es wurden jedoch zu Beginn <strong>des</strong><br />
Lagerungsversuchs (erste Untersuchung zum Zeitpunkt Null, U1) vergleichend in<br />
allen Proben die Konzentrationen bestimmt, so dass auf diese <strong>Aus</strong>kunft verzichtet<br />
werden konnte.<br />
5.5 Lagerungsversuch<br />
5.5.1 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze<br />
Die Keimzahl von Kräutern <strong>und</strong> Gewürzen kann mit bis zu 10 7 KbE/g vergleichsweise<br />
hoch sein (BECKMANN et al. 1996). Die Infektionsgefahren <strong>für</strong> den Menschen sind<br />
jedoch als gering einzuschätzen, da in der Regel während Herstellungs- <strong>und</strong><br />
Kochprozessen die Mikroorganismen abgetötet werden (TEUSCHER 2003).<br />
Die beiden Gewürze (Nelken <strong>und</strong> Schwarzer Pfeffer), die <strong>für</strong> den Lagerungsversuch<br />
verwendet werden sollten, wurden folglich zuvor hinsichtlich ihres Keimstatus
Diskussion<br />
untersucht. Hierbei ergab sich eine nicht unerhebliche Keimbelastung mit mehreren<br />
Spezies, wie auch von BECKMANN et al. (1996) <strong>und</strong> TEUSCHER (2003)<br />
beschrieben. Die Belastung war im Vergleich zu Nelken (gemahlen) bei Schwarzem<br />
Pfeffer (gemahlen) sehr viel höher. Unter den kontaminierenden Mikroorganismen<br />
waren, wie auch bei TEUSCHER (2003), aerobe Sporenbildner (Nelken:<br />
3,00 lg KbE/g; Schwarzer Pfeffer: 6,00 lg KbE/g) sowie Hefen <strong>und</strong> Schimmelpilze<br />
(Nelken: negativ in 10 g; Schwarzer Pfeffer: 3,00 lg KbE/g). Ebenfalls nachgewiesen<br />
wurden aber auch Enterobacteriazeen (Nelken: 3,00 lg KbE/g; Schwarzer Pfeffer:<br />
4,76 lg KbE/g) <strong>und</strong> sulfitreduzierende Clostridien (Nelken: 1,00 lg KbE/g; Schwarzer<br />
Pfeffer: 3,18 lg KbE/g). Nicht nachweisbar waren Salmonellen (negativ in 25 g).<br />
Milchsäurebakterien konnten ebenfalls in keiner der beiden Proben nachgewiesen<br />
werden, wobei die Nachweisgrenze bei 2,00 lg KbE/g lag, <strong>und</strong> als absoluter Wert hier<br />
die halbe Nachweisgrenze, also 1,70 lg KbE/g, angenommen wurde. Insbesondere<br />
das Nichtvorhandensein von Milchsäurebakterien, speziell Laktobazillen, war eine<br />
wichtige Voraussetzung <strong>für</strong> den nachfolgenden Lagerungsversuch.<br />
Die von BECKMANN et al. (1996) beschriebene vergleichsweise hohe<br />
Keimbelastung von Gewürzen konnte bestätigt werden. Die Richt- <strong>und</strong> Warnwerte<br />
der Deutschen Gesellschaft <strong>für</strong> Hygiene <strong>und</strong> Mikrobiologie <strong>für</strong> Gewürze, die zur<br />
Abgabe an den Verbraucher bestimmt sind oder in der untersuchten Form <strong>dem</strong><br />
Lebensmittel zugesetzt <strong>und</strong> keinem keimreduzierenden Verfahren unterworfen<br />
werden (DGHM 1988), wurden hingegen nicht überschritten.<br />
5.5.2 Einlagerung <strong>und</strong> Untersuchung der Proben<br />
Die Lyophilisate der vier Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei<br />
(S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) wurden in den Lagerungsversuch mit einbezogen. Dazu<br />
wurden 1 g ± 0,1 g der Lyophilisate in autoklavierte Röhrchen steril eingewogen, so<br />
dass es zu keiner Kontamination kommen konnte.<br />
141
142<br />
Diskussion<br />
Als Lagerungsmedium <strong>für</strong> die mikroverkapselten Stämme L. reuteri (S 24),<br />
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) wurde Speisegelatine<br />
ausgewählt, da diese eine häufige Zutat in Fleischerzeugnissen ist <strong>und</strong> zu<strong>dem</strong> gute<br />
Träger- <strong>und</strong> Bindungseigenschaften aufweist. Speziell wurde die GELITA ®<br />
Speisegelatine, 240 Bloom 20 mesh PS, ausgewählt, <strong>und</strong> in einer üblichen<br />
Verdünnung 100 g pro 900 ml Aqua. <strong>des</strong>t. angesetzt <strong>und</strong> gelöst. In diesem Verhältnis<br />
erwies sich die Gelatine als stabil <strong>und</strong> zeigte gute Geliereigenschaften. Je 10 ml<br />
wurden in die Lagerungsröhrchen abgefüllt <strong>und</strong> bei 121 °C ± 0,5 °C autoklaviert<br />
(Lagerungsmedium Nr. 1). Der Kochverlust durch das Autoklavieren verteilte sich wie<br />
auch bei den Nährmedien <strong>und</strong> Lösungen auf alle Röhrchen in gleichem Maße.<br />
Nach <strong>Aus</strong>wertung der Vorversuche (siehe Kap. 3.2.2) wurden, wie bereits in Kapitel<br />
5.2 diskutiert, <strong>für</strong> den Lagerungsversuch als Zusätze 5 % NaCl (Lagerungsmedium<br />
Nr. 2), 10 % Nelken (Lagerungsmedium Nr. 3) bzw. 10 % Schwarzer Pfeffer<br />
(Lagerungsmedium Nr. 4) ausgewählt, da diese zu einer deutlichen Beeinträchtigung<br />
<strong>des</strong> Wachstums der vier probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus<br />
(S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) führten.<br />
Die Probenröhrchen wurden bei zwei Temperaturen gelagert: gekühlt bei<br />
2 °C ± 0,5 °C, sowie bei einer Raumtemperatur von 20 °C ± 0,5 °C. Die<br />
zugelassenen Temperaturschwankungen während der Lagerung betrafen wiederum<br />
alle Proben in gleichem Maße.<br />
Die 200 verschiedenen Proben wurden zu Beginn der Lagerung (Zeitpunkt Null, U1)<br />
<strong>und</strong> anschließend zu sechs weiteren Untersuchungszeitpunkten (U2, U3, U4, U5, U6<br />
<strong>und</strong> U7) in vierwöchigem Abstand untersucht. Damit ergaben sich <strong>für</strong> jede Probe<br />
sieben Werte (U1 bis U7). Der Probenschlüssel ist in Kapitel 3.2.5.2 (Tab. 18) <strong>und</strong><br />
die Untersuchungszeitpunkte in Kapitel 3.2.6 (Tab. 19) aufgeführt. Die Proben<br />
Nr. 101 bis 200, d. h. die bei 20 °C gelagerten Proben, wurden aus labortechnischen<br />
Gründen jeweils maximal eine Woche später untersucht, was aber alle Proben in<br />
gleichem Maße betraf <strong>und</strong> daher keine <strong>Aus</strong>wirkungen auf die Ergebnisse hatte.
5.5.2.1 Lagerung der Lyophilisate<br />
Diskussion<br />
Nach PIKAL (1999) stellt die Lyophilisation ein besonders schonen<strong>des</strong> Verfahren<br />
dar, um thermolabile Stoffe von Wasser zu befreien. Durch den Entzug von Wasser<br />
werden physikalische <strong>und</strong> chemische Verfahren verhindert <strong>und</strong> kinetische<br />
Umbauprozesse verlangsamt (PIKAL 1999). Dementsprechend erwiesen sich die<br />
Lyophilisate insgesamt bei einer gekühlten Lagerung über den gesamten Zeitraum<br />
als sehr stabil, bei Raumtemperatur als relativ stabil.<br />
Die Keimzahlen von L. paracasei (S 26, Nr. 99) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28, Nr. 100) pro g<br />
Lyophilisat blieben bei einer Lagerungstemperatur von 2 °C über den gesamten<br />
Lagerungszeitraum sehr konstant. Es kam zu keinen methodenunabhängigen<br />
Abnahmen der Keimzahlen. Die Keimzahlen der anderen Lyophilisatproben haben<br />
sich während <strong>des</strong> Lagerungszeitraumes methodenunabhängig, aber ebenfalls nur<br />
geringgradig verringert. Die Keimzahl von L. rhamnosus (S 25, Nr. 98) nahm um<br />
0,83 lg KbE/g <strong>und</strong> die von L. reuteri (S 24, Nr. 97) um 1,34 lg KbE/g ab.<br />
Bei Raumtemperatur gelagerte Proben zeigten im Vergleich zu den gekühlt<br />
gelagerten Proben deutlich höhere Abnahmen der Keimzahlen über die Zeit. Am<br />
größten war hier die Abnahme mit 7,00 lg KbE/g bei L. paracasei (S 26, Nr. 199), am<br />
kleinsten mit 2,38 lg KbE/g bei L. rhamnosus (S 25, Nr. 198), obwohl beide Stämme<br />
Vertreter der L. casei-Gruppe sind (KLEIN et al. 1998).<br />
Die Lagerung der Proben bei 2 °C führte zu geringeren Abnahmen der Keimzahlen<br />
als bei 20°C. Ein solcher Temperatureinfluss auf die Lyophilisate ist in der Literatur<br />
nicht beschrieben. Es wurde jedoch von der Firma THT SA eine gekühlte Lagerung<br />
empfohlen.<br />
143
144<br />
Diskussion<br />
5.5.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24)<br />
Entgegen den Erwartungen beeinflusste eine Temperatur von 20 °C L. reuteri (S 24)<br />
nur in Gelatine ohne Zusätze gelagert nicht. Eine gekühlte Lagerung beeinflusste die<br />
Proben hingegen schon. Zunächst sieht es so aus, dass die Verkapselung hier keine<br />
Rolle spielte. Vergleicht man diese Ergebnisse jedoch mit den Ergebnissen <strong>des</strong><br />
entsprechenden Lyophilisates, das bei 20 °C gelagert wurde, so fällt auf, dass es<br />
dort schon zu methodenunabhängigen Abnahmen bei einer 20 °C-Lagerung kam. Es<br />
ist also anzunehmen, dass durch die Verkapselung der von MUSCHIOLIK <strong>und</strong><br />
NAUMANN (2002) beschriebene Schutzeffekt der eingeschlossenen Komponenten<br />
eingetreten ist.<br />
Unter den gekühlt gelagerten Proben kam es im Vergleich zu den wasserlöslich<br />
verkapselten Proben bei den wasserunlöslich verkapselten Proben zu deutlich<br />
höheren Abnahmen der Keimzahlen, obwohl die Proben in einem wässrigen Milieu<br />
gelagert wurden. Hierbei waren bei den wasserunlöslich verkapselten Proben die<br />
Abnahmen umso geringer, je dicker die Kapsel war. Besserer Schutz durch eine<br />
dickwandigere Kapsel erscheint sinnvoll, nicht erklärbar ist hingegen, warum dies bei<br />
den wasserlöslich verkapselten Proben nicht festgestellt werden konnte.<br />
Auch bei Proben von L. reuteri (S 24) mit <strong>dem</strong> Zusatz von 5 % NaCl erwies sich eine<br />
Lagerung bei 20 °C besser als bei 2 °C. Auffällig ist, dass bereits zum Zeitpunkt der<br />
ersten Untersuchung die Keimzahlen der Proben mit der 10%igen wasserunlöslichen<br />
Kapsel, unabhängig von der Lagerungstemperatur, unter die Nachweisgrenze von<br />
2,30 lg KbE/ml gesunken waren, dickwandigere Kapseln aber einen effektiveren<br />
Schutz boten. Des Weiteren gilt <strong>für</strong> die bei 2 °C gelagerten Proben, dass die<br />
Abnahmen bei den wasserunlöslich verkapselten Proben im Vergleich zu den<br />
wasserlöslich verkapselten Proben geringer waren. Dies ist insofern erklärbar, da es<br />
sich um ein wasserlösliches Lösungsmittel handelte. Nicht erklärbar ist hingegen,<br />
warum sich diese Proben aber genau umgekehrt zu den Proben ohne NaCl-Zusatz<br />
verhielten. Die Keimzahlen der Proben mit den wasserlöslichen Kapseln sind bereits<br />
ab der zweiten Untersuchung unter die Nachweisgrenze von 2,30 lg KbE/ml
Diskussion<br />
gesunken. Für die wasserunlöslich verkapselten Proben war dies erst ab der vierten<br />
Untersuchung der Fall. Für beide Verkapselungsarten ergaben sich bei dieser<br />
Lagerungstemperatur umso geringere Abnahmen, je dicker die Kapsel war. Die<br />
Kapselwandstärke bestimmte also auch hier den Grad <strong>des</strong> Schutzeffektes.<br />
Nelken (gemahlen) als Zusatz zum Lagerungsmedium führten, unabhängig von der<br />
Verkapselungsart, bei L. reuteri (S 24) dazu, dass bereits zum Zeitpunkt der ersten<br />
Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der Proben, die Keimzahlen unter<br />
die Nachweisgrenze gesunken waren. Gegen die starke antimikrobielle Wirkung von<br />
Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et al. 1989, BEUCHAT 1994, DORMAN u.<br />
DEANS 2000) konnten auch die verschiedenen Verkapselungen keinen wirksamen<br />
Schutz darstellen.<br />
Proben von L. reuteri (S 24), die mit <strong>dem</strong> Zusatz von Schwarzem Pfeffer gelagert<br />
wurden, zeigten, bis auf die Probe Nr. 112 (50 % wasserlösliches Coating, 20 °C<br />
Lagerungstemperatur), methodenunabhängige Abnahmen der Keimzahlen über die<br />
Zeit. Die antimikrobielle Wirkung ethanolischer Pfefferextrakte oder ätherischer<br />
Pfefferöle wurde auch hier deutlich (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP<br />
1980, ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS<br />
2000).<br />
Unter den wasserlöslich verkapselten Proben zeigten die bei 20 °C gelagerten<br />
Proben deutlich geringere Abnahmen als die vergleichbaren Proben, die bei 2 °C<br />
