Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg

proportional zur DNA-Konzentration zunimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde die
Expression der Gene At2g44810 und At1g5800 mit Hilfe des LightCyclers (Roche)
und Realplex (Eppendorf) untersucht. Der Einsatz von cDNA als Matrize ermöglichte
es hierbei durch den Verlauf der PCR-Reaktion auf die Ausgangsmenge eines
bestimmten Transkriptes in einer zu untersuchenden Gewebeprobe zu schließen. Die
Aufreinigung der RNA von Arabidopsis thaliana Pflanzenmaterial erfolgte nach den
Angaben des Herstellers mit dem Plant RNeasy Extraction Kit. In den RNA-Proben
verbleibende DNA wurde mit „DNAse I Amplification Grade“ (Invitrogen) nach
Angaben des Herstellers verdaut. Zur Synthese der Einzelstrang cDNA „M-MLV
Reverse-Transcriptase“ (Promega) nach Angaben des Herstellers verwendet. Die
erhaltene cDNA wurde in 20-facher Verdünnung für die quantitative PCR eingesetzt.
(Die quantitative PCR wurde mit dem Light Cycler (Roche) bzw. Realplex
(Eppendorf) mit dem SYBR Green Mix (Thermo) durchgeführt.)
Reaktionsansatz:
Template c`DNA 2 μl (1:20 Verdünnung)
SYBR-Green Mix 10 μl
Primer 1 10 mmol
Primer 2 10 mmol
Light Cycler H2O ad 20 μl
Amplifizierungsprogramm:
Initiale Denaturierung 15 min 95°
Denaturierung 1s 94°C
Annealing 7 s 50-60°C
Polymerisation 19 s 72°C
Finale Polymeristaion 5 s 79°C
Denaturierung des Amplifikats 15 min 75-95°C
45 Zyklen
50