Ablaufplan - Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Ablaufplan - Institut für Pharmakologie und Toxikologie
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Pharmakologisch-Toxikologisches<br />
Demonstrationspraktikum<br />
<strong>für</strong> Pharmaziestudenten<br />
8. FS<br />
Sommersemester 2012<br />
Praktikumsanleitung<br />
1
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Pharmakologie</strong> <strong>und</strong> <strong>Toxikologie</strong><br />
Drackendorfer Str. 1 07747 Jena<br />
Ansprechpartner: Dr. U. Merkel<br />
� 03641/9 325653 Fax: 03641/9 325672<br />
E-Mail: Ute.Merkel@med.uni-jena.de<br />
27.04.2012<br />
2
<strong>Ablaufplan</strong> Demonstrationspraktikum 2012<br />
Pharmaziestudenten 8. Semester<br />
Di., 15.05.2012 12 Uhr HS Philosophenweg<br />
Einführungsveranstaltung<br />
Dr. U. Merkel, AB Klinische <strong>Pharmakologie</strong>, <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Pharmakologie</strong> <strong>und</strong> <strong>Toxikologie</strong><br />
Mo., 21.05.2012 13-17 Uhr HS Chirurgie<br />
"Sind Tierversuche in der Pharmakologischen Forschung noch notwendig?“<br />
Dr. H. Schubert, <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Versuchstierk<strong>und</strong>e<br />
Di., 22.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
Mi., 23.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
Do., 24.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
Fr., 25.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
___________________________________________________________________________________<br />
Mo., 28.05.2012 Frei (Pfingstmontag).<br />
Di., 29.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
Mi., 30.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
Do., 31.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
Fr., 01.06.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)<br />
___________________________________________________________________________________<br />
Mo., 04.06.2012 14:30-18:30 Uhr !!!<br />
Studenten der Gruppen 1-4: HELIOS Klinikum, Erfurt, Nordhäuser Straße 74<br />
„Aufgaben <strong>und</strong> Arbeitsweise des Giftinformationszentrums - Vergiftungsgeschehen -<br />
Allgemeine Maßnahmen der Vergiftungsbehandlung - Akute Vergiftungen durch<br />
Arzneimittel, Haushaltschemikalien <strong>und</strong> Pflanzen“<br />
Dr. D. Prasa, Dr. H. Hentschel, Giftinformationszentrum HELIOS Klinikum Erfurt<br />
Ort: AUDITORIUM HELIOS Klinikum<br />
Treffpunkt: 14:25 Uhr Giftinformationszentrum (vgl. WEGBESCHREIBUNG)<br />
Anschließend R<strong>und</strong>gang durch das GGIZ - Informationsquellen –<br />
Erläuterung der Arbeitsweise am Beispiel konkreter Vergiftungsfälle<br />
WEGBESCHREIBUNG:<br />
Bei Anreise mit der DB: Fahren Sie vom Hauptbahnhof mit den Straßenbahnlinien 3 (Richtung<br />
Europaplatz) oder 6 (Richtung Rieth) bis zur Haltestelle Universität. Gegenüber der Uni ist der<br />
Haupteingang zum HELIOS Klinikum. Nach der Schranke linkerhand um den Parkplatz in die<br />
Sackstraße, dann stehen Sie vor dem Giftinformationszentrum.<br />
Bei Anreise mit Pkw: Autobahn, Abfahrt Erfurt-Ost in Richtung Erfurt, dem Richtungshinweis<br />
HAUPTKLINIKUM Nordhäuser Straße folgen.<br />
Studenten der Gruppen 5-8: SocraTecR&D GmbH, Erfurt, Mainzerhofplatz 14,<br />
Eingang B, 3. OG<br />
„Gr<strong>und</strong>lagen der biometrischen Planung Klinischer Studien“<br />
Dr. M. Wonnemann<br />
„Gr<strong>und</strong>lagen der Bioverfügbarkeit - Bioäquivalenz unter dem Aspekt der galenischen<br />
Optimierung bzw. der Nachentwicklung von Arzneimitteln“<br />
Dr. F. Donath<br />
3
WEGBESCHREIBUNG:<br />
Vom Vorplatz des Erfurter Hauptbahnhofes mit der Linie 4 Richtung Bindersleben/Flughafen bis<br />
zur Station "Theater" (ca. 8 min.). Beim Aussteigen nach rechts wenden, die Straße überqueren.<br />
Benutzen Sie Eingang "B". Die Station befindet sich in der 3. Etage.<br />
Di., 05.06.2012 14-18 Uhr !!!<br />
Thema <strong>und</strong> WEGBESCHREIBUNG: s. 04.06.<br />
Studenten der Gruppen 1-4: SocraTecR&D GmbH, Erfurt, Mainzerhofplatz 14, Eingang B,<br />
3.OG<br />
Studenten der Gruppen 5-8: HELIOS Klinikum, Erfurt, Nordhäuser Straße 74<br />
Mi., 06.06.2012 13-17 Uhr HS KL 2000 HS 2<br />
„HIV-Therapie“<br />
Dr. Th. Seidel, Weimar<br />
Do., 07.06.2012 13-17 Uhr HS Kinderklinik<br />
„Pharmakotherapie im Kindesalter“<br />
Frau Dr. G. Rönnefarth, Klinik <strong>für</strong> Kinder- <strong>und</strong> Jugendmedizin<br />
Fr., 08.06.2012 13-17 Uhr HS Kinderklinik<br />
„Arzneimittelsicherheit / Klinische Studien“<br />
PD Dr. T. Gräser, Jenapharm GmbH; Dr. A. Müller, Boehringer Ingelheim Pharma<br />
___________________________________________________________________________________<br />
Mo., 11.06.2012 13-17 Uhr HS Frauenklinik<br />
“Aktuelle Aspekte des Dopings im Sport”<br />
Frau Dr. B. Wanjek, <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Sportwissenschaften, Lehrstuhl <strong>für</strong> Sportmedizin<br />
Di., 12.06.2012 13-17 Uhr HS HNO<br />
"Medikamentöse Therapie von HNO-Erkrankungen"<br />
Prof. Dr. S. Koscielny, HNO-Klinik<br />
Mi., 13.06.2012 13-17 Uhr Lobeda, Konferenzraum Laborzentrum<br />
„Standardimpfungen nach STIKO-Empfehlungen <strong>und</strong> ausgewählte Impfindikationen“<br />
Prof. Dr. W. Pfister, <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Medizinische Mikrobiologie<br />
Do., 14.06.2012 13-17 Uhr HS KL 2000 HS 1<br />
„Therapie von Schlafstörungen <strong>und</strong> Epilepsie“<br />
Prof. Dr. M. Schwab, Klinik <strong>für</strong> Neurologie<br />
Fr., 15.06.2012 13-17 Uhr HS Kinderklinik<br />
„Aktueller Stand der Gen- <strong>und</strong> Zelltherapie”<br />
Prof. Dr. U. Kleeberg, Berlin<br />
___________________________________________________________________________________<br />
Mo., 18.06.2012 13-17 Uhr HS Frauenklinik<br />
„Pharmakotherapie in der Schwangerschaft“<br />
Frau OÄ Dr. M. Bulgay-Mörschel, Frauenklinik<br />
Di., 19.06.2012 13-17 Uhr HS Psychiatrie<br />
„Klinische Anwendungsgebiete von Psychopharmaka“<br />
OA PD Dr. S. Smesny, Klinik <strong>für</strong> Psychiatrie<br />
Mi., 20.06.2012 13-17 Uhr HS Frauenklinik<br />
“Dentalpharmaka”<br />
Frau PD Dr. F. Jahn, Zentrum <strong>für</strong> Zahn-, M<strong>und</strong>- <strong>und</strong> Kieferheilk<strong>und</strong>e<br />
Do., 21.06.2012 13-14:30 Uhr HS Chirurgie<br />
Testat<br />
4
Themenübersicht<br />
Thema 1: Pharmakologische <strong>und</strong> toxikologische Bedeutung des Seite 8<br />
Fremdstoffmetabolismus<br />
PD Dr. A. Lupp<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Pharmakologie</strong> <strong>und</strong> <strong>Toxikologie</strong>, Drackendorfer Str. 1<br />
Thema 2: Narkose <strong>und</strong> Schmerzbekämpfung Seite 12<br />
Dr. H. Schubert<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Versuchstierk<strong>und</strong>e <strong>und</strong> Tierschutz, Dornburger Straße 23<br />
Thema 3: Demonstration des Elektroenzephalogramms bei verschiedenen Seite 25<br />
Aktivitätszuständen<br />
Herr Dr. R. Huonker<br />
Biomagnetisches Zentrum, Klinik <strong>für</strong> Neurologie, Erlanger Allee 101<br />
Thema 4: Klinische <strong>und</strong> Forensische <strong>Toxikologie</strong>, Gr<strong>und</strong>lagen Seite 30<br />
<strong>und</strong> Fallbeispiele<br />
PD Dr. F. Peters, Dr. Ch. Sauer<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Rechtsmedizin, Fürstengraben 23<br />
Thema 5: Auswirkungen von akuter Hypoxie auf Kreislaufregulation Seite 32<br />
<strong>und</strong> Säure-Basen-Haushalt<br />
Prof. Dr. R. Bauer<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Molekulare Zellbiologie, Zentrum <strong>für</strong> Molekulare Biomedizin,<br />
Ebene 3, Hans-Knöll-Straße 2<br />
Thema 6: Blut <strong>und</strong> Blutbestandteile <strong>und</strong> deren Charakterisierung Seite 42<br />
Dr. S. Mosig, Dr. K. Rennert<br />
AG Molekulare Hämostaseologie, Bachstr. 18<br />
Thema 7: Diagnostische <strong>und</strong> therapeutische Anwendung von Antikörpern Seite 52<br />
Prof. Dr. T. Kamradt, Dr. M. Gabler, U. Lehmann, PhD, Dr. S. Drube,<br />
Dr. J. Stirnweiss, Dr. I. Irmler, Dipl. Biochem. M. Böttcher,<br />
Dipl. Biol. Ch. Göpfert, I. Meininger<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Immunologie, Leutragraben 3<br />
Thema 8: Test zur verhaltensbiologischen Charakterisierung Seite 65<br />
Dr. B. Günther<br />
Service-Einheit Kleinnager, Forschungszentrum Lobeda,<br />
Erlanger Allee 101<br />
5
<strong>Ablaufplan</strong> der praktischen Übungen<br />
IPT <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Pharmakologie</strong> <strong>und</strong> <strong>Toxikologie</strong>, Drackendorfer Str. 1<br />
IfR <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Rechtsmedizin, Fürstengraben 23<br />
CMB <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Molekulare Zellbiologie, Zentrum <strong>für</strong> Molekulare Biomedizin, Hans-Knöll-Straße 2, Ebene 3<br />
AGMH AG Molekulare Hämostaseologie, Bachstr. 18<br />
IVTK <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Versuchstierk<strong>und</strong>e <strong>und</strong> Tierschutz, Dornburger Straße 23<br />
SEK Service-Einheit Kleinnager, Forschungszentrum Lobeda, Erlanger Allee 101<br />
Immunologie <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Immunologie, Leutragraben 3<br />
BMZ Biomagnetisches Zentrum, Klinik <strong>für</strong> Neurologie, Erlanger Allee 101<br />
13 -17 Uhr<br />
Datum<br />
Thema 1<br />
PD Dr. A. Lupp<br />
IPT<br />
Thema 2<br />
Dr. H. Schubert<br />
IVTK<br />
Thema 3<br />
Dr. R. Huonker<br />
BMZ<br />
Thema 4<br />
PD Dr. F. Peters<br />
Dr. C. Sauer<br />
IfR<br />
Thema 5<br />
Prof. Dr. R. Bauer<br />
CMB<br />
Thema 6<br />
Dr. S. Mosig,<br />
Dr. K. Rennert<br />
AGMH<br />
Thema 7<br />
Dr. M. Gabler<br />
U. Lehmann, PhD<br />
Immunologie<br />
Thema 8<br />
Dr. B. Günther<br />
22.05.2012 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8<br />
23.05.2012 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1<br />
24.05.2012 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2<br />
25.05.2012 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3<br />
29.05.2012 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4<br />
30.05.2012 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5<br />
31.05.2012 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6<br />
01.06.2012 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7<br />
SEK<br />
6
TEILNEHMER<br />
Gruppe 1 Gruppe 5<br />
1. Kühn, Anne 31. Schubert, Gregor<br />
2. Müller, Lisa 32. Hartwig, Manfred<br />
3. König, Stefanie 33. Werner, Sebastian<br />
4. Klinger, Stephan 34. Langenberg, Maximilian<br />
5. Gabriel, Nils 35. Beitlich, Florian<br />
6. Hauck, Markus 36. Zhong, Sicheng<br />
7. Lihs, Anna 37. Maczewsky, Jonas<br />
8. Knitsch, Sebastian 38. Löser, Konstantin<br />
Gruppe 2 Gruppe 6<br />
9. Hunger, Maike 39. Sturm, Michael<br />
10. Kamm, Katrin 40. Eger, Julia<br />
11. Marquardt, Stefanie 41. Schömburg, Kevin<br />
12. Kraus, Manuela 42. Seidel, Christoph<br />
13. Hofmann, Sarah 43. Hoffmann, Mario<br />
14. Hilgenberg, Daniela 44. Striegel, Anne-Sophie<br />
45. Oette, Stefan<br />
46. Hoxha, Ana<br />
Gruppe 3. Gruppe 7<br />
15. Viehmeier, Verena 47. Wetzel, Diana<br />
16. Fischer, Christoph 48. Ebert, Kerstin<br />
17. Boydeva, Hristina G. 49. Wohlsdorf, Anja<br />
18. Harnisch, Henrik 50. Bauer, Julia<br />
19. Bachmann, Julia 51. Jestädt, Nadine<br />
20. Grimm, Christiane 52. Höppner, Marlen<br />
21. Zettl, Mareen 53. Brandenburger, Isabell<br />
22. Lapp, Sissy 54. Jacob, Heike<br />
Gruppe 4 Gruppe 8<br />
23. Dörfer, Franziska 55. Weile, Carolin<br />
24. Reif, Andrea 56. Petzel, Linda<br />
25. Linhardt, Claudia 57. Heyen, Marie<br />
26. Mücke, Marie-Sophie 58. Heidenreich, Pia<br />
27. Gröpler, Christine 59. Weber, Daniela<br />
28. Ernst, Julia 62.<br />
29. März, Stefanie 63.<br />
30. Frank, Franziska 64.<br />
7
Thema 1 Pharmakologische <strong>und</strong> toxikologische Bedeutung des<br />
Fremdstoffmetabolismus<br />
PD Dr. A. Lupp<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Pharmakologie</strong> <strong>und</strong> <strong>Toxikologie</strong>, Drackendorfer Str. 1<br />
1.1 Einführung<br />
Der Organismus besitzt eine Reihe von Enzymen, die in der Lage sind, Fremdstoffe <strong>und</strong><br />
endogene Substanzen zu metabolisieren. Dieser Prozeß wird als Biotransformation bezeichnet.<br />
Hauptort der Biotransformation ist die Leber. Allerdings sind auch in praktisch allen anderen<br />
Organen <strong>und</strong> Geweben Biotransformationsaktivitäten nachweisbar. Man unterscheidet<br />
Reaktionen der Phase I (Oxidation, Reduktionen, Hydrolysen) <strong>und</strong> der Phase II (Konjugationen,<br />
z.B. Glucuronidierung, Sulfatierung, Kopplung an Glutathion).<br />
Die durch Biotransformation entstehenden Metabolite sind meistens hydrophiler als die Ausgangssubstanz,<br />
so dass überhaupt erst eine Ausscheidung über die Niere ermöglicht wird. Ohne<br />
Biotransformation wäre die Verweildauer der meist lipophilen Fremdstoffe im Organismus sehr<br />
lang. Damit ist die Biotransformation entscheidend <strong>für</strong> die Elimination der meisten Stoffe. Hinzu<br />
kommt, dass viele Arzneimittel durch die Metabolisierung ihre Wirkung verlieren. Es ist aber<br />
auch möglich, dass durch Biotransformation eine Substanz erst in die wirksame Form überführt<br />
wird oder ein toxischer Metabolit entsteht.<br />
Eine besondere Bedeutung besitzt die Cytochrom-P450 (CYP)-abhängige Monooxygenierung<br />
von Fremdstoffen. Es gibt eine große Anzahl von CYP-Enzymen, die sich in ihrer<br />
Substratspezifität <strong>und</strong> dementsprechend in ihrer Bedeutung <strong>für</strong> die Entgiftung oder Giftung von<br />
Stoffen unterscheiden. Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass verschiedene<br />
Fremdstoffe bestimmte CYPs induzieren <strong>und</strong> somit die Wirkung von Substanzen wesentlich<br />
beeinflussen können. Manche Fremdstoffe können eine Hemmung von CYP-Enzymen<br />
bewirken. Schließlich können Fremdstoffe auch die Leberfunktion ganz allgemein beeinflussen<br />
<strong>und</strong> damit andere Prozesse, z.B. die Induzierbarkeit von CYP-Enzymen, verändern. Die<br />
zugr<strong>und</strong>e liegenden Vorgänge sind meist sehr komplex <strong>und</strong> können die Ursache von<br />
Fremdstoffinteraktionen sein. Solche Interaktionen sind unter anderem bei der Anwendung von<br />
Arzneimitteln zu beachten.<br />
Das CYP 1A1, das <strong>für</strong> die Bildung von kanzerogenen Metaboliten aus z.B. Benz(a)pyren<br />
verantwortlich ist, wird durch polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. 3-Methylcholanthren<br />
<strong>und</strong> β-Naphthoflavon) induziert. Andere CYP-Formen, die <strong>für</strong> den Metabolismus von<br />
körpereigenen Stoffen (z.B. Steroidhormonen) oder von Pharmaka von besonderer Bedeutung<br />
sind, werden durch andere bekannte Modellinduktoren (z.B. Phenobarbital oder Dexamethason)<br />
induziert.<br />
Wegen ihrer toxikologischen <strong>und</strong> pharmakologischen Bedeutung ist es wichtig, die Induktion<br />
bestimmter CYP-Formen nachzuweisen. Das kann geschehen, indem man die<br />
Biotransformation eines Fremdstoffes (Modellsubstrats) bestimmt, die relativ spezifisch nur von<br />
einer (oder mehreren) interessierenden CYP-Form(en) katalysiert wird (z. B. ECOD, EROD oder<br />
PROD, s. Versuch). Mithilfe von Antikörpern kann z.B. im Western-Blot direkt die Konzentration<br />
spezifischer CYP-Enzyme bestimmt werden. Mittels Immunhistochemie ist es möglich, sowohl<br />
die räumliche Verteilung der CYPs innerhalb der Leberläppchen als auch einen Induktionseffekt<br />
zu beurteilen. Eine Aussage über die enzymatische Aktivität ist hiermit aber nicht unmittelbar<br />
erreichbar. Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis einer stattgef<strong>und</strong>enen Induktion stellt die<br />
Ermittlung der spezifischen CYP-mRNA-Expression dar. Hierzu sind moderne<br />
molekularbiologische Methoden verfügbar wie die RT-PCR als semiquantitative Bestimmung<br />
