Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren
Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren
Ebenso wie bei der Simulation präsentiert sich auch bei den empirischen Daten das gleiche Bild: Ist die Basislinie abgezogen, so sind die Werte näher an denen der anderen Methoden. Außerdem liegt QA1 i.d.R. am weitesten von den anderen Messungen entfernt. Bei den Spektren AK2 und AK3 handelt es sich um die gleichen Messungen. Der Unterschied liegt in der Signalqualität. Während AK3 die Summe vieler Messungen ist, ist AK2 das Ergebnis nur einer Messung. Folglich ist bei AK2 der Rauschanteil mit ca. 20% sehr groß, während bei AK3 das Rauschen unter 2% beträgt. Dies ermöglicht eine Beurteilung der Robustheit anhand empirischer Spektren. So sieht man beim Vergleich jeder Messung zwischen AK2 und AK3, dass die Werte sehr ähnlich sind, unabhängig von dem Rauschanteil. Die Verfahren können also auch mit schlechten Daten gut umgehen. Eine genaue Analyse, welche beurteilen kann warum ein Verfahren für eine Masse mehr oder weniger Anteil vorhersagt als die anderen muss noch durchgeführt werden. Offensichtlich hat aber der Abzug der Basislinie eine große Auswirkung auf das Ergebnis, wie man beim Betrachten der synthetischen bzw. der empirischen Spektren sieht. Das Problem bei der Basislinie ist, dass es fremdes Signal enthält, man aber nie weiß ob man in jedem Bereich des Spektrums richtig abzieht. Es kann sein dass zuviel oder zuwenig vom Spektrum abgezogen wird. Für eine genauere Untersuchung könnte man Proben mit einer dritten unabhängigen (z.B. chemischen) Methode quantifizieren und anschließend eine ESI-MS-Aufnahme davon durchführen. Dies würde es ermöglichen den Einfluss der Basislinie zu erkennen bzw. in Zahlen zu beziffern. Hat man einmal die verschiedenen Formen und Anteile der Basislinie am Spektrum erfasst, könnte man in einem nächsten Schritt bei der Erzeugung synthetischer Spektren ähnliche Basislinien dazuaddieren um anschließend eine detaillierte Analyse zu tätigen. Zur Klarstellung sei hier nochmals erwähnt, dass bei den hier erzeugten künstlichen Spektren keine Basislinie dazuaddiert wurde. Wenn eine schwach-intensive Basislinie vorhanden war, dann stammt diese allein von Adduktsignalen. Echte Spektren weisen i.d.R weitaus stärkere Basislinienanteile auf. 84
6. Zusammenfassung und Ausblick Dank der ESI-MS-Technologie ist man heute in der Lage, große Biomoleküle als Ganzes zu analysieren. Ein besonders wichtiger Aspekt der ESI-MS ist die Analyse der Glykosylierungsprofile von Antikörpern und anderen Proteinen, weil diese maßgeblich deren Funktion determinieren. Für die medizinische Therapeutik ist es deshalb von großer Relevanz, zu wissen, in welchem Verhältnis verschiedene Glykovarianten eines Proteins stehen. Die Bestimmung dieser Quantitäten direkt aus dem Spektrum ist keine triviale Aufgabe, weil Peakhöhen und Formen durch Überlagerung mit anderen Peaks verfälscht werden. Sie verlieren ihre Gauß-Form, sie bekommen Schultern, Sättel, etc. Vorhandene Softwareprodukte lösen dieses Problem nur unbefriedigend, weshalb eine Neuentwicklung gewünscht war. Mit Massfinder II wurde das ursprünglich für die qualitative Analyse von Antikörper ESI-MS Spektren entwickelte Programm um Methoden für eine quantitative Analyse erweitert. Neben der Möglichkeit, eine manuelle Quantifizierung der Spektren durchzuführen, wurden robuste Methoden für eine weitestgehend automatisierte Quantifizierung implementiert. Die softwaretechnische Umsetzung wurde mittels Tcl/Tk und ANSI-C vollzogen, wobei Tcl/Tk für die Präsentationsschicht verwendet wird und ANSI-C für die darunter liegenden Logikschichten. Basierend auf Monte-Carlo-Simulationen wurde eine Aussage über die Güte der entwickelten Verfahren gemacht. Die einfache Variante QA1 hat sich als die schlechteste erwiesen. Mit dem weitestgehend automatisierten Verfahren QA2 lassen sich nach