2. Chemische Synthese von Peptiden - Online Media Server

2. Chemische Synthese von Peptiden
Heute ist die chemische Synthese von Peptiden und Proteinen mit
Molekulargewichten von 3.000 – 10.000 Da möglich. Zwei Entwicklungen machten
dieses im Wesentlichen möglich:
- Kupplungsausbeuten von > 99,5%
- Razemisierungsfreiheit der Kupplung
Heute werden Peptide und Peptidomimetika auf zwei Wegen synthetisch hergestellt:
1) Flüssigphasenchemie
2) Festphasenchemie
Beide Methoden beruhen auf einer ausgeklügelten Schutzgruppenchemie. So
müssen die Seitenketten der Aminosäure permanent geschützt werden. Die α-
Aminogruppe wird temporär geschützt und die Carbonsäurefunktion wird zur
Kupplung aktiviert.
2.1 Die N α -Schutzgruppe
Für die Kupplung muss die Aminogruppe der Aminosäure geschützt werden, da
sonst nach Aktivierung der Säure die Aminosäure mit sich selber reagieren würde.
Nach der Kupplung muss diese Schutzgruppe schnell und mild abspaltbar sein,
damit eine weitere Kupplung erfolgen kann. Die Synthese von Peptiden wird somit
vom C- zum N-Terminus durchgeführt. Als temporäre α-Aminoschutzgruppe sind
heute zwei Urethan-Schutzgruppen gebräuchlich.
1) tert-Butoxycarbonyl (Boc) abspaltbar mit H +
2) Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) abspaltbar mit sek. Aminen
1

Die Fmoc-Schutzgruppe wird unter Bildung einer Carbanion-Zwischenstufe nach
einem E1cb-Mechanismus abgespalten. Die Boc-Schutzgruppe eliminiert nach E1
über eine Carbokation-Zwischenstufe (Abb. 1).
Abb. 1 Entschützung der Boc-Schutzgruppe (links) nach E1 und der Fmoc-Schutzgruppe
(rechts) nach E1cb (aus R. Brückner, Reaktionsmechanismen).
2

2.2 Die Schutzgruppen der Seitenketten
Die Schutzgruppen der Seitenketten müssen orthogonal sein. Diese Schutzgruppen
müssen während der Entschützung der N α -Schutzgruppen (Boc oder Fmoc) stabil,
am Ende der Synthese aber abspaltbar sein.
2.2.1 Ser, Thr und Tyr
Für die Boc- und Fmoc-Synthesestrategie schützt man die OH-Gruppen meist als
Ether. Im Fall der Boc-Chemie wird das Peptid am Ende mit HF entschützt und vom
Harz abgespalten. Im Fall eines Fmoc-Syntheseprotokolls wird zum Schluss mit
Trifluoressigsäure TFA (90%) abgespalten. Im Boc-Syntheseprotokoll werden daher
Schutzgruppen verwendet, die bedingt säurestabil sind. Sie überleben die temporäre
Entschützung der Boc-Schutzgruppe mit TFA, werden aber mit HF abgespalten. Es
wird die Benzoyl-(Bz)-Schutzgruppe eingesetzt. Im Fmoc-Syntheseprotokoll wird der
tert-Butylether verwendet. Dieser ist während der temporären Entschützung mit
Piperidin stabil, wird aber am Ende mit TFA gespalten.
Für die Aminosäure Tyr wechselt man oft auf die 2,6-Dichlorbenzylschutzgruppe.
2.2.2 Asp und Glu
Hier werden im Fall der Boc-Chemie die Benzylester (Bn) verwendet. Für die Fmoc-
Chemie kommt der tert-Butylester zum Einsatz.
2.2.3 Lys
O
O
H 2N COOH
O
O
H 2N COOH
Die ε-Aminogruppe von Lysin muss unbedingt geschützt werden. Im Boc-Synthese-
protokoll wird hierzu die Fmoc-Gruppe verwendet. Alternativ kann die 2-Chlorbenzyloxycarbonylschutzgruppe
(2ClZ) eingesetzt werden. Diese ist labiler als die
klassische Z- Schutzgruppe (Z = Benzyloxycarbonylschutzgruppe).
