Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg

Zur Analyse auf Homozygotie bzgl. einer T-DNA-Insertion wurden zwei PCR-Ansätze
mit der isolierten DNA der Insertionslinien sowie von Col-0 als Kontrolle durchgeführt.
Die erste Reaktion erfolgte unter Verwendung der Primer LP und RP der zu
untersuchenden Insertionslinie. A.thaliana Col-0 Proben, welche als Kontrolle
eingesetzt wurden, da diese Pflanzen keine T-DNA-Insertion im Genom inkorporiert
haben, ergaben stets ein Amplifikat von 1000 bis 1100 bp. Heterozygote Individuen,
welche nur in einem Allel des entsprechenden Lipase-Gens die T-DNA-Insertion
trugen, wiesen ebenfalls ein entsprechendes Amplifikat auf. Bei homozygoten
Pflanzen führte die PCR zu keinem Amplifikat, da das zu amplifizierende
Genomstück, welches zusätzlich die T-DNA-Insertion beinhaltete, unter den
verwendeten PCR-Bedingungen auf Grund seiner Größe nicht amplifizierbar war. Mit
diesen putativ homozygoten Pflanzen wurde eine weitere PCR durchgeführt. Die
verwendeten Oligonukleotide waren der RP-Primer des zu untersuchenden
Lipasegens sowie der Insertionsprimer, welcher an der T-DNA-Insertion bindet. Bei
homozygoten Individuen wurde ein Produkt von circa 400 bp amplifiziert. Die DNA
der Kontrollpflanzen ergab folglich auf Grund der fehlenden Insertion niemals ein
Amplifikat. Die Annealingtemperatur der Primerkombination RP-Primer und
Insertionsprimer lag stets zwischen 60°C und 62°C. In Abb.III 16 sind die
Primerbindungstellen der Primer LP und RP im Genom sowie des Insertionsprimers
(Insert.P) innerhalb der T-DNA-Insertion schematisch dargestellt. Ein Beispiel der
gelelektrophoretischen Dokumentation des Homozygotienachweises ist in Abb.III.17
gezeigt.
Abbildung III.16: Schema der Primerbindungsstellen im Genom und der T-DNA-Insertion zum
Homozygotienachweis von T-DNA-Insertionsmutanten des Nottingham Stockcenters.
Gezeigt sind Antisense- und Senseprimerbindungsstellen (LP und RP) zum Nachweis eines
Wildtypgens sowie die Bindungsstelle des Insertionsprimer (Insert.P) zum Nachweis einer T-DNA-
Insertion in einem Gen. Darstellung aus http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html entnommen und
modifiziert.
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