Genetische Untersuchung der Populationsstruktur ... - Die Schmellers

6 MATERIAL UND METHODEN
ben wurden in Homogenisationspuffer (vgl. Kapitel 11.2.7) mit Ultraschall homogenisiert.
Dabei wurde darauf geachtet, daß die Proben weiterhin gekühlt bleiben und nur
wenige Ultraschallstöße (3 - 4) zum Zerkleinern benötigt wurden. Zu hohe Erwärmung
würde den Anteil denaturierten Enzyms deutlich erhöhen. Die spezifischen
Färbemethoden wären dann nicht mehr anwendbar gewesen bzw. hätten durch
Schmierbanden oder eine uninterpretierbare Bandenzahl, die durch aktive kleinere
Untereinheiten entsteht, keine schlüssigen Ergebnisse mehr ergeben
(RICHARDSON et al. 1986).
Nach dem Homogenisieren wurden die Proben in einer Zentrifuge bei 14000 U/min
drei bis vier Minuten zentrifugiert. Auch hierbei wurde beachtet, daß eine zu lange
Zentrifugierzeit die Proben zu sehr erwärmt. Die Proben müssen zentrifugiert werden,
damit sich alle größeren Teilchen (Muskel, Chitinskelett u.ä.) aus dem Überstand
absetzen. Durch zu große Teilchen kann der Lauf der Enzyme stark beeinträchtigt
werden.
Vom so erhaltenen Überstand wurden mit einer Eppendorfpipette ca. 11µl in die
Kammern der Probenplatte (passend zu Applikator) pipettiert. Bevor die Proben nun
mit einem Applikator auf die CA-Platten aufgebracht werden konnten, mußten die
Platten aus ihren Einweichkammern geholt, abgetropft und mit Filterpapier abgetrocknet
werden. Die Oberfläche der CA-Platten muß relativ trocken sein, damit die
applizierten Proben schnell eingesaugt werden und dadurch nicht unkontrolliert in die
Platten einsickern. Nur so ist ein exaktes, punktuelles Applizieren der Proben möglich.
Durch das unkontrollierte Einsickern kommt es zu rundlichen Banden, die
schwerer zu interpretieren sind.
Das Applizieren der Proben erfolgte mit Hilfe des Applikators „Super Z“ (HELENA
Laboratories), durch den mittels zweier Metallschlaufen aus jeder Kammer der Probenplatte
eine genau definierte Menge (1 µl) Homogenat auf die CA-Platten übertragen
werden kann. Je nach Aktivität des zu untersuchenden Enzyms muß das Applizieren
mehrmals wiederholt werden (vgl. Tab. 7.2.2).
Pro Elektrophoreseplatte können auf diese Weise zwölf Tiere aufgebracht werden.
Bei Proben, die zu nahe am Rand laufen, kommt es allerdings zu einem Randeffekt,
d.h. die Enzyme laufen schräg. Um dies zu umgehen wurden nur elf Tiere pro Platte
appliziert (zehn Proben + eine Referenz). Die Referenzprobe sollte die Platten untereinander
leichter vergleichbar machen, weil nicht jeder Lauf exakt dem anderen entspricht
und es so zu Interpretationsschwierigkeiten kommen kann.
Nach erfolgter Applikation wurden die CA-Platten mit der Gelseite (= Auftragungsseite)
nach unten auf die Filterpapierstreifen der Stege der Elektrophoresekammer
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