3

H 2N
COOH
H
N
O
O Cl
H 2N
COOH
Wird Fmoc-Chemie betrieben, so verwendet man meistens die Boc-Schutzgruppe.
2.2.4 Arg
Die Guanidiniumgruppe muß mit ihrem pKa-Wert von 12.5 nicht unbedingt geschützt
werden. Allerdings ist dann die Löslichkeit schlecht. Praktisch werden meistens
Benzolsulfonylschutzgruppen verwendet. Innerhalb der Boc-Chemie ist die 4-Toluol-
sulfonyl (Tos) und die Mesitylen-2-sulfonyl-Gruppe (Mts) beliebt.
H 2N
COOH
N
H
NH
N
H S
O
O
H 2N
COOH
N
H
Tos Mts
H
N
O
NH
N
H S
O
O
Betreibt man Fmoc-Chemie, so wird die Mtr-Schutzgruppe oder die Pmc-
Schutzgruppe verwendet.
H 2N
COOH
N
H
NH
O
NH
S O
OCH 3
H 2N
COOH
Mtr Pmc
N
H
NH
O
O
NH
S O
Die Säureempfindlichkeit dieser Schutzgruppen nimmt in der Reihe wie folgt ab:
2.2.5 His
Pmc > Mtr >> Mts > Tos
Im Fall des Histidins wird entweder N τ oder N π geschützt. So kann das N τ einfach
Tosyl geschützt werden. Im Boc-Syntheseprotokoll wird hingegen meistens die 2,4-
Dinitrophenylschutzgruppe (DNP) eingesetzt. Im Fall der Fmoc-Strategie wird N τ
O
4

häufig Boc oder einfach Trityl (Tr) geschützt. Für N τ wird häufig die BOM- (=
Benzyloxymethyl) oder die Bum-Schutzgruppe (= tert-Butoxymethyl) verwendet. Die
Verwendung von N π Schutzgruppen reduziert das Razemisierungsrisiko.
H 2N
H 2N
COOH
N
N
DNP
COOH
N
H 2N
N
H
Nτ Nπ NO 2
NO 2
2.2.6 Asn und Gln
HSCH 2CH 2OH
COOH
H
N
N
H 2N
HO
COOH
N
N H
S
NO 2
NO 2
H 2N
COOH
N
N
Tr
BOM
O His
O His
Bum
Diese Seitengruppen werden meist ungeschützt gelassen. Allerdings kann es zu
Dehydratisierung kommen was dann Nitrile ergibt.
2.2.7 Trp und Met
Diese Seitenketten werden in der Regel nicht geschützt.
2.2.8 Cys
Es handelt sich um eine sehr problematische Aminosäure, deren Schützung
unbedingt erforderlich ist. Für Boc-Chemie bietet sich die Acetamidomethyl-
Schutzgruppe (Acm) an. Sie ist ebenfalls kompatibel mit der Fmoc-Chemie. Die Acm-
Schutzgruppe wird mit Hg 2+ - oder Ag + -Salzen gespalten. Auch die mit Säure
abspaltbare Tr-Gruppe wird für Cys gerne verwendet.
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2.3 Acylierungen
H 2N
COOH
S
Tr
H 2N
COOH
S
Acm
Um eine Peptidbindung bilden zu können, muss die Carboxylatfunktion aktiviert
werden. Die unterschiedlichen Carboxylatderivate weisen eine unterschiedliche
Resonanzstabilisierung auf, welche die Reaktivität herabsetzt. Das Carboxylat mit ca.
30 kcal/mol, das Amid 22 kcal/mol und der Ester 14 kcal/mol sind relativ unreaktiv.