oder die kompetitive RT-PCR bzw. die Real-time-quantitative-PCR zur Quantifizierung der<br />
mRNA-Konzentration.<br />
8
1.2 Aufgabe<br />
Einfluss von Modellinduktoren auf die hepatische CYP-Aktivität: Bestimmung der Dealkylierung<br />
von Modellsubstraten mit Material aus Rattenlebern (Homogenat, 9.000g-Überstand oder<br />
Mikrosomen) nach Vorbehandlung der Versuchstiere mit den Modellinduktoren β-Naphthoflavon<br />
(BNF) <strong>und</strong> Phenobarbital (PB) in vivo.<br />
1.3 Materialien<br />
• verschiedene Puffer- <strong>und</strong> Substratlösungen sowie Kofaktoren<br />
• nichtinduziertes <strong>und</strong> induziertes Lebermaterial von:<br />
- 4 Kontrolltieren<br />
- 4 β-Naphthoflavon-behandelten Ratten<br />
- 4 Phenobarbital-behandelten Ratten<br />
• Photometer<br />
• Fluorimeter<br />
1.4 CYP-Modellreaktionen<br />
Es werden die CYP-Aktivitäten in den Lebern in vitro mit ausgewählten Modellsubstraten<br />
bestimmt. Das Prinzip <strong>für</strong> die Bestimmung der Enzymaktivitäten besteht darin, dass das<br />
Modellsubstrat durch das CYP in den Lebern dealkyliert wird <strong>und</strong> der gebildete Metabolit<br />
fluorimetrisch bestimmt werden kann. Die Reaktion hängt je nach Modellsubstrat von<br />
verschiedenen CYP-Formen ab. Beispiele:<br />
Modellsubstrat Reaktion Metabolit CYP-Form<br />
1. ECOD Ethoxycoumarin O-Deethylierung Hydroxycoumarin CYP1A u.a.<br />
2. EROD Ethoxyresorufin O-Deethylierung Resorufin CYP1A<br />
3. PROD Pentoxyresorufin O-Depentylierung Resorufin CYP2B<br />
Die Reaktionsgleichungen lauten entsprechend<br />
1., 2.: C2H5-O–〈(Ring) + O2 + NADPH + H + CYP HO–〈(Ring) + NADP + H2O + CH3CHO<br />
3.: C5H11-O–〈(Ring) + O2 + NADPH + H + CYP HO–〈(Ring) + NADP + H2O + C4H9CHO<br />
Die Reaktionen können entweder mit Gesamthomogenat durchgeführt werden oder mit<br />
Fraktionen daraus, die die membrangeb<strong>und</strong>enen CYP-Proteine enthalten (z.B. 9000g-<br />
Überstand). In jedem Fall müssen Kofaktoren zugegeben werden, da keine intakten Zellen mehr<br />
vorliegen.<br />
1.5 Versuchsdurchführung<br />
• Aus jeder Leber wurde vor dem Praktikum mit Na-Phosphatpuffer ein 1:3-Homogenat<br />
hergestellt (1 Teil Gewebe + 2 Teile Puffer), im Eisbad gelagert <strong>und</strong> dann zentrifugiert, um<br />
9.000g-Überstand zu gewinnen.<br />
• Die 9.000g-Überstände werden mit Na-Phosphatpuffer sowohl 1:4 als auch 1:10 weiter<br />
verdünnt, bevor die Dealkylierungsreaktionen durchgeführt <strong>und</strong> der Proteingehalt als<br />
Bezugsgröße ermittelt werden kann. Die 9.000g-Überstände <strong>und</strong> ihre Verdünnungen werden<br />
über die gesamte Versuchsdauer auf Eis gelagert.<br />
9
1.5.1 Bestimmung des Proteingehaltes der 9.000g-Überstände<br />
• Für jeden 9.000g-Überstand werden je 2 Zentrifugengläser <strong>für</strong> die Hauptwerte<br />
•<br />
(Doppelbestimmung) <strong>und</strong> ein Zentrifugenglas <strong>für</strong> den Trübungswert beschriftet <strong>und</strong><br />
bereitgestellt. Zusätzlich wird ein Zentrifugenglas <strong>für</strong> den Leerwert der Hauptwerte <strong>und</strong> ein<br />
Zentrifugenglas <strong>für</strong> den Leerwert der Trübungswerte vorbereitet.<br />
In die Zentrifugengläser der Hauptwerte <strong>und</strong> der Trübungswerte pipettiert man je 0,1 ml der<br />
1:4-Verdünnung des jeweiligen 9000g-Überstandes.<br />
• Anschließend pipettiert man in alle Zentrifugengläser 0,1 ml 5%ige Natriumdesoxycholatlösung,<br />
schüttelt vorsichtig <strong>und</strong> inkubiert den Ansatz <strong>für</strong> 5 min bei Raumtemperatur.<br />
• Danach werden in die Zentrifugengläser der Hauptwerte <strong>und</strong> des Leerwertes der Hauptwerte<br />
1,8 ml Biuret-Lösung hinzugegeben. In die Zentrifugengläser der Trübungswerte <strong>und</strong> des<br />
Leerwerts der Trübungswerte werden dagegen 1,8 ml 3%ige NaOH-Lösung pipettiert.<br />
• Die Proben werden vorsichtig geschüttelt <strong>und</strong> anschließend <strong>für</strong> 20 min bei Raumtemperatur<br />
inkubiert.<br />
• Anschließend erfolgt die Messung der Proben gegen die jeweiligen Leerwerte am<br />
Photometer.<br />
• Die Eichkurve zur Ermittlung des Eichfaktors wird <strong>für</strong> jede Biuret-Charge mit<br />
Rinderserumalbumin in den folgenden Konzentrationen erstellt: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,<br />
18, 20 mg/ml.<br />
• Die Berechnung des Proteingehaltes der 9.000g-Überstände erfolgt mit der Formel:<br />
mg Protein / ml = ΔE * VF * EF<br />
E = Extinktion, ΔE = (E1+E2)/2 - ETr<br />
VF = Verdünnungsfaktor, in diesem Fall: VF = 16<br />
EF = Eichfaktor<br />
1.5.2 CYP-Modellreaktionen<br />
• Für jeden 9.000g-Überstand werden je 2 Zentrifugengläser <strong>für</strong> die Hauptwerte<br />
•<br />
(Doppelbestimmung) <strong>und</strong> ein Zentrifugenglas <strong>für</strong> den Leerwert beschriftet <strong>und</strong> bereitgestellt.<br />
In die Zentrifugengläser pipettiert man 0,1 ml Substratlösung <strong>und</strong> verdampft das<br />
Lösungsmittel Methanol im Wasserbad bei 90 - 95°C (dauert ca. 5 - 10 min).<br />
• Anschließend pipettiert man:<br />
+ 0,1 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer zum Volumenausgleich<br />
+ 0,1 ml MgCl2<br />
+ 0,1 ml Glucose-6-Phosphat-Lösung<br />
+ 0,1 ml 9000g-Überstand (<strong>für</strong> Leerwerte Phosphatpuffer).<br />
• Nach dem Mischen wird der Probeninhalt im Wasserbad (37°C) temperiert.<br />
• Die Reaktion wird mit 0,1 ml NADPH-Lösung gestartet. Die Substratkonzentration beträgt in<br />
diesem Ansatz 0,4 mM (ECOD) bzw. 2 µM (EROD) bzw. 10 µM (PROD).<br />
• Die Reaktion lässt man bei 37°C <strong>für</strong> 10 min (ECOD, PROD) bzw. <strong>für</strong> 5 min (EROD) ablaufen,<br />
stoppt danach durch Zugabe von 0,5 ml eiskalter 0,31 M Trichloressigsäure (ECOD) bzw. 1<br />
ml Methanol (EROD, PROD) <strong>und</strong> stellt die Röhrchen ins Eisbad. Bei der ECOD müssen die<br />
Proben noch mit 4 ml NaOH (0,05 M) versetzt werden (Metabolit fluoresziert im Alkalischen).<br />
• Danach werden die Proben (außer ECOD) 5 min bei 4500 U/min zentrifugiert.<br />
• Anschließend erfolgt die Messung (im Überstand) am Fluorimeter.<br />
10
• Bei jeder Messung wird eine Eichkurve aus 4 definierten Metaboliten-Konzentrationen <strong>und</strong><br />
einem Eichkurvenleerwert mitgeführt. Der Eichprobenansatz setzt sich folgendermaßen<br />
zusammen:<br />
bei der ECOD: bei EROD <strong>und</strong> PROD:<br />
0,1 ml Eichlösung* 0,1 ml Eichlösung in Methanol (wird<br />
verdampft)**<br />
0,4 ml Na-Phosphatpuffer 0,5 ml Na-Phosphatpuffer<br />
0,5 ml TCA 1,0 ml Methanol<br />
1,0 ml Ansatzvolumen 1,5 ml Ansatzvolumen<br />
+ Zugabe von 4 ml NaOH vor der Messung<br />
Eichreihen:<br />
0 / 0,125 / 0,25 / 0,5 / 1,0 µg/Ansatz 0 / 500 / 1000 / 2000 / 4000 pmol/Ansatz<br />
*(Verdünnungsreihe mit Puffer) **(in 50 / 100 / 200 / 400 µl Methanol)<br />
1.6 Protokoll <strong>und</strong> Auswertung der Ergebnisse<br />
Die gemessenen Umsätze werden in [pmol · min -1 · mg Protein -1 ] umgerechnet. Die Aktivitäten<br />
werden in die Messprotokolle eingetragen, um nichtinduzierte <strong>und</strong> induzierte Lebern von<br />
Kontrolltieren bzw. vorbehandelten Tieren zu vergleichen.<br />
ECOD-Aktivität EROD- / PROD-Aktivität<br />
ΔFI · EF · 10 6 · 10 ΔFI · EF · 10<br />
162 · t · Prot. t · Prot.<br />
ΔFI = Fluoreszenzmeßwert abzüglich Probenleerwert; EF = Eichfaktor; t = Inkubationszeit [min]<br />
Prot = Proteingehalt in [mg/ml]<br />
1.7 Fragen<br />
a) Welche Bedeutung hat die Induktion der Biotransformation?<br />
b) Welche Methoden kennen Sie, um eine Enzyminduktion nachzuweisen?<br />
c) Warum werden bei der Bestimmung der Biotransformationsaktivität in vitro Kofaktoren<br />
benötigt?<br />
11
Thema 2 Narkose <strong>und</strong> Schmerzbekämpfung<br />
Dr. H. Schubert<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Versuchstierk<strong>und</strong>e <strong>und</strong> Tierschutz,<br />
Dornburger Straße 23<br />
2.1 Einfluss der Anästhetika/Analgetika auf Reflex- <strong>und</strong> Reaktionsparameter als<br />
Kriterium <strong>für</strong> den Anästhesieverlauf <strong>und</strong> die Anästhesietiefe<br />
2.1.1 Einführung<br />
Narkose (Synonym: Allgemeinnarkose, Anästhesie) ist ein durch Zufuhr von Narkotika<br />
induzierter reversibler Lähmungszustand des ZNS mit Reflexdämpfung (Sedation),<br />
Muskelentspannung (Myorelaxation), Schmerzfreiheit (Analgesie) <strong>und</strong> Bewusstseinsverlust<br />
(Hypnose) zur Durchführung von operativen <strong>und</strong> diagnostischen Eingriffen.<br />
Neben der klassischen „Mononarkose“, bei der durch die Zufuhr von einem Pharmakon (z.B.<br />
Barbiturat) in gefährlich hoher Dosierung den Zustand der Narkose erreicht wird, werden<br />
heutzutage fast generell „Kombinationsnarkosen“ angewendet. Dabei werden spezielle<br />
Medikamente (Hypnotika, Neuroleptika, Ataraktika, Analgetika <strong>und</strong> Muskelrelaxantien) gezielt<br />
zur Beeinflussung einzelner Komponenten der Narkose „kombiniert“. Der Vorteil ist die selektive<br />
<strong>und</strong> reversible Beeinflussung von Schmerz, Muskeltonus, Reflexaktivität <strong>und</strong> Bewusstseinslage<br />
unter Vermeidung überhöhter Einzeldosierungen.<br />
Zur Bewertung <strong>und</strong> Überwachung der Anästhesie (-tiefe) werden unterschiedliche Parameter<br />
kontrolliert.<br />
Bei der Mononarkose (Äther, Barbiturate) ist das GUEDEL-Schema anwendbar (Einteilung der<br />
Narkosetiefe in verschiedene Narkosestadien. Die Zuordnung erfolgt anhand von speziellen<br />
Parametern entsprechend der graduellen ZNS-Beeinflussung.)<br />
Für die Kombinationsnarkose ist das GUEDEL-Schema meist nicht einsetzbar. Zur Überwachung<br />
der Narkose werden deshalb, insbesondere bei den Kleinnagern spezielle Reflexe <strong>und</strong><br />
Reaktionen kontrolliert.<br />
Die Auswahl der Reflex- <strong>und</strong> Reaktionsprüfungen als Anästhesieverlaufskriterien erfolgt nach<br />
Angaben von GREEN (1981), SCHOLZ (1980) <strong>und</strong> WESTHUES/FRITSCH (1961).<br />
Als Kriterium einer sedativ-hypnotischen Wirkung der Pharmaka werden der Stellreflex, der<br />
Kornealreflex, die Lidreaktion <strong>und</strong> die Schnurrhaaraktivität ermittelt. Zur Prüfung der analgetischen<br />
Wirkung dienen der Zwischenzehenreflex <strong>und</strong> der Ohrkneifreflex. Eine mögliche<br />
muskelrelaxierende Wirkung der Pharmaka kann über die Muskeltonusprüfung erfasst werden.<br />
2.1.2 Aufgabe<br />
Kontrollieren Sie die Wirkung von Anästhetika/Analgetika nach parenteraler Applikation anhand<br />
von Reflex- <strong>und</strong> Reaktionsbeobachtungen bei der Ratte.<br />
2.1.3 Materialien/Pharmaka<br />
- Etomidat (Hypnotikum)<br />
- Xylazin (Sedativum, α2-Rezeptoragonist)<br />
- Midazolam (Sedativum)<br />
- Fentanyl (Analgetikum)<br />
- Ketamin (Analgetikum - Dissoziatives Anästhetikum)<br />
- Naloxon (Opioidantagonist)<br />
- Flumazenil (Benzodiazepinantagonist)<br />
- Atipamezol (α2-Rezeptorantagonist)<br />
12
- Glasstab<br />
- Pinzette<br />
- Stoppuhr<br />
- Beobachtungskäfig<br />
2.1.4 Methodik<br />
Den Versuchstieren wird jeweils ein Pharmakon appliziert. Entsprechend dem Zeitschema<br />
erfolgt die Kontrolle der Reflexe/Reaktionen. Es werden Stellreflex (righting reflex = RR),<br />
Cornealreflex (CR), Lidstellung/-reaktion (LR), Zwischenzehenreflex (ZZR), Ohrkneifreflex<br />
(OKR), Schnurrhaaraktivität (ShA), Muskeltonus (MT) geprüft <strong>und</strong> protokolliert.<br />
2.1.5 Versuchsdurchführung<br />
- Die Versuchstiere werden zur Applikation der Substanzen aus den Einzelkäfigen<br />
entnommen <strong>und</strong> erhalten die Präparate entweder intramuskulär (Xylazin, Ketamin,<br />
Ketamin/Xylazin, Xylazin/Midazolam/Fentanyl) oder subkutan (Etomidat, Fentanyl,<br />
Midazolam) injiziert.<br />
- Nach der Injektion werden die Tiere wieder in ihre Einzelkäfige gesetzt.<br />
- Zu den Messzeiten erfolgt zunächst die Auszählung der Atemfrequenz (pro Minute) ohne<br />
das Tier dabei zu berühren. Direkt im Anschluss erfolgt die die Kontrolle der<br />
Reflexaktivitäten:<br />
- Stellreflex<br />
- Kornealreflex<br />
- Lidstellung<br />
- Zwischenzehenreflex<br />
- Ohrkneifreflex<br />
- Schnurrhaaraktivität<br />
- Muskeltonus<br />
- Die Kontrollen erfolgen in der Anfolge: AF > LR > ShA > KR > RR > OKR > ZZR<br />
- Die Kontrollzeiten: 5, 10, 15, 20, 25, 30 Minuten post applikationem<br />
- Das Versuchstier mit der Fentanylverabreichung, erhält 20 Minuten post applikationem eine<br />
subkutane Naloxon-Injektion, das Versuchstier mit der Xylazin/Midazolam/Fentanyl-Narkose<br />
erhält ebenso subkutan ein Antidotgemisch aus Atipamezol/Flumazenil <strong>und</strong> Naloxon<br />
ebenfalls 20 Minuten nach der Applikation der Narkosemittel.<br />
Stellreflex<br />
Zur Prüfung wird die Ratte in Rückenlage gebracht. Bleibt sie in dieser Stellung liegen, so ist der<br />
Reflex negativ. Bringt die Ratte ihren Vorderkörper selbständig in Bauchlage, so ist der Reflex<br />
positiv.<br />
Kornealreflex<br />
Die Kornea wird mit einem an der Spitze abger<strong>und</strong>eten Glasstab kurz berührt. Reagiert das Tier<br />
mit einer spontanen Lidbewegung, so ist der Reflex positiv. Erfolgt keine Reaktion, so ist der<br />
Reflex negativ.<br />
13
Lidreaktion<br />
Die Lidreaktion gilt als positiv oder vorhanden, wenn zum Messpunkt der Augapfel nicht von den<br />
Augenlidern bedeckt ist. Sind die Lider geschlossen, so ist die Reaktion negativ oder<br />
aufgehoben. Bei halbgeschlossenem Lid gilt der Reflex als halbaufgehoben.<br />
Zwischenzehenreflex<br />
Dem Versuchstier wird mit einer chirurgischen Pinzette in die Zwischenzehenhaut gekniffen.<br />
Reagiert das Tier mit einer Bewegung der Extremitäten, so ist der Reflex positiv. Ein Ausbleiben<br />
der Bewegung gilt als negativ. Zu beachten ist dabei, dass die Hintergliedmaße zur Prüfung<br />
dieses Reflexes genutzt wird, an der keine Narkoseapplikation erfolgte.<br />
Ohrkneifreflex<br />
Zur Prüfung des Reflexes wird dem Tier mit einer chirurgischen Pinzette in das Ohr ge-kniffen.<br />
Als positiv gilt der Reflex, wenn das Tier daraufhin mit Ohrzucken oder einer Kopf-bewegung<br />
reagiert. Erfolgt keine Reaktion, so ist der Reflex negativ.<br />
Schnurrhaaraktivität<br />
Die sichtbaren Bewegungen der Schnurrhaare zeigen ein positives Prüfergebnis an. Das<br />
Ausbleiben der Schnurrhaarbewegungen wird als negativ oder nicht vorhanden eingeschätzt.<br />
Eine vollständige, nicht herabgesetzte Schnurrhaaraktivität entspricht dem Zustand der Aktivität<br />
der Schnurrhaare eines unbehandelten, nicht beeinflussten Tieres.<br />
Muskeltonusprüfung<br />
Zur Überprüfung des Grades der Muskelentspannung wird das Tier mit drei Fingern am<br />
Übergang von Thorax <strong>und</strong> Abdomen umfasst <strong>und</strong> angehoben. Sinkt der Ober- <strong>und</strong> Unterkörper<br />
gelöst nach unten, so ist das Prüfergebnis positiv. Jede Krümmung <strong>und</strong> Spannung des Körpers<br />
gilt als negatives Ergebnis.<br />
Die Bewertung der Reflexe <strong>und</strong> Reaktionen erfolgt mit der Einschätzung: positiv bzw. vorhanden<br />
<strong>und</strong> negativ bzw. aufgehoben. Dazwischen liegende Stadien oder Aktivitäten werden als<br />
teilweise vorhanden, teilweise aufgehoben, reduziert oder herabgesetzt bezeichnet.<br />
2.1.6 Versuchsprotokoll<br />
2.1.7 Auswertung<br />
Die Daten werden in das Protokollblatt eingetragen <strong>und</strong> danach in die Abbildung eingezeichnet.<br />
2.1.8 Fragen<br />
1. Warum benötigen Kleintiere bezogen auf das Kilogramm Körpergewicht im Allgemeinen<br />
relativ höhere Pharmakadosen als Großtiere?<br />
2. Nennen Sie Anwendungsbereiche (Zielorte) von Lokalanästhetika in der Versuchstier-<br />
Anästhesie.<br />
3. Wie lässt sich eine Anästhesie steuern?<br />
14
2.2 Einfluss der Anästhetika/Analgetika auf Herz-, Kreislaufparameter I<br />
2.2.1 Einführung<br />
Blutdruck:<br />
Infolge der Herzkontraktionen weist der Druck u.a. in den Arterien des großen <strong>und</strong> kleinen<br />
Kreislaufes periodische Schwankungen auf. Während der Austreibungsphase steigt der Druck in<br />