gelagert wurden, so dass sich auch hier eine höhere Lagerungstemperatur als<br />
vorteilhaft erwies. Ebenfalls vorteilhaft war auch hier eine dickwandigere Kapsel.<br />
Unter den wasserunlöslich verkapselten Proben gab es bei der 10%igen Kapsel<br />
keine Unterschiede zwischen den Lagerungstemperaturen. Bei den 30%igen <strong>und</strong><br />
50%igen wasserunlöslichen Kapseln kam es bei den bei 20 °C gelagerten Proben zu<br />
höheren Abnahmen als bei den bei 2 °C gelagerten Proben, im Gegensatz zu den<br />
wasserlöslich verkapselten Proben.<br />
145
146<br />
Diskussion<br />
5.5.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25)<br />
Die mikroverkapselten Proben von L. rhamnosus (S 25) wurden ebenfalls nur in<br />
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von<br />
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen gelagert, <strong>und</strong> im Laufe der Lagerung zu<br />
sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht.<br />
Bei allen Proben von L. rhamnosus (S 25), die in Gelatine ohne weitere Zusätze<br />
gelagert wurden, kam es von der ersten bis zur letzten Untersuchung zu<br />
methodenunabhängigen Abnahmen der Keimzahlen. Eine gekühlte Lagerung erwies<br />
sich im Fall der wasserlöslich verkapselten Proben als günstig.<br />
Eine dickwandige Kapsel war <strong>für</strong> die bei 20 °C gelagerten Proben vorteilhaft. Unter<br />
den gekühlt gelagerten Proben zeigten die wasserunlöslich verkapselten Proben<br />
geringere Abnahmen als die wasserlöslich verkapselten Proben, zu<strong>dem</strong> waren bei<br />
den wasserunlöslich verkapselten Proben dickwandigere Kapseln besser.<br />
Hingegen zeigten die entsprechend verkapselten Proben bei 20 °C eine Entwicklung<br />
in umgekehrter Richtung, so dass hier auch die Lagerungstemperatur eine Rolle<br />
gespielt hat. Insgesamt waren die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben sehr<br />
gering, so dass Lagerungstemperatur <strong>und</strong> Verkapselungsart wenig Einfluss zeigten.<br />
Bei den Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit Zusatz von Kochsalz zur Gelatine<br />
gelagert wurden, war es unter den wasserlöslich verkapselten Proben unabhängig<br />
von der Lagerungstemperatur besser, je dickwandiger die Kapsel war.<br />
Entsprechen<strong>des</strong> gilt <strong>für</strong> die wasserunlöslich verkapselten Proben, hierbei stellte sich<br />
hingegen eine gekühlte Lagerung als weiterer Vorteil heraus. Bei einer<br />
Lagerungstemperatur von 20 °C stellten die wasserlöslichen Kapseln einen besseren<br />
Schutz dar als die wasserunlöslichen.<br />
Die gute antimikrobielle Wirkung von Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et<br />
al. 1989, BEUCHAT 1994, DORMAN u. DEANS 2000) zeigte sich auch bei den<br />
Proben von L. rhamnosus (S 25) mit Nelkenzusatz zum Lagerungsmedium, wobei<br />
Verkapselungsart <strong>und</strong> Lagerungstemperatur keinen Einfluss hatten. <strong>Aus</strong>nahmen
Diskussion<br />
bildeten die Proben mit 10%iger <strong>und</strong> 30%iger wasserunlöslicher Kapsel, bei 2 °C <strong>und</strong><br />
auch 20 °C. Bei diesen Proben sanken die Keimzahlen erst ab der dritten bzw. <strong>für</strong><br />
Nr. 63 (10 % wasserunlösliches Coating, 2 °C Lagerungstemperatur) sogar erst ab<br />
der vierten Untersuchung unter die Nachweisgrenze von 2,30 lg KbE/ml, so dass hier<br />
als absoluter Wert dann mit 2,00 lg KbE/ml die halbe Nachweisgrenze angenommen<br />
wurde. Nicht erklärbar ist jedoch, warum dies nicht <strong>für</strong> die 50%igen Kapseln galt.<br />
Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit einem Zusatz von Schwarzem Pfeffer, der<br />
antibakteriell wirksam ist (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP 1980,<br />
ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS 2000),<br />
gelagert wurden, ließen hinsichtlich der Entwicklung der Keimzahlen keine so<br />
eindeutigen Trends erkennen. Wasserunlöslich verkapselte Proben zeigten bei 2 °C<br />
gelagert geringere Abnahmen als bei 20 °C. Dickwandige Kapseln waren jedoch<br />
wiederum vorteilhaft. Unter den wasserlöslich verkapselten Proben scheint bei einer<br />
20 °C-Lagerung die Kapselwandstärke keine Rolle gespielt zu haben, bei der 2 °C-<br />
Lagerung hat sich eine dickere Kapselwandstärke sogar negativ ausgewirkt.<br />
5.5.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26)<br />
Eine Lagerung nur in Gelatine bei 2 °C <strong>und</strong> die Verkapselungsart beeinflussten die<br />
Proben von L. paracasei (S 26) im Gegensatz zu den entsprechenden Proben von<br />
L. rhamnosus (S 25) nicht. Dies ist insofern erstaunlich, da L. paracasei <strong>und</strong><br />
L. rhamnosus beide zu der L. casei-Gruppe gehören (KLEIN et al. 1998). Solche<br />
Unterschiede innerhalb der Gruppe konnten auch bereits in den Vorversuchen<br />
gezeigt werden. Die Lagerung bei 20 °C führte hingegen zu einer Beeinträchtigung<br />
der Proben, wobei sich bei einer wasserunlöslichen Verkapselung eine<br />
dickwandigere Kapsel als vorteilhafter erwies.<br />
Proben von L. paracasei (S 26) konnten vor <strong>dem</strong> Einfluss von NaCl durch 30%ige<br />
<strong>und</strong> 50%ige wasserlösliche Kapseln geschützt werden, eine 10%ige Verkapselung<br />
147
148<br />
Diskussion<br />
war nicht ausreichend. Zusätzlich erwies sich eine Lagerung bei niedrigerer<br />
Temperatur als vorteilhaft. Die Temperatur spielte bei den entsprechenden Proben<br />
von L. rhamnosus (S 25) keine Rolle.<br />
Die Ergebnisse <strong>für</strong> die wasserunlöslich verkapselten Proben von L. paracasei (S 26)<br />
sind widersprüchlich. Hier konnte lediglich durch 10%ige Kapseln unabhängig von<br />
der Lagerungstemperatur, sowie <strong>für</strong> 50%ige Kapseln bei einer Lagerungstemperatur<br />
von 20 °C ein schützender Effekt festgestellt werden.<br />
Auch Proben von L. paracasei (S 26) konnten durch keine der untersuchten<br />
Verkapselungsmethoden <strong>und</strong> keine der beiden Lagerungstemperaturen wirksam vor<br />
der starken antimikrobiellen Wirkung von Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO<br />
et al. 1989, BEUCHAT 1994, DORMAN u. DEANS 2000) geschützt werden.<br />
Die antimikrobielle Wirkung von Schwarzem Pfeffer (HUHTANEN 1980, MABROUK<br />
u. EL-SHAYEP 1980, ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994,<br />
DORMAN u. DEANS 2000) auf L. paracasei (S 26) wurde durch die<br />
Verkapselungsart nicht beeinflusst. Die Lagerung bei einer Temperatur von 2 °C<br />
erwies sich als vorteilhaft.<br />
5.5.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28)<br />
Für L. gasseri (S 28) ohne weitere Zusätze war, wie auch <strong>für</strong> L. reuteri (S 24),<br />
unabhängig von der Verkapselungsart eine Lagerung bei 20 °C besser als eine<br />
Lagerung bei 2 °C. Dies galt <strong>für</strong> die wasserlöslich verkapselten Proben wie auch <strong>für</strong><br />
die wasserunlöslich verkapselten Proben. Im Fall der wasserunlöslich verkapselten<br />
<strong>und</strong> bei 20 °C gelagerten Proben kam es sogar zur Zunahme der Keimzahlen.<br />
Bezüglich der Lagerungstemperatur gilt <strong>für</strong> L. gasseri (S 28) mit <strong>dem</strong> Zusatz von<br />
NaCl das Gleiche wie oben aufgeführt <strong>für</strong> die Proben ohne Zusätze. Unerklärlich ist,<br />
warum die Keimzahlen der wasserunlöslich verkapselten Proben mit 10%igen <strong>und</strong>
Diskussion<br />
50%igen Kapseln bereits zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach<br />
der Einlagerung der Proben, unterhalb der Nachweisgrenze von 2,30 lg KbE/ml<br />
lagen, die mit der 30%igen Kapsel hingegen nicht.<br />
Die eingesetzten Verkapselungsmethoden konnten L. gasseri (S 28) bei beiden<br />
Lagerungstemperaturen nicht ansatzweise vor der starken antimikrobiellen Wirkung<br />
von Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et al. 1989, BEUCHAT 1994,<br />
DORMAN u. DEANS 2000) schützen, so dass die Keimzahlen dieser Proben bereits<br />
zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. unmittelbar nach Einlagerung der<br />
Proben, unterhalb der Nachweisgrenze lagen.<br />
Bei einem Zusatz von Schwarzem Pfeffer war <strong>für</strong> L. gasseri (S 28) eine Lagerung bei<br />
2 °C vorteilhafter als bei 20 °C. Hier liegt ein Widerspruch zu den Proben ohne<br />
Zusätze bzw. mit <strong>dem</strong> Zusatz NaCl vor. Auch in diesem Fall boten wiederum die<br />
dickwandigeren Kapseln einen effektiveren Schutz gegen die antimikrobielle Wirkung<br />
von Schwarzem Pfeffer (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP 1980,<br />
ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS 2000).<br />
5.6 Zusammenfassende Diskussion <strong>und</strong> <strong>Aus</strong>blick<br />
Die vier probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei<br />
(S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) verhielten sich unter den Verkapselungs- <strong>und</strong><br />
Lagerungsbedingungen individuell sehr unterschiedlich. Es kann folglich keine<br />
allgemeine Empfehlung <strong>für</strong> die Mikroverkapselung probiotischer Bakterien gegeben<br />
werden. Es sind ansatzweise Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung erkennbar,<br />
welche jedoch <strong>für</strong> die individuelle Anwendung spezifisch zu untersuchen sind. Am<br />
ehesten Erfolg versprechend ist wohl L. rhamnosus (S 25) wasserunlöslich<br />
verkapselt <strong>und</strong> gekühlt gelagert.<br />
149
150<br />
Diskussion<br />
Es war sinnvoll in Vorversuchen die Kochsalzkonzentration (5 %) <strong>und</strong> die zwei<br />
Gewürze (Nelken, Schwarzer Pfeffer) mit den größten Einflüssen auf das Wachstum<br />
der vier Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong><br />
L. gasseri (S 28) auszuwählen, da so eventuelle Schutzeffekte durch die<br />
Verkapselungen am deutlichsten wurden.<br />
Es scheint möglich, die probiotischen Laktobazillen in Fleischerzeugnissen<br />
einzusetzen, auch wenn diese durch Zusätze wie Gewürze <strong>und</strong> Kochsalz in ihrem<br />
Wachstum beeinflusst werden. In spezifischen Fällen kann sich eine<br />
Mikroverkapselung der Bakterien förderlich auf das Überleben der Keime auswirken.<br />
Weitergehende Studien zu <strong>dem</strong> Verhalten in entsprechenden Produkten sind<br />
notwendig, da in der vorliegenden Studie die Bedingungen nur simuliert wurden.<br />
Produkte mit definierten Gewürzmischungen (z. B. ohne Nelken) können gezielt<br />
getestet werden <strong>und</strong> eine Eignung kann außerhalb der „worst case“-Szenarien<br />
geprüft werden.<br />
Die <strong>für</strong> diese Arbeit durchgeführten Mikroverkapselungen stellten einen erheblichen<br />
finanziellen Aufwand dar. Im industriellen Maßstab angewendet, würden die Kosten<br />
sicherlich deutlich sinken, da es sich um größere Chargen handeln <strong>und</strong> nur eine<br />
Verkapselungsart angewendet würde, die technologischen Entwicklungsarbeiten also<br />
schon durchgeführt worden wären. In diesem Rahmen wären die Kosten vermutlich<br />
vertretbar, wobei Kostenberechnungen <strong>für</strong> den Einzelfall durchzuführen wären.<br />
Außer<strong>dem</strong> bleibt offen, ob in dieser Studie die optimalen Verkapselungstechnologien<br />
ausgewählt wurden, auch wenn es sich dabei um industriell übliche Verfahren <strong>und</strong><br />
Materialien handelte. Vielleicht müssen speziell <strong>für</strong> die Anwendung von probiotischen<br />
Bakterien in Fleischerzeugnissen auch noch ganz neue Verkapselungsmaterialien<br />
<strong>und</strong> -verfahren entwickelt werden, die an die speziellen Milieubedingungen (z. B.<br />
Kochsalzkonzentration, Gewürzzusätze) angepasst sind.
