Genetische Untersuchung der Populationsstruktur ... - Die Schmellers

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6.3 ELEKTROPHORESE
gelegt (vgl. Abbildung 6.3-1). Die Auftragungszone muß dabei in der Nähe der Kathode
zu liegen kommen, weil die weitaus meisten Enzyme in Richtung Anode laufen.
Die einzige Ausnahme in dieser Untersuchung bildete der zweite Locus der Glutamatoxalacetattransaminase
(GOT). Dieser lief Richtung Kathode, allerdings nur eine
sehr geringe Strecke, so daß der selbe Auftragungsmechanismus verwendet werden
konnte. Es wurde ferner darauf geachtet, daß die CA-Platten parallel zum Kammersteg
lagen, damit die Lauffront, in bezug auf die Platte, gerade verläuft. Die Kammern
wurden mit Kühlakkus kühl gehalten, damit der Grad der Denaturierung möglichst
gering blieb.
6.3.3 Durchführung der CA-Elektrophorese{ XE "Elektrophorese" }
und der Enzymfärbung{ XE "Enzymfärbung" }
Bei einem vorhergehenden Screening wurden die besten Bedingungen für die Cellulose-Acetat-Gelelektrophorese
bei Platycleis albopunctata ermittelt (vgl. Tabelle 7.2-
2). Variiert wurden dabei:
− die Art der Probe (Bein, Flugmuskulatur)
− die Art des Homogenisationspuffers und des Laufpuffers,
− die Stromstärke,
− die Laufzeit,
− die Zahl der Hits (Zahl der Applikationen pro Platte),
− das Färberezept und
− die Inkubationszeit für die Platten.
Den größten Teil des Screenings führte B. NICKLAS-GÖRGEN innerhalb ihrer Doktorarbeit
durch. An dieser Stelle nochmals vielen Dank für die Ersparnis vieler Stunden
mühsamen Screenings.
Nachdem die Laufkammern und CA-Platten, wie im vorhergehenden Kapitel beschrieben,
vorbereitet worden waren, wurde dann die durch das Screening ermittelte
Spannung angelegt und die Medien eine bestimmte Zeit (vgl. Tabelle 7.2-2) im elektrischen
Feld laufen gelassen. Anschließend wurden die Platten den Kammern entnommen
und mit vorbereitetem Färbemedium übergossen. Bei der Vorbereitung der
Färbemedien wurde darauf geachtet, daß Enzyme, oder andere leicht veränderbare
Stoffe, nicht zu früh dem Gemisch beigefügt wurden. PMS{ XE "PMS" } z.B. zerfällt
sehr leicht bei Zimmertemperatur und Lichteinstrahlung und darf deshalb erst kurz
vor der Verwendung zugegeben werden. Nach der Zugabe aller Reagenzien wurde
Agar-Agar zugegeben, dabei muß das Reaktionsgefäß geschüttelt werden, damit eine
gleichmäßige Verteilung aller Stoffe gewährleistet ist (RICHARDSON{ XE
"RICHARDSON" } et al.1986).