Anhydrid und Säurechlorid haben kaum Resonanzstabilisierung und sind aus diesem
Grund sehr reaktiv. Ziel der Carbonsäureaktivierung muss es also sein, Derivate zu
erzeugen, in denen die Resonanzstabilisierung nur minimal ist
O
O
<
O
NH 2
<
O
OR
<
N
H
O
O
O
O
Reaktivität nimmt zu
Der Angriff des Nukleophils ergibt eine Tetraederzwischenstufe, in der die Resonanzstabilisierung
nicht mehr existiert. Je größer der Verlust an Resonanzenergie, umso
höher liegt der Übergangszustand der Reaktion und umso unreaktiver ist das Derivat
(später Übergangszustand). Die Grundlagen der nukleophilen Substitution am
Carboxylat Kohlenstoff sollten im Lehrbuch (z. B. im R. Brückner Reaktionsmechanismen)
nachgelesen werden.
<
O
Cl
6

Abb. 2 Energieprofil (mit Mesomeriestabilisierung) zur Bildung der Tetraederzwischenstufe
aus einem Carbonsäurederivat.
Ein weiterer Punkt, der die Reaktivität beeinflusst, ist die Stabilisierung der tetraedrischen
Zwischenstufe. Je stärker die Stabilisierung, umso energetisch tiefer liegt
der Übergangszustand und umso schneller ist die Reaktion. Da die tetraedrischen
Zwischenprodukte oft negativ geladen sind, was sich im Übergangszustand partiell
bereits bemerkbar macht, wirken sich sehr elektronenziehende Substituenten (z. B
das Cl im Säurechlorid) stabilisierend und damit ratenbestimmend aus. Auch der
anomere Effekt stabilisiert die Tetraederzwischenstufe sehr stark. Der anomere
Effekt ist in Strukturelementen Het-C-Het (Het = Heteroatom) bedeutsam. Es handelt
sich um eine n-σ* Wechselwirkung (Abb. 3).
Abb. 3 Anomerer Effekt.
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Carbonsäuren werden für die Amidbindungsbildung daher zunächst in reaktive
Substanzen überführt. Sehr bekannt sind die Anhydride, die Pentafluorphenylester
(A), Thioester (B, aktiviert wegen der geringen Neigung des Schwefels Doppel-
bindungen zu bilden), Imidazolide (C) und natürlich die Aktivierung mit Hilfe des
Steglich-Reagenzes Dimethylaminopyridin (D, DMAP). Beim Steglich-Reagenz
würde eine Resonanz zu einer doppelt positiv geladenen Teilstruktur führen was
energetisch sehr ungünstig ist
O
F
F
O F
F F
A
O
S
N
B C
O O
Eine bekannte Methode zur Aktivierung von Carbonsäuren bietet das Mukaiyama-
Verfahren (Schema 1). Hier entsteht über Meisenheimer-analoge Zwischenstufen
(nukleophile aromatische Substitution) ein Aktivester, der leicht mit Nukleophilen
reagiert. Die Aktivierung findet hier in situ statt.
Schema 1 Carbonsäureaktivierung mit dem Mukaiyama-Reagenz.
Der Mechanismus der Carbonsäureaktivierung soll am Beispiel der Imidazolide
dargestellt werden (Schema 2). Hier wird ausgehend von der Carbonsäure mit
Carbonyldiimidazol das Imidazolid erzeugt.
N
N
N
D
O
N
N
8

Schema 2 Carbonsäureaktivierung über ein Imidazolid.
Man informiere sich über den Mechanismus der Bildung von Säurechloriden mit
Thionylchlorid und Oxalyldichlorid, sowie mit der Frage warum DMF die Bildung
eines Säurechlorids aus einer Carbonsäure und Thionylchlorid katalysiert.