Diskussion<br />
Des Weiteren wird noch in Studien nachzuweisen sein, ob die verwendeten Stämme<br />
L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) trotz<br />
der Mikroverkapselungen <strong>und</strong> der Lagerungsbedingungen ihre probiotischen<br />
Wirkungen beibehalten haben.<br />
151
6 Schlussfolgerungen<br />
Schlussfolgerungen<br />
<strong>Aus</strong> den diskutierten Ergebnissen können zusammenfassend die folgenden<br />
Schlussfolgerungen gezogen werden.<br />
1. Die zwölf untersuchten Gewürze beeinflussten das Wachstum der vier<br />
probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26)<br />
<strong>und</strong> L. gasseri (S 28). Den größten Einfluss zeigten Nelken, gefolgt von<br />
Schwarzem Pfeffer.<br />
2. Kochsalz beeinflusste ebenfalls das Wachstum der untersuchten Stämme, wobei<br />
ein Zusatz von 5 % zu einer deutlichen Reduzierung der Keimzahlen führte.<br />
3. Die Lyophilisate der probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) erwiesen sich über den gesamten<br />
Lagerungszeitraum von sechs Monaten bei einer gekühlten Lagerung als sehr<br />
stabil, bei Raumtemperatur als relativ stabil.<br />
4. L. reuteri (S 24) zeigte in verkapselter Form unabhängig vom Lagerungsmedium<br />
bei 20 °C ein besseres Wachstum als bei 2 °C.<br />
5. L. rhamnosus (S 25) erwies sich unabhängig von Lagerungstemperatur,<br />
Verkapselungsart <strong>und</strong> Lagerungsmedium als sehr stabil. Eine <strong>Aus</strong>nahme bildete<br />
der Zusatz von Nelken.<br />
6. Das Wachstum von L. paracasei (S 26) wurde durch eine gekühlte Lagerung<br />
begünstigt. Wasserlösliche, dickwandige Kapseln bewährten sich besser als<br />
andere Kapseln.<br />
7. L. gasseri (S 28) zeigte bei 20 °C gelagert ein besseres Wachstum. Bei einem<br />
Zusatz von Schwarzem Pfeffer war hingegen eine gekühlte Lagerung<br />
vorteilhafter.<br />
8. Insgesamt erwiesen sich in der Regel dickwandigere Kapseln als vorteilhaft.<br />
153
154<br />
Schlussfolgerungen<br />
9. Vor der sehr starken antimikrobiellen Wirkung von Nelken konnte keine der<br />
Verkapselungsarten die probiotischen Bakterien schützen. Eine <strong>Aus</strong>nahme stellte<br />
L. rhamnosus (S 25) dar. Hierbei zeigten die 10%igen <strong>und</strong> 30%igen<br />
wasserunlöslichen Kapseln <strong>für</strong> die ersten drei bis vier Monate einen Schutzeffekt.<br />
10. Die vier probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) verhielten sich unter den<br />
Verkapselungs- <strong>und</strong> Lagerungsbedingungen individuell sehr unterschiedlich.<br />
11. Es sind ansatzweise Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung erkennbar, diese<br />
sind jedoch <strong>für</strong> jede individuelle Anwendung spezifisch zu untersuchen. Es kann<br />
keine allgemeine Empfehlung <strong>für</strong> die Mikroverkapselung probiotischer Bakterien<br />
<strong>und</strong> deren Einsatz in Fleischerzeugnissen gegeben werden.<br />
12. Es scheint möglich, die probiotischen Laktobazillen in Fleischerzeugnissen<br />
einzusetzen, auch wenn diese durch Zusätze wie Gewürze <strong>und</strong> Kochsalz in ihrem<br />
Wachstum beeinflusst werden.
7 Zusammenfassung<br />
Julia Nina Jähne<br />
Zusammenfassung<br />
Entwicklung von mikroverkapselten Probiotika-Präparaten zum Einsatz als<br />
Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen<br />
Ziel dieser Studie war es, die technologischen <strong>und</strong> mikrobiologischen Gr<strong>und</strong>lagen <strong>für</strong><br />
den Einsatz mikroverkapselter Probiotika in Fleischerzeugnissen zu erarbeiten. Es<br />
wurden die vier verschiedenen probiotischen Stämme Lactobacillus reuteri (S 24),<br />
Lactobacillus rhamnosus (S 25), Lactobacillus paracasei (S 26) <strong>und</strong> Lactobacillus<br />
gasseri (S 28) hinsichtlich eines möglichen Einsatzes als Zusatzstoff in<br />
Fleischerzeugnissen untersucht. Getestet wurden der Einfluss verschiedener<br />
Gewürze <strong>und</strong> Kochsalzkonzentrationen, sowie unterschiedliche<br />
Mikroverkapselungen <strong>und</strong> Lagerungstemperaturen.<br />
In Vorversuchen wurde die Wirkung von zwölf verschiedenen Gewürzen <strong>und</strong> drei<br />
Kochsalzkonzentrationen auf das Wachstum der vier probiotischen Keime<br />
untersucht. Es wurde die Wirkung von Nelken (gemahlen), Schwarzem Pfeffer<br />
(gemahlen), Knoblauchgranulat, Oregano (gerebelt), Ingwer (gemahlen),<br />
Senfkörnern, Basilikum (gerebelt), Rosen-Paprika (gemahlen), Paprika edelsüß<br />
(gemahlen), Majoran (gemahlen), Zwiebelgranulat <strong>und</strong> Kümmel (gemahlen)<br />
untersucht. Kochsalz wurde zu 1 %, 2 % <strong>und</strong> 5 % zugesetzt. Für einen sich<br />
anschließenden Lagerungsversuch wurden die Zusätze mit den größten Einflüssen<br />
auf die probiotischen Stämme ausgewählt: 5 % Kochsalz, 10 % Nelken bzw. 10 %<br />
Schwarzer Pfeffer.<br />
Die Laktobazillen wurden lyophilisiert <strong>und</strong> anschließend mikroverkapselt. Jeder<br />
Stamm wurde einerseits wasserlöslich mit einem Maltodextrincoating <strong>und</strong><br />
andererseits auch wasserunlöslich mit einem Fettcoating verkapselt. Je<strong>des</strong> der<br />
155
156<br />
Zusammenfassung<br />
beiden Coatingverfahren wurde in drei unterschiedlichen Formulierungen erstellt:<br />
10 %, 30 % bzw. 50 % Kapselanteil.<br />
Jede dieser mikroverkapselten Proben wurde in einer Gelatinelösung 1. ohne<br />
Zusätze, 2. mit Zusatz von 5 % NaCl, 3. mit Zusatz von 10 % Nelken bzw. 4. mit<br />
Zusatz von 10 % Schwarzem Pfeffer bei 2 °C <strong>und</strong> bei 20 °C über einen Zeitraum von<br />
sechs Monaten gelagert. Parallel dazu wurden die unverkapselten Lyophilisate<br />
ebenfalls bei 2 °C <strong>und</strong> bei 20 °C gelagert.<br />
In einer Verlaufskontrolle wurde zu Beginn <strong>und</strong> dann in vierwöchigem Abstand die<br />
Keimzahl der Proben auf MRS-Agar bestimmt.<br />
Die Lyophilisate der probiotischen Keime L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) erwiesen sich über den gesamten<br />
Lagerungszeitraum von sechs Monaten bei einer gekühlten Lagerung als sehr stabil,<br />
bei Raumtemperatur als relativ stabil.<br />
Die vier Stämme probiotischer Laktobazillen verhielten sich unter den<br />
Verkapselungs- <strong>und</strong> Lagerungsbedingungen individuell sehr unterschiedlich. Es sind<br />
ansatzweise Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung erkennbar. Gegen die<br />
starke antimikrobielle Wirkung von Nelken konnte bis auf anfänglich bei<br />
L. rhamnosus (S 25) kein Coating wirksam schützen. Dickwandigere Kapseln<br />
schützten in der Mehrzahl der Fälle wirksamer. Lactobacillus reuteri (S 24) <strong>und</strong><br />
Lactobacillus gasseri (S 28) zeigten bei 20 °C ein besseres Wachstum. Lactobacillus<br />
rhamnosus (S 25) erwies sich insgesamt als sehr stabil. Das Wachstum von<br />
Lactobacillus paracasei (S 26) wurde durch eine gekühlte Lagerung <strong>und</strong><br />
wasserlösliche, dickwandige Kapseln begünstigt.<br />
Es scheint möglich, die probiotischen Keime in Fleischerzeugnissen einzusetzen.<br />
Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung waren ansatzweise erkennbar. Diese<br />
sind jedoch <strong>für</strong> die individuelle Anwendung, d. h. <strong>für</strong> jeden Stamm <strong>und</strong> Zusatz,<br />
spezifisch zu untersuchen. Es kann folglich keine allgemeine Empfehlung <strong>für</strong> die<br />
Mikroverkapselung probiotischer Bakterien <strong>und</strong> deren Einsatz in Fleischerzeugnissen<br />
gegeben werden.
