Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg
Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg Arabidopsis thaliana - OPUS - Universität Würzburg
4.5 D5-Markierung von Strukturlipiden und freien Lipiden Alle Makierungsexperimente wurden mit 10 Tage alten Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps Col-0, welche in Flüssigmedium kultiviert wurden, durchgeführt. Als Anzuchtsbehältnis wurden sterile 24-Lochplatten verwendet. In jedem Loch befand sich 1ml flüssiges MS-Medium. Es wurden jeweils 3-6 sterilisierte Samen in jedem Loch ausgesät und 2 Tage unter Lichtausschluss bei 4°C stratifiziert. 7 Tage nach der Aussaat erfolgte ein Mediumswechsel. 8 Tage nach dem Stratifikationsende erfolgte ein Austausch des MS-Medium gegen steriles Wasser sowie die Zugabe von D5-Linolensäure-Ethylester. Die Endkonzentration des deuterierten Linolensäure- Ethylesters betrug 150 µM. Als Inkubationszeit für den Einbau der markierten Linolensäure in die Pflanzenmatrix wurde 24 h gewählt. Nach dieser Zeit wurde durch die Zugabe einer Silbernitrat-Lösung die Produktion von Jasmonsäure induziert (siehe Material und Methoden 4.2). Nach gegebenen Zeitpunkten wurden die Pflanzen aus der Silbernitratlösung entnommen und in sterilem Wasser dreimal vorsichtig gewaschen. Anschließend wurde das anhaftende Wasser sorgsam durch Abtupfen entfernt und die Pflanzen in flüssigem Stickstoff gefroren. Das geerntete Pflanzenmaterial wurde bis zur Aufarbeitung bei -80°C gelagert. Kontrollen wurden entsprechenden dem Protokoll behandelt, jedoch wurde anstatt Silbernitrat steriles Wasser zugegeben. 5. Bakterienstämme Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, Karlsruhe) Für die Klonierungsarbeiten wurden E.coli TOP10 verwendet. Die Kultivierung der Bakterien wurde in LB-Flüssigmedium im Schüttler bei 37°C und 250 rpm bzw. auf LB-Festmedium bei 37°C im Inkubationsschrank durchgeführt Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Der Bakterienstamm Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst) wurde zur Infiltration von Arabidopsis thaliana Pflanzen verwendet. Die Pst-Kulturen wurden in KB-Flüssigmedium bei 28°C und 250 rpm kultviert. Der verwendete Bakterienstamm wurde von Brian Staskawicz (Department of Plant and Microbial Biology, Berkeley,USA) zur Verfügung gestellt. 44
6. Plasmide pGEM-T-easy (Promega, Mannheim) Bei dem pGEM-T-easy-Vektor handelt es sich um einen linearisierter Klonierungsvektor. Dieser Vektor wurde zur Klonierung von PCR-Produkten verwendet. Er besitzt eine Größe von 3015 bp. An den 3`-Enden trägt er jeweils einen Thymidin-Überhang. Diese Thymidin-Überhänge sind mit den von der Taq- Polymerase erzeugten Adenin-Überhängen kompatibel. 7. Allgemeine molekularbiologische Methoden 7.1. Polymerasekettenreaktion (PCR) Zur Amplifizierung spezifischer DNA-Fragmente wurde die PCR mittels der Methode nach Mullis und Faloona (Mullis and Faloona 1987) durchgeführt. Als Matrize (Template) diente sowohl Plasmid-DNA als auch genomische DNA aus Arabidopsis thaliana. Als thermostabile DNA-Polymerasen wurde Taq-(Thermus aquaticus) - DNA-Polymerase verwendet. Ansatz mit Taq-Polymerase (V=20μl) Template 10-100 ng Taq-Puffer 1 x MgCl2 1,5 mM d´NTP`s 0,2 mM Primer 1 0,15 pmol Primer 2 0,15 pmol Taq-Polymerase 1-2 U steriles H2O ad 20 μl 45
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Ökotyps Col-0, welche in Flüssigmedium kultiviert wurden, durchgeführt. Als<br />
Anzuchtsbehältnis wurden sterile 24-Lochplatten verwendet. In jedem Loch befand<br />
sich 1ml flüssiges MS-Medium. Es wurden jeweils 3-6 sterilisierte Samen in jedem<br />
Loch ausgesät und 2 Tage unter Lichtausschluss bei 4°C stratifiziert. 7 Tage nach<br />
der Aussaat erfolgte ein Mediumswechsel. 8 Tage nach dem Stratifikationsende<br />
erfolgte ein Austausch des MS-Medium gegen steriles Wasser sowie die Zugabe von<br />
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Ethylesters betrug 150 µM. Als Inkubationszeit für den Einbau der markierten<br />
Linolensäure in die Pflanzenmatrix wurde 24 h gewählt. Nach dieser Zeit wurde<br />
durch die Zugabe einer Silbernitrat-Lösung die Produktion von Jasmonsäure<br />
induziert (siehe Material und Methoden 4.2). Nach gegebenen Zeitpunkten wurden<br />
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vorsichtig gewaschen. Anschließend wurde das anhaftende Wasser sorgsam durch<br />
Abtupfen entfernt und die Pflanzen in flüssigem Stickstoff gefroren. Das geerntete<br />
Pflanzenmaterial wurde bis zur Aufarbeitung bei -80°C gelagert. Kontrollen wurden<br />
entsprechenden dem Protokoll behandelt, jedoch wurde anstatt Silbernitrat steriles<br />
Wasser zugegeben.<br />
5. Bakterienstämme<br />
Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, Karlsruhe)<br />
Für die Klonierungsarbeiten wurden E.coli TOP10 verwendet. Die Kultivierung der<br />
Bakterien wurde in LB-Flüssigmedium im Schüttler bei 37°C und 250 rpm bzw. auf<br />
LB-Festmedium bei 37°C im Inkubationsschrank durchgeführt<br />
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000<br />
Der Bakterienstamm Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst) wurde zur<br />
Infiltration von <strong>Arabidopsis</strong> <strong>thaliana</strong> Pflanzen verwendet. Die Pst-Kulturen wurden in<br />
KB-Flüssigmedium bei 28°C und 250 rpm kultviert. Der verwendete Bakterienstamm<br />
wurde von Brian Staskawicz (Department of Plant and Microbial Biology,<br />
Berkeley,USA) zur Verfügung gestellt.<br />
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