2.4 Kupplungsmethoden
2.4.1 Aktivierung mit DCC
In der Peptidchemie wird nur selten ein stabiles aktiviertes Carbonsäurederivat
eingesetzt. Meist wird die N α - und Seitenketten-geschützte Aminosäure direkt in situ
vor der Kupplung aktiviert. Hierzu wird häufig ganz klassisch ein Gemisch aus DCC +
HOBt eingesetzt. DCC aktiviert die Carbonsäure unter Bildung eines sehr reaktiven
Acylisoharnstoffs. Dieser regiert mit dem HOBt zu einem Reaktivester, in dem ein
sehr großer Teil der anfänglichen Reaktivität konserviert ist (Schema 3). Dieser
Reaktivester reagiert dann mit der Nukleophil, z. B mit der freien Aminogruppe einer
zweiten Aminosäure. Eine direkte Umsetzung des Acylisoharnstoffs ist wenig ratsam,
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da die Reaktivität so hoch ist, das Razemisierung eintritt. Außerdem erfolgt ein, wenn
auch langsamer [1,3]-Acylshift, der zu einem unreaktiven Acylharnstoff führt (Schema
3E).
Schema 3 Carbonsäureaktivierung mit DCC.
Alternativ zum DCC wird häufig Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) verwendet, da der
sich hier bildende Harnstoff löslicher ist und leichter abgetrennt werden kann.
HOBt beschleunigt die Reaktion, unterdrückt die Razemisierung und hilft das die Asn
und Gln Seitengruppen nicht dehydratisieren. Mit Hilfe von DCC lassen sich also die
Aminosäuren in situ in relativ stabile Aktivester überführen wie: Pentafluorphenyl-
(Schema 3C) oder eben HOBt-Ester (Schema 3D). Diese Aktivester sind so stabil,
dass sie isoliert und chromatographiert werden können.
2.4.2 Aktivierung mit BOP
Sehr modern und beliebt ist neben der DCC-Methode, die Kupplung mit einem
Gemisch aus HBTU/HOBt oder BOP (BOP = Benzotriazolyloxytris[dimethylamino]-
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phosphoniumhexafluorophosphat), auch bekannt als Castros-Reagenz. Wichtig ist,
dass das Gegenion sehr wenig nukleophil ist, deshalb das PF6 - .
O
N
N
N
P
N
N
PF6 BOP
O
N
N
N
C
N
N
PF6 HBTU
Das BOP-Reagenz ist stabil, nicht hygroskopisch und sehr gut löslich in organischen
Lösungsmitteln. Generell ist das BOP-Reagenz wesentliche effizienter als die
Kombination DCC/HOBt. Ein Nachteil ist, dass während der Reaktion
Hexamethylphosphorsäuretriamid entsteht, das wegen seiner Carcinogenität
gefürchtet wird. Das neue Reagenz PyBop schafft hier Abhilfe. Dieses Reagenz
besitzt statt Methylgruppen, Pyrrolidineinheiten.
PF 6
O
N
N
N
P
N
N
PyBOP
N
Br
P
N
N
PyBroP
PF 6
N
Br
P
N
BroP
Andere neue Reagenzien enthalten überhaupt keine Oxybenzotriazole mehr. Hierzu
gehören BroP oder auch PyBroP. Diese Reagenzien kuppeln vor allem sekundäre
Amine wie N-Methylaminosäuren sehr effizient.
Weitere Reagenzien, die sehr beliebt sind, sind HBTU (HBTU = 2-(1H-benzotriazol-
1-yL)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat) oder auch einfach die Carbonsäurechloride
oder -fluoride. Besonders aktiv ist das neue Reagenz HATU.
N
PF 6
11

N
O
N
N
N
C
N
N
PF6 HATU
O
OH
N
F
N
F N F O
Die Synthese der Kupplungsreagenzien ist beispielhaft für BOP in Schema 4 gezeigt.
Schema 4 Synthese des BOP-Reagenz.
Manchmal ist es nötig, während der Peptidsynthese gezielt eine Aminogruppe einer
Lys-Seitenkette freizusetzen, um z. B eine Zyklisierung einzuleiten. Hierzu benötigt
man eine weitere orthogonale Schutzgruppe. In der Regel wird hierfür die
Allyloxycarbonylgruppe (Alloc) verwendet.