8 Summary<br />
Julia Nina Jähne<br />
Summary<br />
Development of microencapsulated probiotic preparations for use as additives<br />
in meat products<br />
The aim of this study was to develop technological and microbiological basics for use<br />
of microencapsulated probiotics in meat products. The suitability of four different<br />
probiotic strains Lactobacillus reuteri (S 24), Lactobacillus rhamnosus (S 25),<br />
Lactobacillus paracasei (S 26) and Lactobacillus gasseri (S 28), for potential use as<br />
additives in meat products was tested. The effect of different spices and<br />
concentrations of NaCl was investigated as well as different microencapsulations and<br />
storage temperatures.<br />
In preliminary tests the effect of twelve different spices and three concentrations of<br />
NaCl was investigated. The effect of cloves, black pepper, garlic, oregano, ginger,<br />
mustard, basil, rose-paprika, sweet paprika, majoram, bulb and caraway was tested.<br />
NaCl was added in concentrations of 1 %, 2 % and 5 %, respectively. The additives<br />
with the greatest effects, 5 % NaCl, 10 % cloves and 10 % black pepper, were<br />
chosen for storage trial.<br />
The lactobacilli were lyophilised in a first step and microencapsulated in a second<br />
step. Each strain was microencapsulated in two different ways: water-soluble with a<br />
maltodextrine coating and water-insoluble with a fat coating. Both coatings were<br />
produced in three different formulations: 10 %, 30 % and 50 % capsule part.<br />
These microencapsulated samples were stored at 2 °C and 20 °C for six months in<br />
four different gelatine solutions: 1. without additives, 2. with 5 % NaCl, 3. with 10 %<br />
cloves and 4. with 10 % black pepper. The lyophilised non coated samples were also<br />
stored at both temperatures for six months.<br />
157
158<br />
Summary<br />
At the beginning of the trial and after that every four weeks the bacterial count of all<br />
samples was determined on MRS-agar.<br />
During the storage period of six months the lyophilised probiotic strains Lactobacillus<br />
reuteri (S 24), Lactobacillus rhamnosus (S 25), Lactobacillus paracasei (S 26) and<br />
Lactobacillus gasseri (S 28) showed to be very stable at 2 °C and relatively stable at<br />
20 °C.<br />
The conditions of microencapsulation and storage influenced the four probiotic<br />
lactobacilli strains individually different. Protective effects of the microencapsulation<br />
were recognised in some cases. Although at the beginning protective effects against<br />
the strong antimicrobial effects of cloves were shown for Lactobacillus rhamnosus<br />
(S 25), none of the tested coatings was able to protect durably. In most cases thickwalled<br />
capsules protected better than thin-walled ones. Lactobacillus reuteri (S 24)<br />
and Lactobacillus gasseri (S 28) showed better growth at 20 °C. Lactobacillus<br />
rhamnosus (S 25) proved to be very stable. The growth of Lactobacillus paracasei<br />
(S 26) was promoted by cooled storage and water-soluble, thick-walled capsules.<br />
The use of the tested probiotic strains in meat products seems possible as protective<br />
effects of the microencapsulation were recognised for specific combinations. These<br />
effects must be tested for each specific application, e. g. strain/additive combination,<br />
due to individual differences. Therefore, a general reference for the<br />
microencapsulation of probiotic bacteria and their use in meat products cannot be<br />
given.
9 Schrifttumsverzeichnis<br />
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Änderung durch Art. 438 V v. 31.10.2006 I 2407 (Nr. 50) noch nicht berücksichtigt<br />
BGBl. T. I. 1999, 50<br />
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Taxonomic study of the Lactobacillus acidophilus group, with recognition of<br />
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L. salivarius strains during heat treatment and spray drying.<br />
Appl. Environ. Microbiol. 66, 2605-2612<br />
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Gewürze in der Lebensmittelindustrie – Eigenschaften, Technologien, Verwendung.<br />
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Probiotics and human health: a clinical perspective.<br />
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GIONCHETTI, P. (2005):<br />
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GLATT ® GmbH (2006):<br />
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http://www.glatt.com/d/01_technologien/01_04_08.htm, S. 1-3<br />
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Effect of the major herbs and spices in Spanish fermented sausages on<br />
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Composition of clove (Syzygium aromaticum) bud oil extracted using carbon dioxide.<br />
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Schrifttumsverzeichnis<br />
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Bakterien wachsen langsamer – Einfluss von Gewürzmischungen zur<br />
Haltbarkeitsverlängerung von Schweinefleisch.<br />
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Detection of potent odorants in foods by aroma extract dilution analysis.<br />
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Determination of potent odourants in foods by aroma extract dilution analysis (AEDA)<br />
and calculation of odour activity values (OAVs).<br />
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HAMMES, W. P. u. D. HALLER (1998):<br />
Wie sinnvoll ist die Anwendung von Probiotika in Fleischwaren?<br />
Fleischwirtsch. 78, 301-306<br />
HAMMES, W. P. u. C. HERTEL (1998):<br />
New developments in meat starter cultures.<br />
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Bd. 2. The genera of lactic acid bacteria.<br />
Chapman & Hall, London, Glasgow, S. 19-54
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Lactobacillus acidophilus (Moro) comb. nov.<br />
Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 325-327<br />
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Technologie-Transfer: Gefriertrocknung im Lebensmittelbereich<br />
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Pathogenic potential of lactobacilli.<br />
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HAWLEY, H. B., P. A. SHEPERD u. D. M. WHEATHER (1959):<br />
Factors affecting the implantation of lactobacilli in the intestine.<br />
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172<br />
Schrifttumsverzeichnis<br />
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L. SKOWRONSKI u. S. G. CARMELLA (1995):<br />
Effects of watercress consumption on metabolism of a tobacco-specific lung<br />
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Cancer Epi<strong>dem</strong>iol. Biomarkers Prev. 4, 877-884<br />
HILDEBRANDT, G. u. H. WICHMANN-SCHAUER (2005):<br />
Grenzwerte, Probenstreuung <strong>und</strong> Messungenauigkeit.<br />
Fleischwirtsch. 2005, Nr. 12, 111-114<br />
HITOKOTO, H., S. MOROZUMI, T. WAUKE, S. SAKAI u. H. KURATA (1980):<br />
Inhibitory effects of spices on growth and toxin production of toxigenic fungi.<br />
Appl. Environ. Microbiol. 39, 818-822<br />
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Mikroverkapselung<br />
in: W. GLÖCKNER (Hrsg.): PRAXIS-Schriftenreihe, Abteilung Chemie.<br />
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SCHILLINGER (2001):<br />
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Am. J. Clin. Nutr. 73, 365-373<br />
HUHTANEN, C. N. (1980):<br />
Inhibition of Clostridium botulinum by spice extracts and aliphatic alcohols.<br />
J. Food Prot. 43, 195-196<br />
INCZE, K. (2002):<br />
Fermentierte Fleischprodukte – Überblick über aktuelle Forschungsgebiete.<br />
Fleischwirtsch. 82 (4), 112-118
Schrifttumsverzeichnis<br />
INOUYE, S., T. TAKIZAWA u. H. YAMAGUCHI (2001):<br />
Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory<br />
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J. Antimicrob. Chemother. 47, 565-573<br />
ISHIKAWA, H. (2005):<br />
Randomized trial of dietary fiber and Lactobacillus casei administration for prevention<br />
of colorectal tumors.<br />
Int. J. Cancer 116, 762-767<br />
ISMAIEL, A. A. u. M. D. PIERSON (1990):<br />
Inhibition of germination, outgrowth, and vegetative growth of Clostridium botulinum<br />
67B by spice oils.<br />
J. Food Prot. 53, 755-758<br />
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Effect of formulation on lyophilization, part 1: formulation components – their freezing<br />
and drying.<br />
IVD Technol. 1997, Jan., 38-42<br />
JIMÉNEZ-COLMENERO, F., J. CARBALLO u. S. COFRADES (2001):<br />
Healthier meat and meat products: their role as functional foods.<br />
Meat Sci. 59, 5-13<br />
JOHNSON, J. L., C. F. PHELPS, C. S. CUMMINS, J. LONDON u. F. GASSER<br />
(1980):<br />
Taxonomy of the Lactobacillus acidophilus group.<br />
Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 53-68<br />
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174<br />
Schrifttumsverzeichnis<br />
KAILASAPATHY, K. u. J. CHIN (2000):<br />
Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to<br />
Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.<br />
Immunol. Cell Biol. 78, 80-88<br />
KALANTZOPOULOS, G. (1997):<br />
Fermented products with probiotic qualities.<br />
Anaerobe 3, 185-190<br />
KANDLER, O., K. O. STETTER u. R. KÖHL (1980):<br />
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Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe C 1, 264-269<br />
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KIRJAVAINEN, P. V., E. M. TUOMOLA, R. G. CRITTENDEN, A. C. OUWEHAND, D.<br />
W. S. HARTY, L. F. MORRIS, H. RAUTELIN, M. J. PLAYNE, D. C. DONOHUE u. S.<br />
J. SALMINEN (1999):<br />
In vitro adhesion and platelet aggregation properties of bacteremia-associated<br />
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Infect. Immun. 67, 2653-2655<br />
KIVANÇ, M., A. AKGÜL u. A. DOĞAN (1991):<br />
Inhibitory and stimulatory effects of cumin, oregano and their essential oils on growth<br />
and acid production of Lactobacillus plantarum and Leuconostoc mesenteroi<strong>des</strong>.<br />
Int. J. Food Microbiol. 13, 81-86
Schrifttumsverzeichnis<br />
KLEIN, G. (2001):<br />
Probiotika <strong>und</strong> ges<strong>und</strong>heitliche Unbedenklichkeit<br />
in: H. EBERSDOBLER u. A. MEYER (Hrsg.): Praxishandbuch Functional Food.<br />
Behr’s Verlag, Hamburg, 1. Ordner, Kap. 7.7, S. 1-15<br />
KLEIN, G., C. BONAPARTE u. G. REUTER (1992):<br />
Laktobazillen als Starterkulturen <strong>für</strong> die Milchwirtschaft unter <strong>dem</strong> Gesichtspunkt der<br />
sicheren Biotechnologie.<br />
Milchwissensch. 47, 632-636<br />
KLEIN, G., A. PACK, C. BONAPARTE u. G. REUTER (1998):<br />
Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria.<br />
Int. J. Food Microbiol. 41, 103-125<br />
KNAUF, H. (1997):<br />
Wissenswertes über Starterkulturen <strong>für</strong> die Fleischwarenherstellung – 1. Entwicklung<br />
<strong>und</strong> Eigenschaften von Starterkulturen.<br />
Fleischwirtsch. 77, Nr. 12, 1099-1102<br />
KNAUF, H. (1998):<br />
Wissenswertes über Starterkulturen <strong>für</strong> die Fleischwarenherstellung – 2. Bedeutung<br />
von Starter- <strong>und</strong> Schutzkulturen <strong>für</strong> die Fleischwarenindustrie.<br />
Fleischwirtsch. 78, Nr. 4, 312-314<br />
KNOBLOCH, K., A. PAULI, B. IBERL, H. WEIGAND u. N. WEIS (1989):<br />
Antibacterial and antifungal properties of essential oil components.<br />
J. Essent. Oil Res. 1, 119-128<br />
KNOBLOCH, K., N. WEIS u. H. WEIGAND (1986):<br />
