Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg
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Da weder für DGL noch DAD1 eine essentielle Funktion innerhalb der JA-<br />
Biosynthese in Blättern von A. <strong>thaliana</strong> gezeigt werden konnte, wurde eine<br />
vergleichende Oxylipin-Analyse weiterer plastidär lokalisierter Lipase-Einzelmutanten<br />
unter basalen Bedingungen sowie nach Verwundung und Pathogeninfektion<br />
durchgeführt.<br />
3.3 Analyse weiterer plastidär lokalisierter Lipasen<br />
Wie bereits in der Zielsetzung der vorliegenden Arbeit unter I.4.1 beschrieben, sollten<br />
Einzemutanten von 21 putativ im Chloroplasten lokalisierte Lipasen bzgl. ihrer<br />
Gehalte an den freien Oxylipinen OPDA und JA in Blättern unter basalen<br />
Bedingungen sowie nach Verwundung untersucht werden, um durch vergleichende<br />
Analyse mit Wildtyp-Pflanzen das initiale lipolytische Enzym der JA-Biosynthese zu<br />
identifizieren. Hierfür wurden T-DNA-Insertionsmutanten des Nottingham<br />
Stockcenters verwendet. Die bestellten Mutanten wurden in segregierendem Zustand<br />
geliefert. Nach der ersten Aussaat wurden mittels molekularbiologischer Analyse die<br />
homozygoten Individuen selektiert und deren Nachkommenschaft für die Analyse von<br />
OPDA und JA genutzt. Auch die zur Oxylipin-Analyse verwendeten Nachkommen<br />
von homozygoten Elternpflanzen wurden stets erneut auf Reinerbigkeit geprüft.<br />
3.3.1 Molekularbiologische Analyse auf Homozygotie<br />
Die molekularbiologische Analyse auf Reinerbigkeit der bestellten T-DNA-<br />
Insertionsmutanten erfolgte unter Zuhilfenahme von Primern der jeweiligen<br />
Insertionslinien sowie einem sogenannten Insertionsprimer (Insert.P). Die Sequenzen<br />
der Primer konnten unter dem Internet-Link „http://signal.salk.edu/<br />
tdnaprimers.2.html“ ermittelt werden und die Oligonukleotide bei „www.tib-molbiol.de“<br />
bestellt werden.<br />
Zu Beginn wurden die erhaltenen Primerpaare (LP und RP) der jeweiligen Mutanten<br />
mittels PCR, welche einen Gradienten der Annealingtemperatur von 50°C bis 65°C<br />
beinhaltete, auf die optimale Anlagerungstemperatur überprüft. Hierzu wurde DNA<br />
von Col-0 Pflanzen verwendet. Die erhaltenen Amplifikate der intakten Lipase<br />
codierenden Gene betrugen zwischen 1000 und 1100 Basen-paaren. Die optimalen<br />
Annealingtemperaturen der jeweilgen T-DNA-Insertionslinien-Primer sind Tabelle II.3<br />
zu entnehmen.<br />
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