Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg

Pellets wurden in 1,5 ml MeOH/Chloroform (1:2;v:v) erneut extrahiert. Anschließend
erfolgte ein Zentrifugationsschritt von 10 min bei RT und 14000 rpm. Der Überstand
wurde abgenommen und mit den Überständen der beiden vorangegangenen
Extraktionsschritten vereinigt. Das Protokoll wurde solange wiederholt, bis das
Probenmaterial farblos war. Die vereinigten Überstände wurden zur Trockne
eingeengt und in 100 µl MeOH mit 1 mM Ammoniumacetat gelöst. Bis zur Analyse
der Proben mittels HPLC-Tandem MS wurden die Proben bei -80°C aufbewahrt.
9. Lipidanalytik mittels HPLC-Tandem MS
9.1 HPLC-Methoden
Für die chromatographische Auftrennung aller Proben wurde ein Ultra High
Performance Liquid Chromatograph Acquity UPLC der Firma Waters verwendet.
Die Anlage bestand aus einem Acquity UPLC Binärem Hochdruck-
Gradientenmanagement System, einem Acquity UPLC Probenmanager sowie einem
Acquity UPLC Säulenofen. Im Folgenden sind die Lösemittelgradienten für die
Analytik der untersuchten Lipidspezies tabellarisch beschrieben.
9.1.1 Freie Lipide
Die chromatographische Auftrennung der freien Lipide erfolgte mittels der UPLC-
Säule Aquity UPLC BEH C18 (Partikelgröße: 1,7 μm, Durchmesser: 2,1 mm,
Länge: 30 mm). Zum Schutz der Säule wurde ein 0,2 µm-Partikelfilter und eine
VanGuard BEH C18 Säule (Partikelgröße: 1,7 μm, Durchmesser: 2,1 mm, Länge:
5 mm) verwendet. In Tabelle II.8 ist der zur chromatographischen Trennung von
freien Lipiden verwendete Lösemittelgradient dargestellt.
Tabelle II.8: Lösemittelgradient zur chromatographischen Trennung von freien Lipiden.
Lösemittel A: H2O (1mM NH4CH3COOH, pH 6,6), Lösemittel B: Acetonitril.
Zeit [min] Flussrate [ml/min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0 0,3 95 5
3 0,3 40 60
3,01 0,3 0 100
5 0,3 0 100
5,01 0,3 95 5
8 0,3 95 5
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