Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg
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Tabelle II.6: Primer zur Expressionsanalyse mittels quantitativer Reverser-Transkriptase-<br />
PCR.<br />
Größe Primerkombination<br />
(bp) 5´→3`<br />
DAD1 ATGGTTACCGTAATATCT<br />
At2g44810 CACAAACCCGTCTACCAA<br />
(344 bp)<br />
DGL1 TTACGACATAGCGGAAC<br />
At1g05800 GTAGATATGCCGCATT<br />
(484 bp)<br />
Actin2/8 GGTGATGGTGTGTCT<br />
ACTGAGCACAATGTTAC<br />
Da die absolute Molekülanzahl an eingesetzter cDNA nicht genau bestimmt werden<br />
konnte, diente ein Abgleich mit der vorhandenen cDNA-Anzahl eines konstitutiv<br />
exprimierten Gens (Actin 2/8) für die relative Quantifizierung. Alle in der vorliegenden<br />
Arbeit durchgeführten Quantifizierungen wurden auf 10000 Actin cDNA Moleküle<br />
normalisiert, welche mit in Tab. II.6 beschriebenen Actin2/8 Primern amplifiziert<br />
wurden (Szyroki et al. 2001). Jedes Transkript wurde durch individuelle Standards<br />
quantifiziert. Mit Hilfe von Standards (10, 1, 0.1 und 0.01 fg Amplifikat/μl), die als<br />
Proben eingesetzt wurden, konnte eine Kalibriergerade für alle zu untersuchenden<br />
cDNAs erzeugt werden. Die individuellen Standards wurden vor Verwendung in den<br />
Klonierungsvektor pGEM ® -Teasy (siehe Material und Methoden 7.4) subkloniert und<br />
in E.coli TOP10 transformiert (siehe Material und Methoden 7.5). Das erhaltene<br />
Plasmid konnte abschließend durch Sequenzierung (siehe Material und Methoden<br />
7.10) überprüft werden.<br />
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