O
O
NH
P 1 HN
O
NHP 2
2.5 Festphasensynthese
Bu 3SnH
PdCl 2(PPh 3) 2
H 2N
P 1 HN
F
O
NHP 2
Bei der Festphasensynthese wird das Peptid an einem Polymer, einem festen
Träger, hergestellt. Durch die Immobilisierung können die verwendeten Reagenzien
sehr schnell ausgewaschen werden. Ferner können Sie in großem Überschuss
zugesetzt werden, wodurch die Kupplungsausbeuten deutlich gesteigert werden
können. Die Immobilisierung erlaubt es die Peptidsynthese zu automatisieren. So
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gibt es heute kommerzielle Peptidsynthesegeräte mit denen Peptide bis zu einer
Länge von 100 Aminosäuren (praktisch 50 Aminosäuren) hergestellt werden können.
Bei der Peptidsynthese wird an der festen Phase eine repetitive Sequenz aus
Kupplung, Entschützung der temporären Schutzgruppe und erneuter Kuppelung
durchgeführt (Abb. 4).
Abb. 4 Typische Reaktionssequenz zum Aufbau eines Peptids an der festen Phase.
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Besondere Beachtung muss dem Harz-Polymer und dem Linker geschenkt werden.
Der Linker ist das Bindeglied zwischen dem polymeren Träger und dem Peptid.
Dieser Linker muss am Ende, ebenso wie die permanenten Schutzgruppen, spaltbar
sein, um das Peptid freizusetzen. Im Fall der Boc-Chemie muss die Spaltung
demnach mit HF und im Fall der Fmoc-Chemie mit ca. 80%-iger TFA realisierbar
sein. Der Linker legt fest, ob nach der Abspaltung eine C-terminale Carbonsäure
oder eine andere Gruppe wie z.B. ein Amid erhalten wird.
Im Fall des Harzes, also des Polymers, sind die Quell-Eigenschaften bedeutsam
sowie die Beladung und die Inertheit gegenüber den Reagenzien. Das Harz muss
gut quellen, damit die Reagenzien leicht an die Synthesestelle gelangen können.
Man muss sich das Polymer als ein eng geknüpftes Maschennetzwerk vorstellen, in
dem das Peptid hergestellt wird.
2.5.1 Die feste Phase
In der Regel handelt es sich um Polystyrol, das mit 1% m-Divinylbenzol versetzt
(crosslinking) wurde. Die Funktionalisierung geschieht meist über eine
Chlormethylierung. Zwischen die Chlormethylgruppe und die erste Aminosäure wird
meist ein Linker gesetzt, der die Abspaltung des fertigen Peptides vom Harz am
Ende der Synthese erlaubt.
Die wichtigsten Harze sind:
A) Wang-Harze nennt man Harze, die einen Wang-Linker zwischen dem
Polystyrol und dem Peptid besitzen. Diese Harze werden im Rahmen der Fmoc-
Peptidsynthese eingesetzt und erlauben die Synthese von C-terminalen
Carbonsäuren. Wang-Harze enthalten einen p-Alkoxybenzylesterlinker. Man erhält
die Wang-Harze durch Umsetzung der Chlormethylpolystyrole mit 4-
Hydroxybenzylalkohol. Die Abspaltung des fertigen Peptids erfolgt mit TFA.
B) Rink-Harze (4-(2’,4’-Dimethoxyphenylhydroxymethyl-phenoxy-Harze) sind
entweder als Amid- oder Säure-Harze erhältlich. Das Amid-Harz liefert C-terminale
Amide und wird für die Fmoc-Synthese eingesetzt. Das Rink-Säure-Harz ermöglicht
Peptidsynthese nach der Boc-Strategie. Es liefert C-terminale Carbonsäuren.
