Quantitative Analyse von Protein-Massenspektren

LUDWIG - MAXIMILIANS - UNIVERSITÄT
TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehr- und Forschungseinheit
Bioinformatik
Diplomarbeit
in Bioinformatik
Quantitative Analyse von
Protein-Massenspektren
Alex Kohn
Aufgabensteller: Prof. Dr. Volker Heun
Betreuer: Dr. Alexander Manta
Abgabedatum: 15.10.2005

Erklärung
Ich versichere, dass ich diese Diplomarbeit selbständig verfasst und nur die angegebenen
Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
15. Oktober 2005 ____________________________
Alex Kohn
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Danksagung
Ich danke Prof. Dr. Volker Heun für seine Betreuung und Beratung während der Diplomarbeit
ganz herzlich. Dr. Jörg Regula, Dr. Hans Koll, Dr. Engler Niklas und Achim Gärtner danke
ich für die Bereitstellung empirischer Daten und für deren Ratschläge und Erklärungen. Silke
Schneid-Müller und Mautz Björn danke ich für die manuelle Quantifizierung der synthetischen
Daten. Ich möchte mich auch bei Eckhard Lehmann, für die Hilfestellung in der Einarbeitungsphase
und für seine Denkanstöße, bedanken.
Ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Alexander Manta, für seine Betreuung und die aufschlussreichen
Diskussionen, die ich mit ihm führen durfte.
Danke auch an die gesamte TR-I Abteilung der Roche Diagnostics GmbH für die vielen informativen
Gespräche und für die hervorragende Arbeitsatmosphäre.
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Zusammenfassung
Die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) ist ein weit verbreitetes Werkzeug
in der Analytik großer Biomoleküle. Im Fall von Antikörpern liegt der Schwerpunkt in
der Untersuchung posttranslationaler Modifikationen. Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers
entscheidet oft über dessen Funktion im Immunsystem [Jefferis05].
Für die medizinische Therapeutik ist es essentiell, zwischen verschiedenen Antikörperspezies
(Glykosylierungsvarianten) zu diskriminieren. Nur ein Bruchteil der von einer Zelle sezernierten
Antikörperspezien erfüllen die Eigenschaft, das richtige Zielprotein zu binden. Der Rest
hat andere Eigenschaften und kann sogar schädliche Nebenwirkungen zur Folge haben. Für
die industrielle Antikörperproduktion ist es aus diesem Grund wichtig, zu wissen, in welchen
Verhältnissen die relativen Anteile der jeweiligen Spezies stehen. Dieser Quantifizierungsprozess
kann direkt mit ESI-MS-Spektren durchgeführt werden.
Existierende Quantifizierungsmethoden sind häufig auf kleine Peptide spezialisiert und eignen
sich nicht für die Quantifizierung großer Moleküle. Lösungen, mit denen man auch große
Glykoproteine quantifizieren kann, sind häufig aufwendig zu bedienen und nicht robust genug
beim Quantifizieren. Im Rahmen dieser Diplomarbeit werden neue Methoden für die Quantifizierung
von ESI-MS-Spektren großer Biomoleküle vorgestellt, welche nicht die erwähnten
Mängel besitzen.
Abstract
Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) is a very powerful tool for the analysis of
large biomolecules such as antibodies. The main interest here lies in the posttranslational
modifications of proteins. In the case of antibodies these glycations often determine key functions
[Jefferis05]. In antibody therapeutics it is important to discriminate between those species
(glycation variants) which have a positive effect on the curing of diseases and those
which have negative side effects. For this reason one needs to determine the relative amount
of each species in a probe. This quantification process can be done directly in ESI mass spectra.
Unfortunately the existing quantification methods lack user-friendliness and robustness. In
this publication, new methods for the quantification of ESI-MS spectra, which do not have
these limitations, have been developed.
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Inhalt
Seite
Liste der Abkürzungen .......................................................................................................... 11
1. Einleitung ............................................................................................................. 13
1.1. Motivation ............................................................................................................. 13
1.2. Ziel der Arbeit ....................................................................................................... 14
2. Ausgangssituation ................................................................................................ 17
2.1. ESI-Massenspektrometrie ...................................................................................... 17
2.2. Glykoproteine ........................................................................................................ 20
2.3. ESI-MS-Spektren von Glykoproteinen ................................................................. 24
2.4. Bestehende Software ............................................................................................. 29
2.5. Anforderungen ....................................................................................................... 32
3. Konzepte ............................................................................................................... 35
3.1. Lösungswege ......................................................................................................... 35
3.2. Glättung ................................................................................................................. 38
3.3. Basislinie ............................................................................................................... 42
3.3.1. Von Tal zu Tal ....................................................................................................... 43
3.3.2. Kubische Spline-Interpolation ............................................................................... 43
3.3.3. Vierte Ableitung .................................................................................................... 45
8

3.4. Isotopenverteilung ................................................................................................. 46
3.5. Simulation der Peakverbreiterung ......................................................................... 52
3.6. Curve-Fitting ......................................................................................................... 54
3.6.1. Levenberg-Marquardt-Algorithmus ...................................................................... 56
3.6.2. Güteparameter ....................................................................................................... 59
3.6.3. Optimierung des Fittings ....................................................................................... 61
3.6.4. Ausreißer ............................................................................................................... 63
4. Technische Umsetzung ........................................................................................ 67
5. Validierung .......................................................................................................... 71
5.1. Validierung des Hüllkurven-Fittings ..................................................................... 71
5.2. Validierung der Quantifizierungspipeline ............................................................. 74
5.3. Experimentelle Resultate ....................................................................................... 83
6. Zusammenfassung und Ausblick ....................................................................... 85
Anhang ............................................................................................................................... 87
A. Quantifizierungsergebnisse synthetischer Spektren .............................................. 87
B. Quantifizierungsergebnisse empirischer Spektren ................................................ 92
C. Massfinder II.......................................................................................................... 97
Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 101
9

Liste der Abkürzungen
Ara L-Arabinose
amu atoms per mass unit
D Dalton, 1D=1.665402*10 -27 kg
DLL Dynamic Link Library
DOF Degree of Freedom
ESI Elektrospray Ionisation
FAB Fast Atom Bombardment
FFT Fast Fourier Transformation
Fuc L-Fukose
FWHM Full Width at Half Maximum
Gal D-Galaktose
GalNAc N-Acetyl-D-Galaktosamin
Glc D-Glukose
GlcNAc N-Acetyl-D-Glukosamin
GUI Graphical User Interface
k Kilo
log, ln natürlicher Logarithmus
LM Levenberg-Marquardt
MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Man D-Mannose
MS Massenspektrometrie
MF Massfinder
NANA N-Acetylneuraminsäure bzw. Sialinsäure
SVD Singular Value Decomposition / Eigenwertzerlegung
V Volt
eV Elektronen-Volt
Xyl D-Xylose
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1. Einleitung
Die Massenspektrometrie (MS) ist ein sehr bedeutendes Werkzeug in der Analytik organischer
Verbindungen. Sie findet Anwendung in der Substanzanalyse von Gemischen, in der
Sequenzierung von Biomolekülen, in der Qualitätskontrolle von Medikamenten und vielem
mehr. Es gibt eine Vielzahl von Geräteklassen für die MS, wobei die Elektrospray-
Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) der wichtigste Vertreter ist. Besonders interessant
ist die MS für die Analytik großer Moleküle wie etwa Antikörper, da sie es ermöglicht, die
Moleküle als Ganzes zu untersuchen. Somit ist eine Fragmentierung der Proteine in kleine
Peptide nicht mehr notwendig, was weitere Fehlerquellen ausschließt, Kosten reduziert und
Zeit bei dem Analyseprozess einspart.
1.1. Motivation
Proteine werden häufig durch Glykosylierung posttranslational modifiziert. Die Glykosylierungsarten
eines Proteins üben einen großen Einfluss auf deren Funktion aus. Besonders gut
charakterisiert ist dieser Sachverhalt bei Antikörpern: Hier entscheiden Glykosylierungen über
die Aktivierung von Effektor-Mechanismen des adaptiven Immunsystems [Jefferis05]. Eine
Zelle produziert i.d.R. nicht eine Glykovariante eines Antikörpers, sondern eine Vielzahl verschiedener
Varianten (sog. Mikroheterogenität) [Raju03]. Dies ist einerseits eine wünschenswerte
Eigenschaft, weil dadurch die Flexibilität des Immunsystems gesteigert wird. Andererseits
ist dies für die medizinische Anwendung von Antikörpern jedoch ungünstig, weil oft nur
wenige Glykovarianten eines Antikörpers die gewünschte therapeutische Wirkung entfalten.
Die Herstellung monoklonaler Antikörper (eine Glykovariante) ist deshalb eminent. Regelmäßige
Qualitätskontrollen der pharmazeutischen Produktion sind wichtig, um sicher zu stellen,
dass keine Verunreinigungen durch fremde Glykoformen vorhanden sind. Übersteigen z.B.
bestimmte Glykoformen eines Proteins einen gewissen Konzentrationsanteil, können schädliche
Nebenwirkungen für den Patienten auftreten.
Die Probenanalyse lässt sich mit der ESI-MS tätigen. Die gewonnenen Spektren enthalten Informationen
über die in der Probe vorhandenen Massen und deren Intensitäten. Die Bestimmung
der Massen ist mit Hilfe von Entfaltungsalgorithmen wie z.B. dem „Maximum-
Entropie“-Algorithmus (MaxEnt) möglich [Reinhold92]. Der MaxEnt-Entfaltungsprozess
führt eine auf der Entropie basierten Rekonstruktion des Spektrums durch. Als Ergebnis erhält
man eine Liste mit den im Spektrum vorhandenen Massen und deren wahrscheinlichen Quantitäten.
Ausgehend von der MaxEnt-Massenliste und der Referenzmasse des untersuchten Proteins,
können dessen Zuckermodifikationen ermittelt werden. Die Schwierigkeit hierbei besteht
im Auffinden der richtigen Kombination, denn es gibt eine Vielzahl an Glykoformen und
13

somit viele Kombinationen, die auf ihre Richtigkeit hin überprüft werden müssen. Der MaxEnt-Algorithmus
liefert zwar Informationen über die wahrscheinlichen Quantitäten der ermittelten
Massen, diese weisen aber eine Nichtlinearität auf [Reinhold92], weshalb die Ergebnisse
in der Praxis nur von wenigen Laboranten herangezogen werden. Bei Verwendung der
so ermittelten Massenverhältnisse kann man sich nie über die Größe der Nichtlinearität bzw.
des Fehlers sicher sein. In Folge dessen muss man für die zuverlässige Bestimmung der Quantitäten
andere Wege einschlagen.
Das Bestimmen der richtigen Quantitäten ist bei Spektren großer Biomoleküle keine triviale
Aufgabe: Das Massenspektrum ist eine Überlagerung mehrerer Peakserien. Dadurch ist die
Basislinie nach oben verschoben, einzelne Peaks sind nicht mehr sichtbar, Peakhöhen und
Formen werden durch Summierung mehrerer Peaks verfälscht. Die Peaks verlieren durch
Überlagerung die Gauß-Form, sie bekommen Schultern, Sättel, etc. All diese Punkte erschweren
eine Quantifizierung erheblich.
Bei der Quantifizierung per Hand ist die Reproduzierbarkeit nur bei „erfahrenen“ Laboranten
gewährleistet. Die Bewertungsergebnisse „unerfahrener“ Laboranten weisen eine große Streuung
auf. Der Hauptgrund hierfür ist in der Tatsache begründet, dass bei der manuellen Messung
nur wenige Peaks als Berechnungsgrundlage dienen. Weil Peaks durch andere verfälscht
sein können, kann es bei ungünstiger Peakauswahl zur Berechnung falscher Massenverhältnisse
kommen. Solche Fälle können z.B. auftreten, wenn die Peaks durch andere Massen wie
z.B. Addukte überlagert werden. Addukte sind Zusammenschlüsse zwischen in der Lösung
befindlichen Ionen und Analyten.
Auf dem Markt existieren Lösungen für die Quantifizierung von ESI-MS-Spektren. Jedoch
sind diese Softwareprodukte meistens auf die Quantifizierung kleiner Peptide spezialisiert.
Große Biomoleküle wie Antikörper lassen sich damit nur bedingt quantifizieren. Um die
Quantitäten der Analyten korrekt zu bestimmen, ist deshalb die Entwicklung neuer Verfahren
notwendig, welche zuverlässig, robust und reproduzierbar quantifizieren.
1.2. Ziel der Arbeit
Das Ziel der Arbeit ist es, Methoden für die Quantifizierung von ESI-MS-Proteinspektren zu
entwickeln. Die entwickelten Methoden werden in die bereits bestehende Softwarelösung
Massfinder (MF) eingebaut. MF I wurde im Rahmen einer Diplomarbeit an der FH Weihenstephan
entwickelt [ELehman05] und ist für die qualitative Analyse von ESI-MS-Spektren
konzipiert worden. Durch die Einbindung in das bestehende Programm soll ein optimaler Arbeitsablauf
zwischen qualitativer und quantitativer Analyse der Spektren erreicht werden.
14

Damit die Messung der Quantitäten möglichst unabhängig vom jeweiligen Benutzer ist, soll
ein weitestgehend automatisiertes Quantifizierungsverfahren entwickelt werden. Dabei soll
die Automatisierung mindestens die gleiche Genauigkeit haben wie die des „erfahrenen“ Laboranten.
Um das zu bewerkstelligen muss das Problem der Peaküberlappung und die damit
verbundene Verfälschung der Signalintensität gelöst werden.
Die Bestimmung der Güte der entwickelten Methoden ist bei empirischen Daten nicht ohne
weiteres möglich. Deswegen wird am Ende der Arbeit eine Evaluierung anhand von Monte-
Carlo-Simulationen vollzogen. Es werden künstliche Daten erzeugt und mit Teilen des Programms
bzw. mit der kompletten Prozesspipeline ausgewertet. Zusätzlich werden auch andere
gängige Methoden der Quantifizierung in die Evaluierung mit einbezogen. Dadurch ist ein
Vergleich der Verfahren untereinander möglich.
Mit der Weiterentwicklung von Massfinder wird eine robuste und vielseitig anwendbare Plattform
für die Quantifizierung geschaffen, welche nicht die Mängel anderer Lösungen aufweist.
15

2. Ausgangssituation
Antikörper sind Glykoproteine, die für die Immunabwehr des Organismus von zentraler Bedeutung
sind. Folglich sind sie auch für die Pharmaforschung von großem Interesse, schließlich
können diese, falls richtig eingesetzt, als Therapeutika verwendet werden. Die Analytik
von Glykoproteinen bzw. Antikörpern ist aufgrund der Anzahl möglicher Glykoformen sehr
komplex. Um diese Komplexität zu minimieren, werden häufig Oligosaccharid und Protein
separat analysiert. Dies hat allerdings den Nachteil, dass die Positionsinformation verloren
geht. Für die Charakterisierung von einfach glykosylierten Antikörpern eignen sich Massenspektrometer
besonders gut. Zum einen können mit geringsten Probenmengen verlässliche
Daten geliefert werden und zum anderen kann das Glykoprotein als Ganzes analysiert werden.
Für die Auswertung der Daten bedarf es leistungsfähiger Software, welche in der Lage ist, die
relevanten Informationen für den Biologen herauszugreifen.
Im Folgenden werden die technischen Grundlagen im Hinblick auf die Massenspektrometrie
vermittelt. Des Weiteren werden einige biologische Fakten über Glykoproteine, im speziellen
Antikörper, vermittelt. Anschließend wird ein Überblick über vorhandene Softwareprodukte
gegeben und gezeigt, warum diese allein für eine befriedigende Lösung der hiesigen Thematik
nicht ausreichend sind. Am Ende dieses Kapitels werden die Anforderungen beschrieben,
welchen eine neue Lösung gerecht werden muss.
2.1. ESI-Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrie hat in den letzten Jahrzehnten stetig an Bedeutung gewonnen und
ist heutzutage kaum mehr aus der Analytik wegzudenken. Historisch hatte die MS ihre Hauptanwendung
in der Untersuchung von physikalischen und chemischen Prozessen v. a. in der
Ölindustrie. Durch den raschen technischen Fortschritt wurde es bald möglich, auch biochemische
Analysen hochmolekularer Substanzen durchzuführen. Zunächst waren es Lipide mit
bis zu 1 kD, heutzutage kann man dank moderner Ionisierungsmethoden komplexe Proteine
mit bis zu 250 kD untersuchen [Lehmann96].
Mit Hilfe der MS kann man u.a.:
• bekannte Substanzen in einem Gemisch identifizieren;
• eine quantitative Analyse bekannter Substanzen eines Gemisches durchführen;
• die Struktur unbekannter Verbindungen analysieren;
• Biomoleküle strukturell charakterisieren;
• Proteine und Peptide sequenzieren.
17

Ein Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem Massenanalysator und einem
Detektor (vgl. Abb. 2.1.1). Organische oder anorganische Moleküle werden ionisiert, um anschließend
nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) getrennt zu werden. Ein Detektor
misst die Treffer (Intensität) zu jedem m/z Wert. Für die Ionisierung existieren verschiedene
Methoden. Je nach Wahl erhält man niedrig bis hoch ionisierte Moleküle. Bei den Massenanalysatoren
existiert ebenfalls eine große Zahl an Varianten. [Gross04]
Als Resultat der Messung erhält man ein Spektrum, welches einen zweidimensionalen Abdruck
der Intensität gegen die m/z Werte enthält.
Die Elektrospray-Ionisation ist wegen ihrer besonderen Eigenschaften häufig das Verfahren
der Wahl, wenn es um die Ionisierung von Proteinen geht. Das Elektrospray-
Ionisierungsverfahren wurde von John B. Fenn et al. entwickelt und 1989 publiziert [Fenn89].
Er wurde 2002 dafür mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. Beim ESI-Verfahren
(vgl. Abb. 2.1.2) wird die Lösung, welche die Analyten enthält, durch eine dünne Kapillare
versprüht. Die zwischen der Kapillarspitze und der Gegenelektrode anliegende Potentialdifferenz
von bis zu einigen kV bewirkt, dass die versprühten Tröpfchen beim Austritt aus der Kapillare
geladen werden. Durch die nun folgende Evaporation der Tröpfchen, verringert sich
das Volumen und die Ladungsdichte steigt. Sobald die Coulomb-Abstoßung der Ladungen eine
größere Kraft ausübt als die Oberflächenspannung des Tröpfchens, zerfällt es in noch kleinere
Tröpfchen. Dieser kritische Punkt wird auch als Rayleigh-Limit bezeichnet. Der Verlauf
wiederholt sich so lange, bis nur noch die Analyt-Ionen bzw. die hoch solvatisierten Analyt-
Ionen übrig bleiben. Ein Teil der Ionen gelangt durch einen Spalt in der Gegenelektrode zum
Analysator, in dem sie nach dem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) getrennt werden. Ob
die Ionen negativ oder positiv geladen werden, hängt von ihren chemischen Eigenschaften und
der Polarität der anliegenden Potentialdifferenz ab.
18
Abb. 2.1.1: Schematischer
Aufbau eines Massenspektrometers.
Nach
[Gross04 S.4]
Abb. 2.1.2: Die Tröpfchen werden
beim Austritt aus der Kapillare aufgrund
der hohen Potentialdifferenz
elektrisch geladen. Anschließend
findet eine Coulomb-Explosion der
Tröpfchen statt, so dass sie immer
kleiner werden, bis nur noch die
Analyt-Ionen in der Gasphase übrig
bleiben. Ein Teil der so gebildeten
Ionen gelangen durch einen Spalt in
der Gegenelektrode zum Analysator.
Nach [Lehmann96 S.100]

Die Frequenz, mit der sich bestimmte Ladungszustände bilden, folgt einer statistischen Verteilung.
Die Form der Ladungsverteilung wird durch die Masse und die Konformation des Moleküls
bedingt. Hierbei sei erwähnt, dass jeder Ladungszustand eines Moleküls zwischen minimalem
und maximalem Ladungszustand besetzt wird, d.h. es gibt keine Lücken in der Ladungsverteilung
(vgl. dazu Abb. 2.3.5). [Lehmann96, Samalikova03]
Eine besondere Eigenschaft von ESI ist, dass es ein schonendes Verfahren ist, d.h. es kommt
nur geringfügig zur Fragmentierung der Analyten, was eine exakte Molekulargewichtsbestimmung
ermöglicht. Als zweites Merkmal ist die Detektion großer Massen hervorzuheben
(bis 250 kD). Dies wird durch den Umstand ermöglicht, dass hoch geladene (bzw. mehrfach
geladene) Molekülionen, d.h. hohe z-Werte, bei entsprechend niedrigen m/z-Werten im
Spektrum abgebildet werden.
Diese zwei Merkmale sind bei anderen populären Ionisierungsverfahren wie etwa „Matrix-
Assisted Laser Desorption/Ionization“ (MALDI) oder „Fast Atom Bombardment“ (FAB) nicht
anzutreffen. Bei MALDI wird ein gepulster Laser zur Ionisierung der auf einer Metalloberfläche
angebrachten Analyten verwendet. Im Gegensatz zu ESI entstehen hierbei meistens nur
einfach geladene Ionen, ganz selten auch zweifach geladene. Des Weiteren ist bauartbedingt
die Probe nur schwer vor den zerstörenden Eigenschaften des Lasers zu schützen, und es
kommt dadurch eher zur Fragmentierung der Analyten. [Lehmann96]
Bei FAB werden die Analyten in einer organischen Matrix (i.d.R. bestehend aus Glycerol und
3-nitrobenzyl Alkohol) gelöst, so dass diese als Ionen vorliegen. Die Matrix wird anschließend
mit einem Primärionenstrahl von etwa 10-15keV kinetischer Energie beschossen. Aufgrund
der erzeugten Stoßkaskade werden die Analyt-Ionen in die Gasphase überführt. Die Art
der erzeugten Spektren hängt stark vom verwendeten Lösungsmittel und von der Zusammensetzung
der Matrix ab. FAB ist wie auch MALDI kein wirklich schonendes Verfahren. Bei
Massen mit einem Molekulargewicht ab einigen kD kommt es außerdem zur Fragmentierung
der Analyten. Somit eignet es sich nicht für die Untersuchung großer Glykoproteine. [Budzikiewicz92]
Die Spektren, welche in dieser Arbeit betrachtet werden, stammen alle von einem Quadrupol-
Flugzeit-Analysator. Ein Quadrupol besteht aus vier Metallstäben, welche parallel angeordnet
sind. Die Ionen, welche durch das Quadrupol fliegen, können durch Anlegen geeigneter Spannungen
an den Metallstäben gefiltert werden. Man kann somit bestimmen, welcher Massenbereich
durchgelassen wird. Anschließend treten die Ionen in ein Flugrohr ein, in dem sie durch
gepulstes Anlegen von Hochspannung auf das gleiche kinetische Energieniveau gehoben werden.
Dadurch erreichen leichte Ionen vor den schweren Ionen den Detektor am Ende des Flugrohrs.
Um die Flugzeit messen zu können, werden die Ionen gepulst, d.h. sie werden paketweise
zum Detektor geschickt. Aus den Flugzeiten können die m/z-Werte berechnet werden
und man erhält das m/z-Spektrum. [Budzikiewicz92, Gross04]
19

2.2. Glykoproteine
Hierbei handelt es sich um eine Gruppe komplexer Makromoleküle, welche in nahezu allen
Lebensformen vorkommen. Den größten Anteil daran haben posttranslational modifizierte
Membranproteine sowie Proteine, welche in der extrazellulären Matrix vorkommen. Diese
üben einen großen Einfluss auf die Funktion und Entwicklung von Zellen aus. Besonders
wichtige Vertreter der Glykoproteine lassen sich in der Immunabwehr von Säugetieren finden,
nämlich Immunglobuline und Immunglobulin-Rezeptoren.
Glykoproteine bestehen aus dem kovalenten Zusammenschluss eines Proteins und mehrerer
Kohlenhydrate (vgl. Abb. 2.2.1). Die Bindungstypen lassen sich aufteilen in N-glykosidische
und O-glykosidische Bindungen. Bei der ersten Klasse erfolgt die Bindung an die Aminogruppe
von Asparagin, bei der zweiten an die Hydroxygruppe von Threonin oder Serin. Oligosaccharid-Seitenketten
von Membran-Glykoproteinen sind nur aus den folgenden 9 Monosaccharid
Grundbausteinen zusammengesetzt, obwohl weit mehr Monosaccharide existieren:
Glukose (Glc), Galaktose (Gal), Mannose (Man), Fucose (Fuc), Arabinose (Ara), Xylose
(Xyl), N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc), N-Acetyl-D-Galaktosamin (GalNAc) und Sialinsäure
(NANA). [Klein91]
Antikörper bestehen aus zwei identischen Kettenpaaren, mit je einer leichten Kette (ca. 25kD)
und einer schweren Kette (50kD bis 80kD). Die schwere und die leichte Kette sind durch eine
Disulfidbrücke verbunden. Die zwei schweren Ketten sind in der Gelenkregion durch zwei
Disulfidbrücken miteinander verbunden (vgl. Abb. 2.2.3 a). Charakteristisch für die Antikörper
ist, dass sie über einen konstanten Bereich (CL und CH) und einen variablen Bereich (VL
und VH) verfügen. Der konstante Bereich ist allen Antikörpern gemeinsam, der variable Bereich
– die Antigenbindestelle – zeichnet sich durch eine hohe Heterogenität innerhalb der
Antikörperpopulationen aus. Diese Teile haben zwei wesentliche Aufgaben:
(1) Antigen-Bindung: Moleküle des Antigens (z.B. Pathogene) werden gebunden, wodurch
eine Immunantwort ausgelöst wird.
(2) Wechselwirkung mit Effektoren: Andere Zellen und Moleküle, welche das Antigen
zerstören, werden mobilisiert.
20
Abb. 2.2.1: Zwei Klassen von
Oligosaccharid-Bindungen an
Proteinen. Die Bindungsstelle
zwischen Zucker und Protein
ist durch einen Kreis symbolisiert.
Links sieht man eine
N-glykosidische Bindung und
rechts eine O-glykosidische.
Nach [Klein91 S.139]

