Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren
Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren
Ein starkes Rauschen hat man z.B. dann, wenn man Aufnahmen von geringen Probenmengen macht. Hierbei ist eine starke Amplifizierung des Signals notwendig, was ein verstärktes Rauschen mit sich bringt. Die Basislinienkorrektur wird verwendet, um das durch das Gerät verursachte Signal sowie unerwünschte schwache Addukt-Signale herauszufiltern. Nach diesen zwei optionalen Schritten findet eine Peakauswahl statt, d.h. es wird angegeben, welche Peaks jeder Serie für die Quantifizierung verwendet werden sollen. Für diesen Auswahlprozess werden drei Möglichkeiten geboten: 1) Manuell: Der erfahrene Anwender wählt die Peaks per Hand aus. 2) Schnittmenge: Für jede zu quantifizierende Spezies wird der minimal und der maximal mögliche Ladungszustand ermittelt. Es wird die Schnittmenge gebildet, so dass man das größte Minimum und das kleinste Maximum erhält. Für jede Spezies werden die entsprechenden Ladungszustände in diesem Bereich selektiert. 3) Schnittmenge & nicht überlappend: Analog zu 2) und zusätzlich gilt, dass die ausgewählten Peaks nicht mit Peaks anderer Massen überlappen dürfen. 4) Alle: Es werden von jeder Spezies alle Ladungszustände ausgewählt. Der Sinn hinter Variante 2) ist folgender: Man nimmt an, dass verschiedene Spezies eines Basismoleküls eine ähnliche Ladungsverteilung haben, d.h. die Hüllkurve ist ähnlich. Sofern man jetzt nicht über alle Peaks, sondern nur über eine Teilmenge der im Spektrum vorhandenen Peaks quantifiziert, sollten von allen beteiligten Spezies nur homologe Ladungszustände z betrachtet werden. Um dies zu verdeutlichen hier ein Beispiel: Angenommen, die Hüllkurve I(z) (Intensität I gegen Ladungszustand z) von Spezies A und Spezies B sei Gauß-Verteilt, d.h. es gilt I(z)=GAUSS(z;Amplitude,Mittelpunkt,FWHM). Sei weiterhin angenommen, dass Spezies A und Spezies B sehr ähnlich sind, d.h. wenn man die Parameter der beiden Verteilungen betrachtet, unterscheiden sie sich nur in der Amplitude: 36 Spezies A Spezies B Amplitude 800 1000 Mittelpunkt 30 30 FWHM 10 10 Für eine Quantifizierung von Spezies A und Spezies B im Sinne von Variante 2) wählt man gleiche Ladungszustände aus und berechnet daraus das Verhältnis. Exemplarisch wird z=40 gewählt, damit erhält man für die Intensität an dieser Stelle ISpeziesA(40;800,30,10)=50,0 und ISpeziesB(40;1000,30,10)=62,5, was einem Verhältnis von 44,44 % (Spezies A) zu 55,56 % (Spezies B) entspricht. Dieses Ergebnis entspricht überaus gut dem Verhältnis der Flächen beider Verteilungen. Würde man aber für Spezies B z=30 anstatt z=40 wählen, so erhält man ISpeziesB(30;1000,30,10)=1000, was ein Verhältnis von 4,76 % zu 95,24 % bedeuten würde – ein falsches Ergebnis. Man muss also gleiche z-Werte gegenüberstellen, um ein korrektes Ergebnis zu erhalten. Diese Annahme gilt natürlich nur dann, wenn verschiedene Varianten ei-
