Genetische Untersuchung der Populationsstruktur ... - Die Schmellers
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6 MATERIAL UND METHODEN<br />
ben wurden in Homogenisationspuffer (vgl. Kapitel 11.2.7) mit Ultraschall homogenisiert.<br />
Dabei wurde darauf geachtet, daß die Proben weiterhin gekühlt bleiben und nur<br />
wenige Ultraschallstöße (3 - 4) zum Zerkleinern benötigt wurden. Zu hohe Erwärmung<br />
würde den Anteil denaturierten Enzyms deutlich erhöhen. <strong>Die</strong> spezifischen<br />
Färbemethoden wären dann nicht mehr anwendbar gewesen bzw. hätten durch<br />
Schmierbanden o<strong>der</strong> eine uninterpretierbare Bandenzahl, die durch aktive kleinere<br />
Untereinheiten entsteht, keine schlüssigen Ergebnisse mehr ergeben<br />
(RICHARDSON et al. 1986).<br />
Nach dem Homogenisieren wurden die Proben in einer Zentrifuge bei 14000 U/min<br />
drei bis vier Minuten zentrifugiert. Auch hierbei wurde beachtet, daß eine zu lange<br />
Zentrifugierzeit die Proben zu sehr erwärmt. <strong>Die</strong> Proben müssen zentrifugiert werden,<br />
damit sich alle größeren Teilchen (Muskel, Chitinskelett u.ä.) aus dem Überstand<br />
absetzen. Durch zu große Teilchen kann <strong>der</strong> Lauf <strong>der</strong> Enzyme stark beeinträchtigt<br />
werden.<br />
Vom so erhaltenen Überstand wurden mit einer Eppendorfpipette ca. 11µl in die<br />
Kammern <strong>der</strong> Probenplatte (passend zu Applikator) pipettiert. Bevor die Proben nun<br />
mit einem Applikator auf die CA-Platten aufgebracht werden konnten, mußten die<br />
Platten aus ihren Einweichkammern geholt, abgetropft und mit Filterpapier abgetrocknet<br />
werden. <strong>Die</strong> Oberfläche <strong>der</strong> CA-Platten muß relativ trocken sein, damit die<br />
applizierten Proben schnell eingesaugt werden und dadurch nicht unkontrolliert in die<br />
Platten einsickern. Nur so ist ein exaktes, punktuelles Applizieren <strong>der</strong> Proben möglich.<br />
Durch das unkontrollierte Einsickern kommt es zu rundlichen Banden, die<br />
schwerer zu interpretieren sind.<br />
Das Applizieren <strong>der</strong> Proben erfolgte mit Hilfe des Applikators „Super Z“ (HELENA<br />
Laboratories), durch den mittels zweier Metallschlaufen aus je<strong>der</strong> Kammer <strong>der</strong> Probenplatte<br />
eine genau definierte Menge (1 µl) Homogenat auf die CA-Platten übertragen<br />
werden kann. Je nach Aktivität des zu untersuchenden Enzyms muß das Applizieren<br />
mehrmals wie<strong>der</strong>holt werden (vgl. Tab. 7.2.2).<br />
Pro Elektrophoreseplatte können auf diese Weise zwölf Tiere aufgebracht werden.<br />
Bei Proben, die zu nahe am Rand laufen, kommt es allerdings zu einem Randeffekt,<br />
d.h. die Enzyme laufen schräg. Um dies zu umgehen wurden nur elf Tiere pro Platte<br />
appliziert (zehn Proben + eine Referenz). <strong>Die</strong> Referenzprobe sollte die Platten untereinan<strong>der</strong><br />
leichter vergleichbar machen, weil nicht je<strong>der</strong> Lauf exakt dem an<strong>der</strong>en entspricht<br />
und es so zu Interpretationsschwierigkeiten kommen kann.<br />
Nach erfolgter Applikation wurden die CA-Platten mit <strong>der</strong> Gelseite (= Auftragungsseite)<br />
nach unten auf die Filterpapierstreifen <strong>der</strong> Stege <strong>der</strong> Elektrophoresekammer<br />
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