Die Immunglobuline lassen sich in fünf Klassen unterteilen, wobei jede Klasse eine eigene
physiologische Aufgabe besitzt: IgM, IgD, IgG, IgA und IgE. IgM befindet sich im Blut und
ist der erste Antikörper, welcher sofort nach Kontakt mit einem Antigen sezerniert wird. Seine
Spezialisierung ist das Binden von ins Blut eingedrungenen Mikroorganismen. Die häufigste
Immunglobulin-Klasse (und die interessanteste für die Pharmaforschung) ist IgG, welche im
Blut und interstitieller Flüssigkeit vorkommt. IgG wird in einer verzögerten Phase nach dem
Auftreten von IgM gebildet. Von entscheidender Bedeutung ist IgG für die Immunität des Fetus,
da IgG als einziges Immunglobulin die Plazenta-Barriere überwinden kann. IgA kommt
hauptsächlich im Verdauungsapparat, Speichel, Schweiß und in Tränen vor. Seine Funktion
besteht darin, Erregern die Anlagerung an das Epithel unmöglich zu machen. IgE ist für alle
allergischen Reaktionen verantwortlich, außerdem schützt es vor Parasiten wie z.B. Würmern.
Im Blut kommt es nur in sehr geringen Mengen vor. Ebenfalls im Blut und nur in geringen
Mengen vorhanden ist IgD, dessen Funktion vergleichsweise unbekannt ist. [Voet&Voet92,
Stryer02]
Abb. 2.2.2: Zuckermodifikationen. Links befinden sich
Beispiele für den komplexen Typ, rechts für den Mannose-reichen
Typ. Unten ist eine O-glykosidische Bindung
dargestellt. Bei den komplexen Typen kann man
sehr schön die Kernregion sehen, welche allen Varianten
zugrunde liegt: β – β1,4 – β1,4 – α1,6 – α1,3. Die
N-verknüpfte komplexe Oligosaccharid-Struktur oben
in der Mitte ist die größte Struktur, die je im menschlichen
IgG gefunden wurde [Raju03].
Nach [Klein91 S.140]
Von IgG gibt es vier verschiedene Isotypen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), die sich in der Anzahl
interner Disulfidbindungen und in ihrer Effektor-Funktionalität unterscheiden, obwohl die Isotypen
eine Sequenzhomologie von über 95 % aufweisen [Jefferis05]. IgGs tragen häufig Zu-
21

ckermodifikationen, welche großen Einfluss auf ihre Funktion haben [Raju03]. Die von den
Immunglobulinen O-glykosidisch gebundenen Kohlenhydrate sind variabel in ihrer Struktur,
aber sehr klein (750D). Die N-glykosidisch gebundenen Oligosaccharide hingegen sind wesentlich
größer (ca. 2700D) und können bis zu 15 verschiedene Monosaccharide enthalten.
Bei letzterem unterscheidet man zwei Arten: Mannose-reich und komplex [Klein91].
Ein bestimmtes Glykoprotein kann in verschiedenen Varianten auftreten, die sich in ein oder
mehr Strukturmerkmalen der Glykosylierung unterscheiden [IUPAC]. Man bezeichnet diesen
Sachverhalt als Mikroheterogenität. IgGs verfügen häufig über eine ausgeprägte Mikroheterogenität,
d.h. die N-verknüpften Oligosaccharide sind sehr heterogen. Die Heterogenität
herrscht nicht nur innerhalb einer Zelle, sondern auch über mehrere Zellen hinweg. Die Ursache
liegt in der Variation des Expressionssystems, d.h. die Anzahl gebundener Zuckermoleküle
variiert. Die Mikroheterogenität hat besonders starke Auswirkungen auf die industrielle
Produktion von Antikörpern, da kleinste Variationen in der Herstellung zu unterschiedlichen
Glykosylierungen rekombinanter IgGs führen. Problematisch wird dies durch die Tatsache,
dass kleinste Veränderungen in der Glykosylierung die therapeutische Aktivität stark beeinflussen
können [Raju03, Jefferis05]. Deswegen stellt sich bei der Analyse von Antikörper-
Massenspektren häufig die Frage, welche Art und welche Mengen einzelner Spezies vorhanden
sind.
Antikörper verfügen in der Gelenkregion (Hinge) über eine konservierte Glykosylierungsstelle.
Daneben besitzen die leichte und die schwere Kette in dem variablen Bereich noch einige
nicht konservierte Glykosylierungsstellen. Je mehr solcher Stellen besetzt sind, desto mehr
Glykosylierungskombinationen sind möglich. Um unerwünschte Nebenwirkungen bei der
Therapie mit Antikörpern zu vermeiden, ist es wichtig, dass die Anzahl anormaler Glykosylierungen
minimiert wird. Von den Gesundheitsbehörden gibt es strenge Grenzen, in denen das
Glykosylierungsprofil liegen muss. In Folge dessen hat man vorzugsweise einfache Antikörper,
die nur über eine Glykosylierungsstelle verfügen. [Jefferis05]
Um die Analyse der Spektren zu vereinfachen, werden die Antikörper reduziert, so dass
schwere und leichte Kette massengetrennt sind. Der Nutzen ist dabei, dass die leichte Kette,
22
a) b)
Abb. 2.2.3:
a) Schematischer
Aufbau eines IgG
Antikörpers
b) Beispiel für ein
an IgG gebundenes
Oligosaccharid
vom komplexen
Typ. Der Kernbereich
ist blau hinterlegt.
Nach [EncyclVol2]

welche meistens über keine Glykosylierungen verfügt, als Referenzmasse verwendet werden
kann. Überdies lassen sich die Glykosylierungsvarianten der schweren bzw. leichten Kette
leichter bestimmen, da Variationen der jeweils anderen Kette nicht berücksichtigt werden
müssen.
Im Folgenden wird kurz erläutert, wie Antikörper für die medizinische Therapeutik hergestellt
werden können.
Bei der aktiven Immunisierung gegen ein Antigen werden eine Vielzahl an Antikörpern gebildet
– so genannte polyklonale Antikörper –, welche das Antigen binden. Polyklonal heißt,
dass die Antikörper sich nicht nur in den Glykosylierungen unterscheiden, sondern auch in der
Aminosäuresequenz. Folglich sezerniert jeder B-Lymphozyt einen anderen Antikörper, es
herrscht also eine große Heterogenität. Für die Medizin ist es jedoch von besonderem Interesse,
monoklonale Antikörper in großen Mengen herzustellen, die ein bestimmtes Antigen binden.
Monoklonale Antikörper besitzen die gleiche Aminosäuresequenz, unterscheiden sich jedoch
an den Glykosylierungsstellen (Mikroheterogenität). Die Herstellung monoklonaler Antikörper
ist nicht unproblematisch. Zum einen muss ein Lymphozyt gefunden werden, welcher
Antikörper gegen das zu bindende Antigen produziert und zum anderen muss der Lymphozyt
auch in vitro lebensfähig sein.
Ein möglicher Lösungsweg ist folgender: Um Antikörper gegen ein Antigen X zu erhalten, injiziert
man in die Milz einer Maus eine bestimmte Dosis des Antigen X. Nach erfolgreicher
aktiver Immunisierung haben sich spezifische B-Lymphozyten gegen das injizierte Antigen
gebildet. Im nächsten Schritt werden die Milzzellen und somit auch die aktivierten Lymphozyten
der Maus entnommen. Es bleibt noch das Problem bestehen, dass normale B-
Lymphozyten in vitro nicht lebensfähig sind. Krebsartige Zellen hingegen lassen sich in vitro
vermehren, weil sie mit nur sehr wenigen Wachstumsfaktoren auskommen. Deswegen hybridisiert
man die entnommenen B-Zellen mit krebsartigen Lymphozyten, den Myelomzellen,
welche nur monoklonale Antikörper sezernieren. Die so entstehenden Klone (Hybridome)
sind in vitro lebensfähig und können nun auf einem geeigneten Medium gezüchtet werden.
Die von den Hybridomen sezernierten Antikörper werden anschließend in einem Screening-
Verfahren auf ihre Funktionalität hin überprüft. Es findet also eine Klonauswahl bzw. Antikörperauswahl
statt. In der Therapeutik hat man hierbei Interesse, möglichst effektive Antikörper
zu finden, d.h. hohe Affinität für das zu bindende Antigen, geringe Mikroheterogenität
und keine Wechselwirkung mit anderen Stoffen. Nach Auswahl geeigneter Antikörper müssen
diese noch „humanisiert“ werden, da sonst im Menschen eine Immunantwort gegen die Mausantikörper
stattfinden würde. Die Humanisierung eines Antikörpers beinhaltet den Austausch
der konstanten Bereiche gegen humane Sequenzen. [Voet&Voet92]
Ursprünglich wurden Antikörper in der Medizin v. a. zur passiven Impfung gegen Pathogene
eingesetzt. Mittlerweile hat auch die Tumortherapie mit Antikörpern eine immer größer wer-
23

dende Bedeutung erreicht. Aktuelles Beispiel ist Herceptin, welches gegen Brustkrebs erfolgreich
eingesetzt wird [ÄrzteZeitung, Stern].
2.3. ESI-MS-Spektren von Glykoproteinen
Im Folgenden werden einige wichtige Eigenschaften von ESI-MS-Spektren erläutert. In Abb.
2.3.1 ist ein Spektrum eines Antikörpers abgebildet, welches sieben IgG-Spezies enthält. Bei
allen Spezies ist die leichte Kette identisch. Demzufolge fallen die Massen aller leichten Ketten
im Spektrum zusammen, so dass sie als intensive Peaks zum Vorschein treten (in Abb.
2.3.1 als A13 bis A19 gekennzeichnet). Die Spezies unterscheiden sich durch die Zuckermodifikationen
an der schweren Kette, welche sich bei der Gelenkregion (vgl. Abb. 2.2.3 a) befinden.
In Kap. 2.1 wurde erwähnt, dass ein Analyt während der Ionisierung mehrere Ladungszustände
annimmt. Im Spektrum äußert sich dies darin, dass es für den Analyten nicht nur einen
Peak gibt, sondern einen für jeden Ladungszustand. Zur Illustration dient die Spezies E (vgl.
Abb. 2.3.1) mit der Masse m=50373D. Ein Blick auf das Spektrum zeigt, dass dieses Molekül
Ladungszustände zwischen 26 und 56 einnimmt. Die Peakposition im Spektrum lässt sich mit
Hilfe der Molekülmasse und des Ladungszustandes berechnen. Beispielhaft wird der m/z-Wert
für den Ladungszustand z=37 berechnet:
24
Abb. 2.3.1: Spektrum eines reduzierten IgG-Antikörpers. Die Beschriftung über den Peaks repräsentiert jeweils
einen Peak aus einer Serie. Dabei stehen die Buchstaben für die Masse (vgl. Legende) und die Zahlen für den Ladungszustand.
Auf der y-Achse ist die normierte Intensität aufgetragen. Hinweis: Aus Platzgründen wurden nicht
alle Peaks einer Serie beschriftet.
m + zH 50373D
+ 37 ⋅1,
008D
m / z = =
= 1362,
44D
(2.3.1)
z
37

Analog lässt sich auf diese Weise für jeden Ladungszustand einer Masse die genaue Position
im Spektrum bestimmen. Die Gesamtheit aller Peaks die zu einer Masse gehören bezeichnet
man als Peakserie.
Wenn man mit Massenspektren arbeitet, ist es wichtig, sich über einige grundlegende Dinge
klar zu werden [Gross04]:
• Ein Massenspektrometer trennt nach dem Verhältnis Masse zu Ladung (m/z).
• Ein Peak im Spektrum setzt sich aus der Durchschnittsmasse (der häufigsten Isotopenkombination)
und allen anderen möglichen Isotopenkombinationen des Moleküls
zusammen.
• Die Peakbreite wird durch die Isotopen bestimmt. Außerdem verursachen Geräteparameter
wie Auflösung und Gerätetyp eine zusätzliche Verbreiterung.
Tabelle 2.3.1: Liste der Isotopenhäufigkeit
einiger für die Massenspektrometrie
relevanten Elemente.
[Gross99]
25

Die Masse eines Atoms berechnet sich aus der Summe der Neutronen und Protonen. Isotopen
sind Atome gleicher Protonenzahl, aber unterschiedlicher Neutronenzahl und dadurch auch
unterschiedlicher Massenzahl.
Als monoisotopisch bezeichnet man Elemente, welche nur ein stabiles Isotop haben, z.B. Natrium,
das nur als 23 Na stabil ist. Polyisotopisch werden diejenigen Elemente genannt, welche
mehrere stabile Isotope aufweisen. Die Isotope eines Elements kommen mit einer gewissen
Wahrscheinlichkeit in der Natur vor (vgl. Tabelle 2.3.1). Brom zum Beispiel kommt als 79 Br
(relative Häufigkeit 50,69 %) und 81 Br (relative Häufigkeit 49,31 %) vor. Für Br2 ergibt sich
eine durchschnittliche Masse von 159,8g/mol wenn man die im Periodensystem angegebenen
relativen Atommassen zur Berechnung heranzieht. Betrachtet man nun das Spektrum, so sieht
man folgende Signale:
26
[ 79 Br2] + bei m/z 158
[ 79 Br 81 Br] + und [ 81 Br 79 Br] + bei m/z 160
[ 81 Br2] + bei m/z 162
Für m/z=159,8 gibt es aber kein Signal [Budzikiewicz92]. Die Isotopenverteilung hat zur Folge,
dass man in einem Massenspektrum für ein Molekül nicht einen Strich beobachtet, sondern
mehrere, welche zusammen die Peakform determinieren. Zur Illustration wird die B-
Kette von Rinderinsulin herangezogen. In Abb. 2.3.2 a) ist die theoretische Isotopenverteilung
der B-Kette dargestellt. Zusätzlich ist in Abb. 2.3.2 b) das gemessene Spektrum einer Probe,
welche die B-Kette enthält, dargestellt. Hier findet man im intensivsten Peak die berechnete
Isotopenverteilung wieder. Daneben weißt die empirische Messung noch weitere Peaks auf,
welche wahrscheinlich von anderen in der Probe vorhandenen Massen stammen.
Abb. 2.3.2: Dargestellt ist die B-Kette von Rinderinsulin (C157H233N40O41S2)
(a) Berechnetes Isotopenmuster
(b) Gemessenes Spektrum
[Budzikiewicz92 S.62]
Die Peakbreite wird neben der Isotopenverteilung noch durch das ESI-MS-Gerät beeinflusst,
d.h. die Massen, welche im Spektrum noch getrennt abgebildet werden können, hängen entscheidend
von der Auflösung R des Geräts ab:

m
R = (2.3.2)
∆m
Dabei ist m die Masse, die interessiert, und �m der Massenunterschied, der aufgelöst werden
soll. Die Auflösung gibt an, wann zwei Massen sichtbar getrennt werden können (vgl. Abb.
2.3.3). Dafür gibt es zwei verschiedene Definitionen, wobei sich beide auf die relative Peakhöhe
stützen: zwei Massen sind getrennt, wenn das Tal zwischen beiden Peaks kleiner gleich
10% der Signalhöhe ist. Seit der Einführung der Quadrupol-Massenanalysatoren wird immer
häufiger die Halbwertsbreite (FWHM; Breite des Peaks bei 50% Höhe) als Maß genommen.
Der Grund liegt zum einen an der schlechteren Auflösung des Geräts (10% wäre somit eine zu
starke Grenze) und zum anderen an der starken Verbreitung dieser Geräte. Demnach sind zwei
Peaks getrennt, wenn sie mindestens den FWHM-Wert des Detektors voneinander entfernt
sind (Rayleigh’sche Auflösungsgrenze). Letztere Definition der Auflösung wird auch in dieser
Arbeit verwendet. [Gross04, Budzikiewicz92]
Abb. 2.3.3: Geräte-Auflösung
Oben: Definition der Auflösung bei 10% und 50% Talgrenze.
[Gross04 S.96]
Rechts: Theoretische Peakform der B-Kette von Rinderinsulin
bei verschiedenen Auflösungen. Auf der x-Achse
sind die m/z-Werte aufgetragen. Oben R=1000, Mitte
R=5000 und unten R=10000. Man sieht wie mit steigender
Auflösung die Peaks immer besser getrennt werden.
Als Addukte bezeichnet man Massen, die durch Zusammenlagerung von im Lösungsmittel befindlichen
Ionen mit dem Analyten entstehen. Bei Verwendung einer salzhaltigen Lösung entstehen
Alkali-Addukte, d.h. es lagern sich n-fach viele Na + und K + an die Moleküle an. Ob
und wie viele Ionen sich anlagern, hängt zum einen von der Struktur des Analyten ab und zum
anderen von dem Gehalt an Salzen in der Lösung. Abhängig von der Masse des Moleküls und
der Geräteauflösung kann man die Adduktsignale im Spektrum als eigenständige Peaks erkennen
oder sie sind nur als Verbreiterung des Peaksockels angedeutet. Ein Beispiel für Adduktsignale
kann man Abb. 2.3.4 entnehmen. Als weitere Folgen der Adduktbildung können
Signale anderer Massen durch Adduktsignale überlagert werden, was eine Quantifizierung erschwert.
27

Als Basislinie bezeichnet man denjenigen Signalanteil im Spektrum, welcher vom Gerät verursacht
wird. Die Höhe der Basislinie hängt stark von den gewählten Geräteparametern ab. Im
Falle von ESI-Spektren sind häufig schwache Addukt-Signale auch Mitverursacher der Basislinie.
Von jeder gemessenen Masse können sich n-fach geladene Addukt-Varianten bilden.
Hierbei treten v.a. die höher geladenen Varianten gar nicht mehr als echte Peaks in Erscheinung,
weil sie aufgrund ihrer geringen Intensität im Spektrum untergehen. Vielmehr tragen all
diese schwach intensiven Addukte in der Summe zu einer Erhebung der Basislinie bei (vgl.
Abb. 2.3.5). Vor der quantitativen Analyse sollte die Basislinie – sofern vorhanden – durch
ein geeignetes Verfahren erkannt und anschließend vom Spektrum abgezogen werden. Dadurch
wird verhindert, dass die Intensitäten des gemessenen Spektrums ein falsches Verhältnis
widerspiegeln.
28
Abb. 2.3.4: Gezeigt ist der Ausschnitt aus einem ESI-MS-Spektrum von
IgG. Der Antikörper wurde vor der Messung reduziert. Dargestellt sind die
leichten Ketten sowie drei Addukt-Modifikationen davon. m ist die Molekularmasse
in D und z ist der Ladungszustand. Bei der schweren Kette
sind die Adduktsignale in der Regel nicht mehr aufgelöst, weil die Signale
zu nahe beieinander liegen und deswegen überlappen. Stattdessen sieht
man eine Verbreiterung des Peaksockels.
Abb. 2.3.5:
Oben: ESI-Spektrum eines Antikörpers. Die Basislinie
ist durch einen schwarzen Strich dargestellt. Die
Hüllkurve der leichen Kette ist durch schwarze Kreuze
angedeutet. Es handelt sich hierbei um eine bimodale
Verteilung.
Unten: Vergrößerter Ausschnitt des linken Teils des
oben abgebildeten Spektrums.

Die Hüllkurve repräsentiert die Ladungsverteilung eines Analyten. Man kann sie in einem
Spektrum sehen, indem man eine gedachte Kurve durch alle Maxima einer Peakserie legt (vgl.
Abb. 2.3.5). Die Entstehung der Hüllkurve hat ihren Ursprung im Ionisierungsprozess (vgl.
Kap. 2.1). Hierbei können die Analyten abhängig von ihrer 3D-Struktur mehr oder weniger
stark ionisiert werden. Deren Fähigkeit, Ladungsträger aufzunehmen, folgt einer statistischen
Verteilung. Der Mittelpunkt der Verteilung entspricht dem Optimum an Ladungsträgern, die
ein Molekül aufnehmen kann. Anschaulich heißt dies, dass im Spektrum der intensivste Peak
einer Serie dem Optimum entspricht. Vom Optimum abweichende Ladungszahlen weisen im
Spektrum eine geringere Intensität auf.
Die in Abb. 2.3.5 dargestellte Hüllkurve ist nicht uni-modal sondern bi-modal, wie man an
den zwei lokalen Maxima der Hüllkurve erkennen kann. Dies deutet auf mehr als eine Konformation
des Moleküls hin. Die Ursache für das Vorhandensein mehrerer 3D-Strukturen lässt
sich im verwendeten Lösungsmittel finden. Die verwendeten Pufferlösungen sind meist so
ausgelegt, dass die Analyten in ihrer Fähigkeit, Ladungen aufzunehmen, gestärkt werden. Faktoren
wie Detergenzien, Chaotrope, Alkohole etc. spielen dabei eine Rolle. Der pH-Wert aber
ist sicherlich der bedeutsamste von allen. Verwendet man einen sauren pH-Wert, so können
die Moleküle wesentlich mehr Ladungen aufnehmen. Diese Senkung hat aber noch einen
zweiten Effekt: Ein Teil der Moleküle denaturiert mehr oder weniger stark, d.h. man erhält
neben der nativen Konformation noch weitere Konformationen desselben Moleküls. Jede dieser
3D-Strukturen folgt bei der Ionisierung einer eigenen Ladungsverteilung und im Spektrum
beobachtet man schließlich abhängig von der Zahl an verschiedenen Konformation eine uni-,
bi- oder sogar tri-modale Verteilung der Hüllkurve. Dass man keine n-fach modale Verteilung
beobachtet, liegt daran, dass die diversen 3D-Strukturen oft auf ähnliche Weise Ladungen
aufnehmen und dadurch quasi derselben Verteilung folgen. [Dobo01, Dobo03]
2.4. Bestehende Software
Viele Konzepte und Algorithmen, die im Rahmen dieser Arbeit benötigt werden, stehen in
Form von Bibliotheken oder fertigen Programmen dem Interessenten / Käufer zur Verfügung.
Ein Hauptproblem besteht jedoch darin, dass es sich hierbei oft um Speziallösungen handelt.
Somit wäre der Erwerb einer großen Zahl an Softwarelösungen notwendig, welche sich zudem
schlecht miteinander verknüpfen ließen, um den erwünschten Arbeitsablauf zu gewährleisten.
Im Folgenden werden einige Produkte, welche im Bereich der Massenspektrometrie anzusiedeln
sind, kurz vorgestellt.
Für die Berechnung der theoretischen Isotopenverteilung kann man z.B. das von Fernandez et
al. entwickelte Web-Tool „Isotopica“ verwenden [Fernandez04]. Hiermit kann, ausgehend
29

von einer chemischen Formel, DNA/RNA- oder Aminosäuresequenz, die Isotopenverteilung
für verschiedene Ladungszustände und Auflösungen ermittelt werden. Für die visuelle Kontrolle
besteht die Möglichkeit, die Rohdaten des Spektrums zu laden, um eine Überlagerung
zwischen der theoretischen Isotopenverteilung und dem Spektrum durchzuführen. Eine qualitative
Analyse der im Spektrum vorhandenen Massen ist nur bedingt möglich. Es besteht zwar
die Möglichkeit, Proteinmodifikationen manuell anzugeben, jedoch fehlt eine automatische
Analyse, welche die wahrscheinlichsten Modifikationen selbständig ermittelt. Ein Werkzeug
für die quantitative Analyse ist nicht vorhanden.
Eine professionelle und weit verbreitete Softwarelösung für Massenspektrometrie-Geräte ist
„MassLynx“ der Firma Waters. Sie ermöglicht die Akquisition von Rohdaten direkt vom
Massenspektrometer und bietet eine Fülle von Analysewerkzeugen an. Darunter fallen auch
Methoden für eine qualitative Analyse in Form einer „Maximum-Entropie“-Entfaltung [Reinhold92]
des Spektrums und Methoden für „Quantitative High-Throughput“-Analysen. Ferner
werden noch etliche Standardfunktionen wie Glättung, Basislinienkorrektur usw. angeboten.
Bei der qualitativen Analyse erfährt man zwar, welche Massen im Spektrum vorhanden sind,
jedoch gibt es keinen Aufschluss darüber, welche Glykovarianten den beobachteten Massen
entsprechen. Eine automatische Glykosylierungsanalyse (d.h. Auflistung der den Massen entsprechenden
Glykosylierungen) kann also nicht durchgeführt werden. Die als Zusatzpaket erhältliche
„High-Throughput“-Quantifizierungsanwendung ist für (kleine) Peptide konzipiert.
Deswegen ist dieses Paket für die Quantifizierung großer Moleküle nicht geeignet.
„Grams/AI“ ist eine Plattform für die Entwicklung von Chromatographie- und Spektrometrieanwendungen.
Ein Hauptunterschied zu anderen Produkten besteht darin, dass sie die Möglichkeit
bietet, durch Makros erweitert zu werden. Man könnte also dafür ein Quantifizierungsmodul
entwickeln. Jedoch sprechen die zu erwartenden Schwierigkeiten bei der Implementierung
(viele Standardroutinen, wie etwa Fitting, müssten neu implementiert werden) und
die Abhängigkeit, in die man sich dabei begeben würde, gegen eine solche Entwicklung.
Eine Softwarelösung, die ihren Schwerpunkt auf die Datenanalyse setzt, ist „PeakFit“. Auch
hier werden die üblichen Standardmethoden in diesem Umfeld, wie etwa Glättung oder Basislinienkorrektur
usw., angeboten. Zusätzlich wird die Möglichkeit dargeboten, Peaks verschiedener
Verteilungsfunktionen an das Spektrum zu fitten. Als Erweiterung davon kann man mit
diversen Peakfunktionen eine Entfaltung des Spektrums durchführen. Der Hauptnachteil hierbei
ist, dass dieser Prozess sehr allgemein gehalten ist. Man kann z.B. keine Massen (Signalserien)
angeben, die als Basis für die Entfaltung dienen sollen. Somit bleibt es bei ESI-
Spektren eher dem Zufall überlassen, ob die richtigen Serien gefunden werden oder nicht.
„Massfinder I“ ist bei Roche im Rahmen einer Diplomarbeit [ELehmann05] entstanden, welches
speziell für die qualitative Analyse von ESI-Massenspektren entwickelt worden ist. Ausgehend
von einem Spektrum und dessen MaxEnt-Entfaltung kann mit Massfinder ermittelt
30

werden, welche Massen im Spektrum vorhanden sind. Ein weiteres wichtiges Feature besteht
in der Bestimmung der Glykosylierungsvarianten. So ist im Falle von Antikörpern eine Zuordnung
der Glykosylierungsmodifikation zu einer im Spektrum vorhandenen Spezies möglich.
Hierzu muss die Masse des nackten Antikörpers (ohne Zucker) angegeben werden. Ein
genetischer Algorithmus ermittelt basierend darauf und einer gegebenen Modifikationsliste
die in Frage kommenden Varianten. Eine Möglichkeit zur Quantifizierung ist nicht vorhanden.
Es gibt bereits eine bestehende In-House Entwicklung für die Quantifizierung großer Moleküle.
Diese führt die Quantifizierung auf der 4. Ableitung des Spektrums durch, weil hier das
Hintergrundsignal von den Peaks getrennt ist. Die Messung auf der 4. Ableitung ist unproblematisch,
weil die Peakintensitäten proportional zu den Intensitäten des originalen Spektrums
sind. Obwohl der Rechenprozess komplett automatisiert ist, bedarf es für die Ausführung des
Programms einer Parameterdatei. In dieser müssen neben anderen Kenngrößen die Massen,
die freien Ladungszustände sowie der Bereich, in dem sich die Halbwertsbreiten der Peaks befinden
definiert werden. Das ist auch der Hauptnachteil bei dieser Lösung, denn die Anforderung,
für jedes zu quantifizierende Spektrum eine neue Parameterdatei zu erstellen, macht das
Programm unflexibel.
Dieser kurze Überblick zeigt, dass es Softwarelösungen auf dem Markt gibt, diese jedoch den
Anforderungen (vgl. folgendes Kapitel) nicht gerecht werden:
• Ein Produkt allein ist nicht ausreichend, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen,
folglich kommen Mehrkosten durch den Erwerb zusätzlicher Lizenzen und die Einarbeitungszeit
zustande.
• Eine befriedigende Quantifizierungslösung ist in keinem der hier vorgestellten Produkte
vorhanden. Es besteht zwar eine In-House Entwicklung, diese ist jedoch nicht
flexibel genug, wenn es darum geht, mit geringem Zeitaufwand verschiedene Spektren
zu quantifizieren.
• Die meisten käuflichen Lösungen sind für kleine Peptid-Massen entwickelt worden.
Deren Spektren sind leicht zu handhaben und somit gestaltet sich auch die Quantifizierung
der darin enthaltenen Massen als relativ unproblematisch.
• Der Schwerpunkt der Anforderungen hier liegt in der Entwicklung einer Quantifizierungslösung
für große Moleküle, nämlich Antikörper. Deren Spektren sind weitaus
komplexer als die kleiner Peptidmoleküle. So muss man hier mit Rauschen, Addukt-
Signalen und Überlagerungen von Peaks zurechtkommen, was eine Quantifizierung
erschwert.
• Eine Vereinigung von qualitativer und quantitativer Analyse großer Moleküle, welche
den Arbeitsablauf beschleunigen würde, ist in keinem Produkt zu finden.
All diese Punkte führen zu dem Schluss, dass es für die Lösung des Problems auf dem Markt
keine ausreichend guten Produkte gibt. Somit ist eine Eigenentwicklung anzustreben, welche
den Anforderungen gerecht wird.
31

