Seminar for PhD students - Max-Planck-Institut für biophysikalische ...

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(STED). The result is an isotropic optical resolution (therefore the name isoSTED). This nanoscope, which in essence can be operated like a conventional confocal microscope, allowed us to arbitrarily address any plane inside the cell. We first imaged mammalian (PtK2) cells labeled for a subunit (Tom20) of the translocase of the mitochondrial outer membrane (TOM) complex. The TOM complex, residing in the outer membrane, serves as the mitochondrial entry gate for the vast majority of nuclear-encoded protein precursors. We took several optical sections, each only 40 nm thick, from a single mitochondrion. This allowed us to visualize the distributions of individual TOM complexes on the mitochondrial surface (Fig. 4a) . In the next step, we used the isoSTED nanoscope to image the spatial relationship of two differently labeled mitochondrial proteins. We decided to image in addition to Tom20 also the matrix protein mtHsp70 (also referred to as mortalin or GRP 75). mtHsp70 is a component of the protein import motor located at the matrix side of the inner membrane. Previous biochemical evidence demonstrated that mtHsp70 is involved in protein import by binding to the transported precursor proteins when they reach the matrix side of the translocase. The intermittent association of mtHsp70 with the import machinery may suggest that a sizeable fraction of the mtHsp70 pool is at any time associated with the inner membrane of the mitochondrion. However, we did not find a noticeable enrichment of mtHsp70 at the mitochondrial rim, indicating that the majority of mtHsp70 is located in the mitochondrial matrix (Fig 4b). These data demonstrate that with iso- STED nanoscopy we are able to analyze the distribution and co-localization of proteins within mitochondria, which would be impossible using conventional light microscopy due to its diffraction limited resolution. Seeing cristae with focused light But is it possible at all to visualize the folds of the inner membrane just relying on focused light? Clearly, from a light microscopists' point of view, the visualization of the cristae is a major challenge because of the pronounced convolution of the inner membrane in a very confined space. In fact, arguably, it is one of the most challenging structural elements in a cell to image with far field optical microscopy, Fig. 5: Light microscopic analysis of the arrangement of cristae inside mitochondria of intact PtK2 cells using the isoSTED nanoscope. The mitochondrial inner membrane was labeled with antibodies directed against an abundant protein complex of the inner membrane, the F 1F 0-ATPase. (a) Overview and (b) close-up of an optical section of mitochondria recorded at their equatorial plane (thickness ~ 30 nm). The brackets indicate regions in which the cristae are perpendicularly oriented to the longitudinal axis of the organelle, whereas the arrowheads point to inner-mitochondrial regions devoid of cristae. Scale bars: 500 nm. Abb. 5: Lichtmikroskopische Untersuchung der Anordnung der Cristae im Inneren von Mitochondrien intakter PtK2-Zellen. Die mitochondriale Innenmembran wurde mit Antikörpern gegen die F 1F 0-ATPase, eines häufigen Proteinkomplexes der Innenmembran, dekoriert. (a) Übersicht und (b) Detailvergrößerung eines optischen Schnittes (Dicke ~ 30 nm) durch die Mitte eines Mitochondriums. Die Klammern weisen auf Bereiche hin, in denen die Cristae senkrecht zur Längsachse des Organells ausgerichtet sind, wohingegen die Pfeilspitzen auf Bereiche zeigen, in denen keine Cristae vorkommen. Größenstandard: 500 nm. Seite 4 and its imaging remained elusive. We solved this problem with isoSTED nanoscopy in combination with meticulously optimized labeling and fixation conditions (Schmidt et al., 2009). In general, the images revealed heterogeneous cristae arrangements even within a single mitochondrial tubule (Fig. 5). Regions of stacked cristae alternated with relatively large regions of up to ~10 5 nm 2 , which were devoid of cristae. These images demonstrate that it is indeed possible to visualize the intricate foldings of the mitochondrial membrane with focused light. Altogether, we have shown that the inner membrane of mitochondria is subcompartmentalized. The data suggest that the functional differences of the inner boundary membrane and the cristae membrane are more significant than previously anticipated. Using isoSTED nanoscopy we are now able to visualize sub-mitochondrial protein distributions, even individual cristae arrangements, in intact cells. Together with new GFP-based probes (Andresen et al., 2008), we strongly anticipate that these findings will facilitate the analysis of the molecular mechanisms determining the subcompartmentalization of the inner membrane of mitochondria and beyond. References: Andresen, M., A.C. Stiel, J. Folling, D. Wenzel, A. Schonle, A. Egner, C. Eggeling, S.W. Hell, and S. Jakobs. 2008. Photoswitchable fluorescent proteins enable monochromatic multi- label imaging and dual color fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnol. 26:1035-1040. Schmidt, R., C.A. Wurm, S. Jakobs, J. Engelhardt, A. Egner, and S.W. Hell. 2008. Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nature Methods. 5:539-544. Schmidt, R., C.A. Wurm, A. Punge, A. Egner, S. Jakobs, and S.W. Hell. 2009. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9:2508-2510. Suppanz, I.E., C.A. Wurm, D. Wenzel, and S. Jakobs. 2009. The m-AAA protease processes cytochrome c peroxidase preferentially at the inner boundary membrane of mitochondria. Mol Biol Cell. 20:572-580. Vogel, F., C. Bornhovd, W. Neupert, and A.S. Reichert. 2006. Dynamic subcompartmentalization of the mitochondrial inner membrane. J Cell Biol. 175:237-247. Wurm, C.A., and S. Jakobs. 2006. Differential protein distributions define two subcompartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580:5628-5634.
