Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren
Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren
Ein starkes Rauschen hat man z.B. dann, wenn man Aufnahmen von geringen Probenmengen macht. Hierbei ist eine starke Amplifizierung des Signals notwendig, was ein verstärktes Rauschen mit sich bringt. Die Basislinienkorrektur wird verwendet, um das durch das Gerät verursachte Signal sowie unerwünschte schwache Addukt-Signale herauszufiltern. Nach diesen zwei optionalen Schritten findet eine Peakauswahl statt, d.h. es wird angegeben, welche Peaks jeder Serie für die Quantifizierung verwendet werden sollen. Für diesen Auswahlprozess werden drei Möglichkeiten geboten: 1) Manuell: Der erfahrene Anwender wählt die Peaks per Hand aus. 2) Schnittmenge: Für jede zu quantifizierende Spezies wird der minimal und der maximal mögliche Ladungszustand ermittelt. Es wird die Schnittmenge gebildet, so dass man das größte Minimum und das kleinste Maximum erhält. Für jede Spezies werden die entsprechenden Ladungszustände in diesem Bereich selektiert. 3) Schnittmenge & nicht überlappend: Analog zu 2) und zusätzlich gilt, dass die ausgewählten Peaks nicht mit Peaks anderer Massen überlappen dürfen. 4) Alle: Es werden von jeder Spezies alle Ladungszustände ausgewählt. Der Sinn hinter Variante 2) ist folgender: Man nimmt an, dass verschiedene Spezies eines Basismoleküls eine ähnliche Ladungsverteilung haben, d.h. die Hüllkurve ist ähnlich. Sofern man jetzt nicht über alle Peaks, sondern nur über eine Teilmenge der im Spektrum vorhandenen Peaks quantifiziert, sollten von allen beteiligten Spezies nur homologe Ladungszustände z betrachtet werden. Um dies zu verdeutlichen hier ein Beispiel: Angenommen, die Hüllkurve I(z) (Intensität I gegen Ladungszustand z) von Spezies A und Spezies B sei Gauß-Verteilt, d.h. es gilt I(z)=GAUSS(z;Amplitude,Mittelpunkt,FWHM). Sei weiterhin angenommen, dass Spezies A und Spezies B sehr ähnlich sind, d.h. wenn man die Parameter der beiden Verteilungen betrachtet, unterscheiden sie sich nur in der Amplitude: 36 Spezies A Spezies B Amplitude 800 1000 Mittelpunkt 30 30 FWHM 10 10 Für eine Quantifizierung von Spezies A und Spezies B im Sinne von Variante 2) wählt man gleiche Ladungszustände aus und berechnet daraus das Verhältnis. Exemplarisch wird z=40 gewählt, damit erhält man für die Intensität an dieser Stelle ISpeziesA(40;800,30,10)=50,0 und ISpeziesB(40;1000,30,10)=62,5, was einem Verhältnis von 44,44 % (Spezies A) zu 55,56 % (Spezies B) entspricht. Dieses Ergebnis entspricht überaus gut dem Verhältnis der Flächen beider Verteilungen. Würde man aber für Spezies B z=30 anstatt z=40 wählen, so erhält man ISpeziesB(30;1000,30,10)=1000, was ein Verhältnis von 4,76 % zu 95,24 % bedeuten würde – ein falsches Ergebnis. Man muss also gleiche z-Werte gegenüberstellen, um ein korrektes Ergebnis zu erhalten. Diese Annahme gilt natürlich nur dann, wenn verschiedene Varianten ei-
nes Basismoleküls betrachtet werden, d.h. ähnliche Moleküle. Falls gänzlich unterschiedliche Moleküle betrachtet werden, sollte man über alle Peaks quantifizieren, da hier die Hüllkurven u.U. völlig anders verteilen und sich somit in mehr Parametern als nur der Amplitude unterscheiden. Bei Variante 3) wird versucht, zusätzliche Störquellen auszuschließen, indem nur diejenigen Peaks betrachtet werden, die nicht mit anderen Peaks überlappen. Um Überlappungen zu erkennen, muss jedoch die Peakform einer Masse bekannt sein. Diese wird im Wesentlichen durch die Isotopenverteilung determiniert. Die erste Variante sollte dem erfahrenen