den Arterien an. Der höchste Wert dieser Phase wird als systolischer Blutdruck bezeichnet.<br />
Während der Diastole sinkt der Druck. Der tiefste Wert wird diastolischer Blutdruck genannt.<br />
Die Differenz zwischen dem systolischen <strong>und</strong> diastolischen Druck eines Herzzyklus wird<br />
Blutdruckamplitude genannt.<br />
Unter dem mittleren Druck versteht man den Druck, der durchschnittlich während der Dauer<br />
eines gesamten Schlagintervalls herrscht. Als Maß <strong>für</strong> die treibende Kraft der Blutströmung ist<br />
die Angabe des mittleren Blutdruckes viel aussagekräftiger als die Angabe des systolischen<br />
Druckes.<br />
2.2.2 Aufgabe<br />
Kontrollieren Sie die Wirkung von Ketamin, Xylazin <strong>und</strong> Fentanyl auf Herz- Kreislaufparameter<br />
bei der leicht anästhesierten Ratte.<br />
2.2.3 Materialien/Pharmaka<br />
- Blutdruckmessgerät mit Blutdrucktransducer<br />
- Aufzeichnungsgerät (Schreiber)<br />
- EKG-Nadeln<br />
- Wärmelampe / Wärmematte <strong>für</strong> das Versuchstier<br />
- Prüfsubstanz: Ketamin, Xylazin, Fentanyl<br />
- PVC-Katheter<br />
- kleines Besteck (Instrumente) <strong>für</strong> Katheterverlegung<br />
- Versuchstier: Ratte (3-4 Monate alt)<br />
2.2.4 Methodik<br />
Für die Blutdruckmessung stehen sowohl direkte Methoden, wobei das Blutgefäßsystem eröffnet<br />
wird, als auch indirekt Methoden, ohne Eröffnung der Gefäße zur Verfügung.<br />
Direkte Methode:<br />
Dem anästhesierten Versuchstier wird eine Hohlnadel/Katheter in eine gut zugängliche <strong>und</strong><br />
ausreichend große Arterie (z.B. A.femoralis oder A.carotis) eingeführt <strong>und</strong> mit einem Elektromanometer<br />
verb<strong>und</strong>en, dass die Eigenschaft besitzt, auch sehr rasche Druckschwankungen<br />
genau zu registrieren.<br />
2.2.5 Versuchsdurchführung<br />
- Das Versuchstier wird in ein abgedecktes, mit Äther gesättigtes Glasgefäß gesetzt.<br />
- Nach der Aufhebung des Stellreflexes wird das Tier auf den OP-Tisch gelegt.<br />
- Es folgt die Fixierung des Tieres auf der Unterlage mit Klebestreifen bzw. Gummiband.<br />
- Die Narkosegaszufuhr erfolgt (Sauerstoff/Lachgas/Isofluran) über eine Nase <strong>und</strong> Maul<br />
bedeckende Narkosemaske (Spritzenkörper)<br />
- Narkose a) Vertiefung: 1,2 Vol% Isofluran (N2O/O2 = 1,0/0,5 l/min)<br />
b) Erhaltung: 0,75 Vol% Isofluran N2O/O2 = 1,0/0,5 l/min)<br />
- Katheterverlegung<br />
- Versuchstier (VT): Ratte, Anzahl: 2<br />
15
2.2.5.1 Katheterverlegung (durch Kursleiter/-assistent) in die Arteria carotis<br />
Rasur des Halses zwischen Kiefergelenk <strong>und</strong> Sternum, anschließend Desinfektion. Scharfe<br />
Durchtrennung der Haut im Bereich der medianen Sagittallinie. Nach der Seitverlagerung beider<br />
Mandibulardrüsen <strong>und</strong> Darstellung des Muskulus sternohyoideus (über der Trachea) folgt die<br />
stumpfe Durchtrennung des M.sternohyoideus im rechten seitlichen Bereich. Darstellen der<br />
Arteria carotis <strong>und</strong> des Truncus vagosympaticus. Aufträufeln von 0,2 ml 1% Lidocain.<br />
Separierung der Arterie vom Nervenstamm. Abbinden des proximalen Teils der Arterie <strong>und</strong><br />
Anlage eines Haltefadens im distalen Abschnitt. Anschnitt <strong>und</strong> Einführen eines PVC-Katheters<br />
(PVC; AD: 1,0/ ID: 0,5 mm; Länge: 40 cm) in herzwärtige Richtung. Blutaspirationskontrolle,<br />
Katheterfixierung <strong>und</strong> Vernähen der Haut mit Einzelknopfnähten. Anschluss des Katheters über<br />
einen Druckmesswandler an das entsprechende Messgerät.<br />
2.2.5.2 Kontrolle des Blutdruckes <strong>und</strong> der Atemfrequenz<br />
- Dem anästhesierten Tier werden subkutan Nadelelektroden zur Erfassung von EKG <strong>und</strong><br />
Atmung verlegt.<br />
- Anschluss des Katheters über einen Druckmesswandler an das Messgerät.<br />
- Aufzeichnung des Blutdruckes <strong>und</strong> dessen Verlauf am Aufzeichnungsgerät (mittlerer<br />
arterieller Blutdruck) kontinuierlich mit 0,25mm/sec Aufzeichnungsgeschwindigkeit.<br />
- Applikation von Ketamin (i.m.); Xylazin (i.m.); Fentanyl (i.v. - Schwanzvene)<br />
- Aufzeichnung des Blutdruckes: 3, 6, 9, 12, 15, 18 Minuten post applikationem <strong>für</strong> jeweils<br />
15sec mit 25mm/sec Aufzeichnungsgeschwindigkeit.<br />
- Zu den jeweiligen Kontroll- <strong>und</strong> Messpunkten sind die entsprechenden Reflexe <strong>und</strong> die<br />
Atemfrequenz zu kontrollieren, die Herzfrequenz wird aus EKG oder Blutdruckkurve<br />
ausgezählt.<br />
2.2.6 Versuchsprotokoll<br />
2.2.7 Versuchsauswertung<br />
Eintragen aller Ergebnisse (Reflexe, Atemfrequenz, Blutdruckwert, Herzfrequenz) in das<br />
Versuchsprotokoll <strong>und</strong> Einzeichnen der Parameterverläufe entsprechend der Vorgabe.<br />
2.2.8 Fragen<br />
1. Welche Vor- <strong>und</strong> Nachteile besitzen invasive Methoden?<br />
2. Wie erfolgt im Körper die Kontrolle <strong>und</strong> Regulierung des Blutdruckes?<br />
3. Was versteht man unter einer Shuntverbindung? (Beispiel)<br />
16
2.3 Einfluss von Anästhetika auf Herz-Kreislaufparameter II<br />
2.3.1 Einführung<br />
Bei der Beurteilung der Wirkung von Anästhetika <strong>und</strong> deren Adjuvantien auf verschiedene<br />
Organe des Körpers spielt das Herz zweifellos eine dominierende Rolle. Nahezu alle im<br />
Zusammenhang mit der Anästhsie gebräuchlichen Medikamente (Inhalationsanästhetika,<br />
Injektionsanästhetika, Muskelrelaxantien u.a.) können das Herz beeinflussen. Das messbare<br />
Ergebnis der Einflüsse der Narkose auf das Herz ist der Blutdruck, aus dessen Verhalten der<br />
Anästhesist einige wichtige Hinweise auf das Zusammenspiel zwischen den verabreichten<br />
Medikamenten <strong>und</strong> der Herzpumpfunktion erhält. Die Herzfrequenz <strong>und</strong> ihr Verhalten sind in<br />
diesem Zusammenhang weniger zuverlässige Parameter, obwohl in einigen Situationen auch<br />
eine direkte Beeinflussung des Herzleitungssystems <strong>und</strong> damit der Herzfrequenz durch<br />
Anästhetika möglich ist.<br />
2.3.2 Aufgabe<br />
Kontrolle des Blutdruckes- <strong>und</strong> Herzfrequenzverlaufes nach Applikation von anästhesiologisch<br />
wirksamen Pharmaka.<br />
2.3.3 Materialien<br />
- 2-Kanal-Blutdruckmeßsystem (einschließlich Schreiber)<br />
- Blutdruckmanschette<br />
- Blutdrucktransducer<br />
- Versuchstier: Ratte<br />
- Pharmaka: Ketamin (Analgetikum)<br />
Xylazin (Sedativum)<br />
- Spritzen, Kanülen<br />
2.3.4 Methodik<br />
Indirekte Methode:<br />
Die palpatorische Methode nach RIVA-ROCCI:<br />
Das Prinzip beruht auf der Überlegung, dass zum Zusammendrücken einer Arterie bzw. zur<br />
Blockierung der Blutströmung der gleiche Druck aufgewendet werden muss, der in ihrem<br />
Inneren herrscht. Zur Ausübung des erforderlichen Außendruckes benutzt man eine aufblasbare<br />
Gummimanschette, deren Außenwand durch eine Auflage <strong>und</strong>ehnbar gemacht ist. Zur Ablesung<br />
des Druckes in der Manschette wird dieselbe mit einem Manometer verb<strong>und</strong>en. Die Manschette<br />
wird im speziellen Fall um den Schwanzansatz des Versuchstieres gelegt <strong>und</strong> so lange<br />
automatisch mit Luft aufgeblasen, bis der Puls bzw. die Blutströmung distal der<br />
komprimierenden Manschette verschwindet.<br />
Die Kontrolle des Pulses erfolgt mit einem elektrischen Druckwandler, die Registrierung mit<br />
einem Schreibgerät. Ist peripher der Kompressionsstelle an der Arterie kein Puls mehr<br />
festzustellen, dann ist der Druck in der Manschette höher als der maximale systolische Druck in<br />
der Arterie. Der Druck in der Manschette wird nun langsam gesenkt. In dem Moment, in dem der<br />
Puls in der peripheren Arterie wieder fühlbar wird, ist der Druck in der Manschette gerade ein<br />
wenig kleiner als die systolische Druckspitze in der Arterie. Der nun herrschende<br />
Manschettendruck wird am Manometer registriert (entspricht ca. dem systolischen Blutdruck).<br />
17
2.3.5 Versuchsdurchführung<br />
- Die Ratten werden in die Messkäfige gesetzt, die Käfige mit den Ratten in die temperierte<br />
Versuchstierkammer eingebracht werden.<br />
- Die Messung wird bei ca. 37 - 38° C durchgeführt.<br />
- Am Rattenschwanzansatz wird zuerst die aufblasbare Manschette, dann der<br />
Drucktransducer platziert.<br />
- Der Drucktransducer muss eine solche Position besitzen, dass die Pulsrate (erkennbar am<br />
Aufleuchten der roten Leuchtdiode) erkennbar wird.<br />
- Sobald die Leuchtdiode rhythmisch blinkt, kann mit der Messung begonnen werden.<br />
- Nach dem Anzeigen der Herzrate wird die Taste „Start“ gedrückt. Jetzt beginnt der<br />
Messvorgang <strong>und</strong> endet mit dem Ausdruck von HR 1, HR 2, SAP 1 <strong>und</strong> SAP 2.<br />
- Die Messung wird wiederholt (Drücken Taste: „Repeat“)<br />
- Schema:<br />
o Kontrollmessung: 5. <strong>und</strong> 10. Minute nach Versuchsbeginn jeweils 3 Messungen<br />
o Applikation der Prüfsubstanzen (Ketamin, Xylazin)<br />
o Versuchsmessung: 5, 10, 15, 20, 25, 30 Minuten post applikationem<br />
o wenn möglich, sollte vor jeder Messung, die Atemfrequenz ausgezählt werden.<br />
2.3.6 Versuchsprotokoll<br />
2.3.7 Versuchsauswertung<br />
Einzeichnen der Verläufe von Atemfrequenz, Herzfrequenz <strong>und</strong> systolischem Blutdruck in ein<br />
Diagramm.<br />
2.3.8 Fragen<br />
1. Warum sollten die Versuchstiere konditioniert, d.h. an den Versuch gewöhnt werden?<br />
2. Warum lassen sich mit der Methode Kreislaufinsuffizienzen <strong>und</strong> Schockzustände schlecht<br />
beurteilen?<br />
3. Was sind spontan hypertensive Ratten?<br />
18
2.4 Kontrolle der Narkotika/Analgetika auf analgetische Potenz<br />
2.4.1 Einführung<br />
Unter Analgetika werden Stoffe verstanden, die die Schmerzempfindung unterdrücken. Starke<br />
Analgetika wie Morphium sind dabei in der Lage, auch stärkste Schmerzgefühle (z.B.<br />
postoperative Schmerzen) vollständig aufzuheben, während schwache Analgetika wie<br />
Acetylsalicylsäure, die im Gegensatz zu den zentral wirksamen starken Analgetika vor allem<br />
peripher an schmerzsensiblen Nervenendigungen wirken, im Vergleich deutlich schwächer<br />
analgetisch wirken <strong>und</strong> vor allem bei entzündlich bedingten Schmerzzuständen eingesetzt<br />
werden.<br />
Die Testung der analgetischen Potenz eines Mittels kann am Tier über verschiedene Tests<br />
erfolgen z.B. „tail flick-Test“ oder „hot plate-Test“<br />
2.4.2 Aufgabe<br />
Prüfung der schmerzbeeinflussenden Wirkung verschiedener Pharmaka mittels „hot plate-Test“<br />
2.4.3 Materialien/Pharmaka<br />
- aufheizbare, regelbare Metallplatte<br />
- Stoppuhr<br />
- Spritzen, Nadeln<br />
- Etomidat (Hypnotikum) s.c.<br />
- Xylazin (Sedativum) i.m.<br />
- Fentanyl (Analgetikum) s.c.<br />
- Ketamin (Analgetikum) i.m.<br />
- Metamizol (Analgetikum) s.c.<br />
- Versuchstier: Maus<br />
2.4.4 Methodik<br />
Zur Kontrolle des analgetischen Effektes einer Substanz kann u.a. der „Heiße Plattentest“ (hotplate-test)<br />
angewandt werden. Die heiße Platte besteht aus einer aufheizbaren Metallplatte, die,<br />
um das Entlaufen der Versuchtieres zu erschweren, von einem 15 cm hohen Glaszylinder<br />
umgeben ist.<br />
Wird eine Maus auf die angewärmte Heizplatte (52°C) gesetzt, so versucht sie sich zunächst in<br />
ihrer neuen Umgebung zu orientierten. Wenig später reagiert sie auf die Hitze unter ihren Pfoten.<br />
Sie läuft immer schneller hin <strong>und</strong> her, setzt sich schließlich auf die Hinterbeine <strong>und</strong> beginnt<br />
zunächst an den Vorderpfoten, später auch an den Hinterpfoten zu lecken. Sehr schnelles Hin-<br />
<strong>und</strong> Hereilen wird durch immer häufigere Leckreaktionen unterbrochen, bis sie schließlich der<br />
Hitzeeinwirkung zu entfliehen sucht <strong>und</strong> aus dem Glaszylinder springt.<br />
Die Zeit vom Aufsetzen der Maus bis zur Primärreaktion, dem Pfotenlecken (HP 1) <strong>und</strong> die Zeit<br />
bis zur Flucht (HP 2) werden mit der Stoppuhr gemessen.<br />
Zur Vermeidung stärkerer Erwärmung der Pfoten wird ein behandeltes VT, das nach Ablauf von<br />
90 sec noch nicht aus dem Glaszylinder gesprungen ist, von der „heißen Platte“ genommen.<br />
19
2.4.5 Versuchsdurchführung<br />
- Kontrollwertbestimmung:<br />
o 4 Mäuse werden auf die „Heiße Platte“ gesetzt<br />
o Der HP 1 <strong>und</strong> HP 2 werden bestimmt, andere Verhaltensäußerungen registriert <strong>und</strong><br />
in das beiliegende Versuchsprotokoll eingetragen.<br />
- Applikation der 5 Testsubstanzen (pro Substanz 2 Mäuse)<br />
- Versuchsmessung: Die behandelten Tiere werden auf die Heizplatte gesetzt. HP 1 <strong>und</strong> HP 2<br />
werden bestimmt, andere Verhaltensäußerungen werden registriert <strong>und</strong> eingetragen. Bei<br />
keinerlei Reaktion werden die Tiere nach 90 sec von der Platte genommen.<br />
2.4.6 Versuchsprotokoll<br />
2.4.7 Versuchsauswertung<br />
Die erfassten Zeitpunkte werden in das Protokoll eingetragen. Die erhaltenen Werte werden<br />
gemittelt <strong>und</strong> in ein Diagramm eingezeichnet.<br />
2.4.8 Fragen<br />
1. Warum sollte bei der Prüfung eines Pharmakons auf analgetische Wirkung einen Test zur<br />
Prüfung der sedativ hypnotischen Wirksamkeit angeschlossen werden?<br />
2. Was sind endogene Opioide?<br />
3. Welche Nebenwirkungen treten bei der Verwendung von „starken“ <strong>und</strong> „schwachen“<br />
Analgetika auf?<br />
Fragen zur Vorlesung Versuchstierk<strong>und</strong>e:<br />
1. Wodurch unterscheiden sich individuelle- von kollektiven Tier-Mensch-Beziehungen in<br />
Bezug auf Tierversuche?<br />
2. Werden Tierversuche im Tierschutzgesetz geregelt, <strong>und</strong> wenn ja, in welchen Abschnitten /<br />
Paragraphen?<br />
3. Sind Tierversuche zur Prüfung von Tabakerzeugnissen, Waschmitteln oder Kosmetika nach<br />
dem TSchG zulässig?<br />
4. Wer erteilt die Genehmigung <strong>für</strong> einen Tierversuch?<br />
5. Wer kontrolliert vor Ort d.h. im <strong>Institut</strong> / in der Einrichtung die Einhaltung der<br />
tierschutzrelevanten Auflagen?<br />
6. Wann ist ein Mäuse-/Rattenstamm ein Inzuchtstamm?<br />
7. Wodurch unterscheiden sich Inzuchttiere von Auszuchttieren in Bezug auf den Inzuchtkoeffizienten?<br />
8. Was bedeutet SPF-Tier?<br />
9. In welchem Haltungssystem sind SPF-Tiere zu halten?<br />
10. Wie gewinnt man SPF-Tiere?<br />
11. Welche 3 Worte charakterisieren die 3-R-Regeln?<br />
20
Etomidat (Hypnomidate)<br />
Barbituratfreies Hypnotikum aus der Gruppe von Schlafmitteln mit Imidazol-Carboxylatstruktur<br />
+ Zentralnervensystem:<br />
Etomidat ist ein potentes Hypnotikum, verhindert jedoch nicht die infolge chirurgischer<br />
Stimulation auftretenden Extremitätenbewegungen. Die autonomen Reaktionen sind nicht<br />
blockiert. Die Hirndurchblutung ist herabgesetzt <strong>und</strong> beim prämedizierten Patienten sinkt der<br />
intraokuläre Druck ab. Die EEG-Veränderungen sind denjenigen nach der Applikation von<br />
Thiopental ähnlich. Die bei dem Einsatz Etomidat häufig festzustellenden Muskelbewegungen<br />
stehen nicht mit epileptiformen Entladungen im Zusammenhang.<br />
+ Kardiovaskuläres System:<br />
Es erfolgt keine offenk<strong>und</strong>ige Depression des kardiovaskulären Systems.<br />
+ Atemsystem:<br />
Nach der Verabreichung von Etomidat sinkt die Atemfrequenz vorübergehend ab, <strong>und</strong> das<br />
Atemzugvolumen steigt an. Danach kann die Atmung flach sein. Eine eventuell auftretende<br />
Apnoe ist nur von kurzer Dauer.<br />
+ Magen-Darm-System:<br />
Häufig treten Brechreiz <strong>und</strong> Erbrechen auf.<br />
+ NW :<br />
Etomidat blockiert dosisabhängig die Nebennierenrinde <strong>und</strong> sollte bei Patienten unter Schock<br />
nur unter Cortisolsubstitution gegeben werden.<br />
Ketamin HCl (Ketamin)<br />
Dissoziative Anästhetika rufen einen kataleptischen Zustand eher durch eine zentralnervöse<br />
Erregung als durch eine Depression hervor. Sie verursachen Analgesie, Sedation,<br />
Immobilisation, Abspaltung (Dissoziation) von der Umwelt <strong>und</strong> Bewusstlosigkeit. Ketamin ist ein<br />