Christian Wurm studied biology at the University of Darmstadt. In 2004, he joined the RG Mitochondrial Structure and Dynamics in the Department of Nano- Biophotonics and gra- duated in 2008 at the University of Heidelberg. Currently, he is working as a postdoctoral fellow in Stefan Jakobs group at the MPIbpc. Stefan Stoldt studied biology at the University of Göttingen. In 2005, he joined the RG Mitochondrial Structure and Dynamics, where he is currently carrying out his PhD thesis. Blick ins Innere der Zellkraftwerke Mitochondrien (Abb. 1) sind die „Kraftwerke“ der Zelle. Sie liefern die Energie, die den zellulären Stoffwechsel in Gang hält. Entsprechend fatal sind die Folgen, wenn diese Kraftwerke nicht richtig funktionieren: Defekte Mitochondrien können zu Erkrankungen wie Krebs, Parkinson oder Alzheimer führen. Aus elektronenmikroskopischen Studien weiß man seit langem, dass Mitochondrien eine sehr komplexe innere Architektur haben. Sie besitzen eine äußere Membran und eine stark gefaltete innere Membran, die die sogenannte Matrix umgibt (Abb. 2). Doch wie sind Proteine innerhalb der Mitochondrien, etwa innerhalb der inneren Membran, verteilt? Und welche molekularen Mechanismen stecken hinter ihrer Verteilung? Mitochondrien sind so klein, dass sich solche Fragen bisher nur mit dem Elektronenmikroskop untersuchen ließen. Entsprechend wenig weiß man darüber, was sich in den Mitochondrien lebender Zellen abspielt. Tatsächlich wurde erst vor kurzem durch uns und eine andere Forschungsgruppe gezeigt, dass verschiedene Bereiche der inneren Membran unterschiedliche Seite 5 Stefan Jakobs studied biology in Kaiserslautern and Manchester. The research for his PhD, which he received from the University of Cologne in 1999, was performed at the MPI for Plant Breeding Research, Cologne, and at the John Innes Centre, Norwich. From 1999 to 2005, he was a postdoctoral fellow in the High Resolution Optical Micro- scopy Group (which became the Department of NanoBiophotonics) at the MPIbpc. In 2005, he became head of the RG Mitochondrial Structure and Dynamics. In 2007, Stefan Jakobs habilitated at the University of Göttingen. Proteinzusammensetzungen haben, dass die innere Membran also sub-kompartimentiert ist. Diese Untersuchungen wurden allerdings entweder mit Elektronenmikro- skopen oder mit Lichtmikroskopen an Mito- chondrien durchgeführt, die durch einen genetischen Trick vergrößert wurden. Um zukünftig auch die Mitochondrien unveränderter lebender Zellen untersuchen zu können, nutzen wir jetzt auch neue lichtmikroskopische Verfahren wie die Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopie, mit der sich die Bildschärfe um ein Vielfaches steigern lässt. Mithilfe eines isoSTED-Nanoskops, das die Auflösung in allen drei Raumrichtungen im Vergleich zu konventionellen Mikroskopen verbessert, waren wir nun zum ersten Mal in der Lage, lichtmikroskopisch Proteinverteilungen innerhalb unveränderter Mitochondrien (Abb. 4) und sogar individuelle Cristae, die Einfaltungen der inneren Membran (Abb. 5), abzubilden. Wir hoffen, dass es mit diesen Verfahren in Zukunft möglich sein wird, sogar die Bewegung einzelner Proteine und individueller Cristae in den Mitochondrien lebender Zellen direkt zu beobachten.
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