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Der Rink-Säure-Linker ist, ebenso wie der Chlortrityl-Linker, so säurelabil, dass die
Peptide z. B. mit verdünnter TFA vollgeschützt vom Harz abgespalten werden
können. Diese Fragmente können dann in der Fragmentkondensation eingesetzt
werden.
O
Chlortrityl-Harz
OH
Wang-Linker Rink-Amid-Linker
N
Cl
Cl
NO 2
OH
Oxim-Linker
O
NH 2
O
NHFmoc
MBHA-Amid-Linker
O
NH
O
PAM-Linker
OH
O
OH
Rink-Säure-Linker
Cl
Merrifield-Harz
C) MBHA- und PAM-Harze: Die MBHA = p-Methylbenzhydrylamin- oder PAM =
Phenalacetamidomethyl-Harze werden ebenso wie das klassische Merrifield-Harz im
Rahmen der Boc-Peptidsynthese verwendet. Die Abspaltung der fertigen Peptide
erfolgt am Ende mit HF. Mit den MBHA-Harzen werden Peptidamide erhalten. Die
PAM-Harze liefern die Carbonsäuren. Will man mit Hilfe der Boc-Strategie voll
geschützte Peptide herstellen, so kann dieses mit Oxim-Harzen erreicht werden. Hier
findet die Spaltung mit NH3 oder H2N-NH2 statt.
O
15

Neben diesen Linkern, die mit unterschiedlich starken Säuren die Abspaltung des
Peptides ermöglichen, gibt es eine große Auswahl anderer Linker, die eine völlig
orthogonale Abspaltung mit z. B. Licht (Nitrobenzyl-Harze) oder Pd(0) (Allyl-Harze)
ermöglichen.
HN
O
Nitrobenzyl-Linker
NO 2
Br
HN
O
Br Allyl-Linker
Abb. 5 Abspaltung eines Peptids im vollgeschützten Zustand. Die Synthese erfolgte nach
dem Fmoc-Protokoll an einem Sasrin-Harz, welches dem Wang-Harz sehr ähnlich ist.
2.5.2 Die Entschützung
• Man kann das Peptid mitsamt den Seitenketten-Schutzgruppen abspalten,
wenn z. B. eine spätere Fragmentkondensation geplant ist.
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• Möglich ist auch, zunächst wenige orthogonale Schutzgruppen am Peptid
abzuspalten, um z. B. zunächst eine Cyclisierung am Harz durchzuführen.
• In den meisten Fällen wird man wohl das Peptid komplett am Harz
entschützen und dann auch gleich vom Harz abspalten.
Die komplette Entschützung und gleichzeitige Abspaltung vom Harz erreicht man im
Fall der Boc-Strategie mit flüssigem HF, Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) in TFA
oder HBr in HOAc. Im Fall der Fmoc-Strategie wird TFA (ca. 80%ig) in CH2Cl2
verwendet. Für die HF-Abspaltung wird eine spezielle Ausrüstung benötigt.
In der Regel werden Abfangreagenzien (scavanger) zugesetzt, um reaktive Inter-
mediate abzufangen, die das Peptid schädigen könnten. Hier kommen Anisol,
Ethandithiol, Dimethylsulfid, u. a. zum Einsatz.
Schema 5 Beispiel für die Synthese eines zyklischen Peptids direkt am Harz.
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In Schema 5 ist beispielhaft die Synthese eines zyklischen Peptids an der festen
Phase gezeigt. Das Peptid wird mit Hilfe der Boc-Strategie an einem Oxim-Harz
synthetisiert. Eine Asparaginsäure und ein Lysin-Rest werden Fmoc geschützt. Diese
Schutzgruppen werden nach der kompletten Peptidsynthese selektiv entschützt.
Dann erfolgt die Cyclisierung mit dem Reagenz BOP direkt am Harz. Ganz zum
Schluss wird vollständig entschützt und vom Harz abgespalten.