Mechanisms of antimicrobial activity of essential oils.<br />
Planta Med. 52, 556<br />
175
176<br />
Schrifttumsverzeichnis<br />
KOEBNICK, C., I. WAGNER, K. ISING u. U. STERN (2001):<br />
Die Wirkung eines probiotischen Getränks auf gastrointestinale Symptome <strong>und</strong> das<br />
Befinden von Patienten mit chronischer Obstipation.<br />
Ern. Umschau 48, 392-396<br />
KOLLER, W.-D. (1979):<br />
Einige lagerungsbedingte Veränderungen bei gemahlenen Gewürznelken.<br />
Z. Lebensm. Unters. Forsch. 169, 457-461<br />
KOLLER, W.-D. (1981):<br />
Identifizierung einiger flüchtiger Inhaltsstoffe von gemahlenen Gewürznelken.<br />
Z. Lebensm. Unters. Forsch. 173, 99-100<br />
KOPP-HOOLIHAN, L. (2001):<br />
Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: a review.<br />
J. Am. Diet Assoc. 101, 229-238<br />
KORPELA, R., E. MOILANEN, M. SAXELIN u. H. VAPAATALO (1997):<br />
Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) and platelet aggregation in vitro.<br />
Int. J. Food Microbiol. 37, 83-86<br />
KRAMMER, H. J., F. SCHLIEGER, H. HARDER, A. FRANKE u. M. V. SINGER<br />
(2005):<br />
Probiotika in der Therapie <strong>des</strong> Reizdarmsyndroms.<br />
Z. Gastroenterol. 43, 467-471<br />
KUNZ, B. (1988):<br />
Gr<strong>und</strong>riss der Lebensmittel-Mikrobiologie.<br />
Behr’s Verlag, Hamburg
Schrifttumsverzeichnis<br />
KUNZ, B., S. KRÜCKEBERG u. J. WEISSBRODT (2003):<br />
Chancen <strong>und</strong> Grenzen der Mikroverkapselung in der modernen<br />
Lebensmittelverarbeitung.<br />
Chem. Ing. Tech. 75, 1733-1740<br />
KUNZ, B., B. MARX u. K. GLOVER (2005):<br />
Klassifikationssystem <strong>für</strong> Fermentationsprozesse.<br />
Chem. Ing. Tech. 77, 711-721<br />
LAKE, B. G. (1999):<br />
Coumarin metabolism, toxicity and carcinogenicity: relevance for human risk<br />
assessment.<br />
Food Chem. Toxicol. 37, 423-453<br />
LAUER, E. u. O. KANDLER (1980):<br />
Lactobacillus gasseri sp. nov., a new species of the subgenus Thermobacterium.<br />
Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe C 1, 75-78<br />
MABROUK, S. S. u. N. M. A. EL-SHAYEP (1980):<br />
Inhibition of aflatoxin formation by some spices.<br />
Z. Lebensm. Unters. Forsch. 171, 344-347<br />
MARTEAU, P. R., M. DE VRESE, C. J. CELLIER u. J. SCHREZENMEIR (2001):<br />
Protection from gastrointestinal diseases with the use of probiotics.<br />
Am. J. Clin. Nutr. 73, 430-436<br />
177
178<br />
Schrifttumsverzeichnis<br />
MARTÍNEZ, A., I. CAMBERO, Y. IKKEN, M. L. MARÍN, A. I. HAZA u. P. MORALES<br />
(1998):<br />
Protective effect of broccoli, onion, carrot, and licorice extracts against cytotoxicity of<br />
N-nitrosamines<br />
bromide assay.<br />
evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium<br />
J. Agric. Food Chem. 46, 585-589<br />
MATTILA-SANDHOLM, T., P. MYLLÄRINEN, R. CRITTENDEN, G. MOGENSEN, R.<br />
FONDÉN u. M. SAARELA (2002):<br />
Technological challenges for future probiotic foods.<br />
Int. Dairy J. 12, 173-182<br />
MÄYRÄ-MÄKINEN, A. u. M. BIGRET (2004):<br />
Industrial use and production of lactic acid bacteria<br />
in: S. SALMINEN, A. VON WRIGHT u. A. OUWEHAND (Hrsg.):<br />
Lactic acid bacteria – Microbiological and functional aspects.<br />
Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 3. Auflage, S. 175-198<br />
MCNAUGHT, C. E. u. J. MACFIE (2001):<br />
Probiotics in clinical practice: a critical review of the evidence.<br />
Nutr. Res. 21, 343-353<br />
METZ, M. (1993):<br />
Starterkulturen – Industrielle Herstellung <strong>für</strong> die Fleischwirtschaft.<br />
Fleischwirtsch. 73, Nr. 3, 220-227<br />
MORENO, S., T. SCHEYER, C. S. ROMANO u. A. A. VOJNOV (2006):<br />
Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol<br />
composition.<br />
Free Radic. Res. 40, 223-231
Schrifttumsverzeichnis<br />
MORO, E. (1900):<br />
Über den Bacillus acidophilus n. spec. Ein Beitrag zur Kenntnis der normalen<br />
Darmbakterien <strong>des</strong> Säuglings.<br />
Jahrb. Kinderheilk. 52, 38-55<br />
zit. nach G. KLEIN (1998)<br />
MUSCHIOLIK, G. u. A. NAUMANN (2002):<br />
Schonende Verfahren zur Herstellung von Functional Food-Produkten<br />
in: H. EBERSDOBLER u. A. MEYER (Hrsg.): Praxishandbuch Functional Food.<br />
Behr’s Verlag, Hamburg, 1. Ordner, Kap. 9, S. 1-31<br />
NAKAMURA, L. K. (1981):<br />
Lactobacillus amylovorus, a new starch-hydrolyzing species from cattle waste-corn<br />
fermentations.<br />
Int. J. Syst. Bacteriol. 31, 56-63<br />
NARAHIMSARAO, B. G. V. u. S. S. NIGAM (1970):<br />
The invitro antimicrobial efficiency of essential oils.<br />
Ind. J. Med. Res. 58, 627-633<br />
NIELSEN, P. V. u. R. RIOS (2000):<br />
Inhibition of fungal growth on bread by volatile components from spices and herbs,<br />
and the possible application in active packaging, with special emphasis on mustard<br />
essential oil.<br />
Int. J. Food Microbiol. 60, 219-229<br />
ORLA-JENSEN, S. (1916):<br />
Maelkeri-Bakteriologi.<br />
Schønberske Forlag, Copenhagen<br />
zit. nach J. P. EUZÉBY (2006)<br />
179
ORLA-JENSEN, S. (1919):<br />
The lactic acid bacteria.<br />
Fred Host and Son, Kopenhagen<br />
zit. nach G. KLEIN (1998)<br />
180<br />
Schrifttumsverzeichnis<br />
ÖZCAN, M. (2003):<br />
Antioxidant activities of rosemary, sage, and sumac extracts and their combinations<br />
on stability of natural peanut oil.<br />
J. Med. Food 6, Nr. 3, 267-270<br />
ÖZCAN, M. u. O. ERKMEN (2001):<br />
Antimicrobial activity of the essential oils of Turkish plant spices.<br />
Eur. Food Res. Technol. 212, 658-660<br />
PEREZ, C. u. C. ANESINI (1994):<br />
Antibacterial activity of alimentary plants against Staphylococcus aureus growth.<br />
Am. J. Chin. Med. 22, 169-174<br />
PIKAL, M. J. (1999):<br />
Stabilization of proteins by freeze drying.<br />
J. Pharm. Pharmacol. 51, Beil., 87<br />
PLATEL, K. u. K. SRINIVASAN (1996):<br />
Influence of dietary spices or their active principles on digestive enzymes of small<br />
intestinal mucosa in rats.<br />
Int. J. Food Sci. Nutr. 47, 55-59<br />
PLATEL, K. u. K. SRINIVASAN (2000):<br />
Influence of dietary spices and their active principles on pancreatic digestive<br />
enzymes in albino rats.<br />
Nahrung 44, 42-46
Schrifttumsverzeichnis<br />
REUTER, G. (2001):<br />
Probiotics – possibilities and limitations of their application in food, animal feed, and<br />
in pharmaceutical preparations for men and animals.<br />
Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 114, 410-419<br />
ROY, A. K., K. K. SINHA u. H. K. CHOURASIA (1988):<br />
Aflatoxin contamination of some common drug plants.<br />
Appl. Environ. Microbiol. 54, 842-843<br />
RUNGE, F. E. (2001):<br />
Multiple-core encapsulation – Encapsulation materials<br />
in: P. VILSTRUP (Hrsg.): Microencapsulation of food ingredients.<br />
Leatherhead International Limited, Leatherhead, S. 133-145<br />
RUPPRECHT, H. (1993):<br />
Physikalisch chemische Gr<strong>und</strong>lagen der Gefriertrocknung<br />
in: D. ESSIG u. R. OSCHMANN (Hrsg.): Lyophilisation.<br />
MVG, Stuttgart, 1. Aufl., Bd. 35, Kap. 1, S. 13-38<br />
RUST, R. E. (2004):<br />
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Elsevier Ltd., Oxford, 1. Auflage, S. 1207-1216<br />
SANDERS, M. E. (1993):<br />
Effect of consumption of lactic cultures on human health.<br />
Adv. Food Nutr. Res. 37, 67-130<br />
181
182<br />
Schrifttumsverzeichnis<br />
SANDERS, M. E. u. J. HUIS IN’T VELD (1999):<br />
Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product,<br />
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Antonie Van Leeuwenhoek 76, 293-315<br />
SAXELIN, M., B. GRENOV, U. SVENSSON, R. FONDÉN, R. RENIERO u. T.<br />
MATTILA-SANDHOLM (1999):<br />
The technology of probiotics.<br />
Trends Food Sci. Technol. 10, 387-392<br />
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187
10 Anhang<br />
10.1 Ergebnistabellen<br />
Anhang<br />
Tabelle 24: Keimzahlen (Kz in lg KbE/g) der Lyophilisate von L. reuteri (S 24),<br />
Code<br />
2 °C<br />
20 °C<br />
Proben-Nr.<br />
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28),<br />
Verlaufsübersicht<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz<br />
97 (S 24) 7,52 7,72 7,76 5,76 6,20 6,26 6,18 -1,34<br />
98 (S 25) 10,11 9,85 9,30 8,98 9,41 9,26 9,28 -0,83<br />
99 (S 26) 10,11 9,38 9,30 10,11 9,51 9,28 9,72 -0,39<br />
100 (S 28) 7,30 8,38 8,04 7,30 7,64 8,46 7,74 0,44<br />
197 (S 24) 7,52 6,57 5,46 5,20 3,99 3,83 2,30 -5,22<br />
198 (S 25) 10,11 9,94 8,98 9,34 9,15 8,65 7,73 -2,38<br />
199 (S 26) 10,11 9,67 9,67 8,65 8,20 5,38 3,11 -7,00<br />
200 (S 28) 7,30 8,00 7,81 6,83 4,95 4,43 3,88 -3,42<br />
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), Lagerung bei 2 °C: Nr. 97-100,<br />
Lagerung bei 20 °C: Nr. 197-200, S 24: L. reuteri, S 25: L. rhamnosus, S 26: L. paracasei,<br />
S 28: L. gasseri<br />
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/g<br />
189
Code<br />
wasserlösliches Coating, 2 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 2 °C<br />
190<br />
Anhang<br />
Tabelle 25: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. reuteri (S 24),<br />
Verlaufsübersicht<br />
Proben<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz<br />
1 6,23 5,88 4,45 5,23 4,40 3,48 3,99 -2,24<br />
2 5,04 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -3,04<br />
3 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
4 7,48 6,85 6,83 4,99 4,71 3,89 4,18 -3,30<br />
5 6,72 3,76 5,46 4,15 3,63 4,43 3,20 -3,52<br />
6 3,99 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,99<br />
7 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
8 7,08 5,70 5,93 5,65 4,73 4,94 3,53 -3,55<br />
9 5,51 3,99 3,84 2,60 3,20 3,98 3,85 -1,66<br />
10 2,91 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,91<br />
11 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
12 6,30 5,26 4,94 6,32 3,71 3,34 3,34 -2,96<br />
49 6,63 5,52 3,59 2,48 2,30 2,00 2,00 -4,63<br />
50 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
51 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
52 7,58 5,69 5,79 5,30 2,00 2,00 2,00 -5,58<br />
53 5,90 4,36 4,51 2,78 2,00 2,00 2,00 -3,90<br />
54 3,40 4,18 2,56 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,40<br />
55 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
56 6,34 6,11 5,61 5,08 5,04 3,77 3,11 -3,23<br />
57 5,53 4,91 3,57 3,11 2,70 2,00 2,00 -3,53<br />
58 2,30 2,30 2,30 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,30<br />
59 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
60 6,48 5,64 5,59 5,45 3,28 4,00 3,43 -3,05
Code<br />
wasserlösliches Coating, 20 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 20 °C<br />
Anhang<br />
Proben<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz<br />
101 6,23 8,65 8,20 6,83 6,38 5,82 6,00 -0,23<br />
102 5,04 6,90 6,08 5,45 6,11 6,11 6,04 1,00<br />
103 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
104 7,48 7,87 7,41 5,43 5,85 5,79 6,00 -1,48<br />
105 6,72 8,23 7,15 7,08 6,73 6,71 5,83 -0,89<br />
106 3,99 4,30 4,30 6,30 5,98 5,08 5,92 1,93<br />
107 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
108 7,08 6,30 7,38 6,53 6,96 6,48 5,94 -1,14<br />
109 5,51 4,30 3,30 6,28 6,08 5,15 5,95 0,44<br />
110 2,91 3,30 3,30 4,23 4,46 4,41 4,45 1,54<br />
111 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
112 6,30 8,20 7,08 6,36 6,69 5,90 6,74 0,44<br />
149 6,63 8,00 7,41 6,95 6,62 7,11 7,04 0,41<br />
150 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
151 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
152 7,58 7,61 7,56 6,51 6,45 3,70 2,00 -5,58<br />
153 5,90 7,26 6,90 6,40 6,54 6,26 6,04 0,14<br />