2.5. Anforderungen
Ziel dieser Arbeit ist es, Konzepte für die Quantifizierung von ESI-MS-Spektren zu entwickeln,
sowie deren Realisierung in einem Softwareprodukt umzusetzen. Der Schwerpunkt
wird auf die Quantifizierung schwerer Biomoleküle wie z.B. Antikörper gelegt. Die Verarbeitung
kleiner Moleküle wie z.B. Interferon soll aber auch möglich sein.
Mit „Massfinder I“ wurde bereits ein Schritt in die Softwareentwicklung für ESI-MS-Geräte
unternommen. Wie bereits erwähnt, deckt „Massfinder I“ die qualitative Analyse von Antikörper-Massenspektren
ab. Die bestehende Lösung soll um Mechanismen für eine quantitative
Analyse erweitert werden, so dass ein optimaler Arbeitsablauf von der Erfassung der im
Spektrum vorhandenen Spezies bis zur Bestimmung ihrer Anteile entsteht. Da die Integration
von Quantifizierungslösungen tief in Massfinder verankert werden soll, war eine Einarbeitung
in den bestehenden Quellcode und dessen Organisationsstruktur notwendig.
Bei einem Gespräch mit den verantwortlichen Personen hat sich herauskristallisiert, dass eine
Methode gewünscht wird, die einfach zu bedienen ist, robust ist und ähnlich gute Ergebnisse
liefert wie die per Hand durchgeführte Quantifizierung. Robust heißt, dass das Programm
auch für schlechte Spektren, die stark verrauscht sind oder Verunreinigungen enthalten, noch
gute Resultate liefert. Außerdem soll der Quantifizierungsprozess soweit wie möglich automatisiert
werden. Der Anwender soll demnach im Hintergrund stehen und nur an einigen wenigen
Stellen helfend eingreifen. Dieses Prinzip wird im Folgenden als semiautomatische Quantifizierung
bezeichnet. Neben der Entwicklung semiautomatischer Methoden besteht die Anforderung,
dass mit der Weiterentwicklung von MF auch die manuelle Bestimmung der Massenverhältnisse
möglich sein soll.
Ein genauer Lösungsweg für die Quantifizierung wurde nicht formuliert. Vielmehr wurden die
zu erwartenden Probleme dieser Aufgabenstellung kurz angesprochen: Sowohl die Basislinie
als auch Adduktsignale verfälschen die Peakintensität. Folglich muss für eine korrekte Messung
der Verhältnisse die Basislinie abgezogen werden sowie Adduktsignale auf geeignete Art
und Weise erkannt werden. Ein weiterer Störfaktor von Spektren ist Rauschen. Normalerweise
werden Aufnahmen, in denen fremde Komponenten das Spektrum stören, neu getätigt. Um
dem zu begegnen, könnte man aber auch einen Filter entwickeln, welcher die Signalqualität
steigert, so dass auf dem gefilterten Spektrum gearbeitet werden kann. Als letzter Punkt wurde
angedeutet, dass die korrekte Bestimmung der Hüllkurve hilfreich wäre, weil dadurch eine
Quantifizierung über alle Ladungszustände möglich wäre, was die Genauigkeit der Messung
steigert. Demzufolge müssen Methoden für das Filtern des Spektrums, für die Erkennung von
32

Peak-Überlappungen und für die Bestimmung der Hüllkurve entworfen werden, um anschließend
die Quantifizierung durchzuführen.
Die manuelle Variante unterscheidet sich von der semiautomatischen Variante dadurch, dass
hierbei der Benutzer bei allen Schritten vollständige Kontrolle über die Aktionen hat. Einzig
die Berechnung der Peakhöhen und der damit verbundenen Quantitäten wird automatisiert –
eine Messung der Höhe mit Lineal entfällt also.
Es ist eine weitestgehend automatisierte Quantifizierungpipeline erwünscht, welche a) schneller
durchführbar ist als die manuelle Variante und b) bessere oder ähnlich gute Ergebnisse liefert
wie diese. Die Ergebnisse einer Messung sollen in tabellarischer Form präsentiert werden.
Die Herausforderung besteht somit darin, gute Lösungswege (vgl. dazu Kap. 3.1) für die skizzierten
Probleme zu entwickeln.
33

3. Konzepte
In diesem Kapitel werden die einzelnen Bausteine, welche in der Quantifizierung Verwendung
finden, im Detail vorgestellt. Um den Zusammenhang zwischen den Grundbausteinen
besser zu verstehen, wird zunächst eine Übersicht über das entworfene Gesamtkonzept gegeben.
Hierbei werden die möglichen Arbeitsabläufe einer Quantifizierung gezeigt und auf mögliche
Probleme wird kurz hingewiesen.
3.1. Lösungswege
Ausgehend von einem gemessenen Spektrum stellen sich die Fragen, welche Komponenten
vorhanden sind und in welchen Verhältnissen diese zueinander stehen. Die erste Frage kann
bereits mittels „Massfinder I“ beantwortet werden [ELehmann05]. Die Beantwortung der
zweiten Frage, d.h. die Bestimmung der Quantitäten der im Spektrum vorhandenen Spezies,
kann auf mehrere Arten erfolgen.
Abb. 3.1.1: Das Flussdiagramm zeigt die möglichen
Quantifizierungswege in Massfinder II.
Der bevorzugte Weg ist blau markiert.
Für alle Quantifizierungsvarianten (vgl. Abb. 3.1.1) kann optional eine Glättung und eine Basislinienkorrektur
des Spektrums durchgeführt werden. Ersteres muss bei sehr stark verrauschten
Spektren angewendet werden, da sonst die Peakintensitäten nicht richtig erkannt werden.
35

Ein starkes Rauschen hat man z.B. dann, wenn man Aufnahmen von geringen Probenmengen
macht. Hierbei ist eine starke Amplifizierung des Signals notwendig, was ein verstärktes Rauschen
mit sich bringt. Die Basislinienkorrektur wird verwendet, um das durch das Gerät verursachte
Signal sowie unerwünschte schwache Addukt-Signale herauszufiltern.
Nach diesen zwei optionalen Schritten findet eine Peakauswahl statt, d.h. es wird angegeben,
welche Peaks jeder Serie für die Quantifizierung verwendet werden sollen. Für diesen Auswahlprozess
werden drei Möglichkeiten geboten:
1) Manuell: Der erfahrene Anwender wählt die Peaks per Hand aus.
2) Schnittmenge: Für jede zu quantifizierende Spezies wird der minimal und der maximal
mögliche Ladungszustand ermittelt. Es wird die Schnittmenge gebildet, so
dass man das größte Minimum und das kleinste Maximum erhält. Für jede Spezies
werden die entsprechenden Ladungszustände in diesem Bereich selektiert.
3) Schnittmenge & nicht überlappend: Analog zu 2) und zusätzlich gilt, dass die ausgewählten
Peaks nicht mit Peaks anderer Massen überlappen dürfen.
4) Alle: Es werden von jeder Spezies alle Ladungszustände ausgewählt.
Der Sinn hinter Variante 2) ist folgender: Man nimmt an, dass verschiedene Spezies eines Basismoleküls
eine ähnliche Ladungsverteilung haben, d.h. die Hüllkurve ist ähnlich. Sofern
man jetzt nicht über alle Peaks, sondern nur über eine Teilmenge der im Spektrum vorhandenen
Peaks quantifiziert, sollten von allen beteiligten Spezies nur homologe Ladungszustände z
betrachtet werden.
Um dies zu verdeutlichen hier ein Beispiel: Angenommen, die Hüllkurve I(z) (Intensität I gegen
Ladungszustand z) von Spezies A und Spezies B sei Gauß-Verteilt, d.h. es gilt
I(z)=GAUSS(z;Amplitude,Mittelpunkt,FWHM). Sei weiterhin angenommen, dass Spezies A
und Spezies B sehr ähnlich sind, d.h. wenn man die Parameter der beiden Verteilungen betrachtet,
unterscheiden sie sich nur in der Amplitude:
36
Spezies A Spezies B
Amplitude 800 1000
Mittelpunkt 30 30
FWHM 10 10
Für eine Quantifizierung von Spezies A und Spezies B im Sinne von Variante 2) wählt man
gleiche Ladungszustände aus und berechnet daraus das Verhältnis. Exemplarisch wird z=40
gewählt, damit erhält man für die Intensität an dieser Stelle ISpeziesA(40;800,30,10)=50,0 und
ISpeziesB(40;1000,30,10)=62,5, was einem Verhältnis von 44,44 % (Spezies A) zu 55,56 %
(Spezies B) entspricht. Dieses Ergebnis entspricht überaus gut dem Verhältnis der Flächen
beider Verteilungen. Würde man aber für Spezies B z=30 anstatt z=40 wählen, so erhält man
ISpeziesB(30;1000,30,10)=1000, was ein Verhältnis von 4,76 % zu 95,24 % bedeuten würde –
ein falsches Ergebnis. Man muss also gleiche z-Werte gegenüberstellen, um ein korrektes Ergebnis
zu erhalten. Diese Annahme gilt natürlich nur dann, wenn verschiedene Varianten ei-

nes Basismoleküls betrachtet werden, d.h. ähnliche Moleküle. Falls gänzlich unterschiedliche
Moleküle betrachtet werden, sollte man über alle Peaks quantifizieren, da hier die Hüllkurven
u.U. völlig anders verteilen und sich somit in mehr Parametern als nur der Amplitude unterscheiden.
Bei Variante 3) wird versucht, zusätzliche Störquellen auszuschließen, indem nur diejenigen
Peaks betrachtet werden, die nicht mit anderen Peaks überlappen. Um Überlappungen zu erkennen,
muss jedoch die Peakform einer Masse bekannt sein. Diese wird im Wesentlichen
durch die Isotopenverteilung determiniert.
Die erste Variante sollte dem erfahrenen Anwender überlassen werden. Damit soll gewährleistet
werden, dass auch Spezialfälle behandelt werden können. Variante 3) sollte angewendet
werden, wenn die tatsächliche Hüllkurve einer Spezies nicht bekannt ist. Ist die Hüllkurve einer
Serie bekannt bzw. wird sie durch geeignete Verfahren bestimmt, so sollte Variante 4) benutzt
werden.
Der letzte Schritt vor der Quantifizierung ist ebenfalls optional und beinhaltet die Bestimmung
der tatsächlichen Hüllkurve einer Peakserie. Im Idealfall kann durch die Bestimmung
der Hüllkurven aller Peakserien das komplette Spektrum erklärt werden, d.h. die Summe der
simulierten Peakserien entspricht gerade der gemessenen Kurve (vgl. Abb. 3.1.2). Das Auffinden
der Hüllkurve wird mit Methoden aus dem Curve-Fitting gelöst.
Abb. 3.1.2: Dargestellt ist ein hypothetisches
Spektrum (schwarz). Des
Weiteren sind die Peakserien (rot,
grün und blau) eingezeichnet, deren
Summe dem beobachteten Signal
entspricht.
Bei einfachen Spektren, die über kaum signifikante Überlagerungen verfügen muss die Hüllkurve
nicht notwendigerweise bestimmt werden. Bei komplexen Spektren, wie sie im Falle
von Antikörpern auftreten, ist allerdings die Bestimmung der Hüllkurve sehr empfehlenswert,
da, wie in der Validierung später gezeigt wird, diese zu einem der besten Quantifizierungsergebnisse
führt.
37

Nach optionaler Bestimmung der Hüllkurve kann die Fläche jeder Serie berechnet werden und
die Resultate können in Relation gesetzt werden, so dass man von jeder Masse die relativen
Anteile am Spektrum erhält.
Für eine erfolgreiche Bestimmung der Quantitäten muss / müssen u.a.
38
• die Peakserien simuliert werden und zwar hinsichtlich Isotopenverteilung und ESI-
MS-spezifischer Verbreiterung der Peaks,
• das Spektrum – falls zu stark verrauscht – geglättet werden,
• die Basislinie – sofern vorhanden – abgezogen werden,
• diejenigen Peaks jeder Serie ausgewählt werden, welche zur Quantifizierung herangezogen
werden sollen,
• die tatsächliche Hüllkurve jeder Serie bestimmt werden.
Jeder dieser Schritte ist mit Einschränkungen bzw. Schwierigkeiten verbunden. Bei der Glättung
darf die Form eines Peaks nicht verändert werden, bei der Basislinienkorrektur darf nicht
zuviel vom Spektrum abgezogen werden, bei der Isotopenverteilung muss die Verbreiterung
der Peaks simuliert werden und bei der Entfaltung des Spektrums hat man das Problem, dass
Peaks häufig durch andere überlagert sind (welcher Peak trägt zu welchem Anteil zum gemessenen
Signal bei?), was eine korrekte Bestimmung der Hüllkurve erschwert.
3.2. Glättung
Eine Glättung des Spektrums kann optional durchgeführt werden, um das Signal-zu-Rausch-
Verhältnis der y-Ordinaten zu verbessern. Falls das Spektrum wenig Rauschen besitzt, sollte
auf eine Glättung verzichtet werden, da diese für die Analyse keine Vorteile bringen würde.
Sind die Daten hingegen sehr stark verrauscht, so ist eine Glättung durchaus empfehlenswert
(vgl. Abb. 3.2.2). Die verbesserte Signalqualität führt zu einem besseren Erkennen der Peaks
sowie der Basislinie. Ersteres ist auch für das Fitting der Hüllkurve von Bedeutung.
Eine wichtige Eigenschaft, welche die Glättung erfüllen muss, ist, dass die Peaks nicht verschoben
oder verformt werden. Ist diese Bedingung nicht erfüllt, können Fehler bei der Quantifizierung
die Folge sein.
Die elementarste Glättungsmethode ist „moving window averaging“ [NR]. Ein Fenster einer
festgelegten Größe wird über die y Ordinaten geschoben, beginnend bei y0 und endend bei
yLen-1, wobei Len die Anzahl der Datenpunkte ist. Für jede Position i wird der Durchschnitt der
im Fenster befindlichen y Werte berechnet. Als Ergebnis erhält man für jede Stelle i den lokalen
Durchschnittswert von y. Dieser Prozess lässt sich wie folgt beschreiben:

Man betrachtet um einen Datenpunkt yi nL Punkte links davon und nR Punkte rechts davon, insgesamt
�=nL+nR+1 Punkte. Dies entspricht dem Fenster, welches über die Datenpunkte geschoben
wird. Die Ordinaten werden mit einem Gewichtungsfaktor cn multipliziert. Bei „moving
window averaging“ ist cn=1/�.
= ∑
= −
R n
i cn
n nL
g y
(3.2.1)
i+
n
Dieses Verfahren kann für Spektren nicht angewendet werden, obwohl es auf den ersten Blick
seinen Zweck, nämlich das Rauschen zu vermindern, zu erfüllen scheint. Die Methode bringt
nämlich zusätzliches unerwünschtes Rauschen ins Signal, weil sie sehr stark dazu neigt, Peaks
in ihrer Intensität zu vermindern (vgl. Abb. 3.2.1).
Savitzky und Golay haben 1964 einen Glättungsalgorithmus (genannt: Savitzky-Golay oder
least-squares) speziell für Spektren entwickelt, welcher die Eigenschaft hat, das Rauschen zu
eliminieren, ohne dabei die Intensität der Peaks zu verändern [SavGol64]. Hierbei wird die
Annahme gemacht, dass die x-Ordinaten äquidistant sind und dass nur die y-Daten verrauscht
sind. Die Methode von Savitzky und Golay ist bis auf die Bestimmung des Gewichtungsfaktors
cn analog zum „moving window averaging“-Algorithmus. Um gute Gewichtungsfaktoren
für die im Fenster befindlichen Punkte zu erhalten, wird ein Fitting eines Polynoms M-ten
Grades auf die Ordinaten y i-n ,..., y
L i+
n durchgeführt. Das Polynom hat die Form:
R
k M
k
M
f i = ∑ aki
= a + a i + + aM
i -nL
≤ i ≤
k
=
( )
0 1 ... wobei
= 0
n
R
(3.2.2)
Die Parameter a werden so gewählt, dass der quadratische Fehler χ², d.h. die Differenz zwischen
berechneten und tatsächlichen Punkten, minimiert wird.
2
i
n
∑
n=
−n
= R
( f ( i + n)
− y )
L
2
i+
n
χ (3.2.3)
Um die Parameter a zu finden, welche χ² minimieren, wird die erste Ableitung nach den Parametern
gebildet. Hierbei erhält man:
39

40
∂
0 =
∂a
= 2
⇒
⇒
R
∑ ⎜⎜
∑
i=
−nL
n
R
∑ ∑
∑
k=
0
R
∑
r n=
−nL
⎛⎛
⎜
⎝⎝
n=
−nL
k=
0
M
n
a
n
M
( f ( i + n)
− y )
k=
M
n
k=
0
k
R
∑
k
n=
−nL
k ⎞
ak
( i + n)
⎟ − y
⎠
a ( i + n)
( i + n)
k+
r
k+
r
2
i+
n
=
=
R
∑
i+
n
n=
−nL
n
n
R
∑
∂
=
∂a
i+
n
y
y
i+
n
n=
−nL
n
R
∑ ⎜⎜
∑
r n=
−nL
⎞
⎟
⎟(
i + n)
⎠
( i + n)
( i + n)
r
⎛⎛
⎜
⎝⎝
r
r
k=
M
k=
0
Man bekommt also ein lineares Gleichungssystem:
α
k+
r
β =
k
=
nR
nR
n=
−nL
∑
∑
n=
−nL
( i + n)
( i + n)
[ α k+
r ] a = [ βk
] k,
r
k
k
k+
r
y
i
k ⎞
ak
( i + n)
⎟ − y
⎠
i+
n
⎞
⎟
⎠
2
(3.2.4)
(3.2.5)
Um den Parametervektor a zu bestimmen, wird das Gleichungssystem mit LU-
Dekomposition, Cholesky-Dekomposition oder Gauß-Jordan-Elimination gelöst. Die Komponenten
des Parametervektors a werden als Gewichtungskoeffizienten cn in Gl. (3.2.1) verwendet.
Der so beschriebene Prozess hat den Nachteil, dass das Fitting für jede Fensterbewegung neu
durchgeführt wird. Dies ist aber nicht notwendig, weil die Koeffizienten des angepassten Polynoms
innerhalb des Datenbereichs linear sind, d.h. das Fitting muss nur einmal durchgeführt
werden. Hierzu verwendet man fiktive Ordinaten, welche bis auf y0=1 überall gleich null sind.
Anschließend kann mit den so berechneten Gewichtungskoeffizienten cn jeder beliebige äquidistante
Datensatz geglättet werden. [NR]
Der Savitzky-Golay-Algorithmus benötigt äquidistante Datenpunkte, um eine gute Glättung
durchzuführen. Die gemessenen Spektren sind jedoch nicht äquidistant. Deswegen findet vor
der Glättung eine lineare Interpolation der Spektren statt, so dass das Intervall 0.02 amu beträgt.
Die lineare Interpolation bewirkt an dieser Stelle de facto keine Verfälschung der Signale,
weil die Datendichte der gemessenen Spektren sehr groß ist.
Als Standardparameter für die Glättung von Antikörperspektren werden 91 Datenpunkte festgelegt
sowie ein Polynom 9ten Grades. Ein geringerer Polynomgrad bewirkt bei manchen
Spektren eine Verminderung der Peakhöhe. Ein Polynom höheren Grades kann nicht verwendet
werden, weil der Rechenaufwand zu groß wird. Dies ist aber auch nicht notwendig, weil

mit einem Polynom 9ten Grades die Signalintensität nicht signifikant verfälscht wird. Die Anzahl
Datenpunkte, d.h. die Fenstergröße legt fest wie stark die Glättung ist. Je mehr Datenpunkte
gewählt werden, desto globaler wird die Glättung durchgeführt und umso mehr gehen
die lokalen Eigenschaften des Spektrums verloren. Der Wert 91 hat sich beim Betrachten verschiedener
Spektren als guter empirischer Wert erwiesen.
Abb. 3.2.1: Vergleich von moving window
averaging (Mitte) und Savitzky-
Golay-Glättung (unten) eines Spektrums.
[NR S.654]
Als Implementierung des Savitzky-Golay-Algorithmus wurde die ANSI-C Version aus [NR]
übernommen.
Abb. 3.2.2: Spektrum eines monoklonalen
Antikörpers.
Oben: Unmodifiziertes Spektrum.
Unten: Savitzky-Golay-Glättung des
Spektrums mit einem Polynom 9ten
Grades und 91 Datenpunkten.
41

3.3. Basislinie
Die Basislinie enthält fremdes Signal, welches, falls nicht abgezogen, zu einer Verfälschung
des Quantifizierungsergebnisses führt. Deswegen ist es essentiell, die Basislinie abzuziehen.
Algorithmen für die Erkennung der Basislinie gibt es viele. Jeder hat seine eigenen charakteristischen
Eigenschaften mit Vor- und Nachteilen. Die Diversität der Ansätze entstand nicht
zuletzt durch die unterschiedlichsten Anwendungsgebiete, für die sie entwickelt wurden. Bei
manchen Spektren ist es z.B. ausreichend, einfach eine Linie abzuziehen, welche durch zwei
Punkte bestimmt ist: Einen am Anfang und einen am Ende des Spektrums. Bei anderen sind
Ansätze, die aus der Bildbearbeitung stammen, sinnvoll. Hierbei werden morphologische
nichtlineare Filter angewendet, wie z.B. der „top-hat“-Operator [TopHat].
Bei einer Diskussion mit den Laboranten hat sich herauskristallisiert, dass sie im Wesentlichen
zwei Ansätze wählen, um die Basislinie abzuziehen. Die einen ziehen die Basislinie mit
einer lang gezogenen glatten Kurve ab, die durch das Spektrum gelegt wird, die anderen durch
Linien von Peaktal zu Peaktal (vgl. Abb. 3.3.1).
Um diese Methoden zu automatisieren, werden drei Algorithmen implementiert. Der erste
entspricht der „Tal-zu-Tal“-Variante und wird durch Erkennung der lokalen Minima realisiert.
Der zweite soll die lang gezogene Kurve nachempfinden und wird durch eine kubische Spline-Interpolation
erkannt. Als Alternative zur kubischen Spline-Interpolation wird noch ein
drittes Verfahren entwickelt, welches auf der 4. Ableitung des Spektrums beruht.
42
a)
c)
b)
Abb. 3.3.1: Erkennung der Basislinie mittels kubischer
Spline-Interpolation a) bzw. durch Legen einer Gerade
von Tal zu Tal b). Vergrößerter Ausschnitt von b) ist in
c) dargestellt.

3.3.1. Von Tal zu Tal
Dieses Verfahren zieht von Peaktal zu Peaktal eine Gerade, welche der Basislinie entsprechen
soll (vgl. Abb. 3.3.1). Die Suche nach den lokalen Minima kann relativ einfach implementiert
werden, jedoch bereitet das Signalrauschen Schwierigkeiten. Selbst bei nur leicht verrauschten
Spektren werden neben den Peaktälern viele weitere lokale Minima gefunden. Damit gewährleistet
ist, dass nur die Minima der Peaktäler gefunden werden, wird vor die Suche ein Filter
geschaltet, welcher das Spektrum glättet. Es handelt sich um den im vorigen Kapitel vorgestellten
Savitzky-Golay-Filter. Als Parameter für die Glättung wird ein Polynom 4ten Grades
verwendet und die Fensterbreite auf 41 Datenpunkte festgelegt. Des Weiteren wird die Glättung
dreimal hintereinander ausgeführt. Der geringe Polynomgrad sowie das mehrmalige Hintereinander-Ausführen
des Filters stellt sicher, dass das Spektrum sehr glatt ist. Es werden also
mit hoher Wahrscheinlichkeiten ausschließlich die Peaktäler erkannt. Das mehrmalige Filtern
mit diesen Parametern bewirkt zwar eine Verfälschung der Peakintensitäten, jedoch spielt
dies keine Rolle, weil nur die Lage der Minima von Interesse ist und nicht deren Höhe. Als
Höhe der Minima wird die Intensität des original Spektrums an entsprechender Stelle genommen.
Diese Methode hat den Nachteil, dass u.U. „echtes“ Peaksignal gelöscht wird und dadurch die
Massenverhältnisse eines Spektrums verfälscht werden (vgl. Abb. 3.3.1.1). Nichts desto trotz
hat sich in der Validierung (vgl. Kapitel 4) gezeigt, dass mit diesem Verfahren des Basislinienabzugs
die Ergebnisse einer Quantifizierung i.d.R. besser werden.
3.3.2. Kubische Spline-Interpolation
Abb. 3.3.1.1: Faltung (rote Kurve) zweier
Peaks (graue Kurven). Mit dem „Tal-zu-Tal“-
Verfahren wird auch Signalanteil abgezogen.
Dies verfälscht die Intensitäten und somit
u.U. auch die relativen Verhältnisse der
Peaks.
Der Algorithmus für diese Variante der Basislinienerkennung funktioniert auf folgende Art
und Weise: Das Spektrum wird in M Teile gespalten. In jedem dieser Teilbereiche wird eine
Suche nach dem minimalen y-Wert durchgeführt. Alle so ermittelten Punkte, sowie der erste
und letzte Punkt des Spektrums werden in eine neue Liste geschrieben. Die Ordinaten dieser
43

Liste werden durch eine kubische Spline-Interpolation verbunden und man erhält eine Basislinie
für das Spektrum. Durch die Größe von M kann festgelegt werden, wie hoch die Basislinie
gezogen werden soll. Ein zu großer Wert kann aber zu unerwünschten Nebeneffekten führen,
da dann der Spline eher dazu neigt, auszuschlagen. Als guter empirischer Wert für die Teilbereiche
M hat sich 11 erwiesen.
Die kubische Spline-Interpolation wird im Folgenden kurz erläutert: Gegeben ist ein Datensatz
der Form (x1, f(x1)), (x2, f(x2)), …, (xn, f(xn)). Für jedes Intervall [xi, xi-1], wobei 2

Aufgrund der Einfachheit des Verfahrens wurde die Basislinie zunächst mit dem oben beschriebenen
Verfahren erkannt. Bei der später durchgeführten Bewertung der Methoden hat
sich aber herausgestellt, dass der Abzug der Basislinie sehr starke Auswirkungen auf die
Quantifizierung hat (vgl. Kap. 4). Ein Fehler beim Erkennen der Basislinie kann also zu falschen
Ergebnissen führen. Solche Fehler kommen bei dieser Variante bei ungünstiger Lage
der zu verbindenden Punkte vor. Für den Anwender äußert sich dies visuell am Ausschlagen
der interpolierten Basislinie in die falsche Richtung. Der Anwender kann diesen Fehler korrigieren,
indem er einen anderen Wert für M findet. Weil dieser Methode die nötige Robustheit
fehlt, wurde ein weiteres Verfahren für die Erkennung der Basislinie entwickelt.
3.3.3. Vierte Ableitung
Als Ergebnis der kubischen Spline-Interpolation erhält man eine Basislinie welche lang gezogen
über das gesamte Spektrum liegt. Die Basislinie ist also ein niederfrequentes Signal innerhalb
hochfrequenter Peaksignale. Der Ansatz mit dem kubischen Spline hat den Nachteil,
dass die Fenstergröße M abhängig vom betrachteten Spektrum angepasst werden muss um gute
Resultate zu erhalten. Im Folgenden wird ein gänzlich anderer Ansatz zur Elimination der
Basislinie vorgestellt, welches nicht den erwähnten Nachteil besitzt. Der Grundgedanke hierbei
bleibt jedoch der Gleiche: die Basislinie ist ein nieder frequentes Signal im Spektrum, d.h.
ein Polynom geringen Grades.
Es wird die vierte Ableitung des Spektrums durchgeführt. Dadurch verschwinden alle Polynome
1ten, 2ten und 3ten Grades aus dem Signal. Die nieder frequente Basislinie ist also eliminiert
und es bleiben nur die hochfrequenten Peaksignale übrig. Die Quantifizierung wird
auf den positiven Teil der vierten Ableitung des Spektrums durchgeführt.
Wie eben bereits angedeutet ist es mit Hilfe der Ableitung möglich, Polynome geringen Grades
aus einem Signal zu entfernen. Eine weitere sehr wichtige Eigenschaft der Ableitung ist,
dass die Amplitudenverhältnisse nicht verzerrt werden: Die Amplitude der n-ten Ableitung eines
Peaks ist umgekehrt proportional zur n-ten Potenz ihrer Halbwertsbreite. Folglich trennt
Ableiten nach der Peakbreite, d.h. je größer der Grad der Ableitung, desto größer die Trennung.
[Haver05]
Zur Illustration dient das folgende Beispiel (vgl. dazu Abb. 3.3.3.1). Eine Gauß-Kurve (blaue
Kurve), welche den Peak repräsentiert, ist auf einem Polynom 3ten Grades moduliert (rote
Kurve) (vgl. a). Führt man die zweite Ableitung des Gauß-Peaks und des modulierten Signals
durch (vgl. b), so sieht man, dass im modulierten Signal ein beachtlicher Anteil des Polynoms
3ten Grades bereits entfernt ist. Bei der 4. Ableitung bleibt von dem Polynom 3ten Grades
nichts mehr übrig, wie man an der perfekten Überlagerung beider Signale sehen kann (vgl. c).
45

Dieser Mechanismus funktioniert nur dann, wenn das Hintergrundsignal einen deutlich kleineren
Polynomgrad aufweist, als die Peaks des Spektrums. Dies ist für die hier betrachteten Antikörper
ESI-MS-Spektren der Fall. Das Betrachten einiger repräsentativer Spektren hat gezeigt,
dass es sich bei der Basislinie immer um eine sehr breite Kurve handelt, die durch das
Spektrum geht. In Folge dessen ist die vierte Ableitung ausreichend, um die Basislinie aus
dem Signal zu löschen. Ein höherer Ableitungsgrad ist nicht notwendig und kann sogar schädlich
sein, weil ab einem bestimmten Grad auch Peaksignale eliminiert werden.
Die Quantifizierung der Spezies kann – wegen der erwähnten Proportionalität – auf der vierten
Ableitung durchgeführt werden. Dazu werden nur die positiven Signalanteile benötigt,
weil die Peaks die gleiche Position wie das Ausgangssignal haben und positiv sind.
Um die Ableitung eines Signals zu erhalten, wird der Savitzky-Golay-Filter verwendet [Sav-
Gol64, NR]. Der Vorteil dabei ist, dass die Ableitung bereits geglättet ist. Als Parameter für
die Glättung haben sich folgende empirische Werte als gut erwiesen: Der Grad des Polynoms
sollte auf 6 gesetzt werden und die Anzahl Datenpunkte des Fensters auf 91.
3.4. Isotopenverteilung
Die Isotopenverteilung eines Moleküls kann durch die Entfaltung seines Polynoms berechnet
werden.
46
a) b)
c)
Abb. 3.3.3.1: Blaue Kurve: Gauß-Peak. Rote
Kurve: Überlagerung eines Polynoms 3ten Grades
mit dem Gauß-Peak (blaue Kurve).
a) Ausgangssituation. Die Peakintensität im modulierten
Signal (rote Kurve) ist nicht mehr eindeutig
feststellbar. Beim reinen Peaksignal (blaue
Kurve) hingegen ist die Intensität sauber.
b) Zweite Ableitung beider Kurven. Das Hintergrundsignal
aus der modulierten Kurve ist fast
komplett entfernt.
c) Vierte Ableitung beider Kurven. Das Hintergrundsignal
ist verschwunden und die Kurven
überlagern perfekt.