nes Basismoleküls betrachtet werden, d.h. ähnliche Moleküle. Falls gänzlich unterschiedliche Moleküle betrachtet werden, sollte man über alle Peaks quantifizieren, da hier die Hüllkurven u.U. völlig anders verteilen und sich somit in mehr Parametern als nur der Amplitude unterscheiden. Bei Variante 3) wird versucht, zusätzliche Störquellen auszuschließen, indem nur diejenigen Peaks betrachtet werden, die nicht mit anderen Peaks überlappen. Um Überlappungen zu erkennen, muss jedoch die Peakform einer Masse bekannt sein. Diese wird im Wesentlichen durch die Isotopenverteilung determiniert. Die erste Variante sollte dem erfahrenen Anwender überlassen werden. Damit soll gewährleistet werden, dass auch Spezialfälle behandelt werden können. Variante 3) sollte angewendet werden, wenn die tatsächliche Hüllkurve einer Spezies nicht bekannt ist. Ist die Hüllkurve einer Serie bekannt bzw. wird sie durch geeignete Verfahren bestimmt, so sollte Variante 4) benutzt werden. Der letzte Schritt vor der Quantifizierung ist ebenfalls optional und beinhaltet die Bestimmung der tatsächlichen Hüllkurve einer Peakserie. Im Idealfall kann durch die Bestimmung der Hüllkurven aller Peakserien das komplette Spektrum erklärt werden, d.h. die Summe der simulierten Peakserien entspricht gerade der gemessenen Kurve (vgl. Abb. 3.1.2). Das Auffinden der Hüllkurve wird mit Methoden aus dem Curve-Fitting gelöst. Abb. 3.1.2: Dargestellt ist ein hypothetisches Spektrum (schwarz). Des Weiteren sind die Peakserien (rot, grün und blau) eingezeichnet, deren Summe dem beobachteten Signal entspricht. Bei einfachen Spektren, die über kaum signifikante Überlagerungen verfügen muss die Hüllkurve nicht notwendigerweise bestimmt werden. Bei komplexen Spektren, wie sie im Falle von Antikörpern auftreten, ist allerdings die Bestimmung der Hüllkurve sehr empfehlenswert, da, wie in der Validierung später gezeigt wird, diese zu einem der besten Quantifizierungsergebnisse führt. 37
- Seite 1: LUDWIG - MAXIMILIANS - UNIVERSITÄT
- Seite 5: Danksagung Ich danke Prof. Dr. Volk
- Seite 8 und 9: Inhalt Seite Liste der Abkürzungen
- Seite 11: Liste der Abkürzungen Ara L-Arabin
- Seite 14 und 15: somit viele Kombinationen, die auf
- Seite 17 und 18: 2. Ausgangssituation Antikörper si
- Seite 19 und 20: Die Frequenz, mit der sich bestimmt
- Seite 21 und 22: Die Immunglobuline lassen sich in f
- Seite 23 und 24: welche meistens über keine Glykosy
- Seite 25 und 26: Analog lässt sich auf diese Weise
- Seite 27 und 28: m R = (2.3.2) ∆m Dabei ist m die
- Seite 29 und 30: Die Hüllkurve repräsentiert die L
- Seite 31 und 32: werden, welche Massen im Spektrum v
- Seite 33: Peak-Überlappungen und für die Be
- Seite 38 und 39: Nach optionaler Bestimmung der Hül
- Seite 40 und 41: 40 ∂ 0 = ∂a = 2 ⇒ ⇒ R ∑
- Seite 42 und 43: 3.3. Basislinie Die Basislinie enth
- Seite 44 und 45: Liste werden durch eine kubische Sp
- Seite 46 und 47: Dieser Mechanismus funktioniert nur
- Seite 48 und 49: tionen zu berechnen, multipliziert
- Seite 50 und 51: Der Algorithmus für die Berechnung
- Seite 52 und 53: 3.5. Simulation der Peakverbreiteru
- Seite 54 und 55: die Peakbreite nicht konstant ist.