Abkömmling der Phencyclidine.<br />
+ Zentralnervensystem.<br />
Ketamin scheint selektiv das thalamo-kortikale System zu dämpfen, während es sowohl das<br />
retikulumaktivierende als auch das limbische System stimuliert. Ketamin erzeugt einen<br />
anästhetischen Zustand während es das ZNS funktionell spaltet. Es scheint ein starker Inhibitor<br />
der GABA-Bildung im ZNS zu sein. Es erhöht den zerebrospinalen Liquordruck.<br />
+ Kardiovaskuläres System:<br />
Ketamin neigt dazu, das Herz-Kreislaufsystem zu stimulieren <strong>und</strong> übt eine positiv inotrope<br />
Wirkung auf den Herzmuskel aus (in vivo). Es verursacht einen Anstieg der Herzfrequenz, des<br />
Herzminutenvolumes, des mittleren arteriellen Blutdruckes, des pneumonalen Druckes <strong>und</strong> des<br />
zentralvenösen Druckes.<br />
+ Atemsystem:<br />
Ketamin verursacht eine apnoische Atmung, setzt die Atemfrequenz herab, beeinflusst jedoch<br />
im Allgemeinen die Blutgase nicht. Die Larynx- <strong>und</strong> Pharynxreflexe werden durch Verabreichung<br />
von Ketamin nicht unterdrückt. Ketamin vermehrt den Speichelfluss <strong>und</strong> die Sekretion im<br />
Atemtrakt.<br />
21
+ NW:<br />
Ketamin verursacht einen Muskelspasmus <strong>und</strong> eine erhöhte Rigidität der Extremitäten. Lid- <strong>und</strong><br />
Kornealreflex bleiben bestehen, die Lidspalten bleiben offen. Es kann sowohl Hypothermie als<br />
auch eine Hyperthermie beobachtet werden.<br />
Midazolam (Dormicum)<br />
Midazolam ist ein wasserlösliches Benzodiazepin mit ähnlicher Wirkung wie das Diazepam, hat<br />
allerdings eine kürzere biologische Wirksamkeit als Diazepam. Wegen seiner Wasserlöslichkeit<br />
verursacht Midazolam keine Venenreizung. Rasche <strong>und</strong> hochdosierte Midazolam-Injektionen<br />
können zu Atmungsbeeinträchtigung führen. Selten werden Blutdruckabfälle registriert, ein<br />
passagerer Anstieg der Leberwerte ist möglich.<br />
Fentanylcitrat (FentanylR)<br />
Fentanyl ist ein synthetisches Opiat, das etwa 100-150 mal stärker wirkt als Morphium.<br />
+ Zentralnervensystem:<br />
Fentanyl wirkt über stereospezifische Opiatrezeptoren in Gehirn <strong>und</strong> Rückenmark. Abhängig von<br />
dem verwendeten Präparat, der Dosis <strong>und</strong> der Tierart können die Opiate ZNS- Dämpfungen<br />
oder Erregung verursachen. Tierarten, die eine ZNS-Dämpfung nach Opiatgabe zeigen, haben<br />
etwa doppelt so viele Opiatrezeptoren im Corpus amygdaleum <strong>und</strong> im Frontalkortex als<br />
Tierspezies mit opioidbedingten Erregungserscheinungen.<br />
+ Kardiovaskulares System:<br />
Fentanyl hat nur eine geringe Wirkung auf Blutdruck <strong>und</strong> Herzminutenvolumen, kann aber eine<br />
ausgeprägte Sinusbradykardie erzeugen, der durch Atropin entgegengewirkt werden kann.<br />
+ Atemsystem:<br />
Opiate sind starke Atemdepressoren (direkt an den Atemzentren in der Pons <strong>und</strong> in der Medulla<br />
wirkend). Fentanyl verringert Atemfrequenz <strong>und</strong> Atemvolumen <strong>und</strong> verzögert <strong>und</strong> verringert die<br />
Reaktion auf den arteriellen CO2-Gehalt.<br />
+ NW:<br />
Fentanyl führt nur zu geringer Histaminfreisetzung <strong>und</strong> induziert selten Erbrechen<br />
Xylazin (Rompun)<br />
Xylazin ist ein Thiazinderivat.<br />
+ Zentralnervensystem:<br />
Die sedative <strong>und</strong> kurze analgetische Wirkung beruht auf der alpha-2-adrenergen Stimulation im<br />
Gehirn. Die muskelrelaxierende Wirkung entsteht durch Inhibition der interneuralen<br />
Reizübertragung im Rückenmark. Xylazin erzeugt sowohl eine Aktivierung als auch eine<br />
Hemmung des vegetativen Nervensystems <strong>und</strong> erhöht die zentralvagale- <strong>und</strong><br />
Barorezeptorenaktivität .<br />
22
+ Herz- Kreislaufsystem<br />
Initial kommt es nach der Applikation von Xylazin zu einem kurzfristigen Blutdruckanstieg, der<br />
von einer lang andauernden Phase der Hypotension <strong>und</strong> der Bradykardie gefolgt wird. Es<br />
scheint das Herz empfindlich <strong>für</strong> Katecholamine zu machen (Arrhythmien).<br />
+ Atmungssystem:<br />
Bei manchen Tieren tritt eine bedeutende Abnahme von Atemfrequenz <strong>und</strong> Atemvolumen auf.<br />
Xylazin verursacht eine Erschlaffung des Larynx.<br />
+ NW:<br />
Xylazin dämpft das Thermoregulationszentrum im Gehirn <strong>und</strong> hemmt durch Stimulation der<br />
alpha-2-Rezeptoren in den pankreatischen ß-Zellen die Insulinfreisetzung (Hyperglykämie).<br />
Metamizol (Novalgin)<br />
Metamizol ist ein schwaches“ Analgetikum – Pyrazoloderivat.<br />
Metamizol hat deutliche zentrale analgetische Wirkung <strong>und</strong> kann deshalb auch zur Behandlung<br />
von nichtentzündlichen Schmerzen eingesetzt werden. Neben einer analgetischen weist es<br />
zudem eine antipyretische <strong>und</strong> antiphlogistische Wirkung auf. Der Angriffspunkt der<br />
analgetischen Wirkung wird im Thalamus angenommen, während der Angriffspunkt der<br />
antipyretischen Wirkung in den Hypothalanischen Zentren liegt. Die analgetisch/spasmolytische<br />
Wirkung von Metamizol wird zur Behandlung von Spasmen der glatten Muskulatur des Magen-<br />
Darm-Traktes (v.a. bei Kolik) <strong>und</strong> anderen Bauchhöhlenorganen ausgenutzt. Bei einer<br />
Dauerverabreichung kann es zu Blutbildschäden (bis hin zur Agranulocytose) <strong>und</strong> nach zu<br />
schneller i.v. Applikation zu Schockzuständen kommen (instabile Kreislaufsituation, Hypotonie).<br />
Naloxon<br />
Naloxon ist ein starker Opioidantagonist <strong>und</strong> bindet kompetitiv an Opioidrezeptoren (vor allen an<br />
μ-Rezeptoren), hat selbst aber keine zu den Opioiden agonistische Wirkung.<br />
Bei normotensiven Patienten bewirkt Naloxon keine Veränderung des Blutdruckes. Eine<br />
Verbesserung der kardiovaskulären Funktion wird bei verschiedenen Schockformen <strong>und</strong><br />
Spezies beschrieben. Zum einen scheint diese Wirkung katecholaminabhängig zu sein, zum<br />
anderen ist sie durch die Antagonisierung körpereigener, hypotensiv wirkender ß-Endorphine zu<br />
erklären. Naloxon antagonisiert alle Effekte der Opioidanalgetika, d.h. sowohl deren<br />
atemdepressive Wirkung als auch die erzeugte Analgesie.<br />
Flumazenil (Anexate)<br />
Flumazenil ist ein spezifischer Benzodiazepinantagonist <strong>und</strong> hebt die zentral dämpfende<br />
Wirkung von Benzodiazepinen durch kompetitive Hemmung (Verdrängungsreaktion) an den<br />
Rezeptoren (Benzodiazepinrezeptoren) auf. Wechselwirkungen mit anderen zentral dämpfenden<br />
Substanzen wurden nicht beobachtet. Nach der Anwendung von Flumazenil können Übelkeit<br />
<strong>und</strong> Erbrechen auftreten. Nach zu rascher Injektion ist das Vorkommen von Angstgefühlen,<br />
Herzklopfenn sowie Blutdruckschwankungen mit Veränderung der Herzfrequenz möglich.<br />
Flumazenil kann die durch Benzodiazepine bedingte Senkung eines erhöhten intrakranialen<br />
Druckes aufheben (evtl. kann ein überschießender Hirndruckanstieg auftreten!)<br />
23
Antipamezol (Antisedan)<br />
Antipamezol ist ein spezifischer α-2-Antagonist. Es hebt die Wirkung von an α-2-Rezeptoren<br />
koppelnde Substanzen auf. Bim H<strong>und</strong> <strong>und</strong> anderen Tieren wird die sedative Wirkung von α-2-<br />
Agonisten aufgehoben. Während der ersten 10 Minuten nach Injektion können vorübergehende<br />
Blutdrucksenkungen beobachtet werden, seltener kommt es zu Erbrechen, verstärkter Atmung<br />
oder unkontrolliertem Harnabsatz.<br />
24
Thema 3 Demonstration des Elektroenzephalogramms bei verschiedenen<br />
Aktivitätszuständen<br />
Herr Dr. R. Huonker<br />
Biomagnetisches Zentrum, Klinik <strong>für</strong> Neurologie,<br />
Erlanger Allee 101<br />
• Ableitung des EEG von der Schädeloberfläche mehrerer Probanden bei verschiedenen<br />
Aktivitätszuständen sowie Demonstration von biologischen <strong>und</strong> technischen Artefakten<br />
im EEG.<br />
• Ableitung von akustisch evozierten Potentialen (AEP) nach Stimulation mit reinen <strong>und</strong><br />
verstimmten Akkorden - Fehlerquotenbestimmung bei verschiedenen Aktivitätszu-ständen.<br />
• Auswertung des EEG mit Frequenzanalyse.<br />
3.1 Gr<strong>und</strong>lagen der Elektroenzephalographie<br />
Das EEG als Ausdruck kortikaler Hirntätigkeit kann beim Menschen direkt von der<br />
Schädeloberfläche abgeleitet werden. Die relativ einfache Registriermöglichkeit des EEG am<br />
Menschen führte nach ihrer Entdeckung durch H. BERGER (1929 in Jena) zur schnellen<br />
Verbreitung dieser Methode <strong>und</strong> brachte im klinischen Bereich eine Vielzahl diagnostischer Anwendungen<br />
<strong>und</strong> medizinischer Erkenntnisse, so zur Charakterisierung verschiedener Schlaf-<br />
<strong>und</strong> Narkosestadien <strong>und</strong> <strong>für</strong> die Diagnostik pathologischer zerebraler Veränderungen, wie z.B.<br />
raumfordernder Prozesse im ZNS.<br />
Das Elektroenzephalogramm ist eine zeitabhängige bioelektrische Potentialdifferenz. Bei der<br />
Elektroenzephalographie werden durch Membranpotential-Schwankungen verursachte kortikale<br />
Feldpotentiale extrazellulär registriert. Die Aktivitäten tieferer Hirnstrukturen gehen nur insofern<br />
in das EEG ein, wie sie die neuronale Funktion des Kortex beeinflussen. So werden z.B. die<br />
Generatoren des synchronisierten Alpha-EEG in rhythmisch entladenden Schrittmacherzellen<br />
sowie in periodisch hemmenden neuronalen Verschaltungen des Thalamus vermutet. Den von<br />
der Kopfhaut (EEG) abgeleiteten Potentialdifferenzen liegen hauptsächlich summierte<br />
postsynaptische Potentiale (EPSP <strong>und</strong> IPSP) zugr<strong>und</strong>e. Generatoren dieser Potentiale sind<br />
die senkrecht zur Hirnoberfläche ausgerichteten Pyramidenzellen des Kortex, die durch<br />
Synapsen vielfach untereinander verschaltet sind <strong>und</strong> sich so in ihrer Aktivität gegenseitig<br />
beeinflussen. Die Entstehung der abgeleiteten Potentiale lässt sich mit Hilfe der Dipoltheorie<br />
veranschaulichen: Das aufgezeichnete EEG besitzt einen unregelmäßigen, wellenförmigen<br />
Charakter mit Amplituden zwischen 10 <strong>und</strong> 100 μV <strong>und</strong> hängt in seinem Verlauf stark vom<br />
Ableitort ab. Zur Beschreibung des EEG bedient man sich der Auswertung von Amplituden,<br />
Wellenformen <strong>und</strong> ihren Frequenzen. Man unterscheidet die folgenden klassischen<br />
Frequenzbereiche:<br />
• Delta-Wellen zwischen FU [Hz] = 0,5 FO [Hz] = 3<br />
• Theta-Wellen zwischen FU [Hz] = 4 FO [Hz] = 7<br />
Delta-Wellen <strong>und</strong> Theta-Rhythmus treten im Wach-EEG des Kindes, beim Erwachsenen<br />
während des Schlafes <strong>und</strong> bei gespannter Aufmerksamkeit auf.<br />
• Alpha-Wellen zwischen FU [Hz] = 8 FO [Hz] = 13<br />
Der Alpha-Rhythmus ist besonders im relaxierten Wachzustand, bei geschlossenen Augen<br />
<strong>und</strong> über der okzipitalen Region ausgeprägt. Das EEG zeigt einen regelmäßigen,<br />
synchronisierten Verlauf mit einer (im adulten EEG) vorherrschenden Frequenz bei ca. 10<br />
Wellen/s.<br />
25
• Beta-Wellen zwischen FU [Hz] = 14 FO [Hz] = 30<br />
Das Beta-EEG ist typisch <strong>für</strong> einen Zustand erhöhter Aktivität (z.B. Augen geöffnet,<br />
Sinnesreize, geistige Tätigkeit, Orientierungsreaktionen). Es ist desynchronisiert <strong>und</strong><br />
besteht aus einer unregelmäßigen Überlagerung zahlreicher Wellen mit Frequenzen<br />
zwischen 13 <strong>und</strong> 30 Hz.<br />
Hochfrequente Gamma-Wellen >30 Hz können im aufmerksamen Wachzustand, bei<br />
Wahrnehmungs- <strong>und</strong> Lernprozessen sowie im Traumschlaf auftreten.<br />
3.2 Methode der Elektroenzephalographie<br />
Bei der Ableitung von Biopotential-Differenzen wird zwischen unipolarer <strong>und</strong> bipolarer Ableitung<br />
unterschieden.: Unipolare Ableitungen sind Ableitungen zwischen differenten EEG-Elektroden<br />
über dem Kortex <strong>und</strong> einer indifferenten Referenz-Elektrode. Diese Bezugselektrode erfasst –<br />
genau wie die EEG-Elektroden – unerwünschte Artefakte, d.h. andere Biopotentiale des<br />
Körpers (wie EKG, EMG, EOG) <strong>und</strong> technische Störsignale (z.B. das 50 Hz-Wechselstrom-<br />
“Brummen“), nicht aber das EEG als eigentliches Nutzsignal. Das wird z.B. durch das Setzen<br />
der Referenzelektrode am Ohr erreicht. Dort wird das EEG-Signal vernachlässigbar klein. Die<br />
elektronische Subtraktion im EEG-Differenzverstärker eliminiert dann weitgehend diese<br />
biologischen <strong>und</strong> technischen Störsignale <strong>und</strong> verbessert somit den Signal-Rausch-Abstand<br />
(SNR) des EEG.<br />
Elektrodenersatzschaltbild mit:<br />
R s - Ohmscher Widerstand der Elektrodenpaste <strong>und</strong> Elektrode,<br />
C - Kapazität der elektrischen Doppelschicht der Elektroden,<br />
R F - Faraday-Widerstand der chemischen Prozesse, die bei Stromfluss vor sich gehen.<br />
Die Kopfhaut muss vorher an den Elektrodenpositionen gut gereinigt werden, um den<br />
elektrischen Übergangswiderstand zwischen Kopfhaut <strong>und</strong> Elektrode so weit wie möglich zu<br />
verringern. Je größer der in Reihenschaltung zum Eingangswiderstand des EEG-Verstärkers<br />
liegende Elektroden-Übergangswiderstand ist, desto kleiner wird das spannungsgeteilte EEG-<br />
Nutzsignal <strong>und</strong> umso stärker werden technische Störsignale mitverstärkt.<br />
Zum Vergleich: Während beim EKG Übergangswiderstände
3.3 Versuchsdurchführung<br />
Anlegen der Elektroden<br />
Zum EEG – Versuch sollten die Studenten mit frisch gewaschenem Haar erscheinen, zumindest<br />
die Probanden <strong>für</strong> diesen Versuch. Es wird dann eine der Kopfgröße entsprechende Kappe<br />
ausgewählt, entsprechend der Anleitung wird diese Kappe aufgesetzt <strong>und</strong> die Elektroden<br />
eingeklickt. Um den Hautübergangswiderstand < 5 kΩ zu halten ist es notwendig, die Stellen an<br />
denen die Elektroden sitzen zunächst mit Alkohol zu reinigen <strong>und</strong> dann mit Abralytflüssigkeit zu<br />
füllen. Es werden 28 EEG – Elektroden <strong>und</strong> 4 Elektroden <strong>für</strong> das Registrieren der<br />
Augenbewegungen angeschlossen.<br />
Mit Hilfe des Programms „ Brain Record“ kann kontrolliert werden wie hoch der<br />
Übergangswiderstand der Elektroden ist.<br />
Easy Cap System<br />
Demonstration von Artefakten<br />
Unter der Einwirkung innerer biologischer Faktoren (z.B. Lidschläge, Bulbusbewegungen,<br />
Muskelanspannungen) sowie äußerer technischen Ursachen (z.B. Störspannungen,<br />
elektromagnetische Störfelder) können EEG-Signale verändert, gestört bzw. überlagert werden.<br />
Alle Nicht-EEG-Signale, die das EEG verfälschen, nennt man Artefakte. Vor Versuchsbeginn<br />
werden die verschiedenen Artefakte demonstriert.<br />
c. Registrierung des EEG unter verschiedenen Aktivitätszuständen<br />
1. Augen geschlossen, bequemes ruhiges Sitzen - spontan EEG / 20 sec - AEP erkennen<br />
von verstimmten Akkorden - Fehlerquote<br />
2. 1 Tasse starken Kaffee trinken <strong>und</strong> erneut - spontanes EEG / 20 sec - AEP erkennen von<br />
verstimmten Akkorden - Fehlerquote<br />
EEG-Auswertung - Frequenzanalyse des Elektroenzephalogramms (FOURIER-<br />
Spektralanalyse)<br />
Gr<strong>und</strong>lagen der EEG-Spektralanalyse<br />
Im EEG des Menschen überlagern sich Wellen verschiedener Frequenzen, die mit<br />
mathematischen Verfahren analysiert werden können. Allgemein durchgesetzt hat sich <strong>für</strong><br />
derartige periodische Biopotentialverläufe eine Zerlegung in Sinuswellen <strong>und</strong> Cosinuswellen<br />
verschiedener Frequenzen – die Fourier-Analyse.<br />
Zunächst wird ein EEG-Abschnitt der Dauer T (einige sec) digitalisiert. Dabei wird das analoge,<br />
kontinuierliche Biopotential EEG (t) in diskreten Zeitabständen ti von z.B. 5 msec in eine Folge<br />
digitaler Zahlenwerte EEG (t i) umgewandelt, was einer Digitalisierungs- oder Abtastfrequenz<br />
von 200 Hz entspricht. Die so entstandene EEG-Zeitreihe wird durch Lösung des<br />
Gleichungssystems:<br />
N/2<br />
