Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg

8. Lipidextraktion aus Pflanzenmaterial
8.1 Extraktion nicht veresterter (freier) Lipide
Zur Extraktion von freien Lipiden wurden zwischen 100 und 200 mg gefrorenes und
gemörsertes Pflanzenmaterial mit 1 ml MeOH/Eisessig (99:1;v:v) versetzt. Mittels
einer Kugelmühle wurden die Proben anschließend für 3 min bei einer Frequenz von
30 s -1 homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurden durch einen zehnminütigen
Zentrifugationsschritt bei 14000 rpm und RT die Proben pelletiert. Anschließend
wurden 900 µl Überstand entnommen und bei 60°C im Rotationsvakuumkonzentrator
zur Trockne eingeengt. Zu den trockenen Proben wurden als Interne Standards je 80
ng [ 18 O]2-Linolensäure, 80 ng [ 18 O]2-OPDA sowie 40 ng [ 18 O]2-Jasmonsäure zu
pipettiert und wiederum zur Trockne eingeengt.
Die Herstellung der verwendeten [ 18 O]2-Standards erfolgte im Rahmen meiner
Diplomarbeit, welche dieser Dissertation vorausgegangenen ist. Mittels einem sauer
katalysierten (im Falle von Linolensäure und von Jasmonsäure) sowie einem
enzymatischen Markierungsverfahrens (im Falle von OPDA) wurden jeweils
spezifisch beide 16 O-Atome der Carboxylgruppen gegen 18 O-Atome ersetzt (Müller
M. J. et al. 2006). Die Bestimmung des Markierungsgrades sowie die quantitative
Bestimmung der Standards wurden mittels GC-MS durchgeführt.
Abschließend wurden die Proben in 30 µl Acetonitril/1 mM Ammonium Acetat
(1:1;v:v) gelöst und bis zur Analyse mittels Hochleistungsflüssigs-
keitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-Tandem MS) bei -80°C
aufbewahrt.
8.2 Extraktion komplexer Lipide
Zur Extraktion von komplexen Membranlipiden wurden zwischen 200 und 400 mg
gefrorenes und gemörsertes Pflanzenmaterial mit 1,5 ml 80°C heißem Isopropanol
versetzt und je 5 mg TPP sowie 1,5mg BHT als Antioxidantien als auch je 4 µg 18:0-
18:0-MGDG, 4 µg 18:0-18:0-DGDG sowie 3 µg 17:0-17:0-PC als Interne Standards
zugegeben. Nach einem 20 minütigem Inkubationsschritt bei 80°C im Wasserbad
wurden die Proben 10 min bei RT und 14000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde
entnommen und die verbleibenden Pellets wurden in 1,5 ml Isopropanol/Chloroform
(2:1;v:v) erneut extrahiert. Anschließend erfolgte ein Zentrifugationsschritt von 10 min
bei RT und 14000 rpm. Der Überstand wurde abgenommen und die verbleibenden
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