Seien a, b, c, … polyisotopische Elemente wobei a1, a2, a3, …, b1, b2, b3, …, c1, c2, c3, … die
Isotope der Elemente repräsentieren. Sei na, nb, nc, … die Anzahl der Atome eines Elements
im Molekül. Dann lässt sich die Isotopenverteilung eines Moleküls als Produkt von Polynomen
darstellen:
na
nb
nc
( a a + a + ) ⋅ ( b + b + b + ... ) ⋅ ( c + c + c + ... ) ...
1
+ (3.4.1)
2
3
... 1 2 3
1 2 3
Die Entfaltung des Polynoms gibt Informationen über die Isotopenzusammensetzung, deren
Häufigkeit und deren Masse. Zur Verdeutlichung ein Beispiel mit BrCl3 + als Molekül [Budzikiewicz92].
( ) ( ) ( ) ( )
( ) ( )
( ) ( )
( ) ( ) 3
79 81 35 37 3 79 35 3 79 35 2 37
Br+
Br ⋅ Cl+
Cl = Br ⋅ Cl + 3⋅
Br ⋅ Cl ⋅ Cl
79 35 37 2 79 37 3
+ 3⋅
Br⋅
Cl ⋅ Cl + Br Cl
81 35 3 81 35 2 37
+ Br ⋅ Cl + 3⋅
Br ⋅ Cl ⋅ Cl
81 35 37 2 81 37
+ 3⋅
Br⋅
Cl ⋅ Cl + Br ⋅ Cl
(3.4.2)
Der Koeffizient vor jedem Term sagt aus, wie oft die entsprechende Isotopenkombination
vorkommt. Die Potenz nach jedem Isotop steht für die Menge des Isotops in der jeweiligen
Kombination. Die Häufigkeit kann man aus Tabelle 2.3.1 entnehmen, um damit für jeden
Term die Frequenz zu bestimmen. Zur Vereinfachung werden die Verhältnisse hier gerundet
und man erhält: 35 Cl=3, 37 Cl=1, 79 Br= 81 Br=1. Im letzten Schritt müssen Isotopenkombinationen
gleicher Masse zusammengefasst werden. Das Ergebnis sieht dann so aus:
m/z Isotopenmuster Peakintensität Normiert
184
79 35
Br Cl3 1*3³=27 21%
186
79 35 37 81 35
Br Cl2 Cl + Br Cl3 3*1*3²*1+1*3³=54 42%
188
79 35 37
Br Cl Cl2 + 81 Br 35 37
Cl2 Cl 3*1*3*1²+3*1*3²*1=36 28%
190
79 37
Br Cl3 + 81 Br 35 Cl 37 Cl2 1*1³+3*1*3*1²=10 8%
192
81 37
Br Cl3 1*1³=1 1%
Die Anzahl der Kombinationen K kann mit dem Binomialkoeffizienten berechnet werden. Die
Analogie findet sich in dem Urnenmodell „Ziehen mit Zurücklegen“ wieder. Die verschiedenen
Kugelsorten q entsprechen den stabilen Isotopen eines Elements. Die Anzahl n der gezogenen
Kugeln entspricht der Anzahl Atome des Elements:
K
⎛q + n −1⎞
; (3.4.3)
⎝ n ⎠
( q n)
= ⎜ ⎟
Zur Illustration dient wieder das Molekül BrCl3 + . Für Br erhält man KBr(2,1)=2 Kombinationen
und für Cl3 erhält man KCl(2,3)=4 Kombinationen. Um die gesamte Menge an Permuta-
47

tionen zu berechnen, multipliziert man die Resultate beider Elemente miteinander und erhält
KBr(2,1)KCl(2,3)=8 Isotopenkombinationen. Dies entspricht exakt der Anzahl von Termen,
welche durch die Entfaltung des Polynoms gewonnen wurden (vgl. obige Tabelle).
Für die Ermittlung aller Isotopenpermutationen werden lineare diophantische Gleichungen
verwendet [Chang84]. Das besondere an diesen Gleichungen ist, dass nur ganzzahlige positive
Lösungen erlaubt sind:
48
q
∑
j=
1
x
j
= n
(3.4.5)
xj ist der absolute Anteil des j-ten Isotops im Element. Seien z.B. drei Atome des Elements
Sauerstoff in einem Molekül vorhanden. Sauerstoff hat drei stabile Isotope 16 O, 17 O und 18 O.
Mit obiger Formel berechnet man, dass es insgesamt 10 Permutationen gibt:
i x1= 16 O x2= 17 O x3= 18 O
1 3 0 0
2 2 1 0
3 2 0 1
4 1 2 0
5 1 1 1
6 1 0 2
7 0 3 0
8 0 2 1
9 0 1 2
10 0 0 3
Es gibt also K Isotopenkombinationen. Die Häufigkeit Pi, 1

⎛
⎜
n!
log Pi
= log p
⎜
⎝ x1!
x2!...
xq!
= log
=
n
∑
u=
1
( n!
)
log
⎛
− log⎜
⎝
q
q
∏
u=
1
x
u
( u)
− log(
v)
+ x log(
p )
∑∑
u=
1 v=
1
x1
1
p
x
2
2
... p
x
q
⎞ ⎛
xu!
⎟ + log⎜
⎠ ⎝
q
⎛
⎜
⎞
⎟ = log
⎜
⎟ ⎜
⎠ ⎜
⎝
q
∑
u=
1
q
∏
u=
1
u
p
x
u
u
⎞
⎟
⎠
q
∏
u=
1
n!
u
x !
u
q
∏
u=
1
p
x
u
u
⎞
⎟
⎟
⎟
⎟
⎠
(3.4.7)
Es bleibt noch das Problem bestehen, dass die Anzahl der Permutationen K i.d.R. sehr groß ist
und die Berechnung von log(Pi) zeitaufwendig ist. Yergey hat 1983 einen Weg vorgeschlagen,
wie man die Bestimmung von log(Pi) beschleunigen kann. Es werden zwei beliebige Permutationen
in Relation gesetzt, mit dem Ergebnis, dass ein Großteil der Variablen weggekürzt wird
[Yergey83]:
P
P
i+
1
i
⇒ P
n!
=
n!
i+
1
q q
xu
pu
u=
1 u=
1
q q
∏ ∏
∏
u=
1
⎛
= P
⎜ i
⎝
x
q
!
∏
∏
u
u=
1
u= 1 u
'
xu!
=
'
u p
x
u
'
xu!
p
x !
'
u
xu
−x
u
q
∏
u=
1
q
∏
u=
1
⎞
⎟
⎠
x
x
'
u
u
!
!
q
∏
u=
1
p
'
u
xu
−x
u
=
q
∏
u= 1 u
'
xu!
p
x !
'
u
xu
−x
u
(3.4.8)
Dieser Term wird im nächsten Schritt logarithmiert, wobei zur Vereinfachung der Schreibwei-
se
f
u
'
x ! '
u xu
−xu
: = pu
definiert wird, d.h.:
x !
log
u
'
u xu
−xu
( P ) = log(
P ) + log⎜
p ⎟ = log(
P )
i+
1
= log
i
q
( P ) + log(
f )
i
∑
u=
1
⎛
⎜
⎝
q
∏
'
x !
x !
u= 1 u
Der Logarithmus von fu entspricht dabei:
log
( f )
u
⎧
⎪
⎪
= ⎨
⎪
⎪
⎪⎩
x
u
∑
'
v=
xu
+ 1
log
u
u
⎞
⎟
⎠
' ( v)
− ( x − x ) log(
p )
u
0
xu
' ( xu
− xu
) log(
pu
) − ∑log(
v)
u
'
v=
xu
+ 1
u
x
x
x
u
u
u
i
> x
= x
< x
⎛
+ log ⎜
⎝
'
u
'
u
'
u
q
∏
u=
1
f
u
⎞
⎟
⎠
(3.4.9)
(3.4.10)
49

Der Algorithmus für die Berechnung der Isotopenverteilung ist in Abb. 3.4.1 dargestellt. Zuerst
wird die chemische Summenformel des Moleküls bestimmt. Anschließend wird für jedes
Element die Isotopenverteilung berechnet, d.h. Bestimmung der nominellen Masse und der
Häufigkeit für jede Isotopenkombination. Die Häufigkeiten gleicher Massen werden zusammengefasst.
Sind alle Elemente behandelt, wird noch der Massendefekt korrigiert, indem die
exakte Masse der häufigsten Isotopenkombination ermittelt wird und um den entsprechenden
Differenzbetrag zur nominellen Masse korrigiert wird. Um den Vorgang noch weiter zu beschleunigen,
wird nach jeder Berechnung der Isotopenhäufigkeit einer Kombination ein Pruning
durchgeführt, d.h. wenn die Häufigkeit nicht mehr als 0,01 % vom aktuellen Maximum
ausmacht, wird diese Kombination nicht weiter behandelt.
Mit modernen Rechnern (P4 3.2 GHz) geht die Berechnung der Isotopenverteilung einer
schweren Kette (~50 kD) in weniger als einer Sekunde von statten. Bei der Berechnung von
10 schweren Ketten bedarf es etwa 3 Sekunden Rechenzeit. Sollte einmal der Bedarf vorhanden
sein, mehrere Isotopenverteilungen in einem Batch zu berechnen oder größere Moleküle
zu prozessieren, so sollte ein anderer Lösungsansatz gewählt werden. Deutlich schneller als
der hier angewandte Multi-Nomial-Ansatz arbeitet zum Beispiel der von Rockwood et al.
entworfene Algorithmus, welcher eine schnelle Fourier Transformation (FFT) zur Berechnung
nutzt [Rockwood95]. Die im Rahmen dieser Arbeit behandelten Moleküle lassen sich alle relativ
schnell berechnen und daher spielt die Zeit keine kritische Rolle. Somit wird auf die Im-
50
Abb. 3.4.1: Algorithmus für die Berechnung der Isotopenverteilung
eines Moleküls

plementierung des von Rockwood et al. entwickelten Algorithmus zugunsten des einfacheren
Multi-Nomial-Algorithmus verzichtet.
Leider gibt es auch Fälle, bei denen keine Informationen über die Molekülstruktur vorhanden
sind und somit eine chemische Formel nicht vorliegt. Eine Berechnung der Isotopenverteilung
ist da nicht mehr möglich und es muss somit ein anderer Weg eingeschlagen werden, um die
Peaks zu simulieren.
Bei den Untersuchungen der Isotopenverteilung hat sich gezeigt, dass sich mit zunehmender
Molekülgröße die Isotopenkurve immer mehr einer Gauß-Kurve nähert. Es würde sich also
anbieten, die Peaks näherungsweise durch eine Gauß-Funktion darzustellen. Die Position der
Funktion ist durch den m/z-Wert bestimmt, die Intensität durch die Intensität des Spektrums
am jeweiligen m/z-Wert bzw. durch die Hüllkurve I(z), falls diese schon bestimmt ist. Der
einzige fehlende Parameter ist die Halbwertsbreite. Diese könnte man bestimmen, indem man
eine gedachte Linie auf halber Höhe legt, welche das Spektrum links und rechts schneidet.
Der Abstand der beiden Punkte entspricht dann der Halbwertsbreite. Dieser Weg hat sich allerdings
als nicht praktikabel erwiesen. Das Hauptproblem hierbei ist, dass es Massen im
Spektrum geben kann, welche gar nicht als Peak in Erscheinung treten, d.h. die gedachte Linie
schneidet das Spektrum nie.
Als weitaus bessere Lösung bietet es sich an, die Summenformel abzuschätzen, um mit dieser
in den Algorithmus für die Berechnung der Isotopenverteilung zu gehen. Für die Bestimmung
der durchschnittlichen Aminosäure haben Senko et al. die statistische Verteilung der Aminosäuren
in der PIR Protein Datenbank untersucht. Dabei sind sie auf folgende Summenformel
gekommen: [Senko95]
C4,9384H7.7583N1,3577O1,4773S0,0417 (3.4.11)
Hiermit erhält man für die durchschnittliche Masse einer Aminosäure 111,1254D. Ausgehend
davon lässt sich für eine gegebene Molekülmasse die Anzahl der Aminosäuren und damit die
Anzahl jedes oben erwähnten Atoms berechnen. Für große Moleküle (ab 6000D) stimmt die
geschätzte Summenformel sehr gut mit der tatsächlichen überein. Denn bei einem Molekül
mit z.B. 1000 C-Atomen spielen 50 C-Atome mehr oder weniger für die resultierende Isotopenverteilung
kaum eine Rolle. Da hier Glykoproteine ab 10kD betrachtet werden, ist die
Nährung folglich unproblematisch, d.h. die geschätzte Isotopenverteilung ist zur tatsächlichen
sehr ähnlich.
In Abb. 3.4.2 ist die Isotopenverteilung von vier Spezies dargestellt.
51

3.5. Simulation der Peakverbreiterung
Die Isotopenverteilung allein reicht nicht aus, um einen Peak im gemessenen Spektrum zu simulieren.
Es fehlt noch eine wichtige Komponente, nämlich die durch das ESI-MS-Gerät verursachte
auflösungsabhängige Verbreiterung der Peaks [Chapman92].
Um die Verbreiterung zu simulieren, wird auf jede Masse, welche man aus der Isotopenverteilung
erhält, eine Gauß-Kurve GAUSS(x;a,b,c) gelegt, wobei a die Amplitude ist, b der Mittelpunkt
und c der Streuungsparameter.
52
Abb. 3.4.2: Spektrum eines Antikörpers, aufgenommen
bei einer Auflösung von R=5000. Es ist
die Isotopenverteilung von vier im Spektrum vorkommenden
schweren Ketten dargestellt. Man
sieht, dass die Isotopenverteilung sehr gut mit
dem gemessenen Signal übereinstimmt. Die Verbreiterung
am Sockel der Signalpeaks ist durch
Addukte verursacht, welche hier nicht dargestellt
sind.
Abb. 3.5.1: Theoretische Peakform bei
verschiedenen ESI-MS-Auflösungen für
ein einfach geladenes Molekül.
2
⎛
⎞
⎜
1 ⎛ x − b ⎞
GAUSS ( x;
a,
b,
c)
= a exp − ⎟
⎜
⎜ ⎟
(3.5.1)
⎟
⎝
2 ⎝ c ⎠ ⎠
Die Faltung aller Gauß-Kurven ergibt dann die beobachtete Peakform. Die Position jeder
Gauß-Verteilung ist durch den m/z-Wert der zugehörigen Isotopenmasse festgelegt. Ebenso
verhält es sich mit der Amplitude, welche durch die Häufigkeit der korrespondierenden Isotopenkombination
determiniert wird. Als einziger Parameter muss noch die Breite der Gauß-
Kurve bestimmt werden. Dazu verwendet man die Rayleigh’sche Definition von Auflösung.

Der Zusammenhang zwischen Auflösung R, Halbwertsbreite FWHM und m/z-Wert eines monoisotopischen
Peaks ist folgender:
m / z
R =
FWHM
m / z
⇒ FWHM =
R
(3.5.2)
Um die Halbwertsbreite der Gauß-Funktion zu bestimmen, müssen diejenigen x Punkte bestimmt
werden, bei denen die Gauß-Funktion die halbe Höhe annimmt. Anschließend wird die
Differenz der Punkte gebildet und man erhält die Halbwertsbreite.
2
⎛ 1 x0
b ⎞ 1
a exp⎜ ⎛ − ⎞
− ⎜ ⎟ ⎟ = f ( xmax
)
(3.5.3)
⎜ 2 c ⎟
⎝ ⎝ ⎠ ⎠
2
Die maximale Höhe f(xmax)=a erhält man, wenn man für xmax, den Mittelpunkt b einsetzt:
2
⎛ x b ⎞
a ⎜
1 ⎛ 0 − ⎞
⎟ ⎟
1
exp − ⎜ =
⎜ c ⎟
⎝
2 ⎝ ⎠ ⎠
2
2
⎛ x b ⎞
a ⎜
1 ⎛ 0 − ⎞
⎟ ⎟
1
exp − ⎜ =
⎜ c ⎟
⎝
2 ⎝ ⎠ ⎠
2
1 ⎛ x0
− b ⎞
− ⎜ ⎟
2 ⎝ c ⎠
x
= ± c
2ln(
2)
⎛ 1 ⎞
= ln⎜
⎟
⎝ 2 ⎠
2
− ( x0
− b)
= −ln(
2)
2
2c
( x
2
− b)
2
= 2c
ln( 2)
0
1/
2
2
+ b
f ( b)
a
(3.5.4)
Den Zusammenhang zwischen Halbwertsbreite FWHM und Streuungsparameter c erhält man,
indem die Differenz der beiden Punkte gebildet wird:
FWHM = x − x = 2 2ln(
2)
c = 2.
354820044c
FWHM
⇒ c =
2.
354820044
2
1
(3.5.5)
Nun hat man alle Parameter beisammen, um für jeden Peak die Verbreiterung zu berechnen.
Die Faltung muss für jeden Peak (Ladungszustand einer Masse) neu berechnet werden, weil
53

die Peakbreite nicht konstant ist. Sie ist nichtlinear vom Ladungszustand abhängig (vgl. Abb.
3.5.2).
3.6. Curve-Fitting
Die Peaks einer Serie sind oft durch andere Peaks überlagert. Das macht eine Identifizierung
der tatsächlichen Signalhöhe problematisch. Man kann sich aber die Tatsache zu Nutze machen,
dass die Hüllkurve jeder Serie einer stochastischen Verteilung folgt. Sofern man die
Verteilung kennen würde, wäre es ein Leichtes, die Intensitäten an den überlappenden Peaks
zu berechnen.
Wie in Kap. 2.3. bereits erläutert, liegen die Analyten in mehreren Konformationen vor, wobei
jede einer eigenen Ladungsverteilung Bi(z) folgt. Die Summe aller Basisfunktionen ergibt die
im Spektrum beobachtete Hüllkurve I(z): [Dobo01]
54
n
∑
i=
1
I ( z)
= B ( )
(3.6.1)
i z
Abb. 3.5.2: Zusammenhang zwischen Peakbreite eines
monoisotopischen Peaks und Ladungszustand. Als Masse
wurde 50kD gewählt und als Geräteauflösung wurde
5000 gesetzt. Mit steigender Ladung (z) nimmt die Peakbreite
(FWHM) ab.
Die durchschnittliche Ladung jeder Basisfunktion (die Position des Maximums von Bi(z)) ist
für die Konformation bzw. Oberflächenzugänglichkeit des Analyten charakteristisch. Die
Breite (Standardabweichung von Bi(z)) entspricht der Heterogenität der Konformation.
Schwach strukturierte (große Oberfläche) Proteine erzeugen höhere Ladungszustände als stark
strukturierte (kleine Oberfläche). Der Grund dafür ist, dass bei schwach strukturierten Proteinen
die Oberfläche größer ist und somit für die Anlagerung größerer Ladungsmengen zugänglicher
ist. Bei stark strukturierten Proteinen ist die Oberfläche geringer und dadurch können
während der Ionisierung nicht so viele Ladungsträger aufgenommen werden, da die elektrosta-

tische Abstoßung zu groß ist. Die genauen Mechanismen, welche dahinter stecken, sind aber
noch nicht bekannt. [Šamalikova03]
Um die Anzahl relevanter Basisfunktionen (Faltungszustände des Analyten) zu bestimmen,
müsste man mehrere Experimente bei unterschiedlichen Pufferbedingungen durchführen [Dobo03].
Man könnte z.B. Aufnahmen bei verschiedenen pH-Werten tätigen und beobachten,
wie sich die Hüllkurve abhängig vom pH-Wert ändert. Eine Automatisierung dieses Schrittes
ist möglich. So können bei einer Singulärwert-Dekomposition (SVD) der Messreihen, die Anzahl
relevanter Singulärwerte bestimmt werden, welche der Anzahl Basisfunktion entsprechen
[Dobo01]. Dieser Ansatz kann hier nicht angewendet werden, weil nicht davon ausgegangen
werden kann, dass für jede Analyse ein Dutzend Aufnahmen gemacht werden. Vielmehr wird
dem Anwender die Freiheit gelassen, durch sein fachliches Wissen selbst zu bestimmen, wie
viele relevante Faltungszustände vorhanden sind. Als Faustregel kann man jedoch sagen, dass
eher weniger als mehr Basisfunktionen benutzt werden sollen. Ursache hierfür ist, dass mit
steigender Zahl an Basisfunktionen das Modell natürlich immer besser erklärt werden kann.
Teilweise kann es sogar passieren, dass es keine eindeutige Lösung für die Faltung gibt. Somit
ist die physikalische Aussagekraft dann doch eher zu bezweifeln. Bei Verwendung weniger
Basisfunktionen sinkt zwar die Qualität des Fittings, die Aussagekraft jedoch ist wesentlich
stärker, da es jetzt viel besser die wahre Natur der Hüllkurve widerspiegelt.
Speziell bei Antikörpern kann man zu der Zahl relevanter Funktionen folgende Annahme machen:
Die leichte Kette besitzt zwei homologe Einheiten VL und CL. Die schwere Kette besitzt
vier homologe Einheiten VH, CH1, CH2 und CH3, wobei die C-Domänen viel ähnlicher untereinander
sind als zur V-Domäne. Jede dieser Einheit verfügt über eine interne Disulfidbindung
(vgl. Abb. 2.2.2). Um die Ionsierungsfähigkeit zu verbessern, werden den Proben Detergenzien
zugeführt. Dies hat zur Folge, dass es zu zufälligen Trennungen der Disulfidbindungen
kommt, d.h. es bilden sich verschiedene Faltungszustände. Die leichte Kette z.B. kann eine,
zwei oder gar keine offene Disulfidbindung(en) haben. Es gibt also drei echte Zustände. Für
ein Fitting der Hüllkurve reichen zwei Basisfunktionen völlig aus, weil die Variante mit zwei
offenen Bindungen selten ist und damit nicht ins Gewicht fällt. Bei der schweren Kette sind
mehr Konformationen möglich, wobei auch hier die meisten davon nicht ins Gewicht fallen,
weil sie ähnlich verteilen. Drei Basisfunktionen sind somit völlig ausreichend. Diese Annahme
beruht auf Erfahrungswerten. Für einen Beweis dieses Sachverhalts müssten weitere Analysen
durchgeführt werden.
Das Fitting kann nur so gut sein wie das Modell, welches hierzu benutzt wird. Deswegen ist
es von entscheidender Bedeutung, ein Modell zu wählen, welches die wahre Natur des Phänomens
möglichst gut beschreibt. Für die hier untersuchten Glykoproteine wird eine Gauß-
Verteilung als Basisfunktion angenommen. Diese hat sich in der Praxis als tauglich erwiesen,
weil sie den physikalischen Verteilungsprozess sehr gut widerspiegelt.
55

Um die Parameter der Basisfunktionen zu finden, welche der Hüllkurve zugrunde liegen, wird
folgendermaßen vorgegangen: Als erstes wird eine Datenliste erstellt, welche alle freien Peaks
der untersuchten Spezies enthält. Freie Peaks sind all diejenigen, welche nicht durch Peaks
anderer Massen überlagert werden. Um auch extreme Fälle noch gut behandeln zu können,
werden auch Peaks herangezogen, welche überlappen, wobei die Überlappung nicht mehr als
5% der Peakintensität einnehmen darf. Beim Fitting sind nichtlineare Transformationen der
Daten nicht zulässig, da sie das Ergebnis verfälschen. Folglich kann beim Fitten nicht mit der
m/z-Skala gearbeitet werden, weil die Transformation von I(z) nach I(m/z) nicht linear ist, d.h.
die m/z-Werte der Datenpunkte müssen auf z-Werte umgerechnet werden. Mit diesen Datenpunkten
wird anschließend ein Fitting der Basisfunktionen durchgeführt. Um genauer zu sein:
es werden die Parameter gefittet. Im Falle der Gauß-Funktion sind diese Mittelpunkt, Amplitude
und FWHM.
3.6.1. Levenberg-Marquardt-Algorithmus
Für das Fitting der Basisfunktionen auf die Datenpunkte gibt es eine große Zahl an Algorithmen.
Jedoch kommen nicht alle davon in Frage. Es gibt zwei Klassen an Fitting-Algorithmen:
lineare und nichtlineare. Die erste Klasse scheidet für das hiesige Problem aus, weil es nicht
linear ist. Folglich muss ein Algorithmus der nichtlinearen Fitting Klasse verwendet werden.
Zunächst wurde die „Downhill Simplex“-Methode für Multidimensionen, entwickelt von
Nelder und Mead, betrachtet. Diese wurde auch von [Dobo01] verwendet, welche mittels Entfaltung
der Hüllkurve Konformationsanalysen von Proteinen durchgeführt haben. In einigen
Tests mit einfachen Daten erwies sich dieser Algorithmus jedoch als ungeeignet, weil bei fast
allen Läufen der Algorithmus gar nicht konvergiert hat.
Als Alternative kam der Levenberg-Marquardt-Algorithmus in Frage, welcher als einer der
Standard-Algorithmen im Fitting-Bereich gilt. Dieser hat sich bei den ersten Versuchen mit
Testdaten als robuster entpuppt. Eine später vorgenommene Untersuchung mit synthetischen
Daten zeigt ebenfalls, dass man mit dem LM-Algorithmus gute Ergebnisse erzielt (vgl. Kap.
4). Deshalb fällt die Wahl für eine Fitting-Methode auf den LM-Algorithmus. Im Folgenden
wird die prinzipielle Idee des LM-Algorithmus erläutert. Wegen der Komplexität des Verfahrens
kann nicht auf alle Details eingegangen werden. Den interessierten Leser verweise ich auf
[Madsen04], welcher eine überaus detaillierte Beschreibung des LM-Algorithmus gibt.
Beim nichtlinearen Fitting und somit auch beim LM-Algorithmus wird eine Kostenfunktion
minimiert, welche folgende Form hat:
56