EEG (t i) = Σ [a j ∗ COS (ω j ∗ t i) + b j ∗ SIN (ω j ∗ t i )] (1)<br />
27
j = 1 mit ω j = 2 π ∗ j/T (2)<br />
in eine Folge von COS- <strong>und</strong> SIN-Wellen einer Gr<strong>und</strong>frequenz ω 1 = 2π/T <strong>und</strong> höherer,<br />
ganzzahliger Vielfacher der Gr<strong>und</strong>frequenz ω j (höhere Harmonische oder Oberwellen) zerlegt.<br />
Ergebnis dieses Analyseverfahrens ist das so genannte Leistungsspektrum:<br />
LSD (f j) = N/4π [a j 2 + b j 2 ] in [μV 2 ] (3)<br />
Leistungsspektren des α- <strong>und</strong> des β-EEG<br />
Es werden Zeitabschnitte des abgeleiteten Spontan - EEG bei geschlossenen Augen <strong>und</strong> bei<br />
geöffneten Augen einer Spektralanalyse unterzogen - jeweils bei den verschiedenen<br />
Aktivitätszuständen.<br />
Dabei werden Leistungsspektren berechnet <strong>und</strong> dargestellt, es wird den Studenten demonstriert,<br />
wie die Parameter gewählt werden müssen, damit Ergebnisse deutlich sichtbar werden. Das<br />
unterschiedliche Aussehen der Leistungsspektren wird interpretiert <strong>und</strong> mit dem EEG<br />
verglichen. Es ist auf artefaktfreie EEG-Abschnitte (keine Lidschläge, Bulbusbewegungen oder<br />
EMG-Einstreuungen) zu achten.<br />
Aus den Leistungsspektren des α-EEG <strong>und</strong> des -EEG sind die Frequenzen Fmax der<br />
maximalen spektralen Leistung sowie die Maximalwerte LSDmax der spektralen Leistungsdichte<br />
zu bestimmen:<br />
Akustisch Evozierte Potentiale (AEP) als diagnostisches Hilfsmittel zur Überprüfung der<br />
Funktion neuronaler Verschaltungen: Prinzip des AEP-Averaging <strong>und</strong> Aussage des AEP frühe<br />
<strong>und</strong> späte Komponenten bei verschiedenen Aktivitätszuständen des Probanden .<br />
Fehlerquoten beim Erkennen von verstimmten Akkorden<br />
Es werden randomisiert reine <strong>und</strong> verstimmte Akkorde mit einer Lautstärke von 65 dB SPL im<br />
freien Schallfeld appliziert ( n = 50/1:4) <strong>und</strong> der Proband muss eine Maustaste drücken, wenn<br />
ein verstimmter Akkord zu hören ist - jeweils ohne <strong>und</strong> mit Kaffee. Die als richtig erkannten<br />
verstimmten Akkorde werden gezählt <strong>und</strong> mit den dargebotenen ins Verhältnis gesetzt. Die<br />
Fehlerquote mit <strong>und</strong> ohne Kaffe wird verglichen. Es ist jeweils ein musikalischer <strong>und</strong> ein nicht<br />
musikalischer Proband auszuwählen.<br />
Die Auswertung aller gemessenen Daten erfolgt mit Hilfe des Progammes Brain Analyszer<br />
von der Firma Brain Products München.<br />
28
Bitte beantworten Sie die folgenden Fragen mit einigen kurzen Sätzen schriftlich in Ihr<br />
Protokoll:<br />
1. Welche Veränderungen sind im EEG beim Öffnen bzw. Schließen der Augen zu erkennen?<br />
2. Was ist kennzeichnend <strong>für</strong> den Berger-Effekt?<br />
3. Welche Veränderungen sind im EEG bei mentaler Anspannung zu erwarten?<br />
4. Welche Veränderungen sind im EEG bei Weck- <strong>und</strong> Orientierungsreaktionen zu erwarten?<br />
5. Vergleichen Sie die Größe dieses Artefaktes in den einzelnen Ableitungen: Wie sehen die<br />
Störsignale im EEG aus?<br />
6. Wie stark sind EMG-Artefakte der Körpermuskulatur im EEG?<br />
7. Vergleichen Sie den Verlauf der EEG-Spektren im α-Spektralband <strong>und</strong> im β-Band<br />
miteinander!<br />
8. Vergleichen Sie die Leistungsspektren <strong>und</strong> Fehlerquoten beim EEG <strong>und</strong> AEP bei den<br />
verschiedenen Aktivitätszuständen mit <strong>und</strong> ohne Kaffee! Was können Sie daraus schließen?<br />
9. Warum können die Wellen eines Beta-EEG nur schwierig <strong>und</strong> ungenau ausgezählt werden?<br />
10. Was sind evozierte Potentiale?<br />
11. Wie werden sie ausgelöst <strong>und</strong> beim Menschen registriert?<br />
12. Was sagen die einzelnen Zeitbereiche nach dem Stimulus aus?<br />
Substanzinfos Koffein:<br />
Alkaloid in Kaffeebohnen, Tee- <strong>und</strong> Mateblättern, Kolanüssen <strong>und</strong> Guaranasamen.<br />
Erscheinungsformen: in Cola-Getränken, Kaffee, Energydrinks; als Koffeintabletten oder als<br />
reines (synthetisches) Koffein in Pulverform. Konsumformen: getrunken, geschluckt oder<br />
geschnupft<br />
Wirkung:<br />
Koffein macht wach, beschleunigt den Herzschlag <strong>und</strong> steigert vorübergehend die geistige<br />
Leistungsfähigkeit. In höheren Dosen (ca. 300 bis 600 mg = ca. 8 Tassen Kaffee) erzeugt es<br />
Euphorie.<br />
Wirkungseintritt: nach 10–60 Min.; Wirkdauer: 2–3 Std.<br />
Risiken <strong>und</strong> Nebenwirkungen<br />
Koffein entzieht dem Körper Flüssigkeit (Dehydration). Bei sehr hohen Dosen:<br />
Schweissausbrüche, Herzflattern, Harndrang, Herzrhythmusstörungen, starke<br />
Wahrnehmungsstörungen, Zittern, Nervosität <strong>und</strong> Schlafstörungen.<br />
Langzeitrisiken:<br />
Bei dauerhaftem, regelmäßigem Koffeinkonsum (auch bei Kaffee!) besteht die Gefahr<br />
körperlicher Abhängigkeit. Mögliche Entzugssymptome: Kopfschmerzen, Nervosität, Müdigkeit,<br />
Erbrechen bis hin zu Bewegungs- <strong>und</strong> Konzentrationsstörungen.<br />
Der Säuregehalt des Kaffees fördert zudem langfristig die Bildung von Magengeschwüren. Der<br />
Dauerkonsum von Koffein mit Schmerzmitteln kann zu schweren Nierenschäden mit<br />
lebensbedrohenden Komplikationen führen.<br />
Literatur:<br />
- Beschreibung des Programms Brain Analyzer<br />
- Physiologie der Menschen von Schmidt /Thews<br />
- Sonderdrucke zum EEG <strong>und</strong> Aktivitätszuständen sowie zu Besonderheiten der auditiven<br />
zentralen Verarbeitung von musikalischen Stimuli<br />
29
Thema 4 Klinische <strong>und</strong> Forensische <strong>Toxikologie</strong>, Gr<strong>und</strong>lagen<br />
<strong>und</strong> Fallbeispiele<br />
PD Dr. F. Peters, Dr. Ch. Sauer<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Rechtsmedizin, Fürstengraben 23<br />
4.1 Einführung<br />
Unter Vergiftung versteht man die schädliche Einwirkung toxischer Substanzen (Gifte) auf den<br />
Organismus sowie die daraus resultierende Symptomatik. Die weitaus meisten der<br />
dokumentierten Vergiftungsverdachtsfälle werden durch Arzneimittel verursacht, vor allem<br />
solche mit mittelschwerem bis tödlichem Verlauf. Andere Gifte, die relativ häufig zu schweren bis<br />
tödlichen Vergiftungen führten, waren chemische Produkte, Pestizide, Drogen oder Pflanzen.<br />
Viele Vergiftungen, vor allem bei Kindern, sind akzidenteller Natur. Darüber hinaus sind<br />
Vergiftungen im Rahmen von Suizid(versuch)en von Bedeutung.<br />
Die Klinische <strong>Toxikologie</strong> beschäftigt sich mit der Diagnose <strong>und</strong> Therapie von Vergiftungen,<br />
insbesondere solchen akuter Natur. Neben einer sorgfältigen (Fremd)anamnese kann die<br />
Symptomatik u. U. Hinweise auf die mögliche Vergiftungsursache geben. In der Regel erfordert<br />
die eindeutige Diagnose einer Vergiftung jedoch den Einsatz analytischer Methoden. So muss<br />
vor allem bei unklarem Vergiftungsverdacht zunächst die Noxe identifiziert werden, die <strong>für</strong> die<br />
Vergiftung verantwortlich ist. Dies erfolgt in der Regel durch eine Systematische Toxikologische<br />
Analyse (STA) einer Urinprobe des Patienten mit dem Ziel möglichst viele Substanzen in<br />
möglichst kurzer Zeit zu erfassen. Wegen ihrer hohen Trennleistung <strong>und</strong> Identifizierungskraft ist<br />
hie<strong>für</strong> die GC-MS die Methode der Wahl. Alternativ oder ergänzend kommen auch häufig HPLC-<br />
PDA basierte Verfahren zum Einsatz. Nach Identifizierung der Noxe sollte diese, sofern möglich,<br />
in einer Blutprobe des Patienten quantitativ bestimmt werden, um die Schwere <strong>und</strong> Prognose<br />
der Vergiftung abzuschätzen. Dies kann z.B. mittels immunchemischer oder<br />
chromatographischer Verfahren erfolgen. Die Ergebnisse der klinisch-toxikologischen Analyse<br />
werden gemeinsam mit dem behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von Symptomatik <strong>und</strong><br />
Vergiftungsverslauf interpretiert. Auf dieser Basis kann dann die (gezielte) Therapie des<br />
Patienten z.B. mit Antidota erfolgen.<br />
Die Forensische <strong>Toxikologie</strong> beschäftigt sich mit allen toxikologischen Fragestellung von<br />
rechtlicher Relevanz, angefangen bei Fragen zur Fahr(un)tüchtigkeit durch Alkohol <strong>und</strong> Drogen<br />
im Straßenverkehr über Fragen der Schuldfähigkeit bei Straftaten unter Einfluss berauschender<br />
Mittel bis hin zur post-mortem <strong>Toxikologie</strong> in der Abklärung unklarer Todesursachen oder eines<br />
Vergiftungsverdachts. Bei der Bearbeitung all dieser Fragestellungen sind analytischtoxikologische<br />
Methoden von entscheidender Bedeutung. Die Verfahren können dabei auf einen<br />
einzelnen Analyten (z.B. Ethanol), auf eine definierte Gruppe von Substanzen (z.B. Fahren unter<br />
Drogeneinfluss gemäß §24a StVG) oder im Sinne einer STA auf eine Vielzahl von Substanzen<br />
(z.B. post-mortem <strong>Toxikologie</strong>) ausgerichtet sein. Im letzteren Fall kommen prinzipiell ähnliche<br />
Methoden zum Einsatz wie bei der STA in der klinisch-toxikologischen Analytik. Allerdings ist zu<br />
beachten, dass aufgr<strong>und</strong> häufig fehlender Angaben zur Symptomatik quantitativen<br />
Bestimmungen der involvierten Substanzen eine ungleich höhere Bedeutung zukommt, da die<br />
Schwere der Vergiftung <strong>und</strong> somit ihre Bedeutung als potentielle Todesursache in solchen<br />
Fällen praktisch ausschließlich über die gemessenen Konzentrationen erfolgen kann.<br />
30
4.2 Ablauf der Veranstaltung<br />
Einführungsvortrag durch den/die Dozenten<br />
Zunächst werden in einem Einführungsvortrag die Gr<strong>und</strong>lagen der Klinischen <strong>und</strong> Forensischen<br />
<strong>Toxikologie</strong> vermittelt. Bezüglich der Klinischen <strong>Toxikologie</strong> werden u.a. wichtige Fragen <strong>für</strong> die<br />
Anamnese, häufige Vergiftungssymptome, Therapieoptionen wie primäre <strong>und</strong> sek<strong>und</strong>äre<br />
Giftelimination sowie wichtige Antidota besprochen. Bezüglich der Forensischen <strong>Toxikologie</strong><br />
werden Ordnungswidrigkeits- <strong>und</strong> Straftatbestände bezüglich Alkohol <strong>und</strong> Drogen im<br />
Straßenverkehr sowie Aspekte der Schuld(un)fähigkeit kurz besprochen. Spezielle Probleme in<br />
der post-mortem Analytik werden ebenfalls kurz besprochen.<br />
Bearbeitung von Fallbeispielen<br />
In diesem Teil sollen authentische Fälle in der Gruppe bearbeitet werden. Hierzu erhalten die<br />
Studierenden zunächst die zugr<strong>und</strong>e liegenden Fallgeschichten <strong>und</strong> die entsprechenden<br />
Analysendaten. In der Folge werden diese Informationen im Hinblick auf die entsprechende<br />
klinische oder forensische Fragestellung ausgewertet <strong>und</strong> interpretiert. Dazu gehören im<br />
klinisch-toxikologischen Fall insbesondere die Zuordnung von Symptomen zu nachgewiesenen<br />
Substanzen sowie die Erstellung von Therapievorschlägen. Im forensisch-toxikologischen Fall<br />
ist zu klären, welcher Ordnungswidrigkeits- oder Straftatbestand erfüllt sein könnte, bzw. ob den<br />
vorliegenden post-mortem Bef<strong>und</strong>en eine (mit) todesursächliche Bedeutung zukommen könnte.<br />
Für die Bearbeitung der Fälle können die Studierenden auf ihre eigne Fachliteratur, auf vom<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Rechtsmedizin zur Verfügung gestellte Literatur <strong>und</strong>/oder auf in der nahe gelegenen<br />
ThULB verfügbare Literatur zurückgreifen.<br />
Abschlussbesprechung<br />
In der Abschlussbesprechung soll die Gruppe ihre Lösungsvorschläge präsentieren <strong>und</strong><br />
gemeinsam mit dem Dozenten diskutieren. Dabei wird neben den neu erlernten Inhalten auch<br />
die Anwendung des pharmakologisch-toxikologischen Gr<strong>und</strong>lagenwissens im Focus stehen.<br />
31
Thema 5 Auswirkungen von akuter Hypoxie auf Kreislaufregulation <strong>und</strong><br />
Säure-Basen-Haushalt<br />
Prof. Dr. R. Bauer<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Molekulare Zellbiologie, Zentrum <strong>für</strong> Molekulare<br />
Biomedizin, Ebene 3, Hans-Knöll-Straße 2<br />
5.1 Ziel<br />
Die Studenten sollen lernen, pathogenetisch relevante Kompensationsmechanismen des<br />
Organismus bei akuter Störung des Gasaustausches quantitativ zu erfassen <strong>und</strong> zu beurteilen.<br />
Dabei soll die Einsicht über die neuro-humorale Steuerung der Kreislaufumstellung zur<br />
Sicherung vitaler Funktionen (Gewährleistung zerebraler O2 Versorgung) auf Kosten anderer<br />
Organfunktionen vertieft werden.<br />
Die Wirkung von Inhalationsnarkotika, Katecholaminen, Muskelrelaxatien, Antikoagulanzien <strong>und</strong><br />
Blutersatz wird im Verlauf des Experiments jeweils demonstriert <strong>und</strong> dokumentiert.<br />
Versuchsdurchführung: Demonstration des Versuchsablaufs durch Videoclips <strong>und</strong><br />
Darstellung des Verlaufs der Vitalparameter an Originaldaten<br />
Die Untersuchungen wurden an Schweinen (neugeborene Ferkel (Alter 7 Tage) im Rahmen<br />
eines Forschungsprojektes („Hirnprotektion bei frühkindlicher hypoxisch-ischämischer<br />
Encephalopathie“) durchgeführt.<br />
Die Wahl der Spezies erfolgte aufgr<strong>und</strong> methodischer Notwendigkeiten <strong>und</strong> der weitgehenden<br />
Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den humanen Bereich. Die Untersuchungen erfordern eine<br />
fortlaufende Kontrolle <strong>und</strong> intensivmedizinische Beeinflussung einer Reihe von Vitalparametern,<br />
häufige Blutentnahmen <strong>und</strong> eine künstliche Beatmung. Das Schwein ist hinsichtlich der<br />
perinatalen Reifung von Funktionen des autonomen Nervensystems <strong>und</strong> metabolischer<br />
Funktionen dem Menschen ähnlich.<br />
Alle Untersuchungen wurden am narkotisierten Tier durchgeführt. Es wurde eine<br />
Inhalationsnarkose (0,9-1,2 % Isofluran in 70 % Lachgas <strong>und</strong> 30% Sauerstoff) angewandt. Die<br />
Narkoseeinleitung erfolgte bei den neugeborenen Ferkeln mittels des Narkosegas-Gemisches<br />
(Isoflurankonzentration 2 %) über eine Gesichtsmaske. Hautdurchtrennungen erfolgten jeweils<br />
nach zusätzlicher Lokalanästhesie mit 2% Lidokain (s.c.).<br />
Die Instrumentierung dauerte etwa 2h <strong>und</strong> die Durchführung & Auswertung des Experimentes<br />
dauert 3h.<br />
Beschreibung der Instrumentierung:<br />
• Tracheotomie <strong>und</strong> Muskelrelaxation (Pancuroniumbromid 0,1 mg/kg); künstliche Beatmung<br />
(Servo-Ventilator 900C, Siemens-Elema ® ).<br />
• Verlegen von Kathetern: A. femoralis zur fortlaufenden Messung des arteriellen Blutdruckes<br />
<strong>und</strong> zur Entnahme von arteriellen Blutproben <strong>für</strong> die Blutgasanalyse <strong>und</strong> Erfassung des<br />
Säure-Basen-Status; venöser Katheter via V. jugularis in die obere Hohlvene <strong>für</strong><br />
Flüssigkeitsersatz <strong>und</strong> zur Arzneimittelgabe.<br />
• Fortlaufende Messung der Rektaltemperatur; Konstanthalten der Körpertemperatur mit Hilfe<br />
einer rückgekoppelten Wäremeeinheit (Wärmeplatte <strong>und</strong> Rotlichtlampe) bei 38° C ± 0,3° C.<br />
• Erfassung der Hirndurchblutung (CBF) mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF). Hier<strong>für</strong> wird<br />
der Schädelknochen freigelegt, durch Bohrloch- Trepanation die harte Hirnhaut (Dura mater)<br />
dargestellt <strong>und</strong> eine LDF-Sonde mittels Knochenwachs <strong>und</strong> Kaltpolymerisat (Kallocryl ® )<br />
fixiert.<br />
• Erfassung der Nierendurchblutung (NBF) mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF). Hier<strong>für</strong><br />
wird auf der rechten Seite ein Flankenschnitt durchgeführt <strong>und</strong> der untere Nierenpol<br />
dargestellt. Nachfolgend wird eine LDF- Sonde mittels Sek<strong>und</strong>enkleber auf der Niere<br />
befestigt.<br />
32
• Erfassung des EEG mittels unipolarer Schraubenelektroden, die im Schädelknochen<br />