Anwender überlassen werden. Damit soll gewährleistet werden, dass auch Spezialfälle behandelt werden können. Variante 3) sollte angewendet werden, wenn die tatsächliche Hüllkurve einer Spezies nicht bekannt ist. Ist die Hüllkurve einer Serie bekannt bzw. wird sie durch geeignete Verfahren bestimmt, so sollte Variante 4) benutzt werden. Der letzte Schritt vor der Quantifizierung ist ebenfalls optional und beinhaltet die Bestimmung der tatsächlichen Hüllkurve einer Peakserie. Im Idealfall kann durch die Bestimmung der Hüllkurven aller Peakserien das komplette Spektrum erklärt werden, d.h. die Summe der simulierten Peakserien entspricht gerade der gemessenen Kurve (vgl. Abb. 3.1.2). Das Auffinden der Hüllkurve wird mit Methoden aus dem Curve-Fitting gelöst. Abb. 3.1.2: Dargestellt ist ein hypothetisches Spektrum (schwarz). Des Weiteren sind die Peakserien (rot, grün und blau) eingezeichnet, deren Summe dem beobachteten Signal entspricht. Bei einfachen Spektren, die über kaum signifikante Überlagerungen verfügen muss die Hüllkurve nicht notwendigerweise bestimmt werden. Bei komplexen Spektren, wie sie im Falle von Antikörpern auftreten, ist allerdings die Bestimmung der Hüllkurve sehr empfehlenswert, da, wie in der Validierung später gezeigt wird, diese zu einem der besten Quantifizierungsergebnisse führt. 37
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nes Basismoleküls betrachtet werden, d.h. ähnliche Moleküle. Falls gänzlich unterschiedliche<br />
Moleküle betrachtet werden, sollte man über alle Peaks quantifizieren, da hier die Hüllkurven<br />
u.U. völlig anders verteilen und sich somit in mehr Parametern als nur der Amplitude unterscheiden.<br />
Bei Variante 3) wird versucht, zusätzliche Störquellen auszuschließen, indem nur diejenigen<br />
Peaks betrachtet werden, die nicht mit anderen Peaks überlappen. Um Überlappungen zu erkennen,<br />
muss jedoch die Peakform einer Masse bekannt sein. Diese wird im Wesentlichen<br />
durch die Isotopenverteilung determiniert.<br />
Die erste Variante sollte dem erfahrenen Anwender überlassen werden. Damit soll gewährleistet<br />
werden, dass auch Spezialfälle behandelt werden können. Variante 3) sollte angewendet<br />
werden, wenn die tatsächliche Hüllkurve einer Spezies nicht bekannt ist. Ist die Hüllkurve einer<br />
Serie bekannt bzw. wird sie durch geeignete Verfahren bestimmt, so sollte Variante 4) benutzt<br />
werden.<br />
Der letzte Schritt vor der Quantifizierung ist ebenfalls optional und beinhaltet die Bestimmung<br />
der tatsächlichen Hüllkurve einer Peakserie. Im Idealfall kann durch die Bestimmung<br />
der Hüllkurven aller Peakserien das komplette Spektrum erklärt werden, d.h. die Summe der<br />
simulierten Peakserien entspricht gerade der gemessenen Kurve (vgl. Abb. 3.1.2). Das Auffinden<br />
der Hüllkurve wird mit Methoden aus dem Curve-Fitting gelöst.<br />
Abb. 3.1.2: Dargestellt ist ein hypothetisches<br />
Spektrum (schwarz). Des<br />
Weiteren sind die Peakserien (rot,<br />
grün und blau) eingezeichnet, deren<br />
Summe dem beobachteten Signal<br />
entspricht.<br />
Bei einfachen Spektren, die über kaum signifikante Überlagerungen verfügen muss die Hüllkurve<br />
nicht notwendigerweise bestimmt werden. Bei komplexen Spektren, wie sie im Falle<br />
<strong>von</strong> Antikörpern auftreten, ist allerdings die Bestimmung der Hüllkurve sehr empfehlenswert,<br />
da, wie in der Validierung später gezeigt wird, diese zu einem der besten Quantifizierungsergebnisse<br />
führt.<br />
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