F
1
2
m
∑
i=
1
( x)
= ( f ( ) )
i x
2
Die zu optimierenden Parameter sind im Vektor x ( x x ,..., x )
1,
2
n
(3.6.1.1)
= abgelegt. Bei
n
f : ℜ a ℜ,
i = 1,...,
m ∧ m ≥ n handelt es sich um die Residuenfunktion. Sei das Fitting-
i
Modell M(x,t), dann ist fi(x)=yi-M(x,ti). Um die Darstellung zu vereinfachen, wird der Vektor
f(x)=(f1(x),f2(x),…,fm(x)) definiert und man erhält:
F
m 1 1 1 T
= ∑ i
2 i=
1 2 2
2
2
( x)
( f ( x)
) = f ( x)
= f ( x)
f ( x)
(3.6.1.2)
Es wird angenommen, dass die Kostenfunktion 2fach differenzierbar und glatt ist, so dass die
folgende Taylor-Approximation anwendbar ist:
F
T ' 1 T ''
3
( x h)
= F(
x)
+ h F ( x)
+ h F ( x)
h + O(
h )
+ (3.6.1.3)
2
Damit berechnet man die Kosten, wenn vom aktuellen Parametervektor x um h:=t-x „Schritte“
nach x+h gegangen wird. Die O-Notation am Ende der Gleichung, zeigt wo die Taylor-
Reihe abgeschnitten wurde. Hier betrifft dies alle Terme dritter Ordnung oder höher – diese
werden ignoriert, da sie nicht signifikant sind. Die erste Ableitung F ’ (x) entspricht dem Gradienten
g(x) und die zweite Ableitung F ’’ (x) der Hesse-Matrix H(x). Sei x * ein lokales Minimum,
dann gilt: g(x)=F ’ (x * )=0. Dies ist eine notwendige, aber nicht ausreichende Bedingung:
Die erste Ableitung ergibt auch für Sattelpunkte Null. Um eine ausreichende Bedingung zu
erhalten, muss zusätzlich gelten, dass die zweite Ableitung ungleich Null ist, d.h. H(x)=F ’’ (x * )
ist positiv definit. Falls H(x) negativ definit wäre, hätte man ein lokales Maximum gefunden.
Bei der nichtlinearen Optimierung wird iterativ vorgegangen. Mit jedem Schritt von xk nach
xk+1 wird F(xk) minimiert, d.h. F(xk)>F(xk+1). Optimalerweise hat man eine Methode, welche
abhängig vom aktuellen Gradienten kleine bzw. große Schritte h durchführt. Ist der Gradient
klein, sollten große Schritte gemacht werden, ist der Gradient hingegen groß, sind kleine
Schritte wünschenswert. Dies soll bewirken, dass man in einem kleinen Tal (schlechtes lokales
Minimum) nicht hängen bleibt und zum anderen, dass man ein gutes lokales Minimum
nicht übersieht. Wenn h klein ist, kann man f durch eine Taylor-Reihe approximieren:
2
f ( x + h)
= f ( x)
+ J ( x)
h + O(
h ) ≅ l(
h)
≡ f ( x)
+ J ( x)
h
(3.6.1.4)
J steht für die Jakobi-Matrix:
57

58
⎛ df1
⎜
⎜ dx1
J ( x)
= ⎜ ...
⎜ df m
⎜
dx
⎝ 1
...
...
...
df1
⎞
⎟
dxn
⎟
... ⎟
dfm
⎟
dx
⎟
n ⎠
Setzt man Gl. (3.6.1.4) in die Definition von (3.6.1.2) ein, so erhält man:
1 T
F(
x + h)
≅ L(
h)
≡ l(
h)
l(
h)
2
1 T
T T 1 T T
= f(x) f(x) + h J ( x)
f(x) + h J ( x)
J ( x)
h
2
2
T T 1 T T
= F(
x)
+ h J ( x)
f(x) + h J ( x)
J ( x)
h
2
(3.6.1.5)
(3.6.1.6)
Es ist derjenige Parameterschritt h gesucht, welcher L(h) minimiert: = argmin { L(
h)}
. Um
h zu finden, werden zunächst der Gradient und die Hesse-Matrix bestimmt:
'
g(
x)
= L ( h)
= J ( x)
''
H ( x)
= L ( h)
= J ( x)
T
f ( x)
+ J ( x)
T
J ( x)
T
J ( x)
h
h h
(3.6.1.7)
Man sieht, dass L ’’ (h) unabhängig von h ist. L ’’ (h) ist symmetrisch und wenn die Jacobi-
Matrix J vollen Rang hat, d.h. die Spalten von J sind linear unabhängig, dann ist F ’’ (h) positiv
definit. Der Schritt h, welcher die Kostenfunktion minimiert, kann gefunden werden, indem
T
T
L ' ( h)
= 0 ⇒ J ( x)
J ( x)
h = −J
( x)
f gelöst wird. Der LM-Algorithmus löst eine leichte
opt
T
T
Variation davon, nämlich: ( J ( x)
J ( x)
+ µ I ) h = −J
( x)
f . Der zusätzliche Parameter µ wird
opt
als „Dämpfungsfaktor“ verwendet. Ist µ>0, so ist die Koeffizienten-Matrix positiv definit und
somit zeigt hopt in eine absteigende Richtung. Für große Werte von µ wird ein kleiner Schritt
durchgeführt. Kleine µ Werte hingegen kommen am Ende der Optimierung zum Tragen, wenn
der gesuchte Parametervektor nahe am Optimum ist. Der Dämpfungsparameter wird bei jedem
Iterationsschritt angepasst, damit sichergestellt ist, dass die Kostenfunktion minimiert
wird. Ein weiterer Vorteil der Einführung dieses Parameters ist, dass Situationen in denen
J(x) T J(x) singulär wird, abgefangen werden. Sobald hopt bestimmt ist, wird der neue Parame-
tervektor x gesetzt: x : = x + αhopt
. Der Algorithmus ist in Abb. 3.6.1.1 zusammengefasst.

Beim Least-Squares-Fitting wird die Summe der Quadrate der Residuen minimiert. Dieser
Mechanismus funktioniert nicht bzw. nur unzureichend, wenn starke Ausreißer vorhanden
sind. Das Quadrat der Residuen führt in dem Bereich des Ausreißers dazu, dass die gefittete
Kurve sich weit vom Optimum entfernt. Ein anderer Problemfall ist gegeben, wenn die y-
Daten sich über mehrere Größenordnungen erstrecken. Hier kann das Quadrat der Residuen
der größten y-Daten die Residuen der kleineren y-Daten überragen mit dem Ergebnis, dass die
kleinen Werte nur schlecht oder gar nicht gefittet werden. Diese Punkte werden in den Kapiteln
3.6.3. und 3.6.4. behandelt.
Zunächst wird die Implementierung aus [NR] für den unbeschränkten LM-Algorithmus benutzt.
Dieser erweist sich jedoch als nicht robust genug. Beim Testen mit synthetischen Daten
kam es fast immer zur Bildung einer Singulärmatrix (bei der Gauss-Jordan-Elimination),
wenn die Startparameter ungünstig gewählt sind, d.h. die Fitting-Methode brach ab. Ein weiteres
Problem ist, dass die Implementierung nur sehr spartanisch ist, d.h. viele Entwicklungen,
welche seit der Veröffentlichung des urspr. Algorithmus 1963 bekannt sind, sind nicht in den
Code eingegangen. Somit eignet sich diese Variante nicht, um das hiesige Problem zu lösen.
Stattdessen wird auf den von Manolis Lourakis implementierten LM-Algorithmus gesetzt.
Dieser bietet neben der Beseitigung vorhin genannter Mängel auch die wichtige Option an,
Randbedingungen für die Parameter bzw. die Gleichungen zu setzen. Eine sehr wichtige Eigenschaft
im Hinblick auf die Optimierung des Fittings.
3.6.2. Güteparameter
Abb. 3.6.1.1: Skizze des LM-Algorithmus. Er
stoppt, wenn eine der folgenden Bedingungen
erfüllt ist:
• die maximale Zahl kmax an Iterationen
ist erreicht,
• die Ordnung von g ist kleiner ε1,
• die Änderung von hlm ist kleiner ε2.
Als Werte werden für ε 10 -15 gesetzt und für
kmax 3000.
Um die Güte eines Fittings zu bestimmen und somit verschiedene Fittings miteinander zu
vergleichen, bedarf es eines Maßes. Ein gebräuchliches Maß ist das Bestimmtheitsmaß:
59

60
2
R =1 −
SSE
SSM
(3.6.2.1)
SSE ist die Summe der quadratischen Fehler, d.h. die Summe der Residuen zum Quadrat.
SSM ist die Summe der Quadrate über das arithmetische Mittel (vgl. Abb. 3.6.2.1). Wenn R²
den Wert 1 einnimmt, dann ist der Fit perfekt. Je näher an Null der Wert kommt, desto
schlechter ist der Fit. In extremen Fällen kann der Wert sogar negativ werden, d.h. das Modell
beschreibt die Daten schlechter, als eine Linie durch das arithmetische Mittel. Seien beispielsweise
folgende Daten gegeben:
X Beobachtet Erwartet Residuen²
(Residuen über arithmethisches
Mittel)²
1 1,09 1,00 0,008 0,795
2 1,34 1,41 0,005 0,410
4 1,70 2,00 0,089 0,079
6 2,54 2,45 0,008 0,311
10 3,24 3,16 0,005 1,576
Summiert man die quadratischen Fehler, erhält man SSE=0,12. Das arithmetische Mittel beträgt
1,98. Damit erhält man SSM=3,17. Mit obiger Formel erhält man schließlich für das Bestimmtheitsmaß
R² einen Wert von 0,96. Dies ist ein sehr guter Wert.
Abb. 3.6.2.1: Links sind die Residuen für das gefittete Modell (rote Kurve) zu sehen (SSE). Rechts sind die Residuen
über das arithmetische Mittel der Punkte dargestellt (SSM).
Als weiteres Kriterium, um über die Güte eines Fits zu entscheiden, können die Vertrauens-
Intervalle der Parameter betrachtet werden. Je nach Anwendung kommen 90%-, 95%- oder
99%-Vertrauensintervalle in Frage. Das Intervall sagt aus, dass der gesuchte wahre Parameter
zu 90%, 95% bzw. 99% in dem angegebenen Intervall liegt. Am gebräuchlichsten ist das
95%-Vertrauensintervall, welches auch im Rahmen dieser Arbeit verwendet wird.
Die Vertrauensintervalle lassen sich direkt aus der Kovarianz-Korrelations-Matrix Cov der
Parameter berechnen, welche von den meisten Fitting-Algorithmen mit als Ergebnis zurück-

geliefert werden: Auf der Diagonale der Matrix befinden sich die Eigenkorrelationen jedes Parameters.
Zieht man von diesen Werten die Wurzel, so erhält man den Standardfehler SEi je-
des Parameters Parami, d.h. SE i = Covii
. Damit kann nun das Intervall berechnet werden:
[Motulsky]
CI = Param ± TI�V ( 0.
05,
DOF)
* SE
(3.6.2.2)
i
i
i
DOF steht für die Anzahl der Freiheitsgrade und berechnet sich aus der Differenz der Anzahl
Datenpunkte minus der Anzahl zu bestimmender Parameter. Die Funktion TINV berechnet
den T-Wert der Student-Verteilung als eine Funktion der Wahrscheinlichkeit und des Freiheitsgrads.
Betrachtet man den R² Wert zusammen mit den Vertrauensintervallen der Parameter, kann
nun eine sehr gute Aussage über die Qualität des Ergebnisses gemacht werden. Der R² Wert
allein sagt zwar aus, wie gut die gefittete Kurve sich den Punkten nähert, jedoch kann man allein
daraus nicht herauslesen, ob die gefundenen Parameter die einzige richtige Lösung darstellen
oder nicht. Anhand der Vertrauensintervalle lässt sich jedoch diese Frage beantworten.
Sind nämlich die Intervalle CIi eng, so spiegelt dies einen sehr guten Fit wieder, sind sie breit,
so kann man davon ausgehen, dass man eine von vielen möglichen Lösungen gefunden hat,
d.h. je kleiner die Intervalle, desto besser sind die Parameter durch die Datenpunkte definiert.
3.6.3. Optimierung des Fittings
Bei den im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Spektren ist häufig der Fall, dass die y-Werte –
die Intensitäten – sich über mehrere Größenordnungen erstrecken. Zum Beispiel kommt es oft
vor, dass eine Masse sich über einen Bereich von etwa 500 „Counts“ erstreckt, eine andere
über etwa 2000 „Counts“ und wieder eine andere kann sich über bis zu 20.000 „Counts“ erstrecken.
Solche Fälle entstehen beispielsweise bei der Messung reduzierter Antikörper.
Die Variation bei den Antikörpern ist i.d.R. nur auf der schweren Kette vorhanden. Die leichte
Kette hingegen ist bei allen Spezies identisch. Folglich kommt es bei den Peaks der leichten
Ketten zu sehr hohen „Counts“, da die leichten Ketten aller in der Probe befindlichen Antikörper
zusammen zur Signalstärke beitragen. Dies hat zwei negative Folgen: Die erste ist,
dass ein Fitting über einen so großen Raum mit mehr Rechenzeit verbunden ist. Folglich ist
eine befriedigende Konvergenz oft noch nicht abgeschlossen, wenn die maximale Anzahl an
Iterationen erreicht ist. Die zweite betrifft die Vergleichbarkeit verschiedener Hüllkurven.
Dies ist relevant, sofern Ergebnisse verschiedener Experimente verglichen werden sollen.
61

Um diese Probleme zu umgehen, werden die Daten auf der y-Skala linear transformiert: Sie
werden auf einen Bereich von 0% bis 100% normalisiert. Diese Art der Normalisierung beeinflusst
nicht das Fitting-Ergebnis. Eine nichtlineare Transformation hingegen verändert die
relativen Positionen der Datenpunkte. Beim Fitten äußert sich das dadurch, dass eine andere
Funktion gefunden wird, welche χ² minimiert (vgl. Abb. 3.6.3.1). Es werden also andere Parameter
gefunden. [Motulsky]
Als weitere Verbesserungsmaßnahme, werden für jeden Parameter Schranken gesetzt, d.h. es
werden nur sinnvolle Parameterbereiche zugelassen. Dies hat zur Folge, dass der Suchraum
und somit die notwendige Rechenzeit weiter verkleinert wird. Für die Glykoproteine haben
sich folgende Schranken als sinnvoll erwiesen:
62
Abb. 3.6.3.1: Effekt einer nicht-linearen Transformation. In beiden Bildern ist die Hüllkurve eines Antikörpers mit einer
Masse von ca. 50kD dargestellt (schwarze Linie). Links auf der z-Skala und rechts auf der m/z-Skala
(m/z=(m+1.008z)/z). Rechts ist die Variante, wie man sie im Spektrum sehen würde. In beiden Fällen wurde ein LM-
Fitting (rote Kurve) mit zwei Gauß-Funktionen (grau gestrichelte Kurven) durchgeführt. Auf der z-Skala hat der Fit
perfekt geklappt und man erhält für die Hüllkurve I(z)=GAUSS(z,696,39,12.5)+GAUSS(z,1840,55,16.5). Auf der m/z-
Skala hingegen gelingt das Fitting überhaupt nicht.
• die Amplitude muss in einem Bereich zwischen 1 und 130 liegen,
• der Mittelpunkt muss zwischen 5 und 95 liegen,
• und die Halbwertsbreite muss in dem Bereich zwischen 2 und 17 liegen.
Ein weiterer Faktor, der optimiert werden kann, betrifft die Initialisierung der Startparameter.
Es ist empfehlenswert, diese nicht einfach auf den Wert 1 zu setzen. Ebenso sollten sie nicht
auf einen anderen konstanten Wert gesetzt werden. Vielmehr sollte der Wert abhängig vom
aktuellen Umfeld, dynamisch gewählt werden. Speziell für Glykoproteine werden die Startparameter
wie folgt festgelegt: Die Amplitude wird auf einen 15% der maximalen Intensität gesetzt.
Die Zentren der Basisfunktionen werden in gleichmäßigen Abständen auf der z-Skala
verteilt. Für die Halbwertsbreite wird ein Wert von 4 vergeben.
Wenn die zu fittende Funktion mehrere Minima hat, kann man nicht mit Sicherheit sagen,
dass man das globale Minimum findet. Das gefundene Minimum hängt von den gewählten
Startparametern ab. Als Lösung für dieses Problem werden fünf verschiedene Fittings mit jeweils
maximal 5000 Iterationen durchgeführt. Nach jedem Fit-Lauf werden die Startparameter
zufällig verändert. Am Ende werden diejenigen Parameter gewählt, welche den besten R²

Wert ergeben haben. Die Ausführung mehrerer Fit-Läufe mit unterschiedlichen Startparametern
soll gewährleisten, dass man nicht fälschlicherweise in einem lokalen Minimum hängen
bleibt.
Beim Betrachten komplexer Spektren kann häufig das Problem auftreten, dass weniger Datenpunkte
als Parameter vorhanden sind. In diesem Fall ist ein Fitting nicht durchführbar. Mit
komplexen Spektren, sind solche Spektren gemeint, in denen viele Varianten einer Masse
vorkommen, welche sich nur durch geringe Massendifferenzen unterscheiden. Ebenso sind
Kombinationen, bei denen Massen von ungefähr halber Größe vorkommen, ungünstig, wie es
z.B. bei reduzierten Antikörpern der Fall sein kann (leichte Kette ca. 25kD und schwere Kette
ca. 50kD). Die Peaks dieser beschriebenen Fälle liegen im Spektrum entsprechend dicht beieinander
und überlagern häufig gegenseitig. Dies führt dazu, dass wenige freie Peaks und somit
wenige Punkte für das Fitting zu Verfügung stehen.
Um diesem Problem gerecht zu werden, kann man folgende Annahme machen: Die Varianten
einer Masse bzw. eines Glykoproteins haben eine sehr ähnliche Hüllkurve. Folglich kann man
einen einmal bestimmten Satz an Parametern der Modellfunktion für die anderen Molekülvarianten
wieder verwenden. Hierzu definiert man sich eine Masse als Hauptkomponente, welche
für die anderen Varianten als Grundlage dienen soll. Das stellt kein Problem dar, da häufig
eine Masse im Spektrum derart gut repräsentiert ist, dass deren Hüllkurve ohne weiteres
gefittet werden kann.
Eine alternative Lösung dazu ist es, zuerst die Hüllkurven derjenigen Massen zu bestimmen,
welche über ausreichend freie Punkte verfügen. Anschließend kann die so gewonnen Informationen
dazu genutzt werden, um sukzessive die Intensität überlappender Peaks zu bestimmen.
Der Nachteil bei letzterem Verfahren ist, dass mit jedem Schritt ein gewisser Prozentsatz an
Fehlern mit einfließt. Am Ende kann es dann passieren, dass die Peaks der letzten Massen nur
sehr ungenau sind, so dass ein Fitting nicht das wahre Ergebnis liefert.
3.6.4. Ausreißer
Nach Optimierung des Fitting-Verfahrens sind beim Betrachten biologischer Daten Unregelmäßigkeiten
in der Hüllkurve mancher Antikörpervarianten bzw. Massen aufgefallen. In Abb.
3.6.4.1 sind die nicht überlappenden Peaks der Masse M1=48454,71D eines Antikörpers abgebildet.
Ein Fitting der Hüllkurve ist hier nicht möglich, weil die Intensität in jedem zweiten
Ladungszustand einen Ausschlag nach oben macht. Zunächst war nicht klar, woher dieses
Verhalten herrührt. Folgende zwei Vermutungen lagen nahe: a) Es besteht ein Fehler im Programmcode
b) eine nicht qualitativ erfasste Masse befindet sich im Spektrum.
63

Möglichkeit a) konnte nach einem Blick auf das Spektrum ausgeschlossen werden, da hier
deutlich zu sehen ist, dass die Intensität tatsächlich von einem Ladungszustand zum nächsten
stark variiert. Außerdem sind bei allen m/z-Werten keine Überlagerungen mit bekannten Massen
vorhanden. Diese Fakten deuten darauf hin, dass eine qualitativ nicht erfasste Masse im
Spektrum vorhanden ist, welche an jeder zweiten Stelle mit der hier untersuchten Spezies der
Masse M1 überlagert. Um diese Theorie zu bestätigen, muss zunächst die Masse der unbekannten
Spezies ermittelt werden. Hierzu werden zwei beliebige nacheinander folgende Peaks
(m/z)1 und (m/z)2 an den überlappenden Stellen betrachtet:
64
⎛ m ⎞
⎜ ⎟
⎝ z ⎠
1
⎛ m ⎞
⎜ ⎟
⎝ z ⎠
2
m + nm
=
n
m + ( n + 1)
m
=
n + 1
⎢ ⎛ m ⎞
⎢ ⎜ ⎟ − m +
H
⎢ ⎝ z ⎠2
⇒ n =
⎢⎛
m ⎞ ⎛ m ⎞
⎢⎜
⎟ − ⎜ ⎟
⎣⎝
z ⎠1
⎝ z ⎠
⎛⎛
m ⎞
⇒ M = n ⎜
⎜⎜
⎟ − m
⎝⎝
z ⎠1
H
+
H
2
H
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎦
+
+
⎞
⎟
⎠
Abb. 3.6.4.1: Die nicht überlappenden Peaks der
Serie sind durch Kreuze repräsentiert. Die durchgezogene
Kurve ist das Ergebnis eines Fittings mit
zwei Basisfunktionen auf den gegebenen Punkten.
(3.6.4.1)
Für die Berechnung der Masse werden die Peaks bei (m/z)1=1010,45 und (m/z)2=1054,43
verwendet. Dies ergibt eine Masse von M2=24228,71D, was auf eine Variante der leichten
Kette hindeutet. Die Serie von M2 fällt exakt mit jedem zweiten Peak der Serie von M1 zusammen.
Nun muss die unbekannte Masse nicht zwangsweise exakt auf M2 fallen. Eine kleine
Abweichung davon würde immer noch zu einer Überlappung der Peaks im Spektrum führen.
Die berechnete Masse M2 ist vielmehr ein Hinweis auf den Massenbereich, welcher betrachtet
werden muss, um die tatsächliche Variante / Masse zu entdecken. Die leichte Kette des hier
betrachteten Antikörpers besitzt eine Masse von MLK=24200,21D. Betrachtet man die mögli-

chen Modifikationen, so sieht man, dass nur Addukt-Signale in Frage kommen. Wie sich herausstellt,
ist die gesuchte Masse, welche mit M1 im Spektrum überlappt, M3=24222,21D, eine
Na-Addukt Variante von MLK. Im Spektrum wurde sie wahrscheinlich übersehen, weil es
für jeden z-Wert in die Peaks von M1 reinfällt. Nachdem diese Addukt-Variante erfasst und im
Programm eingetragen wird, verschwindet jeder zweite Punkt und ein Fitting der Hüllkurve
ist möglich (vgl. Abb. 3.6.4.2).
Abb. 3.6.4.2:
Links: Gefittete Hüllkurve der Masse 48454,71D nach
Erkennung der Ausreißer.
Unten: Ausschnitt aus dem Spektrum von CD22. Die
grüne Peakserie entspricht einer Varianten der schweren
Kette mit einer Masse von 48454,71D. Die blaue
Peakserie entspricht dem Na-Addukt der leichten Kette
und hat eine Masse von 24222,21D. Man sieht wie
in jedem zweiten Signal die beiden Massen überlagern.
Nicht immer sind die Fälle so extrem wie der hier vorgestellte. Es kann durchaus vorkommen,
dass es nur ein oder zwei Ausreißer gibt. Ebenso kann es sein, dass die Intensitätsunterschiede
nicht so stark sind wie die hier gezeigten. Dies ist z.B. der Fall, wenn Addukt-Varianten der
schweren Kette verantwortlich sind. Diese haben ja eine geringere Intensität im Spektrum und
fallen dementsprechend nicht so stark auf bei Überlappungen.
Da solche Addukt-Signale immer wieder vorkommen und nicht immer annotiert werden, ist
eine Methode wünschenswert, welche automatisch erkennt, ob es sich bei den Punkten um
Ausreißer handelt oder nicht:
Von allen Massen werden die Addukt-Varianten simuliert. Da es bis zu einer n-fachen Anlagerung
von Na + oder K + Ionen an ein Molekül kommen kann, wird die Zahl auf maximal zwei
65

Ionisierungen beschränkt. Dies kann ohne Bedenken gemacht werden, weil mit zunehmender
Zahl an Addukten die Wahrscheinlichkeit sinkt, dass sich solche bilden. Dementsprechend gering
fällt die Intensität im Spektrum aus, d.h. meistens werden deren Signale im Spektrum
eher untergehen. Im nächsten Schritt wird überprüft, ob die simulierten Addukt-Varianten mit
den Peaks der Masse, dessen Hüllkurve bestimmt wird, überlagern. Falls diese überlagern,
werden sie als Ausreißer markiert. Diese Variante hat sich als zu sensitiv herausgestellt. So ist
die Zahl falsch positiver unverhältnismäßig groß.
Für den zweiten Versuch die Ausreißer zu erkennen, wurde ein komplett anderer Weg eingeschlagen.
Hierbei wird die Steigung als Kriterium verwendet. Die Idee ist folgende: Zunächst
wird die y-Streuung der Punkte ermittelt und gespeichert. Als nächstes wird jeder Punkt der
Hüllkurve betrachtet. Falls die Kurve links vom aktuell betrachteten Punkt steigt und rechts
vom Punkt sinkt, und die Steigung einen von der Streuung abhängigen Schwellenwert überschreitet,
wird der Punkt als Ausreißer markiert. Diese Variante hat sich im Vergleich zu erstgenannten
als robuster erwiesen. Die Sensitivität kann anhand des Schwellenwerts erhöht
oder verringert werden. Ein Nachteil hierbei ist, dass kein universeller Schwellenwert gesetzt
werden kann. Für manche Spektren ist ein geringer Wert besser als ein hoher und bei anderen
ist dieser Sachverhalt gerade umgekehrt.
Die dritte Möglichkeit, welche ausprobiert wurde beruht auf der Annahme, dass die niedrigeren
Punkte keine Ausreißer sind und die höheren Punkte eher Ausreißer darstellen können.
D.h. wenn eine Verfälschung auftritt, dann durch Überlappung mit anderen Massen, was eine
Steigerung der Signalintensität an entsprechender Stelle bewirkt. Zur Ausreißer-Erkennung
wird wie folgt vorgegangen: Es wird eine Savitzky-Golay-Glättung der Datenpunkte durchgeführt
mit einem Polynom 2ten Grades und 5 Datenpunkten als Fenstergröße. Man erhält dadurch
eine Kurve, welche die Tendenz der Punkte aufzeigt. Alle Punkte die oberhalb der geglätteten
Kurve liegen werden als Ausreißer markiert. In der Praxis hat sich diese Methode als
die beste erwiesen und wird deshalb als automatische Erkennungsmethode in MF II angeboten.
Neben den automatischen Erkennungsmechanismen, wird auch die Möglichkeit geboten, manuell
Ausreißer zu bestimmen.
66