Abzug der Basislinie gute Ergebnisse erzielen. Für noch präzisere Ergebnisse muss QA3 angewendet werden – diese ist jedoch mit einem erhöhten Zeitaufwand verbunden, weil das Hüllkurven-Fitting für jede Masse einzeln betrachtet werden muss. Bei der Wahl einer geeigneten Methode für die Elimination der Basislinie ist die Variante „4. Ableitung“ zu empfehlen. Als Schlussfolgerung der Validierung kann man festhalten, dass das Ziel erreicht wurde Verfahren zu entwickeln, welche ähnlich gute Ergebnisse liefern, wie die durch „erfahrene“ Laboranten durchgeführte manuelle Quantifizierung. Dies hat drei Konsequenzen: die Quantifizierung lässt sich schneller durchführen, schlechte Spektren lassen sich dank der Robustheit der Verfahren auch noch gut quantifizieren und zum anderen können mit Massfinder II auch „unerfahrene“ Laboranten reproduzierbare Ergebnisse liefern. Neben den automatisierten Prozessen wird auch die manuelle Quantifizierung im Programm zur Verfügung gestellt, so dass Fälle bei denen die Automatik nur unzureichende Ergebnisse liefert noch behandelt werden können. Massfinder I und II wurden zwar im Hinblick auf Antikörper entwickelt, jedoch lassen sich die Module „Qualitative Analyse“ und „Quantitative Analyse“ auch für andere Biomoleküle verwenden, was Massfinder II zu einem flexiblen Werkzeug in der Analytik macht. 85
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Ebenso wie bei der Simulation präsentiert sich auch bei den empirischen Daten das gleiche<br />
Bild: Ist die Basislinie abgezogen, so sind die Werte näher an denen der anderen Methoden.<br />
Außerdem liegt QA1 i.d.R. am weitesten <strong>von</strong> den anderen Messungen entfernt.<br />
Bei den Spektren AK2 und AK3 handelt es sich um die gleichen Messungen. Der Unterschied<br />
liegt in der Signalqualität. Während AK3 die Summe vieler Messungen ist, ist AK2 das Ergebnis<br />
nur einer Messung. Folglich ist bei AK2 der Rauschanteil mit ca. 20% sehr groß, während<br />
bei AK3 das Rauschen unter 2% beträgt. Dies ermöglicht eine Beurteilung der Robustheit<br />
anhand empirischer Spektren. So sieht man beim Vergleich jeder Messung zwischen<br />
AK2 und AK3, dass die Werte sehr ähnlich sind, unabhängig <strong>von</strong> dem Rauschanteil. Die Verfahren<br />
können also auch mit schlechten Daten gut umgehen.<br />
Eine genaue <strong>Analyse</strong>, welche beurteilen kann warum ein Verfahren für eine Masse mehr oder<br />
weniger Anteil vorhersagt als die anderen muss noch durchgeführt werden. Offensichtlich hat<br />
aber der Abzug der Basislinie eine große Auswirkung auf das Ergebnis, wie man beim Betrachten<br />
der synthetischen bzw. der empirischen Spektren sieht. Das Problem bei der Basislinie<br />
ist, dass es fremdes Signal enthält, man aber nie weiß ob man in jedem Bereich des Spektrums<br />
richtig abzieht. Es kann sein dass zuviel oder zuwenig vom Spektrum abgezogen wird.<br />
Für eine genauere Untersuchung könnte man Proben mit einer dritten unabhängigen (z.B.<br />
chemischen) Methode quantifizieren und anschließend eine ESI-MS-Aufnahme da<strong>von</strong> durchführen.<br />
Dies würde es ermöglichen den Einfluss der Basislinie zu erkennen bzw. in Zahlen zu<br />
beziffern. Hat man einmal die verschiedenen Formen und Anteile der Basislinie am Spektrum<br />
erfasst, könnte man in einem nächsten Schritt bei der Erzeugung synthetischer Spektren ähnliche<br />
Basislinien dazuaddieren um anschließend eine detaillierte <strong>Analyse</strong> zu tätigen. Zur Klarstellung<br />
sei hier nochmals erwähnt, dass bei den hier erzeugten künstlichen Spektren keine<br />
Basislinie dazuaddiert wurde. Wenn eine schwach-intensive Basislinie vorhanden war, dann<br />
stammt diese allein <strong>von</strong> Adduktsignalen. Echte Spektren weisen i.d.R weitaus stärkere Basislinienanteile<br />
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