eingebracht <strong>und</strong> durch Kaltpolymerisat (Kallocryl ® ) fixiert <strong>und</strong> isoliert werden.<br />
• Ableitung des EKG mittels Einstichelektroden an beiden Vorderläufen <strong>und</strong> dem rechten<br />
Hinterlauf (Einthoven-Ableitung) <strong>und</strong> fortlaufende Kalkulation der Herzfrequenz.<br />
5.2 Versuchsablauf<br />
Nach Beendigung der Instrumentierung wurde den Versuchstieren eine ca. 1-stündige<br />
Erholungsperiode eingeräumt. In dieser Zeit wurden die Beatmungsparameter adjustiert <strong>und</strong> die<br />
erforderlichen Kalibrierungen durchgeführt. Dabei werden den Studenten die notwendigen<br />
Mess- <strong>und</strong> Qualitätssicherungsprozeduren erläutert <strong>und</strong> demonstriert, wie sie bei der<br />
Durchführung komplexer Untersuchungsvorhaben unabdingbar sind.<br />
Die Studenten werden dabei mit der Nutzung von Erfassungs-Software vertraut gemacht <strong>und</strong><br />
lernen dabei einige Qualitätsmerkmale aktueller Online-Datenerfassung <strong>und</strong> –analyse kennen.<br />
Außerdem werden die Studenten in den Umgang mit Blutgas- <strong>und</strong> Säure-Basen Analysegeräten<br />
eingeführt.<br />
Unter Benutzung formalisierter Versuchsablaufbögen wird von den Studenten eine<br />
eigenständige Protokollierung des Versuchsablaufes vorgenommen. Das Versuchsprotokoll<br />
bildet die Gr<strong>und</strong>lage <strong>für</strong> die nachgeschaltete Auswertung des Versuchs mit Abgabe des<br />
Protokolls.<br />
Nachfolgend beginnt die Demonstration des Experimentes. Zunächst wurden über 15 min unter<br />
normoxischen Ausgangsbedingungen die Parameter zur Kennzeichnung der systemischen<br />
(ABP, HF) <strong>und</strong> regionalen (CBF, NBF) Kreislaufdynamik aufgezeichnet. Außerdem wurde der<br />
Blutgas- <strong>und</strong> Säure- Basenstatus durch Gewinnung einer arteriellen Blutprobe erfasst.<br />
Nachfolgend erfolgte die Umstellung auf eine schwere hyperkapnische Hypoxie durch<br />
Verminderung des FiO2 von 0.30 auf 0.06 <strong>und</strong> Zusatz von ~10% CO2 zum Atemgas <strong>für</strong> 15 min.<br />
Dabei wurden die Veränderungen in den systemischen <strong>und</strong> regionalen Kreislaufparametern<br />
aufgezeichnet <strong>und</strong> <strong>für</strong> die nachfolgende quantitative Analyse gespeichert. Nach jeweils 5, 10<br />
<strong>und</strong> 15 min wurden Blutproben entnommen <strong>und</strong> der Blutgas- <strong>und</strong> Säure- Basenstatus ermittelt.<br />
Im Anschluss an die Periode „schwere hyperkapnische Hypoxie“ wurde die<br />
Beatmungsgaszusammensetzung wieder auf den prähypoxischen Zustand eingestellt <strong>und</strong> über<br />
weitere 15 min die Normalisierung der Kreislaufparameter während der Reoxignierungsperiode<br />
erfasst. Außerdem wurde nach jeweils 5, 10 <strong>und</strong> 15 min Blutproben entnommen <strong>und</strong> der<br />
Blutgas- <strong>und</strong> Säure- Basenstatus ermittelt.<br />
Zum Abschluss des Experiments wurde die Wirkungen von Medikamenten demonstriert, die bei<br />
kardiopulmonaler Reanimation (CPR) eingesetzt werden. So wird zunächst die Wirkung von<br />
Natriumbikarbonat zur Pufferung einer metabolischen Azidose nach schwere hypoxische<br />
Hypoxie gezeigt. Nachfolgend wird die systemische <strong>und</strong> regionale Kreislaufreaktion auf<br />
intravenöse Applikation von Adrenalin (0,05 mg/Kg Körpergewicht) erfasst.<br />
33
5.3 Auswertung<br />
Herzkreislauf:<br />
Die ermittelten Daten der kontinuierlichen Aufzeichnung werden einer Off-line Datenanalyse<br />
unterzogen. Dazu wird eine Mehrkanal-Analyse der aufgezeichneten Parameter ABP, HF, CBF<br />
<strong>und</strong> NBF unter Nutzung der Software „Watisa for Windows“ <strong>und</strong> „MS Excel“ durchgeführt.<br />
Zunächst werden vorgegebene Zeitabschnitte festgelegt <strong>und</strong> von repräsentativen<br />
Kurvenabschnitten deskriptive Parameter zur zusammenfassenden Dokumentation des<br />
Untersuchungsablaufes ermittelt. Diese Parameter werden nachfolgend in geeigneter<br />
numerischer <strong>und</strong> graphischer Form dargestellt <strong>und</strong> dienen der im Anschluss an die<br />
Datenanalyse stattfindenden Interpretation der Versuchsergebnisse.<br />
Blutgas- <strong>und</strong> Säure- Basenstatus, Elektrolyt- <strong>und</strong> metabolische Daten:<br />
Die ermittelten Daten der Blutprobenanalytik werden von den Studenten in analoger Weise in<br />
vorgegebene Tabellenvorlagen in „MS Excel“ übertragen <strong>und</strong> in geeigneter numerischer <strong>und</strong><br />
graphischer Form dargestellt.<br />
Interpretation der Versuchsergebnisse<br />
In einer abschließenden Diskussionsr<strong>und</strong>e werden die Studenten Gelegenheit haben, die<br />
ermittelten Ergebnisse zu erörtern. Dabei wird schwerpunktmäßig zur Sprache kommen, wie die<br />
Verlaufsbeurteilung der ermittelten Kreislaufdaten zu bewerten sind. Darüber hinaus werden die<br />
Mechanismen der zugr<strong>und</strong>e liegenden Kompensationsvorgänge erörtert werden <strong>und</strong> die Rolle<br />
der erfassten Stoffwechselveränderungen, insbesondere die erheblichen Auswirkungen auf den<br />
Säure- Basenhaushalt besprochen.<br />
Vorausgesetzes Wissen<br />
• Pathophysiologie systemischer Kreislaufregulation bei akutem O2 Mangel<br />
• Adaptation <strong>und</strong> Kompensation bei Hypoxie<br />
• Störungen des Säure- Basenhaushaltes<br />
Fragen:<br />
1. Nenne <strong>und</strong> charakterisieren Sie die 4 Gr<strong>und</strong>typen von Hypoxie!<br />
2. Welche Gr<strong>und</strong>mechanismen sind <strong>für</strong> Redistribution des zirkulierenden Blutvolumens bei<br />
akuter hypoxischer bzw. hyperkapnischer Hypoxie verantwortlich?<br />
3. Wodurch ist metabolische Azidose gekennzeichnet? Welche Kompensationsmechanismen<br />
hat der Säugetierorganismus, die Auswirkungen von vermehrtem Anfall fixer Säuren zu<br />
reduzieren?<br />
Literatur:<br />
34
Thema 6 Blut <strong>und</strong> Blutbestandteile <strong>und</strong> deren Charakterisierung<br />
Dr. S. Mosig, Dr. K. Rennert<br />
AG Molekulare Hämostaseologie, Bachstr. 18<br />
Plasmatische <strong>und</strong> zelluläre Bestandteile des Blutes <strong>und</strong> deren Zusammenwirken spielen eine<br />
wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des menschlichen Organismus;<br />
angeborene oder erworbene Defekte einzelner Komponenten führen zu einer Einschränkung der<br />
jeweiligen Funktionen <strong>und</strong> können eine Manifestation sehr verschiedenartiger Krankheitsbilder<br />
von Störungen der Blutgerinnung bis zu immunologischen Erkrankungen bedingen.<br />
Ziel des Praktikums soll sein, anhand einzelner Methoden Kenntnisse sowohl zur Bedeutung<br />
auch zur Rolle der verschiedenen Blutzellen zu gewinnen. Das Praktikum gliedert sich in 2 Teile:<br />
6.1 Blutzellen<br />
Einführung:<br />
Blut besteht aus den zellulären Bestandteilen (Hämatokrit) <strong>und</strong> dem Plasma. Frauen weisen<br />
typischerweise einen Hämatokrit von 41- 43% auf, Männer haben in der Regel einen höheren<br />
zellulären Anteil von 44 – 46%. Die zellulären Anteile des Bluts bestehen aus Erythrozyten (rote<br />
Blutzellen), Leukozyten (weiße Blutzellen) <strong>und</strong> Thrombozyten (Blutplättchen). Die Aufgabe der<br />
Erythrozyten besteht im Transport von Sauerstoff <strong>und</strong> Kohlendioxid, wohingegen die<br />
Thrombozyten in erster Linie <strong>für</strong> die W<strong>und</strong>heilung <strong>und</strong> die Initiation der Gerinnungskaskade<br />
verantwortlich sind. Die Leukozyten unterteilen sich ihrerseits in die Granulozyten, Monozyten<br />
<strong>und</strong> Lymphozyten. Aufgr<strong>und</strong> des Färbeverhaltens des Protoplasmas lassen sich Granulozyten in<br />
drei Subpopulationen, die eosinophilen, basophilen <strong>und</strong> neutrophilen Granulozyten unterteilen.<br />
Ähnlich wie Monozyten sind Granulozyten <strong>für</strong> die unspezifische Immunabwehr verantwortlich.<br />
Leukozyten, die sich in die drei Hauptgruppen T- , B- <strong>und</strong> Natürliche Killerzell (NK)–<br />
Lymphozyten einteilen lassen, sind im Gegensatz dazu <strong>für</strong> eine spezifische Abwehr von<br />
Pathogenen verantwortlich. Eine schematische Darstellung der einzelnen Blutbestandteile<br />
finden Sie nachstehend.<br />
42
Erythrozyten<br />
Quelle: Uniklinikum des<br />
Saarlands<br />
Thrombozyten<br />
Quelle: Universität Heidelberg<br />
Funktion: Sauerstoff- <strong>und</strong> Kohlendioxid-Transport<br />
Konzentration: Frauen 4,1 – 5,2 Mio./µl; Männer 4,6 – 5,9 Mio./µl<br />
Gesamtmenge eines Erwachsenen: zwischen 24-30 Billionen<br />
gehen aus Retikulozyten hervor<br />
besitzen keinen Zellkern, nur bedingt zur Proteinbildung befähigt<br />
Durchmesser: ca. 7,5µm, Dicke: ca. 2µm<br />
Lebensdauer: 120 Tage, Neubildung: ca. 1% am Tag = 200 Milliarden pro<br />
Tag = 2 Millionen pro Sek<strong>und</strong>e<br />
durchflusszytometrische Detektion durch CD235a Färbung<br />
Funktion: W<strong>und</strong>heilung durch Thrombusbildung infolge von<br />
Thrombozytenaggregation durch fibrin-vermittelte Bindung an andere<br />
Thrombozyten<br />
Konzentration: 150.000 – 380.000 /µl<br />
Gesamtmenge: 0,68 – 1,71 Billionen<br />
entstehen im Knochenmark durch Abschnürung von Megakaryozyten<br />
besitzen keinen Zellkern, nur bedingt zur Proteinbildung befähigt<br />
Durchmesser: 1,5 – 3µm<br />
Lebensdauer: 8 - 12 Tage, Abbau in Milz, Lunge <strong>und</strong> z.T. Leber<br />
durchflusszytometrische Detektion durch CD41a Färbung<br />
Leukozyten<br />
Funktion: Abwehr von Krankheitserregern, z.B. Bakterien, Viren, Würme, Pilze aber auch<br />
Tumorzellen <strong>und</strong> körperfremde Partikel<br />
Bildung im roten Knochenmark (Medulla osseum rubrum) in Brustbein <strong>und</strong> Becken, bei Kindern<br />
zusätzlich in den langen Röhrenknochen von Armen <strong>und</strong> Beinen<br />
gehen aus Vorläuferstammzellen hervor:<br />
Abbildung: University of Minnesota<br />
43
Granulozyten Funktion: unspezifische Immunabwehr von Bakterien, Pilzen <strong>und</strong> Parasiten<br />
polymorphkernige Leukozyten mit gelapptem, chromatinreichen Kern; bilden<br />
45-75% aller Leukozyten; Lebensdauer: 2 bis 3 Tage; sind amöboid beweglich<br />
<strong>und</strong> zur Phagozytose befähigt; 10 – 15µm im Durchmesser;<br />
durchflußzytometrische Detektion durch CD66b Färbung; werden im<br />
Knochenmark gebildet <strong>und</strong> bilden entsprechend ihrem Anfärbeverhalten<br />
3 Unterarten:<br />
neutrophile Granulozyten<br />
Halbwertszeit im Blut: 6 – 7 St<strong>und</strong>en<br />
ein Erwachsener produziert 10 11 Neutrophile pro Tag, wenn Neutrophile 6–8<br />
St<strong>und</strong>en nach Eintritt nicht in den Kontakt mit Pathogenen kommen oder an<br />
Entzündungsreaktionen teilnehmen, werden sie durch Makrophagen in der<br />
Leber oder Milz abgebaut<br />
besitzen Schlüsselrolle bei akuten Enzündungsreaktionen durch Phagozytose<br />
von Bakterien <strong>und</strong> Viren<br />
eosinophile Granulozyten<br />
Halbwertszeit im Blut: 8 St<strong>und</strong>en<br />
anfärbbar mit Eosin, haben wichtige Funktion bei der Parasitenabwehr: binden<br />
<strong>und</strong> phagozytieren mit IgE Antikörpern markierte Pathogene<br />
basophile Granulozyten<br />
Halbwertszeit im Blut: 5 – 6 St<strong>und</strong>en<br />
anfärbbar mit basischen Farbstoffen wie Methylenblau<br />
besitzen unregelmäßige Granula, die unter anderem Histamin <strong>und</strong> Heparin<br />
enthalten genaue Funktion noch nicht vollständig geklärt, weisen<br />
Ähnlichkeiten mit Mastzellen auf<br />
Monozyten Funktion: haben wichtige Funktion bei der unspezifischen Immunabwehr<br />
durch Phagozytose von Pathogenen, ähnliche Funktion wie neutrophile<br />
Granulozyten, treten jedoch zeitlich versetzt am Infektionsort auf<br />
Konzentration: 180 – 550/µl<br />
entstehen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark unter dem<br />
Einfluss von Wachstumsfaktoren wie M-CSF oder GM-CSF<br />
zwei Subpopulationen: inflammatorische CD14 ++ CD16 - Monozyten <strong>und</strong><br />
geweberesidente CD14 + CD16 + mit unterschiedlichen Aufgaben<br />
Durchmesser: 10 – 18 µm, Zellen enthalten einen nierenförmigen Kern<br />
Lebensdauer: 1 bis 3 Tage<br />
durchflusszytometrische Detektion durch CD14 Färbung<br />
44
Lymphozyten<br />
Quelle: Dr. Triche National Cancer <strong>Institut</strong>e<br />
• T-Lymphozyten<br />
Funktion: spezifische adaptive Immunabwehr<br />
durchflusszytometrische Detektion durch CD3 oder CD45 Färbung<br />
• T-Helferzellen<br />
CD4-positive T-Zellen; Sezernierung von Zytokinen <strong>und</strong> Modulation der TH1 <strong>und</strong> TH2<br />
Immunantwort<br />
• zytotoxische T-Killerzellen<br />
CD8-positive T-Zellen; erkennen über MHCI-Komplexe präsentierte virale Antigene;<br />
vermitteln die Induktion der Apoptose viral infizierter Zellen über Fas/FasL <strong>und</strong><br />
Perforin/Gramzym Signalwege<br />
• Gedächtnis T-Zellen<br />
verbleiben im Blut als immunologische Gedächtniszellen; können sowohl CD4+- als auch<br />
CD8+-positiv sein; nach ihrer erneuten antigenspezifischen Aktivierung kann ihre Anzahl<br />
um das 10 – 100 fache in sehr kurzer Zeit ansteigen<br />
• regulatorische T-Zellen<br />
auch „Suppressor T-Zellen“, steuern das Entzündungsgeschehen, indem sie<br />
überschießende Immunreaktion unterdrücken<br />
B-Lymphozyten<br />
NK-Lymphozyten<br />
Quelle:<br />
Universität Köln,<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Mikrobiologie,<br />
Immunologie <strong>und</strong> Hygiene<br />
Funktion: erkennen mittels B-Zell-Rezeptoren in der Regel<br />
körperfremde Antigene <strong>und</strong> produzieren daraufhin Antikörper, die<br />
gegen diese Antigene gerichtet sind<br />
nach Bindung eines Antigens <strong>und</strong> gleichzeitigem kostimulatorischen<br />
Signal durch Helfer-T-Zellen wandern B-Zellen in Lymphknoten oder<br />
Milz, beginnen dort zu proliferieren <strong>und</strong> anschließend zur antigenproduzierenden<br />
Plasmazelle zu differenzieren<br />
ein Erwachsener besitzt 10 9 bis 10 10 verschiedene<br />
antigenspezifische B-Lymphozyten<br />
gehen aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks<br />
hervor durchflussytometrische Detektion durch CD19 Färbung<br />
Funktion: können Tumorzellen <strong>und</strong> virusinfizierte Zellen durch<br />
Freisetzung von Granzymen <strong>und</strong> Perforinen abtöten<br />
sind Teil des angeborenen Immunsystems <strong>und</strong> besitzen keine<br />
antigenspezifischen Immunrezeptoren<br />
gehen aus Vorläuferzellen des Knochenmarks hervor<br />
durchflusszytometrische Detektion durch CD56 Färbung<br />
45
Kurzer Überblick zur Durchflusszytometrie<br />
Prinzip: Detektion antikörper-markierter Einzelzellen mittels laser-angeregter Fluorochrome.<br />
In der Probenvorbereitung erfolgt die Markierung von Oberflächenproteinen durch Fluorochromgekoppelte<br />
Antikörper.<br />
Die markierten Zellen werden in einem Flüssigkeitsstrom in eine Messküvette transportiert <strong>und</strong><br />
die Fluorochrome durch Laserlicht angeregt. Es können neben den Fluoreszenzsignalen noch<br />
das Vorwärtsstreulicht (FSC) als Maß <strong>für</strong> die Zellgröße <strong>und</strong> das Seitwärtsstreulicht als Maß <strong>für</strong><br />
die Granularität der Zelle gemessen werden.<br />
46
Anhand der Lage der Zellen im FSC – SSC Dot Plot sind bereits einzelne Zellpopulation<br />
identifizierbar:<br />
Fluorochrome:<br />
1. Schritt: 2. Schritt:<br />
Anregung des Fluorochroms Emission des absorbierten<br />
mit Laserlicht (Absorbtion) Laserlichts als Photon mit<br />
z.B. Anregung von FITC mit einer größeren Wellenlänge<br />
blauem Laser (λ = 488nm)<br />
47
Es können mehrere Fluorochrome gleichzeitig verwendet werden, diese können sich jedoch in<br />
ihren Emissionswellenlängen gegenseitig überlagern.<br />
blauer Laser:<br />
roter Laser:<br />
violetter Laser:<br />
Zur Signaltrennung ist eine Kompensation der Fluoreszenzsignale notwendig.<br />
Für ein spezifisches Einzelsignal muss der jeweilige Anteil überlappender Signale vom<br />
Gesamtsignal abgezogen werden.<br />