4. Technische Umsetzung
In diesem Kapitel wird die Entwicklungsumgebung kurz vorgestellt, wobei teilweise auch auf
Implementierungsdetails eingegangen wird. Eine Beschreibung der Programmoberfläche von
Massfinder II lässt sich in Anhang C finden.
Massfinder I, welches für die qualitative Analyse entwickelt wurde, ist komplett in der Skriptsprache
Tcl/Tk geschrieben [ELehmann05]. Die Gründe hierfür lagen an den Möglichkeiten,
schnell und einfach ein Programm zu entwickeln und zum anderen an der Tatsache, dass
Tcl/Tk auf allen wichtigen Plattformen wie etwa Mac, Linux oder MS Windows eingesetzt
werden kann.
Eine der Hauptanforderungen war es, das existierende Programm durch Methoden für eine
Quantifizierung zu erweitern. Eine komplette Neuentwicklung war also nicht erwünscht und
somit stand die Vorgabe fest, Tcl/Tk als Programmiersprache zu verwenden.
Abb. 4.1: Multi-Layer-Architektur von
Massfinder II.
Der Aufbau von Massfinder II entspricht einer Multi-Schicht-Architektur (vgl. Abb. 4.1). Das
Programm gliedert sich in eine Präsentationsschicht, eine Logikschicht und eine Persistenzschicht.
In der Präsentationsschicht sind die Dialogdarstellung sowie die Dialogsteuerung eingebaut.
Als Programmiersprache wird hierfür eine objektorientierte Variante von Tcl/Tk verwendet,
nämlich incr Tcl (http://incrtcl.sourceforge.net/itcl/). Die Logikschicht ist in ANSI-C
geschrieben und implementiert die Geschäftsprozesse sowie damit verbundenen Funktionen.
Schließlich gibt es noch die Persistenzschicht, welche die Datenhaltung regelt und ebenfalls in
ANSI-C programmiert ist. Als Dateiformat für die Daten wird der XML (Extended Markup
Language) Standard verwendet.
Damit man von Tcl aus auf ANSI-C Prozeduren zugreifen kann, wird eine Tcl Erweiterungs-
Bibliothek (DLL) erzeugt, welche die notwendigen Funktionen enthält. Zentraler Punkt in der
67

DLL ist die Methode DLLEXPORT int Masslib_Init (Tcl_Interp *interp) {…}, weil
hier alle für incr Tcl zur Verfügung stehenden Kommandos registriert werden. An dieser Stelle
wird also das Interface für die Verbindung zwischen der Präsentationsschicht und der Logikschicht
definiert. Angenommen, man will eine ANSI-C Methode namens int
advps_isotopedistr(ClientData data, Tcl_Interp *interp, int objc, Tcl_Obj
*CONST objv[]) {…} im Interface bekannt geben, so dass die Methode in incr Tcl unter dem
Namen isotope_distribution(…) zur Verfügung steht. Die Registrierung dieses Kommandos
würde wie folgt durchgeführt werden:
68
Itcl_RegisterObjC (interp, "isotope_distribution",
advps_isotopedistr, (ClientData)NULL,
(Tcl_CmdDeleteProc *)NULL);
Die Gründe für die logische Trennung des Codes in mehrere Schichten sind vielfältig. Zum
einen spielen Faktoren wie Wiederverwendbarkeit, Flexibilität sowie Wartbarkeit eine Rolle
und zum anderen die Performanz des Programms. Die Performanz ist deshalb von Bedeutung,
weil Tcl nicht für intensive Rechenoperationen, wie sie hier durchgeführt werden müssen, geeignet
ist (vgl. Konzepte aus 3. Kapitel). Deshalb wird die GUI mit Tcl/Tk umgesetzt, während
die Logik in ANSI-C abgehandelt wird.
Der C-Code wird im Falle von MS Windows in eine DLL gekapselt, welche von Tcl/Tk aus
angesprochen wird. Für eine evt. gewünschte Portierung auf andere Plattformen kann der
ANSI-C- und Tcl/Tk-Code bis auf kleine Änderungen komplett wieder verwendet werden.
Für die Darstellung der Spektren wird die freie Bibliothek PLplot
(http://plplot.sourceforge.net/) verwendet. Diese bietet entsprechende Erweiterungen an, so
dass sie von Tcl aus benutzt werden kann.
Während der Entwicklung traten die meisten Fehler auf Ebene der Präsentationsschicht auf.
Dies liegt an der Art der Skriptsprache Tcl, welche nicht typisiert ist. Syntaxfehler treten deswegen
erst zur Laufzeit des Programms auf. Bei ANSI-C beschränkten sich die meisten Probleme
auf Speicherzugriffsfehler, die jedoch selten waren und schnell behoben werden konnten.
Als Entwicklungswerkzeuge für die Programmierung wurden die OpenSource-Produkte Dev-
C++ (http://www.bloodshed.net/devcpp.html) sowie Ased (http://www.tcl-home.de/ased) für
Tcl/Tk verwendet.
Im Folgenden wird erläutert welche Programmteile selber entwickelt wurden, welche von
Drittanbietern stammen und wo die entsprechenden Bausteine in der Architektur (vgl. Abb.
4.1) eingebaut wurden.

Die Methoden für die Berechnung der Isotopenverteilung eines Moleküls wurden alle selber
entwickelt. Der Code ist in der Logik-Schicht angesiedelt und somit in ANSI-C programmiert.
Die für die Berechnung notwendigen Funktionen entsprechen zum Großteil den Methoden aus
Abb. 3.4.1. Dazu gehören Methoden welche die Isotopenkombinationen berechnen, deren relative
Häufigkeit bestimmen, die Einzelverteilungen zusammenfassen, den Massendefekt korrigieren
und die Häufigkeiten skalieren. Zusätzlich wurden Methoden implementiert, welche
die von der Geräteauflösung abhängige Peakverbreiterung berechnen.
Ebenso in der Logikschicht eingebaut sind die Routinen des Savitzky-Golay-Filters, welche
aus [NR] stammen. Einzig die Funktion für das Anwenden der Savitzky-Golay-Koeffizienten
(vgl. Gl. (3.2.1)) musste selber programmiert werden. Um den Filter ohne Signalverfälschende
Wirkung anwenden zu können, bedarf es wie bereits in Kap. 3.2. erwähnt äquidistanter Datenpunkte.
ESI-MS-Spektren erfüllen diese Eigenschaft nicht und es muss folglich interpoliert
werden. Der Code für die lineare Interpolation der Daten ist eine Eigenentwicklung.
Bei den Routinen für die Elimination der Basislinie handelt es sich bis auf die kubische Spline
Interpolation und den Savitzky-Golay-Filter für die 4. Ableitung welche beide aus [NR]
stammen um Eigenentwicklungen.
Die Bibliothek für den LM-Algorithmus, welche für das Fitting der Hüllkurven verwendet
wird, stammt von [Lourakis05]. Diese ist im Gegensatz zur [NR] Implementierung wesentlich
robuster. Die Methode welche den LM-Algorithmus aufruft und dabei versucht die Startparameter
möglichst geschickt zu wählen wurde selber programmiert. Ebenso wurden die Methoden
für die Erkennung der Ausreißer selber programmiert.
Die Funktionen für die Peakauswahl, d.h. Erkennung überlappender Peaks sowie die Berechnung
der Quantitäten sind ebenfalls selber geschrieben und zwar in ANSI-C.
Neben den hier erwähnten Aspekten wurden eine Reihe weiterer Hilfsfunktionen implementiert,
welche in der Logikschicht immer wieder zur Anwendung kommen. Beispielhaft seien
zwei Methoden erwähnt: Die eine formatiert Tcl-Konforme Fehlermeldung und die andere
dient zum Verfolgen von Nachrichten im Debug-Modus.
Auf Ebene der Präsentationsschicht wurde die Seite „Envelope Modelling“ eigens für das Fitting
der Hüllkurven entwickelt und zum vorhandenen Programm hinzugefügt (vgl. Anhang
C). Daneben wurden noch diverse Anpassungen an verschiedenen Stellen im Code vorgenommen.
So mussten entsprechende Menüpunkte gesetzt werden und kleinere Dialogboxen
erstellt werden, um die oben beschriebenen Funktion aufrufen zu können. Außerdem mussten
existierende iTcl Klassen um verschiedene Attribute erweitert werden damit die Datenhaltung
gewährleistet ist. Die bestehenden Methoden für das Berechnen von Peakserien wurden aus
dem Tcl Code ausgelagert und in ANSI-C geschrieben, da sie erstens dadurch schneller von
69

statten gehen und zweitens nicht in der Präsentationsschicht gehören. Während dem kompletten
Entwicklungszeitraum wurden darüber hinaus Fehler aus dem bestehenden Code beseitigt,
sofern welche gefunden wurden.
Neben den Entwicklungen, welche das Programm Massfinder II betreffen wurden zusätzlich
einige Werkzeuge in ANSI-C geschrieben. Deren Aufgabe ist im Wesentlichen die Generierung
synthetischer Daten. Diese wurden für die Validierung verwendet (vgl. folgendes Kapitel).
70

5. Validierung
An dieser Stelle wird eine Validierung der entwickelten Methoden anhand von Monte-Carlo-
Simulationen durchgeführt.
Die Güte der Algorithmen bzw. das gesamte Verfahren kann anhand empirischer Daten nur
bedingt überprüft werden, da hier die wahren Quantitäten unbekannt sind. Ein Vergleich mit
anderen Quantifizierungsmethoden gibt zwar Aufschluss darüber, ob man sich im richtigen
Bereich bewegt, jedoch kann es auch bei diesen Methoden zu Abweichungen vom tatsächlichen
Wert kommen. Deswegen müssen die Referenzmethoden kritisch betrachtet werden. Um
eine korrekte Aussage über die Güte der hier entwickelten Methoden zu treffen, werden deshalb
Simulationen durchgeführt: Synthetische Daten werden mit den entwickelten Konzepten
analysiert, um die Verfahren zu validieren.
Es werden zwei Aspekte des Programms validiert. Zum einen findet eine separate Bewertung
des letzten Teils des Arbeitsablaufs statt, nämlich des Fittings der Hüllkurve. Und zum anderen
wird die Quantifizierung, im gesamten Prozessablauf betrachtet, validiert.
5.1. Validierung des Hüllkurven-Fittings
Die Bewertung des letzten Bausteins – die Bestimmung der Hüllkurve – wird mittels der
Monte-Carlo-Simulation durchgeführt. Bei einer Monte-Carlo-Simulation werden mehrere
Szenarien eines Modells erzeugt, um anschließend einen – wie auch immer gearteten – Test
auf den generierten Szenarien durchzuführen. Die bei dem Test erhaltenen Variablen werden
in einem Histogramm aufgetragen, auf dem man sehen kann, welcher Verteilung diese folgen,
und wie groß die Streuung der Variablen ist. Dadurch kann geschätzt werden, in welchem
Rahmen sich die Qualität des Verfahrens bewegt.
Die Simulationen sollen aufzeigen, wie stabil das Konzept ist, deswegen werden die generierten
Hüllkurven mit viel Rauschen versehen. Zusätzlich werden nur wenige, schlecht verteilte
Punkte aus der Hüllkurve für das Fitting herangezogen. Sehr schwierige Voraussetzungen also,
um die richtigen Parameter zu bestimmen.
Als Referenzmodell wird die Hüllkurve einer schweren Kette eines Antikörpers verwendet
(vgl. Abb. 5.1.1 und Kap. 3.6). Ausgehend von diesem Modell werden insgesamt 500 Szenarien
erzeugt. Bei jedem Szenario werden die y-Ordinaten des Basismodells mit einem 10%igen
Gauß-Rauschen versehen. Dies soll, durch Überlappung mit z.B. Addukt-Signalen, verzerrte
Intensitäten simulieren. Im nächsten Schritt werden zufällig 20 Punkte aus der generier-
71

ten Hüllkurve gezogen. Basierend auf diesen 20 Punkten wird schließlich ein Fitting durchgeführt,
bei dem versucht wird die Hüllkurve zu rekonstruieren.
Für alle so erzeugten und gefitteten Szenarien / Hüllkurven werden die einzelnen Parameter in
einem Histogramm aufgetragen, um deren Verteilung zu sehen. Die Ergebnisse der Monte-
Carlo-Simulation sind in Abb. 5.1.2 zusammengefasst. Für alle drei Basisfunktionen sind die
Histogramme (die Werte, welche aus dem Fitting resultieren) der Parameter Mittelpunkt und
Sigma (Breite) aufgetragen. Beim Blick auf die Resultate fällt auf, dass die Streuung der Parameter
Mittelpunkt und Sigma bei den letzten beiden Basisfunktionen am größten ist. Ein
Grund hierfür kann sein, dass diese beiden stark überlappen müssen, um die resultierende
Hüllkurve zu erzeugen (vgl. Abb. 5.1.1). B1 ist durch die Hüllkurve verhältnismäßig gut charakterisiert.
B2 und B3 hingegen sind nicht eindeutig durch die Hüllkurve determiniert, d.h.
die Position und die Amplitude beider Basisfunktionen können variiert werden und man erhält
immer noch ein gutes Fitting Resultat (R² nahe 1). Konkret wird im Beispiel B3 beim Fitting
einerseits von B1 und andererseits von B2 beeinflusst. Dadurch kommt es zu größeren Abweichungen
der Parameter von den tatsächlichen Werten.
Beim Betrachten der großen Parametervarianzen darf man nicht vergessen, dass die Simulationen
schwierig ausgelegt sind – sie sollen die Grenzen aufzeigen. So beträgt bei den analytischen
Daten das Rauschen i.d.R. unter 10% und die Punkte, auf denen ein Fitting durchgeführt
wird, sind meistens äquidistant, was gewährleistet, dass über den gesamten Datenbereich
ein gutes Fitting durchführbar ist. Bei den Simulationen hingegen wurden die Punkte zufällig
gezogen. Es kann also durchaus passieren, dass ein Bereich der Hüllkurve überaus gut charakterisiert
ist und ein anderer sehr schlecht. Dies erklärt, warum die Parameterabweichung vom
tatsächlichen Wert stellenweise so groß ist (s. Abb. 5.1.2 B3).
Neben den Parametern der Basisfunktionen ist auch die Betrachtung der Fläche (hier: Summe
von I(z) über alle Ladungszustände z), welche die Hüllkurve beschreibt, von Interesse.
Schließlich spiegelt sich die Fläche der Hüllkurve direkt im Quantifizierungsergebnis wider.
Um diese Eigenschaft zu charakterisieren werden zwei weitere Testreihen gestartet, wobei jede
1000 Szenarien enthält. Die Anzahl Szenarien wurde verdoppelt, um eine bessere Ge-
72
Abb. 5.1.1: Dargestellt ist die Hüllkurve
einer schweren Kette eines Antikörpers.
Folgende Verteilung wird für das
Erzeugen der Hüllkurve verwendet:
I(z)=B1+B2+B3
B1=GAUSS(1647,39,4.7)
B2=GAUSS(1698,60,4.2)
B3=GAUSS(2855,52,5.4)

nauigkeit für die zu erwartende Standardabweichung zu bekommen. Bei beiden Testreihen
sind die Bedingungen für das Erzeugen der Datenpunkte identisch zu den vorhin durchgeführten
Simulationen. Nur bei der zweiten Testreihe gibt es einen Unterschied: Die Punkte sind
nicht zufällig aus der generierten Hüllkurve gewählt sondern äquidistant, was der Normalfall
bei biologischen Daten ist.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
60
50
40
30
20
10
B1 - Parameter: Center - StdErr: 8,25
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
B2 - Parameter: Center - StdErr: 9,99
0
34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84
80
70
60
50
40
30
20
10
B3 - Parameter: Center - StdErr: 20,10
c
0
2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 82 86 90 94 98
B1 - Parameter: Sigma - StdErr: 4,91
Abb. 5.1.2: Ergebnis einer Monte-Carlo-Simulation mit 500 Tests. Es sind die Histogramme der Parameter Mittelwert
und Breite / Sigma einer jeden Basisfunktion abgebildet. Für jeden Parameter ist zusätzlich die Standardabweichung
vom Erwartungswert angegeben.
Die Variation der Fläche beider Testreihen ist in Abb. 5.1.3 zusammengefasst. Die erste Testreihe
ergibt eine Standardabweichung der Fläche von 25,8%. Zum Vergleich dazu erhält man
eine Standardabweichung von nur 2,52% wenn die Punkte äquidistant sind. Sind die Datenpunkte
äquidistant, stört das 10%-ige Rauschen sowie die geringe Zahl an Datenpunkten
kaum, was sich in der geringen Standardabweichung der Fläche von nur 2,52% äußert. Dies
lässt den Schluss zu, dass eine Quantifizierung auf ähnlichen biologischen Daten gut gelingt.
Einzig im niederprozentualen Bereich, d.h. bei Massen, die mit nur ca. 5% Anteil im Spekt-
140
120
100
80
60
40
20
0
120
100
80
60
40
20
0
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
B2 - Parameter: Sigma - StdErr: 5,50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
B3 - Parameter: Sigma - StdErr: 5,56
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
73

um vertreten sind, muss man Abstriche in der Qualität machen. Eine exakte Aussage für solche
Massen ist bei einer Standardabweichung von 2,52% nur noch schwer zu treffen.
Als Resultat kann man sagen, dass bei sehr schlechten Daten eine automatische Quantifizierung
für stark ausgeprägte Spezies noch durchführbar ist, wohingegen bei schwach repräsentierten
Spezies eine Aussage bei so großen Standardabweichungen eher einem Lotto-Spiel
gleicht. Die Qualität des Ergebnisses kann aber sicherlich durch den Eingriff eines erfahrenen
Anwenders (visuelle Kontrolle, Setzen der Startparameter) bei schwierigen Fällen gesteigert
werden.
5.2. Validierung der Quantifizierungspipeline
Damit die komplette Quantifizierungspipeline validiert werden kann, muss die Simulation an
der Wurzel ansetzen, nämlich am Anfang des Quantifizierungsprozesses. Um das zu ermöglichen,
werden synthetische Spektren erzeugt. Bei den künstlich erzeugten Spektren sind die
Verhältnisse der zur Synthese verwendeten Massen bekannt. Somit kann bei einer Analyse der
Spektren mit Massfinder II oder anderen Methoden überprüft werden, ob die korrekten Massenverhältnisse
gefunden werden.
Die synthetischen Spektren sind an echte Messungen reduzierter Antikörper angelehnt, d.h.
die verwendeten Massen entsprechen echten Glykosylierungsformen, die Hüllkurve und das
Signal-zu-Rausch-Verhältnis sind ähnlich gewählt. Einzig die Adduktanzahl wurde erhöht,
um die Quantifizierung zu erschweren. Auf die Erzeugung einer gerätespezifischen Basislinie
74
45
40
35
30
25
20
15
10
5
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Are a-Unde r-Curv e - StdErr: 25,8%
0
0 9 18 27 36 45 54 63 72 81 90 99 108 117 126 135 144 153 162 171 180 189 198
Area-Unde-Curve - StdErr: 2,52%
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110
Abb. 5.1.3: Histogramm der Fläche der gefundenen
Hüllkurven. Der Wert 100 entspricht der tatsächlichen
Fläche. Ist die Zahl größer 100, so beschreibt
die gefundene Hüllkurve eine größere Fläche als die
Tatsächliche. Entsprechend umgekehrt verhält es
sich, wenn die Zahl kleiner 100 ist. Oben ist die MC
Simulation für den Grenzfall dargestellt, bei dir die
Standardabweichung 26% beträgt und unten ist der
Normalfall gegeben, bei dem ausreichend viele
Punkte zum Fitten vorhanden sind. Hier beträgt die
Standardabweichung nur noch 2,52%.

wird verzichtet, weil auch ohne sie ein Vergleich der Quantifizierungsmethoden durchführbar
ist, d.h. falls eine Basislinie in den synthetischen Spektren vorhanden ist, so stammt diese allein
von den Addukten der zur Synthese verwendeten Massen sowie vom hinzugefügten
Grundrauschen.
Um ein künstliches Spektrum zu erzeugen muss für jede Masse eine Peakserie für den betrachteten
m/z-Bereich erzeugt werden. Ferner wird die Hüllkurve der Peakserie generiert.
Anschließend wird die Intensität der Peakserie angepasst, indem sie mit dem festgelegten
Massenanteil multipliziert wird. Sind alle Peakserien der Massen erzeugt, werden sie moduliert
(Faltung der Peakserien), so dass ein Spektrum entsteht. Im letzten Schritt wird das generierte
Spektrum mit einem Gauß-Rauschen versehen.
Auf die exakte Berechnung der Peakform wird verzichtet, weil sich die Isotopenverteilung bei
großen Molekülen einer Gauß-Kurve nähert. Folglich werden die Peaks mit einer Gauß-
Funktion erzeugt. Die beiden Parameter Mittelpunkt und Amplitude der Gaußfunktion sind
direkt gegeben. Ersterer entspricht dem m/z-Verhältnis und letzterer der Intensität I(z) der
Hüllkurve am entsprechenden Ladungszustand. Der Wert für den Parameter Halbwertsbreite
wurde empirisch auf 0,19D festgelegt. Die von dem m/z-Verhältnis abhängige Peakverbreiterung
wird nicht simuliert, da sie für die Simulation nicht weiter von Belang ist.
Für die Berechnung der Hüllkurve werden Gauß-Funktionen als Basisfunktionen verwendet.
Die Hüllkurve der leichten Kette wird abhängig vom simulierten Spektrum mit einer oder
zwei Basisfunktionen erzeugt. Für die schwere Kette werden durchweg zwei Basisfunktionen
verwendet. Innerhalb eines Spektrums sind die Hüllkurven für alle Varianten der schweren
bzw. leichten Kette identisch. Die Parameter zur Erzeugung der künstlichen Spektren sind in
Tab. 5.2.1 zusammengetragen.
Für jede Masse werden 44 Adduktsignale erzeugt. Dabei ist die Wahrscheinlichkeit für die
Bildung eines Addukts auf P(Addukt)=0,21 gesetzt. Die Wahrscheinlichkeit, dass sich n Addukte
anlagern, ist P(Addukt) n .
75

Die Auswertung der Spektren findet statt
76
Molekül Basisfunktion Amplitude Mittelpunkt Sigma
Maximale
Intensität
AK1
2,5% Noise
LK
B1(z)
B2(z)
0,84
0,16
26,00
16,49
3,55
1,61
25316
SK
B1(z)
B2(z)
0,34
0,66
40,00
56,92
4,96
6,59
16418
AK2, AK8
5% Noise
LK
B1(z)
B2(z)
0,92
0,09
17,30
13,50
1,15
0,99
40000
SK
B1(z)
B2(z)
0,87
0,13
36,64
35,19
3,28
7,00
54054
AK3
2,5% noise
LK
B1(z)
B2(z)
0,24
0,76
18,98
26,88
1,89
2,69
25000
SK
B1(z)
B2(z)
0,44
0,56
51,44
36,40
5,13
5,09
4167
AK4, AK9
2,5% noise
LK
B1(z)
B2(z)
0,33
0,67
17,70
27,13
1,57
3,30
14300
SK
B1(z)
B2(z)
0,26
0,74
36,64
57,29
7,00
6,62
5600
AK5
10% noise
LK
B1(z)
---
1,00
---
21,94
---
4,21
---
333
SK
B1(z)
B2(z)
0,39
0,61
44,03
58,59
6,99
6,99
300
AK6
30% noise
LK
B1(z)
---
1,00
---
20,59
---
4,63
---
57
SK
B1(z)
B2(z)
0,57
0,43
41,02
57,18
6,89
5,96
50
AK7
2,5% noise
LK
---
---
---
---
---
---
---
---
---
SK
B1(z)
B2(z)
0,25
0,75
30,08
43,29
4,85
5,35
18750
• manuell (per Hand mit Lineal),
• mit der In-House Entwicklung,
• mit dem MaxEnt-Algorithmus.
• und mit Massfinder II.
Tab. 5.2.1: Die
Tabelle gibt die
Daten, welche
zur Erzeugung
der Hüllkurven
verwendet wurden,
wieder.
Bei der Analyse mit Massfinder II werden drei Quantifizierungsarten (QA) betrachtet:
• QA1: Die Peakauswahl entspricht der zweiten Variante aus Kap. 3.1 (Schnittmenge).
Die Hüllkurve wird nicht bestimmt, d.h. als Intensität wird die Intensität des
Spektrums an entsprechender Stelle verwendet.
• QA2: Die Peakauswahl entspricht der dritten Variante aus Kap. 3.1 (Schnittmenge
& nicht überlappend). Auch hier wird die Hüllkurve nicht bestimmt.
• QA3: Die Peakauswahl entspricht der vierten Variante aus Kap. 3.1 (alle). Die Hüllkurve
wird durch Fitting bestimmt.
Diese drei Varianten werden einmal direkt auf das Spektrum angewendet und einmal nachdem
die Basislinie mit einer der drei vorgestellten Methoden entfernt wurde. Es werden also drei
Arten mit vier Methoden des Basislinienabzugs getestet, somit werden insgesamt 12 Möglichkeiten
der Quantifizierung durchleuchtet.
Da die Analyse bei allen Methoden manuelle Schritte enthält, welche Zeit kosten, wurde die
Untersuchung auf 9 synthetische Spektren beschränkt. Diese Anzahl ist für eine umfassende

Bewertung zwar zu gering, jedoch gibt sie bereits eine Aussage darüber, in welchem Rahmen
sich die betrachteten Verfahren bewegen. Um die Methoden besser vergleichen zu können,
wird neben den ermittelten Verhältnissen auch die Standardabweichung zur Referenz angegeben.
Die detaillierten Ergebnisse der Simulation sind in Anhang A zu finden.
Die Entwickler des „Maximum Entropie“-Algorithmus schreiben, dass die Ergebnisse, welche
aus der Entfaltung eines Spektrums stammen, nicht zur Quantifizierung verwendet werden
sollten, weil der Entropieprozess einen Bias durch seine Nichtlinearität hineinbringt [Reinhold92],
d.h. die von MaxEnt gefundenen Intensitäten sind nicht proportional zu den Intensitäten
im gemessenen Spektrum. In [Schmieder97] ist außerdem zu lesen, dass der Fehler zum
einen durch das Spektrum selber und zum anderen durch die zur Entfaltung verwendeten Parameter
stark beeinflusst wird. Vermutlich ist wegen dieser zwei äußeren Faktoren in der Literatur
keine Aussage darüber zu finden, in welchem Rahmen sich der Quantifizierungsfehler
bei MaxEnt befindet. Dies hat dazu bewegt, auch den MaxEnt-Algorithmus mit in die Auswertung
einzubeziehen.
Im Folgenden werden die Ergebnisse jeder Quantifizierungsmethode diskutiert. Zum besseren
Verständnis der Diskussion werden die Daten aus Anhang A als Diagramme aufbereitet. Auf
der x-Achse der Diagramme sind alle Massen welche zur Synthese der Spektren verwendet
wurden aufgetragen und zwar geordnet nach deren jeweiligen Anteil am Spektrum. Auf der y-
Achse befindet sich der Quotient aus ermittelter Quantität und dem Erwartungswert (Referenz-Quantität).
Man erhält also für jede Methode ein Streudiagramm, welches die Informationen
aller Experimente kapselt. Im Idealfall (d.h. jeder Massenanteil wurde richtig vorhergesagt)
sollte man eine Gerade sehen, welche auf 100% liegt. Ist eine Masse überbewertet, d.h.
es wird mehr Anteil am Spektrum vorhergesagt, so ist der Wert an entsprechender Stelle größer
100%. Analog dazu ist bei einer Unterbewertung der Wert kleiner 100%. Um die Tendenzen
besser zu erkennen, werden die Punkte durch Linien verbunden. Damit unterbewertete
Massen nicht bevorzugt dargestellt werden, wird die y-Skala logarithmiert.
Die Resultate der Simulation zeigen, dass der MaxEnt-Algorithmus im Schnitt eine geringe
Standardabweichung aufweist (Tab. 5.2.2). Betrachtet man das Streudiagramm (vgl. Abb.
5.2.1) von MaxEnt, so sieht man, dass für Quantitäten unter 10% eine große Streuung in der
Genauigkeit herrscht. Teilweise wird sogar die tatsächliche Quantität um das 6fache überbewertet.
Ab einem Massenanteil von mehr als 10% lässt sich der MaxEnt-Algorithmus gut für
die Quantifizierung verwenden. Offensichtlich eignet sich MaxEnt für die Quantifizierung der
hier untersuchten Problemklasse. Ob diese Aussage auch für Spektren anderer Proteine zutrifft,
wurde nicht untersucht.
77