2.6 Synthese von langen Peptiden und Proteinen
Zur Synthese sehr langer Peptide oder von Proteinen mit unnatürlichen Aminosäuren
existieren derzeit 4 Methoden:
1. Fragmentkondensation
2. Ligationen (native chemical ligation)
3. Int-/Ent-Systeme
4. Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine
2.6.1 Fragmentkondensation
Durch die normale Peptidsynthese sind Peptide mit einer Länge von 30 – 40
Aminosäuren herstellbar. Längere Peptide neigen am Harz zur Aggregation, was die
Syntheseausbeute sehr deutlich reduziert. Man erhält dann uneinheitliche Produkte.
Die Kupplungsausbeute lässt sich mit Hilfe von Detektoren (Abspaltung der Fmoc-
Gruppe) oder mit Hilfe von Ninhydrin-Tests überwachen.
Bei der Segmentkondensation werden die Peptide vollständig geschützt isoliert.
Dann werden die zwei Fragmente gekuppelt. Die Limitierungen liegen in zu
schlechten Ausbeuten auch bedingt durch eine geringe Löslichkeit. Razemisierung
der aktiven Aminosäure ist ebenfalls ein Problem.
2.6.2 Ligation von ungeschützten Peptidsegmenten
Eine typische funktionelle Proteindomäne enthält 130 ± 40 Aminosäuren. Nur 70
lassen sich heute am Harz routinemäßig kuppeln und schon das erfordert viel
Erfahrung.
Chemische Ligation ermöglicht es zwei ungeschützte Peptidsegmente zu kuppeln.
Man benötigt allerdings einen N-terminalen Cysteinrest an der Kupplungsstelle.
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Man synthesitsiert zunächst ein Peptid mit einem C-terminalen Thioester. Das zweite
Fragment enthält N-terminal ein Cystein. Werden beide Fragmente zusammen-
gegeben, so setzt ein Thiolaustausch ein, in dessen Folge im Gleichgewicht auch
das Thioester verknüpfte Produkt entsteht. Eine schnelle Umlagerung führt zum
Trapping des Intermediats unter Ausbildung einer Peptidbindung.
Es gibt mittlerweile auch Methoden, die es ermöglichen Peptide zu legieren ohne
dass ein Cys-Rest anwesend sein muss.
Ein Problem ist immer die Synthese des Thioesters vom Fragment 1. Hier wird
zumeist das Peptid durch Boc-Chemie assembliert, welches per Thioester mit dem
Harz verbunden ist. Dann wird das Peptid schrittweise aufgebaut und am Ende
abgespalten. Der Thioester „überlebt“ diese Schritte gut. Problematischer ist die
Synthese der Thioester basierend auf der Fmoc-Chemie, da der Thioester den
regelmäßigen Fmoc-Abspaltungen nicht standhält.
Meist wird zunächst das Peptid hergestellt, welches dann mit Benzylbromid den in
die Ligation einsetzbaren Thioester ergibt.
Fmoc-Chemie muss unbedingt angewendet werden, wenn zum Beispiel glykosylierte
Peptide legiert werden sollen. Hier helfen die Säure und Base stabilen „Safety-
Catch“-Linker von J. Ellman. Das Peptid wird am „Safety-Catch“-Linker mittels Fmoc-
Chemie assembliert. Die letzte Aminosäure ist Boc geschützt. Das ist wichtig, da
diese erst nach der Thioesterbildung entschützt werden kann. Das Harz wird dann
mit ICH2CN behandelt und so der Linker aktiviert. Die Abspaltung vom Harz unter
Ausbildung des Thioesters erfolgt mit Thiobenzylalkohol. Dann werden alle
Schutzgruppen mit TFA abgespalten und das Peptid gereinigt. Die Ligation wird per
HPLC verfolgt. Die endgültige Charakterisierung erfolgt durch MS (ESI-MS).
2.6.3 Int-/Ent-Systeme †
2.6.4 Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine †
† Dieser Abschnitt wird zu einem späteren Zeitpunkt fertig gestellt.
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