154 3,40 3,30 3,30 4,43 4,36 3,89 4,40 1,00<br />
155 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
156 6,34 8,40 7,04 5,81 5,92 5,32 2,00 -4,34<br />
157 5,53 6,76 6,96 6,88 6,82 6,62 6,11 0,58<br />
158 2,30 2,90 2,30 3,91 3,88 3,73 3,97 1,67<br />
159 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
160 6,48 7,08 6,99 6,94 6,53 5,73 2,00 -4,48<br />
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 1-4, 49-52,<br />
101-104, 149-152, 30 % Coating: Nr. 5-8, 53-56, 105-108, 153-158, 50 % Coating: Nr. 9-12, 57-60,<br />
109-112, 157-160, Ohne Zusätze: Nr. 1, 5, 9, 49, 53, 57, 101, 105, 109, 149, 153, 157, Zusatz NaCl:<br />
Nr. 2, 6, 10, 50, 54, 58, 102, 106, 110, 150, 154, 158, Zusatz Nelken: Nr. 3, 7, 11, 51, 55, 59, 103,<br />
107, 111, 151, 155, 159, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 4, 8, 12, 52, 56, 60, 104, 108, 112, 152, 156,<br />
160<br />
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml<br />
191
192<br />
Anhang<br />
Tabelle 26: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. rhamnosus (S 25),<br />
Code<br />
wasserlösliches Coating, 2 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 2 °C<br />
Verlaufsübersicht<br />
Proben<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz<br />
13 8,26 7,93 8,04 7,85 7,28 5,85 7,28 -0,98<br />
14 7,78 5,00 7,63 5,79 5,82 5,72 5,53 -2,25<br />
15 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
16 7,54 7,38 6,95 7,08 6,98 6,82 6,91 -0,63<br />
17 8,20 7,73 7,54 7,59 7,73 6,51 6,86 -1,34<br />
18 7,69 7,41 7,41 6,76 6,79 6,85 6,76 -0,93<br />
19 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
20 7,89 7,40 7,18 6,89 6,61 6,78 6,64 -1,25<br />
21 8,26 7,76 7,88 6,08 6,58 6,69 6,92 -1,34<br />
22 7,20 6,45 7,00 6,72 6,58 6,73 6,83 -0,37<br />
23 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
24 7,80 7,30 7,46 6,58 6,60 6,88 6,62 -1,18<br />
61 8,04 7,67 7,11 6,91 6,96 6,81 7,04 -1,00<br />
62 8,00 7,90 7,68 6,91 6,20 6,69 6,86 -1,14<br />
63 3,58 2,30 2,48 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,58<br />
64 7,32 7,83 7,70 8,40 6,83 6,79 6,51 -0,81<br />
65 7,63 7,56 7,67 7,60 7,88 6,67 6,66 -0,97<br />
66 8,00 7,52 7,94 4,52 6,81 6,75 6,81 -1,19<br />
67 2,60 2,30 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,60<br />
68 7,97 7,45 7,67 8,00 8,04 7,32 6,95 -1,02<br />
69 7,58 7,70 7,46 7,34 7,88 6,63 6,74 -0,84<br />
70 7,64 7,18 7,36 6,73 6,69 6,63 6,79 -0,85<br />
71 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
72 7,67 7,53 7,97 6,46 7,77 7,45 7,88 0,21
Code<br />
wasserlösliches Coating, 20 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 20 °C<br />
Anhang<br />
Proben<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz<br />
113 8,26 8,40 6,70 7,00 6,63 6,23 5,90 -2,36<br />
114 7,78 8,00 7,34 7,18 6,11 5,92 6,08 -1,70<br />
115 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
116 7,54 7,88 7,84 6,97 6,82 6,74 6,04 -1,50<br />
117 8,20 7,52 7,74 7,23 6,65 6,76 6,41 -1,79<br />
118 7,69 7,11 7,08 6,86 6,73 6,93 6,95 -0,74<br />
119 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
120 7,89 7,23 6,98 6,89 5,76 5,57 5,94 -1,95<br />
121 8,26 8,08 8,04 7,63 7,32 6,51 6,71 -1,55<br />
122 7,20 6,85 7,20 7,15 6,72 6,61 7,30 0,10<br />
123 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
124 7,80 9,48 7,83 6,83 6,80 6,49 6,18 -1,62<br />
161 8,04 8,68 8,23 7,11 7,20 6,74 6,99 -1,05<br />
162 8,00 7,72 7,45 6,95 7,04 4,53 4,00 -4,00<br />
163 3,58 2,95 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,58<br />
164 7,32 8,46 8,04 7,91 6,63 6,20 5,20 -2,12<br />
165 7,63 7,63 8,78 7,75 7,86 7,65 6,30 -1,33<br />
166 8,00 7,41 7,71 7,34 7,86 6,26 4,89 -3,11<br />
167 2,60 3,20 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,60<br />
168 7,97 8,70 7,20 7,58 6,76 6,08 5,36 -2,61<br />
169 7,58 8,56 7,08 8,04 6,85 7,00 6,04 -1,54<br />
170 7,64 7,04 7,20 6,94 7,23 6,86 6,54 -1,10<br />
171 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
172 7,67 8,68 7,30 8,00 6,23 6,88 6,58 -1,09<br />
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 13-16,<br />
61-64, 113-116, 161-164, 30 % Coating: Nr. 17-20, 65-68, 117-120, 165-168, 50 % Coating:<br />
Nr. 21-24, 69-72, 121-124, 169-172, Ohne Zusätze: Nr. 13, 17, 21, 61, 65, 69, 113, 117, 121, 161,<br />
165, 169, Zusatz NaCl: Nr. 14, 18, 22, 62, 66, 70, 114, 118, 122, 162, 166, 170, Zusatz Nelken:<br />
Nr. 15, 19, 23, 63, 67, 71, 115, 119, 123, 163, 167, 171, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 16, 20, 24, 64,<br />
68, 72, 116, 120, 124, 164, 168, 172<br />
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml<br />
193
194<br />
Anhang<br />
Tabelle 27: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. paracasei (S 26),<br />
Code<br />
wasserlösliches Coating, 2 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 2 °C<br />
Verlaufsübersicht<br />
Proben<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz<br />
25 7,65 8,63 8,04 8,08 7,72 7,91 8,40 0,75<br />
26 5,97 6,36 6,59 6,38 4,89 5,04 4,92 -1,05<br />
27 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
28 8,15 7,75 7,76 7,41 7,18 7,30 7,04 -1,11<br />
29 7,46 7,36 7,92 7,20 6,93 7,15 7,30 -0,16<br />
30 4,81 5,00 5,04 4,89 5,04 4,71 4,95 0,14<br />
31 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
32 7,23 8,18 7,94 7,81 6,98 7,04 6,56 -0,67<br />
33 7,62 7,20 9,23 6,62 6,41 6,65 6,97 -0,65<br />
34 3,75 4,90 3,74 5,23 4,71 3,61 4,08 0,33<br />
35 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
36 7,59 7,78 7,61 7,61 6,99 6,65 6,76 -0,83<br />
73 6,65 5,30 6,65 5,30 6,30 6,11 6,41 -0,24<br />
74 5,88 5,08 6,23 5,04 5,32 4,76 5,41 -0,47<br />
75 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
76 7,81 7,62 7,76 7,88 7,08 7,20 7,15 -0,66<br />
77 6,76 6,49 6,79 6,86 6,67 6,59 6,57 -0,19<br />
78 5,86 4,85 5,26 5,68 6,43 5,65 3,79 -2,07<br />
79 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
80 7,81 7,60 7,57 7,81 7,83 7,34 6,79 -1,02<br />
81 6,46 6,38 7,89 6,65 6,45 6,38 5,65 -0,81<br />
82 5,04 4,15 4,57 4,30 3,92 3,63 3,53 -1,51<br />
83 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
84 8,15 7,60 8,11 7,98 7,96 7,85 7,18 -0,97
Code<br />
wasserlösliches Coating, 20 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 20 °C<br />
Anhang<br />
Proben<br />
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz<br />
125 7,65 9,08 7,38 6,68 7,26 4,80 5,00 -2,65<br />
126 5,97 6,94 3,32 4,43 4,48 4,36 4,36 -1,61<br />
127 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
128 8,15 8,43 6,60 6,65 6,00 3,91 2,00 -6,15<br />
129 7,46 8,83 6,76 6,89 5,79 4,81 2,00 -5,46<br />
130 4,81 6,49 3,56 4,41 4,34 4,30 4,28 -0,53<br />
131 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
132 7,23 8,52 6,62 6,60 6,04 3,81 2,70 -4,53<br />
133 7,62 8,64 7,85 7,30 5,52 3,52 4,08 -3,54<br />
134 3,75 6,95 6,81 5,69 6,04 3,81 4,18 0,43<br />
135 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
136 7,59 8,51 6,98 6,61 6,08 3,71 2,00 -5,59<br />
173 6,65 6,51 6,78 6,18 5,41 5,97 3,26 -3,39<br />
174 5,88 6,20 6,00 5,40 6,57 5,48 5,95 0,07<br />
175 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
176 7,81 8,82 7,63 7,72 6,51 5,30 2,00 -5,81<br />
177 6,76 8,48 6,51 6,72 6,51 6,40 3,52 -3,24<br />
178 5,86 8,40 6,38 5,59 5,23 5,93 4,59 -1,27<br />
179 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
180 7,81 8,88 7,69 7,74 5,54 5,45 2,00 -5,81<br />
181 6,46 8,60 7,54 7,92 5,61 5,88 4,18 -2,28<br />
182 5,04 3,30 3,30 4,41 4,45 4,34 4,48 -0,56<br />
183 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
184 8,15 8,36 8,10 7,53 5,81 5,98 2,00 -6,15<br />
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 25-28,<br />
73-76, 125-128, 173-176, 30 % Coating: Nr. 29-32, 77-80, 129-132, 177-180, 50 % Coating:<br />
Nr. 33-36, 81-84, 133-136, 181-184, Ohne Zusätze: Nr. 25, 29, 33, 73, 77, 81, 125, 129, 133, 173,<br />
177, 181, Zusatz NaCl: Nr. 26, 30, 34, 74, 78, 82, 126, 130, 134, 174, 178, 182, Zusatz Nelken:<br />
Nr. 27, 31, 35, 75, 79, 83 127, 131, 135, 175, 179, 183, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 28, 32, 36, 76,<br />
80, 84, 128, 132, 136, 176, 180, 184<br />
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml<br />
195
196<br />
Anhang<br />
Tabelle 28: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. gasseri (S 28),<br />
Code<br />
wasserlösliches Coating, 2 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 2 °C<br />
Verlaufsübersicht<br />
Proben U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz<br />
37 7,38 6,40 6,00 4,93 3,67 2,95 2,90 -4,48<br />
38 5,98 2,78 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -3,98<br />
39 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
40 7,34 7,08 6,90 6,56 6,26 6,54 4,83 -2,51<br />
41 6,76 6,59 5,78 4,51 4,99 3,92 2,90 -3,86<br />
42 6,89 2,30 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -4,89<br />
43 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
44 6,70 6,43 6,08 5,92 5,90 5,80 5,66 -1,04<br />
45 7,08 6,30 5,89 4,68 4,79 3,75 2,85 -4,23<br />
46 6,26 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -4,26<br />
47 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
48 6,96 5,86 6,08 6,32 6,34 5,76 5,79 -1,17<br />
85 5,30 5,38 4,89 3,54 2,90 2,95 2,00 -3,30<br />
86 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
87 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
88 7,71 6,96 6,93 6,18 6,43 6,32 4,90 -2,81<br />
89 6,49 5,48 6,00 3,57 3,38 2,98 2,00 -4,49<br />
90 6,78 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -4,78<br />
91 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
92 6,83 6,84 6,74 6,57 5,15 5,15 4,69 -2,14<br />
93 3,58 5,54 4,66 3,56 3,78 3,18 2,00 -1,58<br />
94 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
95 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
96 7,20 6,70 6,54 6,48 6,79 6,57 4,61 -2,59
Code<br />
wasserlösliches Coating, 20 °C<br />
wasserunlösliches Coating, 20 °C<br />
Anhang<br />
Proben U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1<br />
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz<br />
137 7,38 6,54 7,15 7,23 6,98 6,56 5,71 -1,67<br />
138 5,98 5,30 5,94 5,87 2,30 3,83 4,30 -1,68<br />
139 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
140 7,34 8,08 7,83 6,52 6,51 5,38 3,00 -4,34<br />
141 6,76 8,26 7,04 7,18 6,98 5,81 5,04 -1,72<br />
142 6,89 6,45 6,46 6,61 5,45 6,51 5,77 -1,12<br />
143 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
144 6,70 7,98 5,30 6,61 5,90 5,98 3,26 -3,44<br />
145 7,08 8,15 7,38 7,08 6,90 6,43 6,11 -0,97<br />
146 6,26 7,04 6,53 6,46 6,76 5,40 5,04 -1,22<br />
147 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
148 6,96 7,73 7,00 6,93 6,62 6,30 5,65 -1,31<br />
185 5,30 7,38 7,04 6,76 5,85 5,98 5,98 0,68<br />
186 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
187 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
188 7,71 7,56 6,45 6,26 6,46 6,23 3,18 -4,53<br />
189 6,49 7,65 7,93 7,64 7,86 6,40 6,92 0,43<br />
190 6,78 7,04 7,11 7,43 6,72 6,57 6,95 0,17<br />
191 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
192 6,83 8,11 6,40 6,11 5,94 5,48 2,00 -4,83<br />
193 3,58 7,36 7,11 7,28 7,18 7,18 6,41 2,83<br />
194 2,00 2,00 2,00 2,00 0,70 0,70 0,70 0,00<br />
195 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00<br />
196 7,20 7,95 7,52 7,38 5,74 5,68 5,45 -1,75<br />
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 37-40,<br />
85-88, 137-140, 185-188, 30 % Coating: Nr. 41-44, 89-92, 141-144, 189-192, 50 % Coating:<br />
Nr. 45-48, 93-96, 145-148, 193-196, Ohne Zusätze: Nr. 37, 41, 45, 85, 89, 93, 137, 141, 145, 185,<br />