- Seite 56 und 57: Um die Parameter der Basisfunktione
- Seite 58 und 59: 58 ⎛ df1 ⎜ ⎜ dx1 J ( x) = ⎜
- Seite 60 und 61: 60 2 R =1 − SSE SSM (3.6.2.1) SSE
- Seite 62 und 63: Um diese Probleme zu umgehen, werde
- Seite 64 und 65: Möglichkeit a) konnte nach einem B
- Seite 66 und 67: Ionisierungen beschränkt. Dies kan
- Seite 68 und 69: DLL ist die Methode DLLEXPORT int M
- Seite 70 und 71: statten gehen und zweitens nicht in
- Seite 72 und 73: ten Hüllkurve gezogen. Basierend a
- Seite 74 und 75: um vertreten sind, muss man Abstric
- Seite 76 und 77: Die Auswertung der Spektren findet
- Seite 78 und 79: Bei der manuellen Quantifizierung g
- Seite 80 und 81: Ein ähnliches Bild bietet sich, we
- Seite 82 und 83: Die Daten aus Anhang A sind in Tabe
- Seite 84 und 85: Ebenso wie bei der Simulation präs
Ein starkes Rauschen hat man z.B. dann, wenn man Aufnahmen <strong>von</strong> geringen Probenmengen<br />
macht. Hierbei ist eine starke Amplifizierung des Signals notwendig, was ein verstärktes Rauschen<br />
mit sich bringt. Die Basislinienkorrektur wird verwendet, um das durch das Gerät verursachte<br />
Signal sowie unerwünschte schwache Addukt-Signale herauszufiltern.<br />
Nach diesen zwei optionalen Schritten findet eine Peakauswahl statt, d.h. es wird angegeben,<br />
welche Peaks jeder Serie für die Quantifizierung verwendet werden sollen. Für diesen Auswahlprozess<br />
werden drei Möglichkeiten geboten:<br />
1) Manuell: Der erfahrene Anwender wählt die Peaks per Hand aus.<br />
2) Schnittmenge: Für jede zu quantifizierende Spezies wird der minimal und der maximal<br />
mögliche Ladungszustand ermittelt. Es wird die Schnittmenge gebildet, so<br />
dass man das größte Minimum und das kleinste Maximum erhält. Für jede Spezies<br />
werden die entsprechenden Ladungszustände in diesem Bereich selektiert.<br />
3) Schnittmenge & nicht überlappend: Analog zu 2) und zusätzlich gilt, dass die ausgewählten<br />
Peaks nicht mit Peaks anderer Massen überlappen dürfen.<br />
4) Alle: Es werden <strong>von</strong> jeder Spezies alle Ladungszustände ausgewählt.<br />
Der Sinn hinter Variante 2) ist folgender: Man nimmt an, dass verschiedene Spezies eines Basismoleküls<br />
eine ähnliche Ladungsverteilung haben, d.h. die Hüllkurve ist ähnlich. Sofern<br />
man jetzt nicht über alle Peaks, sondern nur über eine Teilmenge der im Spektrum vorhandenen<br />
Peaks quantifiziert, sollten <strong>von</strong> allen beteiligten Spezies nur homologe Ladungszustände z<br />
betrachtet werden.<br />
Um dies zu verdeutlichen hier ein Beispiel: Angenommen, die Hüllkurve I(z) (Intensität I gegen<br />
Ladungszustand z) <strong>von</strong> Spezies A und Spezies B sei Gauß-Verteilt, d.h. es gilt<br />
I(z)=GAUSS(z;Amplitude,Mittelpunkt,FWHM). Sei weiterhin angenommen, dass Spezies A<br />
und Spezies B sehr ähnlich sind, d.h. wenn man die Parameter der beiden Verteilungen betrachtet,<br />
unterscheiden sie sich nur in der Amplitude:<br />
36<br />
Spezies A Spezies B<br />
Amplitude 800 1000<br />
Mittelpunkt 30 30<br />
FWHM 10 10<br />
Für eine Quantifizierung <strong>von</strong> Spezies A und Spezies B im Sinne <strong>von</strong> Variante 2) wählt man<br />
gleiche Ladungszustände aus und berechnet daraus das Verhältnis. Exemplarisch wird z=40<br />
gewählt, damit erhält man für die Intensität an dieser Stelle ISpeziesA(40;800,30,10)=50,0 und<br />
ISpeziesB(40;1000,30,10)=62,5, was einem Verhältnis <strong>von</strong> 44,44 % (Spezies A) zu 55,56 %<br />
(Spezies B) entspricht. Dieses Ergebnis entspricht überaus gut dem Verhältnis der Flächen<br />
beider Verteilungen. Würde man aber für Spezies B z=30 anstatt z=40 wählen, so erhält man<br />
ISpeziesB(30;1000,30,10)=1000, was ein Verhältnis <strong>von</strong> 4,76 % zu 95,24 % bedeuten würde –<br />
ein falsches Ergebnis. Man muss also gleiche z-Werte gegenüberstellen, um ein korrektes Ergebnis<br />
zu erhalten. Diese Annahme gilt natürlich nur dann, wenn verschiedene Varianten ei-
Change language