Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg

Tabelle II.5: Primer zur Sequenzierung von DNA-Sequenzen innerhalb von Klonierungsvektoren.
Primername Primersequenz (5`->3`)
M13 for GTA AAA CGA CGG CCA GT
M13 rev AAC AGC TAT GAC CAT G
7.11 Gesamt-RNA-Präparation aus Pflanzenmaterial
Die Isolation von RNA aus Pflanzenmaterial erfolgte ausschließlich mit RNeasy-Plant
Mini Kit (Qiagen). Es wurde entsprechend der Anleitung des Herstellers
vorgegangen.
7.12 Denaturierende Agarosegele zur elektrophoretischen Auftrennung von
RNA
Zur elektrophoretischen Auftrennung von RNA wurden denaturierende 1%ige (m/v in
1x FA-Puffer, 2% Formaldehyd) Agarosegele verwendet. Alle Geräte, die mit den
RNA-Proben in Berührung kamen, mussten vor Gebrauch von RNAse -
Kontaminationen befreit werden. Dies erfolgte durch ein mehrstündiges Einlegen der
Geräte in eine 3%ige H2O2-Lösung. Jeweils 8 μg Gesamt-RNA wurden mit 1/4
Volumen 5x RNA-Probenpuffer (40% (v/v) 10x FA-Puffer; 30,8% (v/v) Formamid;
20% (v/v) Glycerin; 7,2% (v/v) Formaldehyd; 0,8% (v/v) EDTA; 0,16% (v/v)
Bromphenolblau-Lösung) versetzt, für 10 min auf 65°C erhitzt, kurz auf Eis abgekühlt
und dann auf ein denaturierendes Agarosegel aufgetragen.
Die Auftrennung erfolgte bei einer Spannung von 80 V für ca. 1-1,5 Stunden in 1x
FA-Laufpuffer (20 mM MOPS; 5 mM NaAc; 1 mM EDTA).
7.13 Quantitative Reverse-Transkriptase-PCR
Die quantitative RT-PCR ermöglicht sowohl die Detektion als auch die quantitative
Darstellung der Kinetik und des Ergebnisses einer PCR-Reaktion. Desweiteren
können durch eine Schmelzpunkt-Analyse spezifische PCR-Produkte von
unspezifischen Amplifikaten verifiziert werden. Durch die spezifische Interkalierung
des Fluorszenz-Farbstoffes „SYBR Green“ in die während einer PCR-Reaktion
entstehende doppelsträngige DNA, ist eine Bestimmung der eingesetzen DNA-
Menge möglich, da die Fluoreszenz während der exponentiellen Phase der PCR
49