48
Optisches System des FACSCanto II<br />
49
Erfassung <strong>und</strong> Umwandlung in digitale Signale<br />
Aufgabenstellung:<br />
Es sollen die einzelnen zellulären Bestandteile der weißen Blutzellen aus Vollblut präpariert,<br />
durchflusszytometrisch erfasst <strong>und</strong> analysiert werden.<br />
Durchführung:<br />
Das Vollblut wird zur Verhinderung einer nachfolgenden Gerinnung in einer Lithium-Heparin<br />
Monovette abgenommen. Zur Entfernung der enthaltenen Erythrozyten erfolgt zunächst eine<br />
Zerstörung (Lyse) der Erythrozyten durch Zusatz eines Erythrozytenlysis-Puffers. Durch Zusatz<br />
dieses niedermolaren Puffers entsteht ein osmotischer Gradient. Da Erythrozyten eine<br />
verhältnismäßig dünne Zellmembran besitzen, können auf diese Weise Erythrozyten spezifisch<br />
zerstört <strong>und</strong> weiße Blutzellen angereichert werden. Nach zweimaligem Waschen mit<br />
isotonischem Waschpuffer können die verbleibenden weißen Blutzellen mit spezifischen<br />
Antikörpern angefärbt werden. Das Zellpellet wird in 50µl Waschpuffer resuspendiert <strong>und</strong> es<br />
werden jeweils 2µl der folgenden Antikörper zugesetzt:<br />
50
Antikörper gekoppeltes Fluorochrom spezifische Zelldetektion<br />
CD66b FITC Granulozyten<br />
CD16 PE Monozyten/NK Zellen<br />
CD14 PerCP Monozyten<br />
CD56 PE/Cy7 NK Zellen<br />
CD41a APC Thrombozyten<br />
CD19 APC/Cy7 B-Lymphozyten<br />
CD3 Horizon V450 T-Lymphozyten<br />
Die Färbung erfolgt 15 min in der Dunkelheit. Die Messung der Probe erfolgt am BD FACSCanto<br />
II Durchflusszytometer.<br />
51
Thema 7 Diagnostische <strong>und</strong> therapeutische Anwendung von Antikörpern<br />
Prof. Dr. T. Kamradt, Dr. M. Gabler, U. Lehmann, PhD, Dr. S. Drube,<br />
Dr. J. Stirnweiss, Dr. I. Irmler, Dipl. Biochem. M. Böttcher,<br />
Dipl. Biol. Ch. Göpfert, I. Meininger<br />
<strong>Institut</strong> <strong>für</strong> Immunologie, Leutragraben 3<br />
7.1 Diagnostische <strong>und</strong> therapeutische Anwendung von Antikörpern<br />
Die meisten immunologischen Methoden erfordern einen oder mehrere spezifische Antikörper.<br />
Es wird zwischen polyklonalen <strong>und</strong> monoklonalen Antikörpern unterschieden.<br />
Polyklonale Antikörper (Ak) besitzen eine Antigenspezifität, aber unterschiedliche<br />
Epitopspezifitäten. Nach Immunisierung eines Tieres mit einem Antigen (Ag) wird eine Mischpopulation<br />
von Antikörpern erzeugt. Diese Antikörper werden nach der Aufreinigung aus dem<br />
Serum als polyklonal bezeichnet. Bei der unaufgereinigten Variante spricht man dagegen von<br />
einem polyklonalen Antiserum. Die Vorteile polyklonaler Ak liegen in der schnellen,<br />
unkomplizierten <strong>und</strong> somit preisgünstigen Gewinnung. Durch die Immunisierung großer Tiere<br />
lassen sich große Mengen von Antiserum gewinnen. Polyklonale Seren eignen sich v.a. <strong>für</strong> den<br />
Nachweis sehr kleiner Moleküle, die wenige Epitope aufweisen. Die Nachteile polyklonaler Ak<br />
bestehen in den chargenabhängigen Schwankungen <strong>und</strong> der somit aufwendigen<br />
Qualitätskontrolle. Außerdem enthalten polyklonale Antiseren oft ungewünschte Ak, die z.B. von<br />
Infektionen des immunisierten Tieres herrühren. Diese führen durch ihre Unspezifität oft zu<br />
Kreuzreaktionen.<br />
Monoklonale Ak werden von ein <strong>und</strong> demselben B-Zell-Klon gebildet. Sie besitzen nur eine<br />
Epitopspezifität. Für die Generierung monoklonaler Ak-produzierender Zellen, sogenannten<br />
Hybridomazelllinien, wird eine Plasmazelle mit einer Myelomazelle fusioniert. Diese<br />
Hybridomazelle vereinigt nun in sich die Fähigkeit einer Plasmazelle zur Produktion eines<br />
spezifischen monoklonalen Ak <strong>und</strong> die Eigenschaft einer Tumorzelle, sich unbegrenzt teilen zu<br />
können. Die Vorteile monoklonaler Ak liegen in ihrer Herstellung: Hybridomazellen lassen sich<br />
unendlich vermehren <strong>und</strong> die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper aus dem<br />
Zellkulturmedium ist einfacher als aus dem Serum, da dieses weniger störende Begleitproteine<br />
enthält. Durch den Herstellungsprozess ist eine gleichbleibende Qualität gewährleistet. Dadurch,<br />
dass ein monoklonaler Ak nur eine Epitop erkennt, treten nur äußerst selten Kreuzreaktionen<br />
auf.<br />
Die Wahl eines polyklonalen oder eines monoklonalen Ak hängt letztendlich vom<br />
Verwendungszweck ab.<br />
7.1.1 Therapeutischer Einsatz von Ak<br />
Der folgende Abschnitt soll einen Einstieg in die komplexe Thematik des therapeutischen<br />
Einsatzes von Ak in der Medizin bieten, die im Rahmen dieses Praktikums nicht erschöpfend<br />
behandelt werden kann.<br />
In den letzten Jahren haben in den verschiedensten Bereichen der Medizin wie z.B. Therapie<br />
von malignen <strong>und</strong> Autoimmun-Erkrankungen, Infektionen, aber auch bei Verhinderung von<br />
Transplantatabstoßungen sogenannte „Biologicals“ mehr <strong>und</strong> mehr an Bedeutung gewonnen.<br />
Zu den „Biologicals“ zählen neben löslichen Rezeptoren <strong>und</strong> molekularen Mimetika auch<br />
monoklonale Antikörper (mAk).<br />
Die mAk stellen eine besonders erfolgreiche Gruppe von Arzneimitteln dar: 29% der chimären<br />
Antikörper <strong>und</strong> 25 % der humanisierten Antikörper schaffen es von der Entwicklung bis zur<br />
Zulassung, während die Erfolgsquote bei herkömmlichen Arzneimitteln nur bei 11 % liegt.<br />
Die Limitationen bei der Therapie mit mAk liegen in den möglichen Targets: als Target kommen<br />
lediglich Strukturen in Frage, die <strong>für</strong> Ak zugänglich sind, sich also zumeist auf der Oberfläche<br />
von Zellen befinden.<br />
Entscheidend <strong>für</strong> die therapeutischen Effekte der mAk ist ihre Struktur, z.B. agglutinieren F(ab´)2<br />
Fragmente Bakterien <strong>und</strong> Viren <strong>und</strong> sind so in der Lage, diese zu neutralisieren; Fc-Fragmente<br />
52
dagegen verstärken Phagocytoseprozesse (Opsonierung) <strong>und</strong> wirken toxisch via ADCC<br />
(antibody-dependant cellular cytotoxicity).<br />
In ersten Versuchen, die zunächst moderaten klinischen Effekte von mAk zu verbessern,<br />
wurden Toxine, Radionukleotide oder andere biologische Effektormoleküle chemisch an mAk<br />
gekoppelt.<br />
Die Fc-Region eines Ak ist entscheidend <strong>für</strong> seine Halbwertszeit <strong>und</strong> Stabilität <strong>und</strong> beeinflusst<br />
so entscheidend seine Pharmakokinetik. Darüber hinaus vermittelt die Fc-Region die<br />
Effektorfunktionen der Ak wie ADCC <strong>und</strong> CDCC (complement-dependent-cellular cytotoxicity).<br />
Der Fortschritt in der Biotechnologie ermöglicht z.B. den Austausch einzelner Aminosäuren oder<br />
eine Veränderung der Glycosylierung der Fc-Region. So konnten durch den Austausch weniger<br />
AS in der Fc-Region die in vitro Effektorfunktionen der anti-Tumor mAk Rituximab <strong>und</strong><br />
Trastuzumab um das zweifache gesteigert werden.<br />
Im Allgemeinen sind mAk gut verträglich, obwohl bei der ersten Applikation oft<br />
Infusionsreaktionen (wie Fieber <strong>und</strong> Schüttelfrost) auftreten, die aber zumeist leicht in den Griff<br />
zu bekommen sind.<br />
Um die Immunogenizität der xenogenen mAk zu reduzieren, ist man zum Design chimärer Ak<br />
übergegangen: dabei wird durch homologe Rekombination z.B. ein Fab-Fragment aus einem<br />
Nagetier (z.B. der Maus) mit einem humanen Fc-Fragment verb<strong>und</strong>en. Die Phage-Display-<br />
Technik ermöglicht sogar die Generierung kompletter humaner mAk jeder beliebiger Spezifität<br />
(s. Abbildung 1).<br />
Abbildung 1: Darstellung humanisierter <strong>und</strong> chimärer mAK<br />
Diese Techniken ermöglichen die Reduktion von Nebenwirkungen <strong>und</strong> eine Verbesserung der<br />
klinischen Wirksamkeit.<br />
Abbildung 2 zeigt eine Auswahl therapeutischer mAk, die in Deutschland bereits zur Therapie<br />
zugelassen sind.<br />
53
Abbildung 2: In Deutschland zur Therapie zugelassene monoklonale Antikörper<br />
Trotz aller Forschritte beim Einsatz von mAk zu Therapiezwecken müssen die enormen Kosten<br />
berücksichtigt werden, die durch die aufwendige Entwicklung der mAk sowie deren Herstellung<br />
<strong>und</strong> die aufwändigen Qualitätskontrollen entstehen.<br />
Abbildung 3 erläutert die Nomenklatur der Arzneimittelnamen monoklonaler Ak.<br />
Abbildung 3: Nomenklatur der mAk<br />
Bei allen Erfolgen in der Therapie sind bei der Entwicklung von mAk auch Rückschläge zu<br />
verzeichnen (s. Abbildung 4).<br />
54
Abbildung 4: Verlauf der Phase I Studie des mAk anti-CD28 (TGN1412) [2]<br />
7.1.2 Ak-basierte Methoden in der Diagnostik<br />
Antikörper bilden die Basis <strong>für</strong> zahlreiche diagnostische Verfahren in allen Bereichen der<br />
Medizin <strong>und</strong> in der medizinischen Forschung. Zu den zahlreichen analytischen <strong>und</strong> präparativen<br />
Techniken zählen z.B. die Immunhistochemie, Immunfluoreszenz (FACS,<br />
Fluoreszenzmikroskop), Immunoassays (ELISA, ELISPOT, Immunoblot, Immunopräzipitation)<br />
<strong>und</strong> Affinitätschromatographie.<br />
Im Praktikum sollen Seren auf Antikörper mittels ELISA untersucht werden <strong>und</strong> Lymphozyten<br />
mittels einer FACS-Färbung charakterisiert werden.<br />
Darüber hinaus wird auf die Methoden SDS-PAGE, Immunoblot <strong>und</strong> MACS eingegangen.<br />
7.1.2.1 ELISA<br />
Der ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) ist einer der am häufigsten verwendeten<br />
quantitativen Immunoassays. Der Substratumsatz eines an einen Antikörper gekoppelten<br />
Enzyms ist dabei proportional zur Antigenkonzentration. Mit Hilfe des ELISAs können Proteine,<br />
Viren aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine <strong>und</strong> Pestizide in einer<br />
Probe (Blutserum, Milch, Urin etc.) nachgewiesen werden. In der Diagnostik wird der ELISA zur<br />
Bestimmung von Ak-Titern in Patientenseren, Nachweis von Hormonen oder Bestimmung von<br />
Serumproteinen eingesetzt.<br />
Es gibt verschiedene ELISA-Typen: den direkten, den kompetitiven <strong>und</strong> den Sandwich-ELISA.<br />
Die folgende Tabelle stellt die Unterschiede der verschiedenen Typen dar:<br />
55
Direkter ELISA Sandwich ELISA Kompetitiver ELISA<br />
1 Adsorption des Ag an 1 Adsorption des Ak an 1 Adsorption des Ak an<br />
Mikrotiterplatte<br />
Mikrotiterplatte<br />
Mikrotiterplatte<br />
2 Blocken freier<br />
2 Blocken freier<br />
2 Blocken freier<br />
Proteinbindestellen<br />
Proteinbindestellen<br />
Proteinbindestellen<br />
3 Inkubation mit Probe (z.B. 3 Inkubation mit Probe 3 Inkubation mit markiertem<br />
Serum)<br />
Antigen <strong>und</strong> der Probe<br />
4 Inkubation mit Detektions- 4 Inkubation mit Detektions- 4 Inkubation mit Detektions-<br />
Ak<br />
Ak<br />
Ak<br />
5 Farbreaktion 5 Farbreaktion 5 Farbreaktion<br />
6 Messung im Photometer 6 Messung im Photometer 6 Messung im Photometer<br />
Zwischen den einzelnen beschriebenen Schritten erfolgen Waschschritte.<br />
Im Allgemeinen zeichnet sich der Sandwich-ELISA durch seine hohe Sensitivität aus. Der<br />
direkte ELISA findet bei der Bestimmung von Antigenspezifischen Antikörpern in Seren<br />
Anwendung.<br />
Mittels ELISA soll die Antikörperantwort gegen humanes G6PI (rhG6PI) im Serum von Mäusen<br />
nach rhG6PI Immunisierung gemessen <strong>und</strong> gleichzeitig der Isotyp der gebildeten Antikörper<br />
untersucht werden. Das Prinzip des Tests beruht auf der Immobilisierung von rhG6PI als<br />
Antigen an die feste Phase von Mikrotiterstreifen (Polystyrol) <strong>und</strong> anschließender Zugabe des<br />
Serums (mit anti-rhG6PI-Antikörpern, die spezifisch an das Antigen binden). Während der sich<br />
anschließenden Waschschritte bleiben nur anti-rhG6PI Antikörper an dem immobilisierten<br />
Antigen geb<strong>und</strong>en <strong>und</strong> werden mit einem zweiten Antikörper, der spezifisch Antikörper eines<br />
bestimmten Isotyps erkennt, inkubiert. Der Nachweis der so geb<strong>und</strong>enen Antikörper erfolgt<br />
mittels eines weiteren enzymmarkierten Antikörpers. Nach Zugabe einer Substratlösung<br />
entwickelt sich ein Farbstoff, dessen Farbintensität proportional der Konzentration <strong>und</strong>/ oder der<br />
Aktivität der Antikörper ist.<br />
Fragen zur Vorbereitung:<br />
• Was würden Sie zum Blocken verwenden?<br />
• Welcher ELISA-Typ wird im Praktikum demonstriert?<br />
• In untenstehender Abbildung ist der schematische Ablauf des ELISAs dargestellt.<br />
+ Ziege-anti + Esel-anti- + Substrat<br />
+ Serum Maus (IgM IgG1) Ziege IgG<br />
rhG6PI Esel-anti-Ziege IgG Konjugat<br />
Maus- anti-rhG6PI-Antikörper POD<br />
Ziege- anti-Maus (IgM, IgG1) Substrat<br />
Abbildung 5: Prinzip des ELISAs<br />
56
Die Schritte 1-5 werden durch Ihre Praktikumsbetreuer/-in durchgeführt.<br />
Durchführung:<br />
• 1. Beschichtung der Platte: 100µl der rhG6PI (5µg/ml) in PBS werden in die Wells der<br />
Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platten werden über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer<br />
inkubiert.<br />
• 2. Waschen <strong>und</strong> Blockieren: Platte ausleeren, Flüssigkeitsreste durch kräftiges<br />
Aufschlagen der umgedrehten Platte auf ein sauberes, trockenes Tuch (z.B. Zellstoff)<br />
entfernen. Danach 200µl /Well Blockierungspuffer einpipettieren <strong>und</strong> 1h auf der Platte zum<br />
Blockieren stehen lassen. Anschließend wird die Platte geleert <strong>und</strong> noch 3x durch Füllen mit<br />
200 µl Waschpuffer/Well, <strong>und</strong> erneutem Ausschlagen gewaschen.<br />
• 3. Reaktion mit Mäuseserum: Das Mausserum wird seriell von 1:100 – 1: 102.400 mit<br />
Wasch-puffer verdünnt <strong>und</strong> jeweils 100µl der unterschiedlichen Verdünnungen als Dupletts<br />
in die Wells eingefüllt. Anschließend erfolgt eine 1h Inkubation bei Raumtemperatur.<br />
• 4. Waschen: s.o.<br />
• 5. Inkubation mit Ziege-anti-Maus-IgG1, <strong>und</strong> IgM Antikörper: jeweils 100 µl der einzelnen<br />
Antikörper werden in einer Verdünnung von 1:1000 in Waschpuffer <strong>für</strong> 1h bei<br />
Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubiert.<br />
• 6. Waschen: s.o.<br />
• 7. Inkubation mit Peroxidase-gekoppelten Esel-anti-Ziege-IgG Antikörper: Der<br />
Peroxidase-gekoppelte Antikörper wird 1:3000 mit Waschpuffer verdünnt <strong>und</strong> jeweils<br />
100µl/Well <strong>für</strong> 20 min bei 37°C in der feuchten Kammer inkubiert.<br />
• 8. Waschen: s.o.<br />
• 9. Substratreaktion: 10mg ortho-Phenylendiamin (OPD) wird in 10 ml Substratpuffer gelöst.<br />
Danach werden 5µl 30% Wasserstoffperoxid-Lösung zugesetzt <strong>und</strong> gut gemischt. 100µl<br />
dieser Lösung werden in jede Vertiefung der Platte einpipettiert. Die Farbentwicklung durch<br />
Zusatz von 50µl Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wird bei 492nm in einem ELISA-<br />
Plattenreader gemessen.<br />
Auswertung:<br />
Bestimmen Sie den Titer der immunisierten <strong>und</strong> der unimmunisierten Maus. Der Titer ist die<br />
höchste Serumverdünnung bei der anti-rhG6PI Antikörper noch detektierbar sind. Dabei werden<br />
OD-Werte, die dreifach höher als die Standardabweichung des Leerwertes (wells ohne<br />
Mausserum) sind, als positiv eingeschätzt.<br />
Die Antikörpertiter der einzelnen Subtypen sind als Säulendiagramm grafisch darzustellen.<br />
Haben Sie dieses Ergebnis erwartet?<br />
57
7.1.2.2 Western-Blot<br />
Der Western-Blot (WB) dient der Identifizierung <strong>und</strong>/oder Quantifizierung spezifischer Proteine<br />
innerhalb eines Proteingemisches. Die Detektion erfolgt mittels eines Ak, der spezifisch an<br />
antigene Epitope des auf einer Membran fixierten Zielproteins bindet. Man spricht daher auch<br />
von Immunoblot.<br />
In Abhängigkeit vom verwendeten Detektionssystem liegt die Nachweisgrenze im Piko- bis<br />
Nanogrammbereich.<br />
Abbildung 6: Kammer <strong>für</strong> SDS-PAGE <strong>und</strong> Gel nach Coomassie-Färbung<br />