189, 193, Zusatz NaCl: Nr. 38, 42, 46, 86, 90, 94, 138, 142, 146, 186, 190, 194, Zusatz Nelken:<br />
Nr. 39, 43, 47, 87, 91, 95, 139, 143, 147, 187, 191, 195, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 40, 44, 48, 88,<br />
92, 96, 140, 144, 148, 188, 192, 196<br />
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml<br />
197
10.2 Nährmedien<br />
10.2.1 Nährmedien <strong>für</strong> Laktobazillen<br />
MRS-Bouillon<br />
198<br />
Anhang<br />
CM 359, Oxoid, Wesel, Deutschland<br />
(Lactobacillus-Bouillon nach de Man, Rogosa <strong>und</strong> Sharp)<br />
Typische Zusammensetzung g/l<br />
Pepton 10,0<br />
Fleischextrakt ‚Lab-Lemco’ 8,0<br />
Hefeextrakt 4,0<br />
Glukose 20,0<br />
‚Tween’ 80 1 ml<br />
Dikaliumhydrogenphosphat 2,0<br />
Natriumacetat 5,0<br />
Triammoniumcitrat 2,0<br />
Magnesiumsulfat 0,2<br />
Mangan(II)-sulfat 0,05<br />
pH 6,2 ± 0,2<br />
52 g MRS-Bouillon in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. unter Rühren bei 60 °C bis zum vollständigen<br />
Lösen erhitzen. Abfüllen der MRS-Bouillon zu 10 ml in Reagenzgläser. 15 Minuten<br />
bei 121 °C autoklavieren.<br />
MRS-Nährboden<br />
CM 361, Oxoid, Wesel, Deutschland<br />
(Lactobacillus-Agar nach de Man, Rogosa <strong>und</strong> Sharpe)
Typische Zusammensetzung g/l<br />
Anhang<br />
Pepton 10,0<br />
Fleischextrakt ‚Lab-Lemco’ 8,0<br />
Hefeextrakt 4,0<br />
Glukose 20,0<br />
‚Tween’ 80 1 ml<br />
Dikaliumhydrogenphosphat 2,0<br />
Natriumacetat 5,0<br />
Triammoniumcitrat 2,0<br />
Magnesiumsulfat 0,2<br />
Mangan(II)-sulfat 0,05<br />
Agar<br />
pH 6,2 ± 0,2<br />
10,0<br />
62 g MRS-Nährboden in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. suspendieren <strong>und</strong> bis zum vollständigen<br />
Lösen erhitzen. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren.<br />
Agar-Nr. 1, neutral (Bakteriologischer Agar)<br />
LP 11, Oxoid, Wesel, Deutschland<br />
Typische Analyse<br />
Feuchtigkeitsgehalt 7 %<br />
Asche 2,0 %<br />
Säureunlösliche Asche
200<br />
Anhang<br />
10.2.2 Weitere Nährmedien <strong>für</strong> die Untersuchung der Gewürze<br />
CASO-Agar<br />
105458, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
(Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar)<br />
40 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder<br />
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C<br />
RAMBACH ® -Agar<br />
107500, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
1 Flasche Supplement in 250 ml oder 1000 ml (je nach Packungsgröße) Aqua <strong>des</strong>t.<br />
einmischen <strong>und</strong> gut umschwenken bis zur vollständigen Verteilung. 1 Flasche<br />
Nährbodenpulver in das Ansatzgefäß geben, gut umschwenken, bis der Nährboden<br />
vollständig suspendiert ist. Anschließend wird das Ansatzgefäß in ein kochen<strong>des</strong><br />
Wasserbad oder einen Dampftopf überführt <strong>und</strong> unter häufigem Umschwenken<br />
gekocht. Der Nährboden darf keiner weiteren Hitze ausgesetzt werden! Der<br />
Nährboden darf nicht autoklaviert werden! pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C<br />
Salmonella-Anreicherungsbouillon nach RAPPAPORT zur selektiven<br />
Anreicherung von Salmonella<br />
110236, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
54 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen, in Röhrchen abfüllen, schonend autoklavieren<br />
(20 Minuten bei 115 °C). Bei längerer Aufbewahrung <strong>des</strong> zubereiteten Nährbodens<br />
können Niederschläge auftreten, die die Wirksamkeit jedoch nicht beeinträchtigen.<br />
pH 6,0 bei 25 °C<br />
Standard I-Nähragar<br />
107881, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
37 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder<br />
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 7,5 ± 0,2 bei 25 °C
TBG-Bouillon, modifiziert<br />
Anhang<br />
105178, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
(Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Anreicherungsbouillon)<br />
63 g/l Aqua <strong>des</strong>t. lösen, nötigenfalls unter kurzem Erwärmen auf max. 50 °C; bei<br />
Abfüllen das ungelöste Calciumcarbonat gleichmäßig verteilen. Nicht autoklavieren!<br />
pH auf 7,0 ± 0,2 einstellen.<br />
TSC-Agar<br />
111972, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
(Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar)<br />
42 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder<br />
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. Bei 50 bis 45 °C 0,5 g/l<br />
Cycloserin (TSC-Agar) oder 3 mg/l Polymyxinsulfat <strong>und</strong> 12 mg/l Kanamycinsulfat<br />
(SFP-Agar) als sterilfiltrierte Lösungen einmischen. pH 7,4 ± 0,2 bei 25 °C<br />
Cycloserin pharm (17685, Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Deutschland)<br />
VRBD-Agar<br />
110275, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
(Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar nach MOSSEL)<br />
39,5 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen <strong>und</strong> im siedenden Wasserbad oder strömenden Dampf<br />
unter regelmäßigem Umschwenken solange kochen bis der Nährboden vollständig<br />
gelöst ist. Anschließend nicht länger als 2 Minuten weiterkochen. Nicht autoklavieren!<br />
Nicht überhitzen. pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C<br />
XLD-Agar<br />
105287, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
55 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. vollständig lösen. Nicht autoklavieren. Gelegentliche<br />
<strong>Aus</strong>fällungen beeinträchtigen nicht die Leistungsfähigkeit <strong>des</strong> Nährbodens.<br />
pH 7,4 ± 0,2 bei 25 °C<br />
201
YGC-Agar<br />
202<br />
Anhang<br />
116000, Merck, Darmstadt, Deutschland<br />
(Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar FIL-IDF)<br />
40 g in 1 l Aqua <strong>des</strong>t. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder<br />
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 6,6 ± 0,2 bei 25 °C<br />
10.3 Technische Geräte <strong>und</strong> Verbrauchsmaterialien<br />
Abwägeschiffchen Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe,<br />
Deutschland<br />
Anaerobiertopf, 2,5 l Oxoid, Wesel, Deutschland<br />
AnaeroGen Oxoid, Wesel, Deutschland<br />
Autoklav Webeco, Bad Schwartau, Deutschland<br />
Brutschrank, 30 °C Memmert, Schwabach, Deutschland<br />
Brutschrank, 37 °C Memmert, Schwabach, Deutschland<br />
Brutschrank, 42 °C Memmert, Schwabach, Deutschland<br />
CO2-Brutschrank, CB 210 Binder GmbH, Tuttlingen, Deutschland<br />
Crystal Violet Concentrate Viva Diagnostika, Diagnostische<br />
Produkte GmbH, Köln, Deutschland<br />
Dampftopf Nr. 920909 Fritz Gössner GmbH & Co., Hamburg,<br />
Deutschland
Anhang<br />
Dilute Carbol Fuchsin Concentrate Viva Diagnostika, Diagnostische<br />
Produkte GmbH, Köln, Deutschland<br />
Dispensor, Fortuna ® , Optimat ® 2,<br />
Nr. 4000974600501<br />
OMNILAB, Bremen, Deutschland<br />
Gefriertruhe -80 °C, Typ 6385 GFL – Gesellschaft <strong>für</strong> Labortechnik<br />
mbH, Burgwedel, Deutschland<br />
Glaskolben, 500 ml Schott Duran GmbH, Wertheim/Main,<br />
Deutschland<br />
Kapsenberg-Kappen Schott Duran GmbH, Wertheim/Main,<br />
Deutschland<br />
Kohlendioxid Linde AG, Wiesbaden, Deutschland<br />
Kühlkammer Stibbe, Wunstorf, Deutschland<br />
Kühlschrank Liebherr, Ochsenhausen, Deutschland<br />
Lugol’s Iodine Concentrate Viva Diagnostika, Diagnostische<br />
Produkte GmbH, Köln, Deutschland<br />
Magnetrührer C. Gerhardt GmbH & Co. KG,<br />
Königswinter, Deutschland<br />
Microbank ® , 22 V 160 MO Viva Diagnostika, Diagnostische<br />
Produkte GmbH, Köln, Deutschland<br />
Mikroliter-Pipette, Reference ® ,<br />
1 - 100 µl<br />
Mikroliter-Pipette, Reference ® ,<br />
1 - 1000 µl<br />
Eppendorf GmbH, Hamburg,<br />
Deutschland<br />
Eppendorf GmbH, Hamburg,<br />
Deutschland<br />
203
204<br />
Anhang<br />
Mikroskop Axiolab Carl Zaiss AG, Oberkochen,<br />
Deutschland<br />
Petrischalen, 90Ø ohne Nocken,<br />
10-00218<br />
Ronnenberger Laborbedarf,<br />
Ronnenberg, Deutschland<br />
pH-Meter, Nr. 38900138 WTW GmbH, Weilheim, Deutschland<br />
Pipettenspitzen 1000 µl Ratiolab GmbH, Dreieich, Deutschland<br />
Pipettenspitzen 300 µl Eppendorf GmbH, Hamburg,<br />
Deutschland<br />
Reagenzgläser Schott Duran GmbH, Wertheim/Main,<br />
Deutschland<br />
Röhren aus Polypropylen mit run<strong>dem</strong><br />
Boden <strong>und</strong> Schraubverschluss mit O-<br />
Ring (autoklavierbar), 13 ml, farblos,<br />
60.541.004 PP<br />
Rondoflame, Fireboy eco TecNoMara<br />
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland<br />
Sauerstoff Linde AG, Wiesbaden, Deutschland<br />
Schüttler Janke & Kunkel IKA ® -Werke GmbH &<br />
Co. KG, Staufen, Deutschland<br />
Sterilisator Memmert, Schwabach, Deutschland<br />
Stickstoff Linde AG, Wiesbaden, Deutschland<br />
Stomacher 400 Seward, London, UK
Anhang<br />
Umkehr Osmose Anlage SG Kloos Laborbedarf, Langenhagen,<br />
Deutschland<br />
Waage 0,1 - 120 g Mettler-Toledo GmbH, Giessen,<br />
Deutschland<br />
Waage 1 - 2000 g Mettler-Toledo GmbH, Giessen,<br />
Deutschland<br />
Waage Oberschale, Typ MC1 Sartorius AG, Göttingen, Deutschland<br />
Wasserbad Memmert, Schwabach, Deutschland<br />
205
10.4 Abbildungsverzeichnis<br />
206<br />
Anhang<br />
Abbildung 1: Morphologie mikroverkapselter Teilchen nach RUNGE (2001).... 60<br />
Abbildung 2: Prinzipien Wirbelschicht-Coating (GLATT ® 2006)........................ 65<br />
Abbildung 3: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -Fließbett<br />
Top-Spray (GLATT ® 2006)........................................................... 65<br />
Abbildung 4: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -Fließbett<br />
Bottom-Spray (GLATT ® 2006) ..................................................... 66<br />
Abbildung 5: L. reuteri (S 24) <strong>und</strong> L. rhamnosus (S 25): Isolierung, Kultivierung<br />
<strong>und</strong> Sicherung der Stämme ......................................................... 80<br />
Abbildung 6: L. paracasei (S 26): Isolierung, Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung <strong>des</strong><br />
Stammes...................................................................................... 82<br />
Abbildung 7: L. gasseri (S 28): Isolierung, Kultivierung <strong>und</strong> Sicherung <strong>des</strong><br />
Stammes...................................................................................... 84<br />
Abbildung 8: Versuchsaufbau Vorversuche ...................................................... 89<br />
Abbildung 9: Darstellung einer Wirbelschichtanlage GPCG (GLATT ® )............. 91<br />
Abbildung 10: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -Fließbett<br />
Top-Spray (GLATT ® ).................................................................... 92<br />
Abbildung 11: Keimzahlen der Lyophilisate von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus<br />
(S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28), Verlaufsübersicht<br />
................................................................................................... 112<br />
Abbildung 12: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) ohne den Einfluss von Zusätzen..<br />
................................................................................................... 114<br />
Abbildung 13: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter <strong>dem</strong> Einfluss von NaCl . 115<br />
Abbildung 14: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 117<br />
Abbildung 15: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) ohne den Einfluss von<br />