Bei der manuellen Quantifizierung gab es Schwierigkeiten bei den Spektren AK5 und AK6.
Das schlechte Signal-zu-Rausch-Verhältnis hat eine Messung per Hand ausgeschlossen. Für
alle anderen Spektren wurde die Quantifizierung durchgeführt und die erhaltenen Werte liegen
sehr nahe an der Referenz.
78
1000%
10%
1000%
10%
Abb. 5.2.2: Quantifizierungsvarianz eines Laboranten.
MaxEnt
100%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
Abb. 5.2.1: Quantifizierungsvarianz von MaxEnt
Manuell
100%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%

Die Standardabweichung ist bei der manuellen Bewertung nie höher als 2,5% und im Schnitt
liegt sie bei 1,4% (vgl. Tab. 5.2.2). Ein Blick auf das Streudiagramm in Abb. 5.2.2 zeigt, dass
auch bei der manuellen Messung, Massen mit einem geringen Anteil am Spektrum (kleiner
10%) schwer zu quantifizieren sind. Die Streuung ist aber halb so groß wie bei MaxEnt.
Das In-House entwickelte Quantifizierungsprogramm, welches über die 4. Ableitung quantifiziert,
schneidet bei der Auswertung mit am schlechtesten ab. Dies hat überrascht, wo doch die
gleichen Peaks für die Quantifizierung verwendet wurden wie bei QA2. Beim Betrachten von
Abb. 5.2.3 fällt außerdem auf, dass die Messungen verfälscht sind. Massen mit einem geringem
Anteil am Spektrum werden überbewertet und Massen mit einem hohen Anteil werden
unterbewertet. Ob das Programm nun tatsächlich schlechter quantifiziert oder das Ergebnis
durch falsche Programmparameter verfälscht wurde, konnte nicht geklärt werden. An dieser
Stelle besteht noch Klärungsbedarf.
1000%
In-House Entwicklung
100%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
10%
Abb. 5.2.3: Quantifizierungsvarianz der In-House Entwicklung.
Nachdem die Quantifizierung mit MaxEnt, mit der Hand und mit der In-House Entwicklung
betrachtet wurde, werden im Folgenden die verschiedenen Quantifizierungswege von Massfinder
II betrachtet.
In Abb. 5.2.4 ist das Resultat abgebildet, welches man erhält, wenn die Basislinie nicht abgezogen
wird. Unabhängig von der Quantifizierungsart, lässt sich ein starker Bias beobachten,
der sich analog zur In-House Entwicklung verhält. Ebenso lässt sich auch hier bei ca. 10% die
Stelle finden, bei der ein Qualitätssprung stattfindet. Innerhalb dieser Gruppe schneidet QA3
(Bestimmung der Hüllkurve) v.a. im Bereich unter 10% am besten ab.
79

Ein ähnliches Bild bietet sich, wenn die Basislinie mit einem Spline abgezogen wird (vgl.
Abb. 5.2.5). Hier wird zwar die Stärke des Bias abgeschwächt, jedoch bleibt die Tendenz des
Bias die gleiche wie bei nicht abgezogener Basislinie. Der Abzug der Basislinie mit dieser
Methode ist demnach nicht empfehlenswert, da es den Bias nur geringfügig korrigiert.
80
1000%
1000%
10%
Basislinie: nicht abgezogen
100%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
10%
Abb. 5.2.4: Quantifizierungsvarianz von MF II bei nicht abgezogener Basislinie.
Basislinie: Spline
100%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
Abb. 5.2.5: Quantifizierungsvarianz von MF II bei Abzug der Basislinie mittels Spline-Interpolation.
QA1
QA2
QA3
QA1
QA2
QA3

Als nächstes werden die Ergebnisse nach Elimination der Basislinie mittels 4. Ableitung betrachtet
(vgl. Abb. 5.2.6). Mit diesem Ansatz ist kein Bias mehr zu beobachten. Somit kann
man diese Methode für die Quantifizierung heranziehen, jedoch gilt auch hier, dass die Güte
der Vorhersage bei einem Massenanteil von unter 10% stark abnimmt. QA2 und insbesondere
QA3 erreichen in diesem Grenzbereich bessere Ergebnisse als QA1.
1000%
Basislinie: 4. Ableitung
100%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
10%
Abb. 5.2.6: Quantifizierungsvarianz von MF II bei entfernen der Basislinie mittels 4. Ableitung.
Als letzte Methode wird der Abzug der Basislinie mit dem „Tal-zu-Tal“-Verfahren betrachtet
(vgl. Abb. 5.2.7). In Kap. 3.3.1 wurde gezeigt, dass mit dieser Variante u.U. zuviel vom Signal
abgezogen wird. Solche Fälle treten auf, wenn Peaks sehr nahe neben anderen Peaks liegen,
so dass die Basislinie zuviel wegschneidet (vgl. Abb. 3.3.1.1). Dadurch, dass bei manchen
Peaks mehr Signal als bei anderen abgeschnitten wird, wird ein starkes Rauschen in der
Hüllkurve generiert. Die direkte Folge ist, dass ein Fitting der Hüllkurve bei zu starkem Rauschen
nicht gut gelingen kann. Dies ist wahrscheinlich der Hauptgrund dafür, dass QA3
manchmal schlechter abschneidet als QA2. Trotz aller Kritik an der „Tal-zu-Tal“-Variante
und den offensichtlichen Schwächen, zeigt die Auswertung, dass man mit dieser Variante mit
die besten Ergebnisse erzielt. Evt. gleichen sich die beim Basislinienabzug gemachten Fehler
beim Betrachten mehrerer Peaks wieder aus, so dass das Ergebnis am Ende wieder stimmt. Ob
dies wirklich die Ursache ist, bleibt aber offen. Hierzu sind genauere Untersuchungen notwendig.
Für die verschiedenen Arten des Basislinienabzugs lässt sich zusammenfassend sagen, dass
die Ergebnisse durchweg besser sind, wenn die Basislinie abgezogen wird. Ferner ist bei Massenanteilen
unter 10% nur mit den Methoden „Tal-zu-Tal“ bzw. „4. Ableitung“ in Kombination
mit QA3 noch eine halbwegs vernünftige Aussage durchführbar.
QA1
QA2
QA3
81

Die Daten aus Anhang A sind in Tabelle 5.2.2 zusammengefasst worden. Dabei sieht man,
dass die Quantifizierung per Hand, mit MaxEnt sowie mit QA3 über die 4. Ableitung die besten
Ergebnisse liefern. Die Tatsache, dass sich mit den hier entwickelten Methoden selbst
schwierige Spektren wie AK5 und AK6 quantifizieren lassen, spricht für die Robustheit von
Massfinder II.
MaxEnt hat durch seine Genauigkeit für diese Problemklasse überrascht, wo doch die allgemeine
Meinung kursiert, dass es für die Quantifizierung nicht geeignet ist. Die Tatsache, dass
es sich beim MaxEnt-Algorithmus um ein Black-Box-System handelt, spricht allerdings gegen
dessen Verwendung, denn man kann sich nie wirklich sicher sein, ob ein Fehler nun auftritt
oder nicht.
82
1000%
100%
10%
1%
Abb. 5.2.7: Quantifizierungsvarianz von MF II bei Abzug der Basislinie mit dem Tal zu Tal verfahren.
Basislinie:
nicht
abgezogen
Basislinie:
Tal zu Tal
Manuell
MaxEnt
In-House Lösung
1,4%
1,5%
5,2%
Basislinie: Tal zu Tal
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
QA1 5,1% QA1 4,8%
Basislinie:
QA2 3,8% QA2 3,9%
Spline
QA3 3,2% QA3 2,7%
QA1 2,5% QA1 2,7%
Basislinie: 4.
QA2 1,3% QA2 2,0%
Ableitung
QA3 1,6% QA3 1,3%
QA1
QA2
QA3
Tabelle 5.2.2: Zusammenfassung
der Validierung.
Es sind die durchschnittlichenStandardabweichungenangegeben.
Es sind nur diejenigen
Datensätze verwendet,
bei denen alle Methoden
ein Ergebnis geliefert
haben.

Vergleicht man die drei Quantifizierungsarten von Massfinder II miteinander, so stellt man
fest, dass die QA1 am schlechtesten abschneidet. Der Grund liegt daran, dass überlappende
Peaks mit in die Quantifizierung einbezogen werden und das Ergebnis dadurch verfälscht
wird. Als zweitbeste Methode hat sich die QA2 herauskristallisiert. Diese betrachtet nur diejenigen
Peaks, welche nicht durch andere überlagert sind. Die dritte Methode, QA3, ist ähnlich
gut wie QA2. Bei QA3 werden alle Peaks zur Quantifizierung herangezogen, jedoch wird
die Hüllkurve durch ein Fitting bestimmt. Der mögliche Grund, warum QA2 und QA3 ähnliche
Werte liefern, ist folgender: Bei den synthetischen Spektren kommen nicht viele Fälle vor,
bei denen, wie in Abb. 3.6.4.2 gezeigt, nicht erfasste Addukt-Signale der leichten Kette mit
Signalen der schweren Kette überlappen. Deswegen bringt das Fitting der Hüllkurve keine
bzw. kaum Verbesserung an dieser Stelle. Wenn aber die Ergebnisse von QA2 und QA3 signifikant
abweichen, dann ist QA3 besser positioniert.
5.3. Experimentelle Resultate
In den letzten Kapiteln wurde anhand künstlicher Daten gezeigt, wie zuverlässig die konzipierten
Methoden tatsächlich sind. Die Monte-Carlo-Simulation hat gezeigt, dass das Fitting
der Hüllkurve auch mit schlechten Daten noch gut durchführbar ist. Die Untersuchung der
kompletten Quantifizierungspipeline hat das Bild weiter bestätigt. Die besten Methoden von
Massfinder II sind mit ca. 1,5% Standardabweichung sehr nahe an der Realität. Selbst durch
starkes Rauschen bzw. durch Peaküberlagerung charakterisierte Spektren lassen sich mit
Massfinder II im Gegensatz zur manuellen Methode noch gut quantifizieren.
Nach der Validierung anhand künstlicher Daten wurden empirische Daten betrachtet. Die eingesetzten
Analysemethoden sind die gleichen wie bei der Simulation: Massfinder II, manuell,
In-House Lösung und MaxEnt. Als Untersuchungsmaterial standen 11 Spektren zur Verfügung.
Die Ergebnisse der Quantifizierung sind in Anhang B dargestellt. Als Hinweis sei erwähnt,
dass in manchen Fällen QA1 und QA2 gleiche Massenverhältnisse liefern. Das liegt
daran, dass bei QA2 keine Überlappungen mit anderen Peaks gefunden werden, und somit
dieselben Ladungszustände wie bei QA1 zum Quantifizieren verwendet werden.
Die Schwierigkeit bei diesen und anderen empirischen Daten besteht darin, dass es keine Referenzmethode
gibt. Folglich kann man bei dem durchgeführten Vergleich nur feststellen, ob
die Methoden im selben Rahmen bleiben oder nicht. Eine Aussage darüber, welche Methode
die bessere ist, kann nicht getroffen werden.
83

Ebenso wie bei der Simulation präsentiert sich auch bei den empirischen Daten das gleiche
Bild: Ist die Basislinie abgezogen, so sind die Werte näher an denen der anderen Methoden.
Außerdem liegt QA1 i.d.R. am weitesten von den anderen Messungen entfernt.
Bei den Spektren AK2 und AK3 handelt es sich um die gleichen Messungen. Der Unterschied
liegt in der Signalqualität. Während AK3 die Summe vieler Messungen ist, ist AK2 das Ergebnis
nur einer Messung. Folglich ist bei AK2 der Rauschanteil mit ca. 20% sehr groß, während
bei AK3 das Rauschen unter 2% beträgt. Dies ermöglicht eine Beurteilung der Robustheit
anhand empirischer Spektren. So sieht man beim Vergleich jeder Messung zwischen
AK2 und AK3, dass die Werte sehr ähnlich sind, unabhängig von dem Rauschanteil. Die Verfahren
können also auch mit schlechten Daten gut umgehen.
Eine genaue Analyse, welche beurteilen kann warum ein Verfahren für eine Masse mehr oder
weniger Anteil vorhersagt als die anderen muss noch durchgeführt werden. Offensichtlich hat
aber der Abzug der Basislinie eine große Auswirkung auf das Ergebnis, wie man beim Betrachten
der synthetischen bzw. der empirischen Spektren sieht. Das Problem bei der Basislinie
ist, dass es fremdes Signal enthält, man aber nie weiß ob man in jedem Bereich des Spektrums
richtig abzieht. Es kann sein dass zuviel oder zuwenig vom Spektrum abgezogen wird.
Für eine genauere Untersuchung könnte man Proben mit einer dritten unabhängigen (z.B.
chemischen) Methode quantifizieren und anschließend eine ESI-MS-Aufnahme davon durchführen.
Dies würde es ermöglichen den Einfluss der Basislinie zu erkennen bzw. in Zahlen zu
beziffern. Hat man einmal die verschiedenen Formen und Anteile der Basislinie am Spektrum
erfasst, könnte man in einem nächsten Schritt bei der Erzeugung synthetischer Spektren ähnliche
Basislinien dazuaddieren um anschließend eine detaillierte Analyse zu tätigen. Zur Klarstellung
sei hier nochmals erwähnt, dass bei den hier erzeugten künstlichen Spektren keine
Basislinie dazuaddiert wurde. Wenn eine schwach-intensive Basislinie vorhanden war, dann
stammt diese allein von Adduktsignalen. Echte Spektren weisen i.d.R weitaus stärkere Basislinienanteile
auf.
84

6. Zusammenfassung und Ausblick
Dank der ESI-MS-Technologie ist man heute in der Lage, große Biomoleküle als Ganzes zu
analysieren. Ein besonders wichtiger Aspekt der ESI-MS ist die Analyse der Glykosylierungsprofile
von Antikörpern und anderen Proteinen, weil diese maßgeblich deren Funktion
determinieren. Für die medizinische Therapeutik ist es deshalb von großer Relevanz, zu wissen,
in welchem Verhältnis verschiedene Glykovarianten eines Proteins stehen. Die Bestimmung
dieser Quantitäten direkt aus dem Spektrum ist keine triviale Aufgabe, weil Peakhöhen
und Formen durch Überlagerung mit anderen Peaks verfälscht werden. Sie verlieren ihre
Gauß-Form, sie bekommen Schultern, Sättel, etc. Vorhandene Softwareprodukte lösen dieses
Problem nur unbefriedigend, weshalb eine Neuentwicklung gewünscht war.
Mit Massfinder II wurde das ursprünglich für die qualitative Analyse von Antikörper ESI-MS
Spektren entwickelte Programm um Methoden für eine quantitative Analyse erweitert. Neben
der Möglichkeit, eine manuelle Quantifizierung der Spektren durchzuführen, wurden robuste
Methoden für eine weitestgehend automatisierte Quantifizierung implementiert. Die softwaretechnische
Umsetzung wurde mittels Tcl/Tk und ANSI-C vollzogen, wobei Tcl/Tk für die
Präsentationsschicht verwendet wird und ANSI-C für die darunter liegenden Logikschichten.
Basierend auf Monte-Carlo-Simulationen wurde eine Aussage über die Güte der entwickelten
Verfahren gemacht. Die einfache Variante QA1 hat sich als die schlechteste erwiesen. Mit
dem weitestgehend automatisierten Verfahren QA2 lassen sich nach Abzug der Basislinie gute
Ergebnisse erzielen. Für noch präzisere Ergebnisse muss QA3 angewendet werden – diese
ist jedoch mit einem erhöhten Zeitaufwand verbunden, weil das Hüllkurven-Fitting für jede
Masse einzeln betrachtet werden muss. Bei der Wahl einer geeigneten Methode für die Elimination
der Basislinie ist die Variante „4. Ableitung“ zu empfehlen.
Als Schlussfolgerung der Validierung kann man festhalten, dass das Ziel erreicht wurde Verfahren
zu entwickeln, welche ähnlich gute Ergebnisse liefern, wie die durch „erfahrene“ Laboranten
durchgeführte manuelle Quantifizierung. Dies hat drei Konsequenzen: die Quantifizierung
lässt sich schneller durchführen, schlechte Spektren lassen sich dank der Robustheit der
Verfahren auch noch gut quantifizieren und zum anderen können mit Massfinder II auch
„unerfahrene“ Laboranten reproduzierbare Ergebnisse liefern. Neben den automatisierten Prozessen
wird auch die manuelle Quantifizierung im Programm zur Verfügung gestellt, so dass
Fälle bei denen die Automatik nur unzureichende Ergebnisse liefert noch behandelt werden
können. Massfinder I und II wurden zwar im Hinblick auf Antikörper entwickelt, jedoch lassen
sich die Module „Qualitative Analyse“ und „Quantitative Analyse“ auch für andere Biomoleküle
verwenden, was Massfinder II zu einem flexiblen Werkzeug in der Analytik macht.
85

Im Hinblick auf die technische Umsetzung gibt es noch Möglichkeiten zur Verbesserung. So
ließe sich auf Kosten der Transparenz der Quantifizierungsprozess noch weiter beschleunigen,
indem separate Schritte zusammengefasst werden. Gemeint sind der Abzug der Basislinie, die
Auswahl der Ladungszustände und die Quantifizierung an sich.
Ist eine Funktionserweiterung für Massfinder II vorgesehen, so empfiehlt sich auch ein Wechsel
der GUI-Plattform. Mit der Skriptsprache Tcl/Tk bewegt man sich hier mit über 10.000
Zeilen Code bereits an den Grenzen des Machbaren. Aufgrund der Tatsache, dass die Sprache
nicht typisiert ist, sind unvorhersehbare Laufzeitfehler vorprogrammiert. Es kann nicht jedes
Szenario überprüft werden, weil die möglichen Kombinationen der Userinteraktion mit der
Programmoberfläche nahezu unbegrenzt sind. Für eine solidere Grundlage bedarf es einer
besser strukturierten Programmiersprache, die typisiert ist und zur Compile-Zeit bereits einen
Großteil der Fehler abfängt. Da die GUI und die Logik in dem jetzigen Zustand bereits stark
getrennt sind, lässt sich ein Wechsel auf eine andere Plattform für die Sicht mit verhältnismäßig
wenig Aufwand durchführen. Als Alternative zu Tcl/Tk käme C/C++, C# oder Java in
Frage, wobei Java die Ideologie der Betriebssystem-Unabhängigkeit am besten umsetzen
würde.
Bei der Methodik besteht an manchen Stellen noch Raum für Optimierung. So könnte man im
Falle von Antikörpern die Quantifizierung auf den mittleren Ladungszustand beschränken,
welcher am besten ausgeprägt ist. Die Randbereiche weisen meistens eine geringe Intensität
auf und lassen sich aufgrund dessen durch Störfaktoren leichter beeinflussen und dadurch
leichter verfälschen. Das Prinzip, dass ähnliche Spezien eine ähnliche Ladungsverteilung haben,
könnte man für die bessere Bestimmung der Hüllkurve anwenden: Die Spektren weisen
i.d.R. eine Hauptspezies auf, die gut repräsentiert ist. Für diese ist die Bestimmung der Hüllkurve
meistens problemlos möglich. Die so gewonnen Parameter der Basisfunktionen könnten
bis auf die Amplitude für Varianten der Hauptspezies wieder verwendet werden. D.h. die Parameter
Mittelpunkt und Halbwertsbreite werden von der Hauptspezies übernommen und
festgehalten. Das Fitting wird auf die Amplitude als freien Parameter beschränkt.
Ein gänzlich anderer Ansatz für die Quantifizierung wäre es, den MaxEnt-Algorithmus hierzu
zu verwenden. Die Schwierigkeit besteht darin, die Nichtlinearität des Algorithmus zu korrigieren.
In [Schmieder97] wurde für NMR-Spektren bereits ein solcher Korrektur-
Mechanismus entwickelt. Ob für ESI-Spektren auch die Möglichkeit besteht, die Nichtlinearität
des MaxEnt Algorithmus zu korrigieren, muss untersucht werden. Eine interessante Möglichkeit
wäre dies auf jeden Fall, weil dadurch eine komplette Automatisierung des Quantifizierungsprozess
möglich wäre und trotzdem noch gute Ergebnisse erzielt werden.
86

Anhang
A. Quantifizierungsergebnisse synthetischer Spektren
Ergebnisse des Vergleichs zwischen verschiedenen Quantifizierungsarten anhand synthetischer
Spektren. Die Referenz entspricht den tatsächlichen Werten. Die grauen Prozentzahlen
entsprechen den von den jeweiligen Methoden gefundenen Verhältnissen. Die blauen Zahlen
geben die Standardabweichung zur Referenz wieder. Bei manchen Datensätzen war eine
Quantifizierung mit der entsprechenden Methode nicht möglich. Bei QA2 liegt das daran, dass
keine nicht überlappenden Peaks gefunden wurden. Bei der manuellen Methode hingegen
liegt das am zu schlechten Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Spektrums.
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK1 48801 65.1% 62.9% 62.6% 59.4% 53.2% 55.1% 56.6%
(SK) 48963 10.8% 13.3% 13.7% 13.2% 14.5% 15.3% 15.1%
49090 5.1% 4.4% 4.1% 6.6% 8.4% 6.7% 6.2%
49123 5.8% 6.9% 6.5% 6.8% 10.2% 8.5% 8.0%
48929 13.2% 12.5% 13.2% 14.0% 13.7% 14.4% 14.2%
1.6% 1.8% 2.9% 6.1% 5.1% 4.4%
Basislinie: Tal zu Tal
Basislinie: Spline
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
67.5% 70.1% 72.4% 53.8% 55.8% 57.5% 61.8% 65.6% 67.2%
9.3% 10.2% 9.7% 14.4% 15.2% 15.0% 9.2% 11.2% 10.9%
6.2% 3.8% 3.2% 8.2% 6.5% 5.8% 6.9% 5.0% 4.5%
8.0% 5.9% 5.1% 10.0% 8.3% 7.7% 8.6% 6.1% 4.9%
9.1% 10.0% 9.6% 13.6% 14.3% 14.1% 13.5% 12.2% 12.6%
2.5% 2.8% 3.8% 5.8% 4.8% 4.0% 2.2% 0.6% 1.1%
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK1 23428 88.5% 86.4% 86.6% 83.4% 76.5% 82.4% 82.7%
(LK) 23590 6.5% 7.6% 6.9% 6.3% 10.9% 8.4% 8.3%
23612 2.3% 6.0% 3.8% 4.6% 8.4% 5.0% 5.0%
23753 2.6% 0.0% 2.7% 5.7% 4.3% 4.3% 4.0%
2.5% 1.2% 3.2% 7.1% 3.5% 3.3%
Basislinie: Tal zu Tal
Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
84.5% 88.3% 90.9% 77.0% 77.0% 84.4% 82.0% 85.4% 87.3%
7.9% 6.2% 4.4% 10.7% 10.7% 7.2% 8.5% 5.9% 5.4%
5.2% 3.0% 2.2% 8.2% 8.2% 5.3% 7.2% 5.9% 4.9%
2.5% 2.6% 2.5% 4.1% 4.1% 3.0% 2.4% 2.8% 2.5%
2.5% 0.4% 1.6% 6.8% 6.8% 2.5% 4.2% 2.4% 1.5%
87

88
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK2 48765 4.7% 3.6% 3.9% 9.7% 5.6% 5.5% 4.5%
49983 3.4% 3.2% 2.1% 2.8% 3.4% 3.2% 3.1%
50211 29.3% 28.4% 25.8% 22.4% 24.7% 25.0% 25.2%
50373 37.8% 36.4% 34.1% 29.9% 31.9% 32.2% 32.8%
50414 6.1% 10.0% 13.8% 15.9% 14.2% 14.3% 14.6%
50536 13.8% 12.0% 12.7% 11.5% 12.6% 12.1% 12.1%
50576 5.0% 6.4% 7.6% 7.9% 7.7% 7.7% 7.7%
1.9% 3.7% 5.9% 4.3% 4.3% 4.2%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
5.2% 5.2% 4.6% 5.6% 5.5% 4.6% 4.7% 4.9% 4.5%
3.7% 3.4% 3.1% 3.5% 3.2% 3.1% 3.7% 3.2% 2.9%
27.2% 27.1% 27.9% 24.6% 25.0% 25.2% 28.2% 27.2% 27.7%
34.1% 34.7% 35.6% 31.8% 32.1% 32.8% 35.5% 35.5% 35.9%
10.1% 10.4% 9.4% 14.3% 14.3% 14.6% 9.9% 9.9% 10.3%
13.4% 12.7% 12.9% 12.6% 12.1% 12.1% 12.0% 13.0% 12.8%
6.3% 6.6% 6.4% 7.7% 7.7% 7.7% 6.0% 6.3% 5.8%
2.3% 2.3% 1.7% 4.4% 4.3% 4.2% 1.9% 2.0% 1.9%
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK3 48207 10.7% 11.2% 10.2% 5.7% 3.7% 7.9%
(SK) 48296 9.7% 9.2% 5.8% 10.9% 7.3% 7.3%
48334 32.5% 34.3% 28.3% 25.5% 20.5% 21.3%
48387 3.4% 7.3% 3.5% 10.4% 11.4% 7.0%
48426 6.6% 6.3% 7.0% 4.2% 6.5% 7.7%
48455 5.3% 6.3% 4.2% 10.6% 7.0% 7.2%
48472 1.6% 0.0% 2.9% 4.4% 8.7% 5.0%
48510 15.5% 14.1% 18.3% 10.4% 11.9% 11.8%
48541 6.6% 8.9% 10.6% 9.4% 9.1% 9.1%
48560 5.7% 2.4% 6.7% 5.6% 7.5% 7.9%
48599 1.3% 0.0% 1.4% 1.6% 3.8% 5.1%
48688 1.2% 0.0% 1.1% 1.3% 2.6% 2.7%
1.9% 2.2% 4.1% 5.4% 4.2%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
6.7% 12.4% 3.0% 7.6% 13.1% 11.3%
7.4% 8.0% 7.2% 7.0% 8.9% 14.0%
36.9% 37.3% 22.3% 25.5% 22.5% 38.2%
7.9% 1.4% 11.8% 6.4% 1.0% 1.1%
2.2% 4.9% 6.2% 7.2% 3.9% 4.9%
2.2% 3.3% 6.8% 7.8% 5.1% 5.5%
7.2% 1.1% 8.8% 3.2% 1.1% 0.9%
16.4% 16.2% 12.4% 13.0% 10.3% 17.1%
7.8% 8.3% 9.3% 9.3% 30.9% 4.9%
3.4% 4.8% 7.4% 7.7% 1.2% 0.8%
0.6% 1.2% 3.1% 4.2% 1.0% 0.7%
1.3% 1.2% 1.8% 1.3% 1.1% 0.7%
3.3% 1.9% 5.1% 3.0% 7.9% 2.7%

Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK3 24142 2.7% 1.6% 10.2% 3.1% 2.6%
(LK) 24159 56.5% 41.3% 43.8% 41.5% 42.1%
24181 6.2% 15.0% 15.9% 15.0% 14.9%
24200 2.7% 15.8% 6.1% 13.9% 13.6%
24246 25.8% 22.1% 20.5% 21.0% 21.3%
24334 4.2% 3.7% 3.0% 4.3% 4.3%
24424 0.8% 0.4% 0.6% 1.3% 1.2%
8.4% 7.1% 8.0% 7.8%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
0.4% 0.4% 2.6% 2.3% 3.1% 7.4% 3.2%
51.3% 51.8% 42.6% 43.2% 43.5% 40.9% 43.5%
11.1% 10.6% 15.1% 14.9% 20.6% 20.3% 20.6%
10.7% 10.6% 13.8% 13.7% 12.6% 13.1% 12.6%
22.5% 22.7% 21.3% 21.3% 17.2% 15.6% 17.2%
3.3% 3.3% 3.9% 3.9% 2.4% 2.2% 2.4%
0.7% 0.6% 0.7% 0.7% 0.5% 0.5% 0.4%
4.3% 4.2% 7.7% 7.5% 8.9% 9.9% 8.9%
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK4 49732 2.5% 3.2% 1.8% 1.7% 7.3% 5.1% 3.3%
49813 4.5% 3.8% 3.7% 2.8% 9.2% 5.3% 4.8%
50017 3.3% 4.8% 2.7% 13.7% 10.2% 11.6% 11.6%
49960 52.0% 49.0% 52.7% 39.8% 32.0% 37.9% 40.5%
50089 7.2% 6.1% 7.1% 5.9% 12.5% 8.0% 8.3%
50121 22.7% 21.3% 25.1% 11.9% 17.2% 19.1% 20.9%
50252 4.2% 5.1% 3.9% 19.9% 5.6% 5.8% 5.1%
50279 3.6% 6.7% 3.9% 4.2% 6.1% 7.1% 5.6%
1.8% 1.0% 8.8% 8.4% 6.2% 5.1%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
8.0% 4.0% 2.5% 7.3% 5.1% 3.3% 5.9% 2.0% 2.7%
10.2% 4.7% 4.4% 9.2% 5.3% 4.8% 10.9% 21.2% 5.0%
4.0% 5.1% 4.6% 10.2% 11.6% 11.4% 3.8% 1.9% 4.5%
41.4% 51.1% 55.7% 32.0% 37.9% 40.6% 40.8% 40.2% 54.0%
11.5% 4.2% 4.0% 12.5% 8.0% 8.3% 12.9% 8.0% 5.6%
18.3% 22.1% 24.6% 17.2% 19.1% 20.9% 17.8% 19.4% 24.7%
2.9% 3.3% 2.3% 5.6% 5.8% 5.1% 3.1% 3.5% 1.9%
3.7% 5.5% 1.9% 6.1% 7.1% 5.6% 4.9% 3.9% 1.7%
5.2% 1.6% 2.1% 8.4% 6.2% 5.0% 5.4% 7.4% 1.6%
Molekül Massen Referenz Manuell
MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK5 50564 13.0% 12.1% 11.4% 8.8% 10.0% 9.3%
50726 18.5% 25.8% 11.7% 12.7% 12.1% 12.8%
50885 5.6% 8.7% 7.9% 8.5% 10.6% 9.2%
50693 18.7% 18.1% 12.3% 9.6% 10.0% 10.6%
50854 19.8% 20.1% 10.3% 11.2% 12.8% 11.9%
51014 2.5% 0.5% 4.8% 6.4% 7.0% 6.3%
51036 3.6% 2.6% 6.3% 6.7% 6.6% 7.4%
51195 3.1% 2.6% 6.4% 6.6% 6.1% 6.5%
51162 4.5% 3.2% 7.3% 6.9% 5.0% 6.6%
51324 3.2% 1.6% 6.4% 6.4% 7.0% 6.2%
49119 2.4% 1.4% 6.1% 7.6% 5.6% 6.3%
49248 5.1% 3.2% 9.1% 8.8% 7.4% 6.9%
2.6% 4.6% 5.1% 4.7% 4.7%
89

90
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
11.6% 17.0% 18.6% 9.1% 10.4% 10.1% 13.7% 16.4%
16.6% 27.6% 20.5% 16.3% 15.7% 17.4% 17.0% 21.5%
5.0% 5.4% 4.7% 8.9% 9.9% 10.2% 3.8% 5.2%
9.3% 13.7% 12.1% 11.2% 13.7% 13.6% 14.9% 21.0%
14.8% 17.7% 19.4% 13.1% 13.7% 14.4% 17.7% 19.3%
5.0% 1.8% 3.3% 4.8% 4.4% 4.2% 1.8% 3.4%
5.3% 3.9% 5.6% 5.6% 4.9% 5.3% 4.7% 3.6%
5.0% 0.1% 2.9% 5.2% 6.5% 4.9% 4.5% 1.7%
5.9% 5.2% 1.9% 5.7% 7.1% 5.2% 4.4% 1.3%
4.8% 0.5% 2.6% 4.5% 4.6% 4.2% 3.0% 0.6%
7.0% 2.2% 3.2% 6.9% 4.0% 5.0% 4.4% 0.9%
9.8% 5.0% 5.3% 8.9% 5.3% 5.5% 10.1% 5.2%
3.9% 3.5% 2.8% 3.9% 3.2% 2.9% 2.2% 2.0%
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK6 50602 70.0% 75.8% 63.6% 47.7% 48.9% 50.9%
50764 25.0% 22.3% 21.6% 24.1% 24.7% 25.1%
50927 3.0% 1.1% 6.4% 13.6% 13.3% 12.5%
49157 2.0% 0.8% 8.3% 14.7% 13.1% 11.5%
3.4% 5.1% 13.9% 13.0% 11.7%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
67.3% 69.3% 73.9% 61.7% 63.9% 66.0% 67.2% 70.0% 75.9%
22.0% 21.4% 20.7% 23.8% 24.2% 25.4% 23.2% 22.5% 22.4%
4.0% 4.0% 2.7% 5.9% 5.6% 4.4% 2.5% 1.7% 0.5%
6.8% 5.3% 2.8% 8.6% 6.4% 4.2% 7.1% 5.8% 1.2%
3.2% 2.5% 2.9% 5.5% 4.0% 2.4% 3.1% 2.4% 3.5%
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK7 35498 7.6% 7.5% 6.8% 6.2% 7.9% 7.5% 7.6%
35581 11.6% 11.4% 11.1% 11.8% 11.1% 11.1% 11.2%
35662 14.6% 14.4% 14.3% 14.9% 14.0% 14.2% 14.1%
35743 16.3% 16.0% 16.3% 16.4% 15.8% 15.9% 15.9%
35825 16.5% 16.5% 16.6% 16.5% 16.1% 16.2% 16.2%
35906 14.9% 14.8% 15.2% 15.0% 14.9% 15.0% 15.0%
35986 10.4% 10.9% 11.0% 11.0% 11.1% 11.1% 11.1%
36063 8.2% 8.5% 8.7% 8.1% 9.2% 9.0% 8.9%
0.2% 0.5% 0.6% 0.5% 0.5% 0.4%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
7.7% 7.4% 7.2% 7.4% 7.1% 7.1% 7.3% 7.1% 6.5%
11.3% 11.4% 11.5% 11.0% 11.0% 11.0% 11.3% 11.3% 11.5%
14.5% 14.6% 14.7% 14.2% 14.3% 14.3% 14.5% 14.5% 14.7%
16.2% 16.3% 16.5% 16.1% 16.2% 16.3% 16.3% 16.3% 16.5%
16.4% 16.5% 16.6% 16.5% 16.5% 16.6% 16.4% 16.4% 16.7%
14.9% 15.0% 15.0% 15.1% 15.2% 15.2% 15.0% 15.0% 15.3%
10.4% 10.6% 10.6% 10.9% 11.0% 11.0% 10.7% 10.8% 10.9%
8.5% 8.2% 8.1% 8.9% 8.7% 8.7% 8.6% 8.6% 8.0%
0.2% 0.1% 0.2% 0.4% 0.4% 0.4% 0.2% 0.3% 0.5%

Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK8 48765.2 4.7% 4.3% 4.5% 9.8% 9.6% 7.7% 6.0%
49983.1 50.9% 49.7% 51.5% 41.7% 43.1% 45.2% 46.3%
50210.9 22.4% 22.9% 22.4% 22.3% 20.2% 21.1% 21.3%
50373.1 4.0% 4.0% 3.5% 5.9% 4.9% 4.9% 5.1%
50414.4 10.0% 10.7% 10.7% 10.4% 10.8% 10.8% 10.9%
50536.0 3.0% 3.0% 2.0% 5.0% 5.0% 4.0% 4.1%
50576.4 5.0% 5.4% 5.4% 5.0% 6.4% 6.4% 6.5%
0.6% 0.6% 4.1% 3.7% 2.6% 2.1%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
7.2% 4.9% 4.6% 9.2% 7.2% 5.3% 8.0% 4.8% 5.1%
48.4% 49.8% 50.8% 45.5% 47.3% 49.1% 49.3% 50.6% 51.0%
21.7% 22.3% 22.8% 20.6% 21.6% 21.7% 21.7% 22.0% 22.0%
3.8% 4.1% 4.1% 4.2% 4.3% 4.2% 3.7% 4.0% 4.0%
10.0% 10.5% 9.8% 10.5% 10.6% 10.8% 9.8% 10.3% 10.5%
4.0% 2.9% 2.5% 4.3% 3.2% 3.2% 2.6% 3.0% 2.6%
5.0% 5.6% 5.3% 5.7% 5.8% 5.8% 4.9% 5.4% 4.8%
1.4% 0.5% 0.3% 2.8% 1.7% 0.9% 1.4% 0.3% 0.3%
Molekül Massen Referenz Manuell MaxEnt
In-House
Lösung
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
AK9 49732 2.5% 3.6% 1.6% 8.7% 7.4% 5.3% 3.5%
49813 45.6% 45.9% 48.3% 27.3% 34.0% 35.3% 38.4%
50017 7.0% 6.3% 5.9% 4.1% 8.8% 10.0% 9.8%
49960 15.7% 14.6% 14.5% 10.0% 12.9% 14.8% 14.7%
50089 3.5% 3.9% 3.4% 2.7% 10.5% 5.7% 5.6%
50121 1.5% 4.5% 1.4% 3.5% 4.7% 4.1% 4.0%
50252 4.2% 3.0% 3.0% 26.2% 5.8% 6.1% 5.3%
50279 20.0% 18.2% 22.0% 17.5% 15.9% 18.8% 18.8%
1.4% 1.4% 10.6% 5.5% 4.2% 3.1%
Basislinie: Tal zu Tal Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
7.6% 4.2% 2.5% 7.0% 4.5% 2.6% 5.2% 3.2% 1.9%
43.0% 44.6% 49.5% 35.7% 37.6% 41.1% 44.5% 46.8% 50.4%
5.2% 6.6% 6.6% 8.5% 9.7% 9.4% 6.2% 4.9% 6.1%
11.8% 13.5% 14.8% 13.0% 15.0% 14.9% 12.2% 13.6% 17.0%
10.1% 3.0% 2.7% 10.3% 5.0% 4.9% 11.3% 4.2% 3.6%
1.5% 1.3% 0.8% 4.1% 3.3% 3.1% 1.1% 1.9% 1.1%
3.4% 4.2% 2.8% 5.3% 5.5% 4.6% 2.1% 6.2% 1.5%
17.5% 22.6% 20.4% 16.2% 19.4% 19.4% 17.4% 19.2% 18.6%
3.6% 1.4% 1.5% 4.9% 3.2% 2.0% 3.4% 1.4% 2.1%
91

B. Quantifizierungsergebnisse empirischer Spektren
Ergebnisse der Quantifizierung von 10 Antikörper-Spektren mit verschiedenen Methoden.
Moleküle, die mittels der 4. Ableitung quantifiziert wurden, sind durch das Symbol * markiert.
Bei AK4 und AK5 wurden manche Massen zusammengefasst, weil diese eine gemeinsame
Glykosylierungsbasis haben.
Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK1 50116 11,1% 11,1% 11,5% 8,3% 9,7% 8,7%
50278 20,0% 20,0% 22,2% 21,8% 25,7% 26,6%
50440 25,5% 25,5% 25,3% 30,7% 29,5% 30,5%
50601 14,9% 14,9% 14,0% 13,8% 11,7% 11,6%
50762 16,9% 16,9% 16,3% 16,8% 16,7% 16,4%
50909 11,7% 11,7% 10,9% 8,7% 6,8% 6,3%
92
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
9,5% 12,7% 9,3% 9,3% 9,7% 9,6% 12,4% 9,5%
25,4% 24,2% 21,1% 21,1% 24,2% 22,8% 29,2% 29,6%
29,2% 30,7% 28,5% 28,5% 28,6% 31,5% 31,3% 34,2%
11,2% 13,9% 14,3% 14,3% 12,7% 12,5% 10,6% 11,0%
17,3% 12,7% 16,9% 16,9% 16,4% 17,1% 9,9% 10,8%
7,4% 5,8% 10,0% 10,0% 8,4% 6,5% 6,6% 4,9%
Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK2 50602 46,7% 48,8% 50,3% 63,5% 63,6% 68,7%
* 50764 23,6% 24,4% 23,7% 21,6% 23,2% 23,4%
50927 14,2% 13,1% 13,1% 7,5% 7,4% 5,5%
49157 15,5% 13,7% 12,9% 7,5% 5,9% 2,5%
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
69,5% 83,0% 54,4% 55,9% 62,8% 58,2% 60,2% 72,3%
25,5% 14,3% 23,2% 24,2% 24,8% 22,0% 23,5% 22,0%
3,1% 2,5% 10,4% 9,8% 5,9% 9,9% 8,0% 3,3%
2,0% 0,2% 12,1% 10,1% 6,5% 9,9% 8,3% 2,4%
Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK3 50602 47,8% 50,0% 49,6% 63,8% 66,4% 70,6%
* 50764 23,4% 24,3% 24,8% 22,3% 23,6% 24,5%
50927 13,9% 12,9% 13,3% 6,6% 5,3% 3,2%
49157 15,2% 12,9% 12,4% 7,3% 4,7% 1,7%
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
69,5% 83,0% 56,1% 58,9% 61,8% 64,6% 65,8% 74,3%
25,5% 14,3% 22,8% 24,2% 24,2% 20,7% 24,2% 23,7%
3,1% 2,5% 9,7% 8,7% 7,6% 6,2% 5,2% 0,9%
2,0% 0,2% 11,4% 8,2% 6,4% 8,6% 4,9% 1,1%

Molekül
AK4 49813
50015
50182
Manuell /
In-House
9,0%
34,0%
40,0%
17,0%
Molekül
49901
49959
50089
50121
50063
50222
50282
AK5 49732
49813
50017
Manuell /
In-House
9,3%
54,6%
29,9%
Massen
MaxEnt
10,1%
35,6%
37,2%
17,0%
Massen
49960
50089
50121
50252
Basislinie: nicht abgezogen
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
26,8% 29,8% 29,2%
18,4% 19,8% 19,1%
Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
16,3%
15,4% 8,2% 5,5%
41,5% 39,2% 39,4%
Basislinie: nicht abgezogen
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
28,9% 24,3%
31,4% 29,4%
13,9%
31,5% 31,1%
37,8% 38,4% 40,2%
27,4% 28,0%
25,4% 10,3% 9,2%
51,3%
59,1% 60,9%
26,9% 26,3%
50279 8,7% 10,0% 9,2% 3,6% 3,6% 3,6%
MaxEnt
14,5%
53,8%
21,4%
33,5%
18,8%
34,5%
28,8%
17,9% 19,4%
24,6%
22,7%
Basislinie: Spline Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3 QA1 QA2 QA3
26,2% 19,0% 15,2%
41,9% 43,6% 47,6%
25,3% 24,5% 28,4%
19,0% 22,3%
32,9% 34,8%
20,2%
29,8%
12,2% 5,5%
39,4% 36,6%
33,6%
14,8%
39,2%
14,8%
19,8%
42,6%
15,3%
15,0%
4,3%
36,1%
44,8%
14,7%
14,7%
30,3% 11,4% 8,8%
45,7% 53,0% 59,3%
17,9%
37,5%
27,4%
40,5%
28,3%
6,2% 6,5% 7,5% 9,0% 7,4% 6,0% 8,3% 3,6%
93

Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK6 35498 7,7% 7,7% 7,6% 4,1% 4,1% 3,4%
35581 11,6% 11,6% 11,6% 12,2% 12,2% 12,2%
35662 14,6% 14,6% 14,2% 17,3% 17,3% 17,6%
35743 16,2% 16,2% 16,4% 20,1% 20,1% 20,5%
35825 16,4% 16,5% 16,7% 19,5% 19,5% 19,7%
35906 14,9% 14,9% 14,9% 15,8% 15,8% 16,2%
35986 10,4% 10,4% 10,5% 7,1% 7,1% 7,0%
36063 8,2% 8,2% 8,1% 3,9% 3,9% 3,5%
94
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
6,0% 7,4% 4,6% 4,6% 4,1% 3,1% 3,1% 2,4%
11,0% 12,3% 11,0% 11,0% 11,1% 11,6% 11,6% 11,9%
16,0% 15,3% 16,0% 16,0% 16,3% 16,9% 16,9% 17,1%
18,0% 16,7% 18,8% 18,8% 19,3% 20,1% 20,1% 20,2%
19,0% 16,9% 19,1% 19,1% 19,4% 20,4% 20,4% 20,9%
16,0% 15,7% 16,4% 16,5% 16,2% 16,7% 16,7% 17,2%
9,0% 9,8% 8,9% 8,9% 8,8% 7,1% 7,1% 6,9%
5,0% 5,8% 5,2% 5,2% 4,9% 4,1% 4,1% 3,5%
Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK7 35340 10,6% 10,6% 10,5% 9,7% 9,7% 9,7%
35420 16,3% 16,3% 16,3% 18,1% 18,1% 18,3%
35503 20,9% 20,9% 21,0% 24,0% 24,0% 24,1%
35584 20,9% 20,9% 21,4% 24,0% 24,0% 24,3%
35665 15,2% 15,2% 15,1% 14,8% 14,8% 15,0%
35745 9,7% 9,7% 9,8% 6,7% 6,7% 6,6%
35825 6,5% 6,5% 6,0% 2,6% 2,6% 2,1%
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
8,0% 11,0% 9,3% 9,3% 8,4% 9,0% 9,0% 8,4%
14,0% 16,8% 17,1% 17,1% 16,8% 17,6% 17,6% 17,8%
20,0% 20,8% 23,3% 23,3% 23,6% 24,2% 24,2% 24,5%
28,0% 21,3% 23,4% 23,4% 24,2% 24,5% 24,5% 25,0%
18,0% 16,0% 15,5% 15,5% 16,0% 15,5% 15,5% 15,6%
9,0% 9,4% 8,0% 8,0% 8,1% 6,7% 6,7% 6,4%
3,0% 4,7% 3,6% 3,6% 3,0% 2,7% 2,7% 2,3%

Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK8 35342 13,2% 13,2% 12,9% 12,3% 12,3% 12,2%
35422 19,2% 19,2% 19,4% 22,4% 22,4% 22,4%
35504 23,1% 23,1% 23,3% 27,3% 27,3% 27,8%
35586 21,9% 21,9% 22,1% 24,7% 24,7% 25,2%
35668 13,8% 13,8% 13,8% 10,6% 10,6% 10,4%
35747 8,7% 8,7% 8,5% 2,7% 2,7% 2,0%
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
13,0% 13,5% 11,6% 11,6% 10,8% 13,2% 13,2% 13,0%
21,0% 20,3% 20,5% 20,5% 21,1% 19,2% 19,2% 19,4%
26,0% 23,7% 26,3% 26,3% 26,5% 23,1% 23,1% 23,3%
24,0% 23,1% 24,5% 24,5% 24,8% 21,9% 21,9% 22,2%
12,0% 14,0% 12,4% 12,4% 12,4% 13,8% 13,8% 13,7%
4,0% 5,5% 4,7% 4,7% 4,4% 8,7% 8,7% 8,4%
Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK9 35341 14,1% 14,1% 14,0% 14,4% 14,4% 14,1%
35422 20,3% 20,3% 20,3% 24,3% 24,3% 24,5%
35504 22,3% 22,3% 22,4% 25,2% 25,2% 25,7%
35585 22,8% 22,8% 22,9% 26,3% 26,3% 27,1%
35667 11,7% 11,7% 11,6% 6,5% 6,5% 6,2%
35744 8,9% 8,9% 8,8% 3,3% 3,3% 2,5%
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
16,0% 14,8% 12,9% 12,9% 12,3% 13,6% 13,6% 13,4%
24,0% 21,9% 22,0% 22,0% 21,1% 23,8% 23,8% 24,3%
23,0% 23,1% 25,0% 25,0% 25,3% 25,8% 25,8% 26,1%
24,0% 24,5% 25,7% 25,7% 27,1% 27,3% 27,3% 27,9%
9,0% 10,5% 9,4% 9,4% 9,5% 6,2% 6,2% 5,9%
4,0% 5,2% 5,2% 5,2% 4,7% 3,3% 3,3% 2,5%
Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK10 50601 47,0% 49,8% 49,9% 62,0% 64,3% 69,4%
* 50763 23,6% 24,2% 25,6% 21,8% 22,7% 23,5%
50927 14,0% 12,9% 11,2% 7,8% 6,6% 4,1%
49152 15,4% 13,1% 13,4% 8,4% 6,5% 3,0%
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
69,0% 69,0% 54,4% 56,9% 59,9% 57,6% 59,4% 74,7%
25,6% 28,0% 23,1% 24,1% 24,8% 21,7% 22,7% 21,4%
3,4% 2,9% 10,3% 9,6% 7,7% 10,5% 9,6% 2,9%
2,0% 0,1% 12,2% 9,4% 7,6% 10,2% 8,3% 0,9%
95

Molekül Massen
Basislinie: nicht abgezogen
QA1 QA2 QA3
Basislinie: Tal zu Tal
QA1 QA2 QA3
AK11 50564 8,4% 13,1% 7,4% 10,0% 3,3% 16,9%
50726 10,7% 11,6% 12,3% 11,2% 26,5% 16,9%
50885 8,6% 7,3% 9,0% 6,5% 3,0% 0,8%
50693 10,9% 11,8% 11,1% 13,5% 20,4% 20,7%
50854 11,3% 13,4% 11,1% 15,9% 19,2% 19,6%
51014 6,8% 5,8% 7,4% 4,6% 3,7% 4,5%
51036 7,4% 7,4% 7,5% 6,0% 4,1% 1,5%
51195 6,7% 8,5% 7,0% 4,9% 1,7% 4,6%
51162 7,4% 6,7% 7,5% 6,6% 2,5% 1,1%
51324 6,9% 4,4% 6,7% 6,5% 9,9% 4,4%
49119 7,9% 4,7% 5,9% 8,6% 2,7% 4,3%
49248 7,0% 5,3% 7,2% 5,9% 3,1% 4,9%
96
Manuell /
In-House
MaxEnt
QA1
Basislinie: Spline
QA2 QA3
Basislinie: 4. Ableitung
QA1 QA2 QA3
13,0% 15,3% 8,4% 14,2% 8,1% 11,1% 7,1% 6,7%
18,5% 18,9% 11,7% 12,4% 11,9% 17,7% 12,6% 22,5%
5,6% 2,0% 8,7% 7,0% 9,9% 5,5% 4,0% 10,0%
18,7% 20,5% 12,0% 12,7% 10,7% 15,1% 17,4% 25,9%
19,8% 20,4% 12,6% 14,7% 12,5% 13,8% 12,2% 20,6%
2,5% 1,6% 6,2% 5,3% 7,9% 2,3% 0,0% 1,3%
3,6% 5,4% 7,0% 7,3% 7,0% 6,9% 0,0% 2,2%
3,1% 4,5% 6,0% 8,7% 6,7% 4,0% 1,1% 1,8%
4,5% 4,1% 6,9% 6,4% 6,6% 7,2% 0,0% 2,2%
3,2% 3,4% 6,2% 3,5% 5,8% 3,9% 2,6% 0,8%
2,2% 1,3% 7,8% 3,6% 6,5% 6,6% 1,0% 1,2%
5,1% 2,5% 6,5% 4,3% 6,5% 5,9% 42,0% 5,0%

C. Massfinder II
Die Hauptseite von Massfinder II ist in Abb. C.1 zu sehen. Der obere Bereich enthält das ESI-
MS-Spektrum und der untere Bereich enthält die Maximum-Entropie-Entfaltung des Spektrums.
Die Peakserien werden im ESI-Spektrum vom Programm durch farbige Linien markiert.
Dabei entspricht jede Farbe einer anderen Masse. Auf dieser Seite besteht die Möglichkeit,
das Spektrum auf vorhandene Massen zu analysieren. Hierzu kann man sich die von MaxEnt
berechneten Massen als Linien-Peakserien oder Isotopenverteilte-Peakserien anzeigen lassen
und verifizieren, ob diese auch tatsächlich im Spektrum vorkommen oder nicht. Des Weiteren
hat man hier die Möglichkeiten, das Spektrum zu Glätten, die Basislinie abzuziehen, Peaks für
die Quantifizierung zu selektieren usw.
Abb. C.1: Hauptseite von Massfinder II.
Die nächste Seite (vgl. Abb. C.2) ist für die qualitative Auswertung konzipiert. Hier werden
für eine Masse automatisch die wahrscheinlichsten Modifikationen aus einer gegebenen Modifikationsliste
gefunden. Bei der Suchmethode kann zwischen direkter Suche und genetischem
Algorithmus gewählt werden.
97

Auf die Abbildung der dritten Seite wird verzichtet. Sie enthält eine Gesamtübersicht aller
Massen, derer Strukturen und derer Quantitäten. Der Report kann für die weitere Protokollierung
im ASCII-Format exportiert werden.
Die letzte Seite ist für die Bestimmung der Hüllkurve zuständig (vgl. Abb. C.3). Für jede
Masse kann hier die Hüllkurve im Diagramm dargestellt werden. Ein Algorithmus filtert im
Hintergrund automatisch diejenigen Peaks heraus, welche wahrscheinlich Ausreißer sind
(blaue Kreise). Das Fitting erfolgt dann auf die übrig gebliebenen (roten) Punkte. Die angepasste
Hüllkurve ist rot dargestellt. Die Basisfunktionen der Hüllkurve sind in grau dargestellt.
Um die Güte des Fittings zu beurteilen, werden von allen Parametern die Vertrauensintervalle
sowie der R² Wert angegeben. Sollte ein Fitting misslingen, besteht die Möglichkeit,
die Startparameter manuell festzulegen und durch Drücken von „Find & Update“ das Fitting
erneut zu starten. Beim Drücken des Knopfes „Autofit & Update“ hingegen wird versucht
die besten Startparameter automatisch zu ermitteln. Sollte die Ursache eines schlechten Fittings
nicht an den Startparametern liegen, sondern an der Anzahl verwendeter Basisfunktionen,
so kann diese angepasst werden. Standardmäßig werden zwei Basisfunktionen verwendet.
Die Anzahl kann jedoch zwischen 1 und 4 variiert werden. Sobald das Fitting ein akzep-
98
Abb. C.2: Zuweisung von Strukturen.

tables Resultat hat, kann dies dem Programm durch Drücken des Knopfes „Model accepted“
mitgeteilt werden. Die Hüllkurve der Peakserie wird daraufhin im Spektrum aktualisiert.
Abb. C.3: Fitting der Hüllkurve.
99

100

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