Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg

Das Endreaktionsvolumen betrug 20 μl. Die Ligation wurde für 1 Stunde bei RT
inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Ligationsansatz zur
Transformation kompetenter E.coli-TOP10 Zellen verwendet.
7.5 Transformation von Bakterien
Für die Transformation wurde ein 50 μl-Aliquot kompetenter E.coli-TOP10 Zellen auf
Eis aufgetaut. Im Anschluss wurden die aufgetauten Bakterien mit dem
Ligationsansatz versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Mittels Hitzeschock bei
42°C für 70 s erfolgte die Aufnahme der Plasmide. Anschließend wurde der
Transformationsansatz für 2 min auf Eis abgekühlt und 500 μl LB-Medium
zugegeben. Eine darauffolgende Inkubation für 1,5 h bei 37°C auf einem Schüttler
bei 300 rpm diente zur Regeneration der Zellen. Die Zellsuspension wurden
anschließend auf Selektionsfestmedien ausplattiert und für 12-16 Stunden bei 37°C
im Wärmeschrank kultiviert.
7.6 „Colony Screen―: Identifizierung transformierter Bakterien-Kolonien
Um die gewünschte Transformation der Bakterien zu überprüfen wurde eine PCR
durchgeführt. Hierfür wurden einzelne Bakterienkolonien, die auf den
Selektionsfestmedien innerhalb von 12-16 Stunden gewachsen waren, in je 20 μl
sterilem Wasser aufgenommen. Ein 10 μl-Aliquot jeder resuspendierten Kolonie
diente für die nachfolgende PCR als Matrize. Die verwendeten Primerpaare wurden
in Abhängigkeit des zu untersuchenden Konstrukts gewählt. Die verbleibenden 15 μl
der Bakteriensuspension konnten nach der Identifizierung eines positiven Klons
direkt zum Animpfen auf Selektionsfestmedium verwendet werden.
Reaktionsansatz:
Template 10 μl Bakteriensuspension
Taq-Puffer 1x
MgCl2 1,5 mM
Primer 1 0,15 pmol
Primer 2 0,15 pmol
Taq-Polymerase 1-2 U
steriles H2O ad 20 μl
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