Zusätzen .................................................................................... 119<br />
Abbildung 16: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter <strong>dem</strong> Einfluss von NaCl<br />
................................................................................................... 120
Anhang<br />
Abbildung 17: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Nelken........................................................................................ 121<br />
Abbildung 18: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 123<br />
Abbildung 19: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) ohne den Einfluss von<br />
Zusätzen .................................................................................... 124<br />
Abbildung 20: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter <strong>dem</strong> Einfluss von NaCl ..<br />
................................................................................................... 125<br />
Abbildung 21: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 127<br />
Abbildung 22: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) ohne den Einfluss von Zusätzen<br />
................................................................................................... 128<br />
Abbildung 23: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von NaCl 129<br />
Abbildung 24: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 131<br />
207
10.5 Tabellenverzeichnis<br />
208<br />
Anhang<br />
Tabelle 1: Wichtige technologisch genutzte Genera <strong>und</strong> probiotisch eingesetzte<br />
Spezies der Milchsäurebakterien (KLEIN 2001).................................. 21<br />
Tabelle 2: Einteilung <strong>des</strong> Genus Lactobacillus in Subgenera (nicht mehr gültig)<br />
bzw. in phänotypische/molekularbiologische Untergruppen (KLEIN<br />
2001)................................................................................................... 24<br />
Tabelle 3: L. acidophilus-Gruppe, Referenzen <strong>und</strong> Typstämme .......................... 26<br />
Tabelle 4: L. casei-Gruppe, Referenzen <strong>und</strong> Typstämme.................................... 27<br />
Tabelle 5: L. reuteri/L. fermentum-Gruppe, Referenzen <strong>und</strong> Typstämme............ 29<br />
Tabelle 6: Gesicherte <strong>und</strong> mögliche Ges<strong>und</strong>heitseffekte von Pro- <strong>und</strong> Prebiotika<br />
(DE VRESE u. SCHREZENMEIR 2000) ............................................. 31<br />
Tabelle 7: Immunmodulatorische Effekte von Probiotika (DE VRESE u.<br />
SCHREZENMEIR 2000)...................................................................... 34<br />
Tabelle 8: Risikogruppen <strong>für</strong> biologische Arbeitsstoffe nach § 3 Biostoffverordnung<br />
(ANONYM 1999) ................................................................................. 35<br />
Tabelle 9: Risikogruppen der in Tab. 3 - 5 genannten Laktobazillen nach<br />
TRBA 466 (ANONYM 2006)................................................................ 37<br />
Tabelle 10: Physiologische Kriterien von probiotischen Mikroorganismen, die einer<br />
Unbedenklichkeitsprüfung bedürfen (ARBEITSGRUPPE<br />
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN<br />
LEBENSMITTELN“ AM BUNDESINSTITUT FÜR<br />
GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND<br />
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000) ............................................. 41<br />
Tabelle 11: Häufig in der Fleischindustrie eingesetzte Starterkulturen (RUST<br />
2004) ................................................................................................... 52<br />
Tabelle 12: Verwendete Bakterienstämme ............................................................ 71<br />
Tabelle 13: Zusammensetzung Lyophilisate, THT SA ........................................... 72<br />
Tabelle 14: Musterübersicht der mikroverkapselten Bakterien, Micap ® GmbH...... 73<br />
Tabelle 15: Nährmedienübersicht .......................................................................... 74
Anhang<br />
Tabelle 16: Übersicht über die verwendeten Gewürze <strong>und</strong> deren Einsatz............. 78<br />
Tabelle 17: Analysedaten der lyophilisierten Stämme, THT SA............................. 90<br />
Tabelle 18: Probenschlüssel.................................................................................. 94<br />
Tabelle 19: Untersuchungszeitpunkte.................................................................... 99<br />
Tabelle 20: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Gewürzen 1 - 6.................................................................................. 106<br />
Tabelle 21: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Gewürzen 7 - 12................................................................................ 107<br />
Tabelle 22: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),<br />
L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28) unter <strong>dem</strong> Einfluss von<br />
Kochsalz in verschiedenen Konzentrationen..................................... 109<br />
Tabelle 23: Keimbelastung der Gewürze Nelken <strong>und</strong> Schwarzer Pfeffer............. 110<br />
Tabelle 24: Keimzahlen (Kz in lg KbE/g) der Lyophilisate von L. reuteri (S 24),<br />
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) <strong>und</strong> L. gasseri (S 28),<br />
Verlaufsübersicht............................................................................... 189<br />
Tabelle 25: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. reuteri (S 24), Verlaufsübersicht ...<br />
...................................................................................................... 190<br />
Tabelle 26: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. rhamnosus (S 25),<br />
Verlaufsübersicht............................................................................... 192<br />
Tabelle 27: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. paracasei (S 26), Verlaufsübersicht<br />
...................................................................................................... 194<br />
Tabelle 28: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. gasseri (S 28), Verlaufsübersicht ..<br />
...................................................................................................... 196<br />
209
Erklärung<br />
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit <strong>dem</strong> Titel<br />
„Entwicklung von mikroverkapselten Probiotika-Präparaten zum Einsatz als<br />
selbständig verfasst habe.<br />
Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen“<br />
Bei der Anfertigung wurde keine Hilfe Dritter in Anspruch genommen.<br />
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten<br />
(Promotionsberatern oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat<br />
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen <strong>für</strong> Arbeiten erhalten, die<br />
im Zusammenhang mit <strong>dem</strong> Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.<br />
Ich habe die Dissertation an folgender <strong>Institut</strong>ion angefertigt:<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Lebensmittelqualität</strong> <strong>und</strong> -<strong>sicherheit</strong><br />
<strong>des</strong> Zentrums <strong>für</strong> Lebensmittelwissenschaften<br />
der Tierärztlichen Hochschule Hannover<br />
Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover<br />
Die Dissertation wurde bisher nicht <strong>für</strong> eine Prüfung oder Promotion oder <strong>für</strong> einen<br />
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.<br />
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig<br />
<strong>und</strong> der Wahrheit entsprechend gemacht habe.<br />
Julia Nina Jähne
Danksagung<br />
Herrn Prof. Dr. Günter Klein danke ich <strong>für</strong> die Überlassung <strong>des</strong> Themas <strong>und</strong> die<br />
Unterstützung <strong>und</strong> Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit, sowie <strong>für</strong> die<br />
Bereitstellung <strong>des</strong> Arbeitsplatzes.<br />
Herrn PD Dr. Michael Kühne danke ich <strong>für</strong> die Überlassung <strong>des</strong> Themas dieser<br />
Arbeit <strong>und</strong> die Unterstützung <strong>und</strong> Betreuung bei der Umsetzung. Trotz <strong>des</strong> Wechsels<br />
seines Dienstortes nach Oldenburg war er bei Problemen <strong>und</strong> Schwierigkeiten immer<br />
erreichbar.<br />
Frau Dr. Christine Bonaparte danke ich herzlich <strong>für</strong> die hilfreiche <strong>und</strong> engagierte<br />
Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit. Während der Planung, im Labor, <strong>und</strong><br />
auch in der End- <strong>und</strong> Schreibphase gab sie mir immer wieder mit einem großen<br />
Engagement wertvolle Ratschläge <strong>und</strong> Anregungen. Merci Christine.<br />
Der Fritz-Ahrberg-Stiftung, Hannover danke ich <strong>für</strong> die finanzielle Förderung dieser<br />
Arbeit.<br />
Der Universität <strong>für</strong> Bodenkultur Wien, Department <strong>für</strong> Lebensmittelwissenschaften<br />
<strong>und</strong> -technologie, Abteilung Lebensmittelmikrobiologie <strong>und</strong> -hygiene danke ich <strong>für</strong> die<br />
Bereitstellung der Stämme S 24 <strong>und</strong> S 25.<br />
Der Firma THT SA, Gembloux, Belgien danke ich <strong>für</strong> die Durchführung der<br />
Lyophilisation. Besonders danke ich Herrn Eric De Mol. Merci Eric.<br />
Der Firma Micap ® GmbH, Bremerhaven, speziell Herrn Jörg Rendel <strong>und</strong> Herrn<br />
Andreas Bruns, danke ich <strong>für</strong> die Beratung hinsichtlich der Mikroverkapselung <strong>und</strong><br />
deren Durchführung.
Der GELITA ® AG, insbesondere Herrn Dr. Seybold <strong>und</strong> Herrn Dr. Ahlers, danke ich<br />
<strong>für</strong> die fre<strong>und</strong>liche Bereitstellung der Gelatine.<br />
Der Firma Glatt ® GmbH danke ich <strong>für</strong> die fre<strong>und</strong>liche Genehmigung die Abbildungen<br />
Nr. 2, 3, 4, 9 <strong>und</strong> 10 dieser Arbeit veröffentlichen zu dürfen.<br />
Ich danke meinen Kolleginnen <strong>und</strong> Kollegen <strong>des</strong> <strong>Institut</strong>es <strong>für</strong> <strong>Lebensmittelqualität</strong><br />
<strong>und</strong> -<strong>sicherheit</strong> <strong>für</strong> die angenehme <strong>und</strong> fre<strong>und</strong>liche Arbeitsatmosphäre. Insbesondere<br />
danke ich Frau Dr. Ute Körner <strong>für</strong> Ihre Unterstützung, sowie <strong>für</strong> die Antworten auf<br />
viele Fragen <strong>und</strong> die angenehme, abwechslungsreiche (WG-)Büroatmosphäre, wo<strong>für</strong><br />
ich ebenfalls Frau Dr. Soumaya Lhafi <strong>und</strong> Herrn Sameh Abuseir danke. Frau Birte<br />
Ahlfeld danke ich da<strong>für</strong>, dass sie mir in labortechnischen <strong>und</strong> Laktobazillenspezifischen<br />
Fragen immer gerne geholfen hat.<br />
Bei meiner Familie, vor allem bei meinen Eltern <strong>und</strong> Großeltern, möchte ich mich<br />
da<strong>für</strong> bedanken, dass sie immer an mich geglaubt <strong>und</strong> mich unterstützt hat.<br />
Helge, Dir danke ich <strong>für</strong> ALLES!!!
ISBN 978-3-939902-35-5<br />
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH<br />
35392 Gießen · Frankfurter Str. 89 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375<br />
e-mail: Geschaeftsstelle@dvg.net · Homepage: http://www.dvg.net