Dem Western-Blot geht in der Regel eine SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)<br />
voraus. Die SDS-PAGE ermöglicht die Auftrennung von Proteingemischen. SDS ist ein<br />
anionisches Detergenz, das die Eigenladung von Proteinen überdeckt. Durch den Überschuss<br />
an SDS werden Sek<strong>und</strong>är- <strong>und</strong> Tertiärstrukturen der Proteine zerstört. Die stark negativ<br />
geladenen Proteine wandern dann im elektrischen Feld nur noch entsprechend ihrer Masse. Da<br />
eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichts <strong>und</strong> der<br />
Wanderungsgeschwindigkeit der SDS-Polypeptid-Micellen besteht, kann mit Hilfe eines<br />
Standard-Protein-Markers das Molekulargewicht eines Proteins bestimmt werden. Zum<br />
Nachweis der Proteine direkt im Gel wird häufig eine Coomassiefärbung verwendet (s.<br />
Abbildung 6).<br />
Nach der SDS-PAGE erfolgt der eigentliche Blot. Dabei werden die separierten Proteine in<br />
einem „Blot-Sandwich“ auf eine Trägermembran übertragen.<br />
Abbildung 7: „Blot-Sandwich“<br />
58
Im Anschluss erfolgt der Detektion der Proteine auf der Membran mittels Antikörper. Dabei ist<br />
der praktische Ablauf ähnlich dem ELISA:<br />
1 Blocken der unspezifischen Bindungsstellen<br />
2 Waschen<br />
3 1. AK<br />
4 Waschen<br />
5 2. AK (enzym-markiert)<br />
6 Waschen<br />
7 Substratumsetzung<br />
In der Diagnostik wird der Western-Blot z.B. zum Nachweis HIV-spezifischer Antikörper<br />
verwendet.<br />
Abbildung 8: Western Blot am Beispiel des Nachweises von Ak gegen verschiedene Bestandteile von<br />
HIV im humanen Serum<br />
7.1.2.3 FACS ( Fluorescent activated cell sorting)<br />
Die Durchflusszytometrie wird in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, um einzelne Zellen<br />
näher zu charakterisieren. Fluoreszenzmarkierte Zellen werden hierbei durch eine, die Probenflüssigkeit<br />
umgebende Mantelflüssigkeit (Sheath) vereinzelt. Anschließen werden sie durch eine<br />
Messküvette gedrückt, in der sie den Strahl eines oder mehrer Lasers passieren. Die<br />
auftretende Lichtstreuung sowie die Emission der Fluoreszenzfarbstoffe werden mit<br />
Photodetektoren (PMTs) gemessen, digitalisiert <strong>und</strong> können dann mit Hilfe spezieller Software<br />
analysiert werden. Auf diese Art kann man gleichzeitig mehrere physikalische <strong>und</strong> Fluoreszenz-<br />
Parameter einer großen Zellmenge auf Einzelzellebene analysieren. Im Folgenden ist der<br />
schematische Aufbau eines FACS-Gerätes dargestellt:<br />
59
Abbildung 9: Schematische Darstellung,<br />
wie mit Hilfe von Druck die Mantelflüssigkeit<br />
aus dem Vorratsbehälter (Sheath) die<br />
Zellen vereinzelt an dem fokussierten<br />
Laserlicht vorbeiführt. In der Messküvette<br />
(Flow Chamber) trifft das Laserlicht auf die<br />
Zellen <strong>und</strong> die abgestrahlten Lichtsignale<br />
werden dann von entsprechenden PMT-<br />
Detektoren aufgefangen <strong>und</strong> in digitalisierter<br />
Form an einen Computer übermittelt.<br />
Es werden Informationen über die Morphologie der Zellen gesammelt, indem das<br />
durchgelassene <strong>und</strong> das im 90° Winkel abgestrahlte Licht gemessen werden. Damit<br />
können Rückschlüsse auf die Größe der Zellen <strong>und</strong> auf die Granularität der Zellen (granuläre<br />
Strukturen streuen das Licht stärker) gezogen werden. Wenn man Oberflächenmoleküle durch<br />
Antikörper markiert, an welche ein fluoreszierender Farbstoff gekoppelt wurde, dann kann die<br />
Expression dieser Moleküle durch die Messung der emittierten Lichtsignale nachgewiesen<br />
werden.<br />
Die folgende Abbildung bietet eine Zusammenfassung dieser Messparameter.<br />
Informationen über:<br />
Zellgröße (FSC)<br />
Granularität (SSC)<br />
Fluoreszenz (z.B. FITC)<br />
D<br />
FITC<br />
539<br />
SSC<br />
90°<br />
488<br />
FSC<br />
2°-16°<br />
Abbildung 10: Der von der Zelle modifizierte Laserstrahl<br />
wird mit den entsprechenden Detektoren<br />
• FSC (Forward-Scatter Channel: Zellgröße) in<br />
Laserstrahl in Vorwärtsrichtung,<br />
• SSC (Side-Scatter Chanel: Zellgranularität) <strong>für</strong><br />
das im 90° Winkel durch die Zelle gestreute<br />
Licht<br />
• <strong>und</strong> einem Messkanal <strong>für</strong> die Fluoreszenz einer<br />
bestimmten Wellenlänge (z.B. FITC-gekoppelter<br />
Ak) gemessen.<br />
60
SSC<br />
tote<br />
Zellen<br />
Granulozyten<br />
Mø<br />
Lymphozyten<br />
FSC<br />
Abbildung 11:<br />
Schematische Dot Plot-Darstellung der<br />
FSC <strong>und</strong> SSC Charakteristika von Zellen<br />
des peripheren Bluts.<br />
Wenn man die Messwerte <strong>für</strong> die Intensität der FSC-Signale (X-Achse) <strong>und</strong> der SSC Signale (Y-<br />
Achse) in einem sogenannten DOT-PLOT darstellt, kann man erkennen, dass aufgr<strong>und</strong> der<br />
unterschiedlichen Morphologie Zellpopulationen des peripheren Blutes identifizierbar sind. Die<br />
eher kleinen Lymphozyten mit wenig intrazellulären Granula geben weder im FSC noch im SSC<br />
ein starkes Signal; Granulozyten dagegen geben, wegen ihrer reichlich vorhandenen Granulae,<br />
ein starkes Signal im SSC ab.<br />
Für die weitere Unterscheidung der Zellfraktionen reichen diese morphologischen Parameter<br />
nicht aus; weswegen man hier unterschiedliche Fluorochrom-markierte Antikörper verwendet.<br />
Diese Antikörper binden beispielweise an bestimmten Oberflächenmolekülen <strong>und</strong> durch<br />
Kombinieren von mehreren mit unterschiedlichen Fluorochromen gekoppelten Antikörpern<br />
können auch kleine Zell-Subpopulationen identifiziert werden.<br />
61
Gebräuchliche Fluorochrome, welche häufig in Kombinationen zusammen verwendet werden,<br />
sind in folgender Tabelle aufgeführt (FLUOROCHROM-AUSWAHL).<br />
Fluorochrom Ex (nm) Em(nm) PMT Detektor<br />
FITC (fluoresceinisothiocyanat) 495 519 530/30<br />
CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) 495 519 530/30<br />
PE (R-phycoerythrin) 480 578 575/26<br />
pi (propidium iodid) 530 617 575/26, 695/40<br />
PerCP (peridinin chlorophyllprotein) 490 670 695/40<br />
APC (allophycocyanin) 650 660 660/20<br />
Cy5 (Cyanine 5)<br />
Cy5-bis-OSU, N,N'-biscarboxypentyl-5,5'disulfonatoindodicarbocyanine<br />
488<br />
FLUORESCENCE DETECTOR FILTER PASSBANDS<br />
green FITC orange PE<br />
red PerCP<br />
530/30 575/26 695/40<br />
530 580 630 660 n<br />
650 670 660/20<br />
Abbildung 12 :<br />
Emissionskurven von FITC, PE <strong>und</strong><br />
PerCP sowie die Filter der PMTs <strong>für</strong><br />
die Detektion dieser Signale.<br />
Die Emission der einzelnen Fluorochrome stellt eine Kurve dar (vgl. Abbildung 12). Daraus<br />
resultiert, dass die Emissionssprektren der hier ausgewählten Fluorochrome FITC, PE <strong>und</strong><br />
PerCP überlappen, was in der praktischen Arbeit am FACS Komplikationen verursacht. Die<br />
Detektoren messen die Lichtsignale innerhalb ihres festgelegten Wellenlängenbereiches<br />
unabhängig vom Ursprung dieser Signale. Die unerwünschten Signale können während der<br />
Messung vom Computer ´herausgerechnet´ werden, so dass dann in jedem Kanal nur noch<br />
Signale eines einzelnen Fluorochromes angezeigt werden. Diese extrem fehleranfällige<br />
Operation nennt man Kompensation. Eine korrekte Kompensation wird mit Kontrollproben der<br />
zu analysierenden Zellen durchgeführt, die mit jeweils nur einem der <strong>für</strong> die Analyse<br />
kombinierten Fluorochrom-gekoppelten Antikörper gefärbt wurden.<br />
In der Diagnostik wird die FACS –Färbung z B. zur Bestimmung der Frequenz von CD4+<br />
T-Helferzellen verwendet (s. Abbildung 9).<br />
62
Abbildung 13: 30jähriger Patient mit bekannter HIV-Infektion, mit drastisch reduzierter CD4 positiver Th-<br />
Zellpopulation<br />
Im Praktikum werden die T-Lymphozyten in der Milz einer Maus mittels FACS-Färbung<br />
charakterisiert.<br />
Die Färbung erfolgt mit folgenden Antikörpern:<br />
anti-CD3-PE (CD3=cluster of differentiation = Oberflächenprotein T-Lymphocyten)<br />
anti-CD4-PacBlue (CD4 Oberflächenprotein charakteristisch <strong>für</strong> T-Helferzellen)<br />
anti-CD8-Dy647 (CD8 Oberflächenprotein, cytoxische T-Lymphocyten)<br />
Durchführung:<br />
Oberflächenfärbung:<br />
1 CD3-PE, CD4-PacBlue, CD8-D647<br />
2 CD3-PE 1 :200<br />
3 CD4-PacBlue 1:100<br />
4 CD8-D647 1:100<br />
5 ungefärbt<br />
• Es werden 1x 10 6 Zellen pro Färbung eingesetzt<br />
• Alle Schritte werden auf Eis, in relativer Dunkelheit durchgeführt<br />
• 1ml PBA zu den Zellen geben, 5´@ 4°C bei 400xg zentrifugieren, Überstand abkippen<br />
<strong>und</strong> Zellpellet resuspendieren (= Waschen)<br />
• Blockieren der unspezifischen Bindungen: Zugabe von antiCD16/CD32 (2.4G2, 10<br />
µg/ml) sowie aufgereinigtem Ratten-IgG (Jackson, 10 µg/ml ) zum resuspendierten<br />
Zellpellet <strong>und</strong> 8min inkubieren<br />
• zwischenzeitlich: Vorbereiten der Antikörper-Färbelösungen (Titer s. Tabelle)<br />
• <strong>für</strong> die Oberflächenfärbung in die entsprechenden tubes anti-CD3-PE, anti-CD4-PacBlue<br />
<strong>und</strong> anti-CD8-Dy-647 dazugeben <strong>und</strong> 10 min inkubieren<br />
• Waschen mit PBA<br />
• Zellen in 300µl PBA aufnehmen<br />
• Die Proben können nun im FACS gemessen werden.<br />
63
7.1.2.4 MACS® – Magnetic Cell Sorting<br />
Zellpopulationen können unter geringem Zeitaufwand mit Hilfe des MACS ® (magnetic cell<br />
sorting) Verfahrens aus gemischten Zellsuspensionen isoliert werden. Da<strong>für</strong> werden<br />
superparamagnetische Mikropartikel (ca. 50 nm Durchmesser) mit Antikörpern, welche <strong>für</strong> die<br />
spezifische Zellpopulation charakteristische Oberflächenmoleküle erkennen, konjugiert (MACS-<br />
Beads). Mit den Bead-Antikörpern werden die gewünschten Zellen markiert <strong>und</strong> auf eine<br />
spezielle Trennsäule gegeben, die mit Stahlkügelchen gefüllt ist <strong>und</strong> zwischen den Magnetpolen<br />
eines Hochleistungsmagneten eingehängt werden kann. Innerhalb des Magnetfeldes entsteht<br />
ein Hochgradientenfeld, so dass die markierten Zellen in der Säule festgehalten werden,<br />
während unmarkierte Zellen durch die Säule gespült <strong>und</strong> als negative Fraktion aufgefangen<br />
werden können. Die markierten Zellen werden durch Elution von der Säule ´außerhalb´ des<br />
Magnetfelds gewonnen.<br />
Literatur:<br />
Abbildung 14: Auftrennung von<br />
zwei unterschiedlichen<br />
Zellpopulationen mit Hilfe einer<br />
MACS-Trennsäule. Solange sich die<br />
Säule innerhalb des Magnetfeldes<br />
befindet, werden die Beadsbeladenen<br />
Zellen zurückgehalten.<br />
Die nicht-markierten Zellen werden<br />
aus der Säule gespült. Wird die<br />
Säule aus dem Magnetfeld entfernt,<br />
können auch die markierten Zellen<br />
eluiert werden.<br />
[1] Chatenoud, L. (2006) Immune therapie of autoimmune diseases: are we approaching a real cure? Curr<br />
Op Immunol 18: 710-717<br />
[2] Logtenberg, T. (2007) Antibody cocktails: next generation biopharmaceuticals with improved potency.<br />
TREND in Biotechnology 25:9<br />
[3] Melero, I. Et al. (2007) Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy. Nat Rev Cancer<br />
7:95-106<br />
[4] Nepom, G.T. (2002) Therapy of autoimmune diseases: clinical trials and new biologics. Curr Op<br />
Immunol 14:812-815<br />
[5] Mix, E. et al. (2006) Immunoglobulins-Basic considerations. J Neurol 253 [suppl S] V/9-V/17<br />
[6] Carter, P.J. (2006) Potent antibody therapeutic by design. Curr Op Immunol 6:343-357<br />
[7] Experimentator Immunologie<br />
.<br />
64
Thema 8 Test zur verhaltensbiologischen Charakterisierung<br />
Dr. B. Günther<br />
Service-Einheit Kleinnager, Forschungszentrum Lobeda,<br />
Erlanger Allee 101<br />
8.1 Wasserausstiegslerntest<br />
8.1.1 Einführung<br />
Dieser Lerntest wurde 1961 von Essmann <strong>und</strong> Jarvik beschrieben <strong>und</strong> stellt ein Beispiel <strong>für</strong><br />
operante Konditionierung dar. Lernexperimente zur operanten Konditionierung sind in der Regel<br />
aufwendig <strong>und</strong> erfordern bei Nagern in Abhängigkeit von der Methode 10-100 Übungen, bis ein<br />
Lernerfolg nachweisbar ist. Durch positive <strong>und</strong> negative Verstärkung läßt sich die Anzahl der<br />
notwendigen Übungen verringern. Beim Wasserausstiegslerntest sind auf Gr<strong>und</strong> der negativen<br />
Bekräftigung durch den Aufenthalt im Wasser nur 3 Übungen notwendig, um einen Lernerfolg zu<br />
zeigen. Dieser Test eignet sich zum Nachweis von Lern- <strong>und</strong> Gedächtnisschwächen <strong>und</strong> kann<br />
bei verhaltensbiologischen Untersuchungen eingesetzt werden.<br />
8.1.2 Aufgabe<br />
Ermitteln Sie die Lernkurve <strong>für</strong> das Wasserausstiegsverhalten bei unbehandelten <strong>und</strong><br />
behandelten C57BL/6-Mäusen.<br />
8.1.3 Materialien<br />
� Makrolonkäfig Typ III (42 x 28 x 15cm – M3)<br />
� Landungsrampe<br />
� Thermometer<br />
� auf 27 – 28°C temperiertes Wasser<br />
� Handtuch<br />
� digitale Stoppuhr<br />
� Käfige zum Aufbewahren der Tiere<br />
� Protokollblätter, Kugelschreiber<br />
� C57BL/6-Mäuse (Böcke oder Weibchen) ca. 4 Wochen alt<br />
� 96% iges Ethanol, unvergällt, Leitungswasser, sterile Spritzen <strong>und</strong> Schl<strong>und</strong>sonden<br />
� Tierwaage<br />
8.1.4 Methoden<br />
Der Makrolonkäfig Typ III dient als Schwimmbecken <strong>und</strong> wird mit 27 – 28°C warmen Wasser<br />
gefüllt. Die Wasserhöhe soll ca. 8 – 10cm betragen. In eine Käfigecke wird die Landungsrampe<br />
im Winkel von 32 Grad eingehängt. Die Rampe soll ca. 0,5 – 1,0cm in das Wasser eintauchen.<br />
Im Wasserausstiegstest wird die Schwimmzeit bzw. die Zeit bestimmt, die die Tiere benötigen,<br />
um das Schwimmbecken zu verlassen.<br />
65
8.1.5 Durchführung des Versuches<br />
Die Versuchstiere werden am Praktikumstag vor Praktikumsbeginn mit Ethanol (1,69g/kgKM,<br />
p.o., 3 x 15ml/kgKM, behandelte Gruppe) behandelt oder erhalten Leitungswasser (3 x<br />
15ml/kgKM, p.o., Kontrollgruppe).<br />
Für den Verhaltenstest wird ein Ohr-markiertes Versuchstier aus dem Käfig entnommen <strong>und</strong><br />
gegenüber der Rampe mit dem Kopf zur Käfigwand bzw. –ecke in das Schwimmbecken gesetzt<br />
<strong>und</strong> die Zeit genommen, bis das Tier mit allen 4 Pfoten auf der Rampe steht.<br />
Das Tier wird mit dem Handtuch abgetrocknet <strong>und</strong> in den Käfig zurück gesetzt. Analog wird mit<br />
allen anderen Versuchstieren verfahren. Ist der 1. Testdurchgang beendet, wird im 10 minutigen<br />
Abstand zum Tier 1 ein 2. <strong>und</strong> danach ein 3. Testdurchgang ebenfalls in 10 minutigen Abstand<br />
mit allen Tieren durchgeführt.<br />
Wenn alle Tiere im 1. Test getestet sind, wird im Abstand von 40 min zum 1. Tier des 1. Testes<br />
ein 2. Test mit allen Tieren durchgeführt.<br />
Es wird <strong>für</strong> diesem Test ein Schwimmzeitlimit von 60 sec. festgelegt. Erreicht ein Tier während<br />
dieser Zeit nicht die Rampe, wird es aus dem Becken genommen <strong>und</strong> als „nicht geschafft“<br />
geführt.<br />
8.1.6 Protokoll<br />
1. Test<br />
Versuchstier-<br />
Nr.<br />
1. Durchgang 1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
2. Durchgang 1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
3. Durchgang 1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
Schwimmzeiten<br />
Gruppe C = Ethanoltiere<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
Schwimmzeiten<br />
Gruppe A = Kontolltiere<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
66
2. Test<br />
Versuchstier-<br />
Nr.<br />
1. Durchgang 1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
2. Durchgang 1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
3. Durchgang 1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
Schwimmzeiten<br />
Gruppe C = Ethanoltiere<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
Schwimmzeiten<br />
Gruppe A = Kontolltiere<br />
8.1.7 Auswertung<br />
1. Es werden der arithmetische (Ma) <strong>und</strong> der harmonische (Mh) Mittelwert berechnet.<br />
M<br />
a<br />
x1<br />
+ x2<br />
+ ... + xn<br />
=<br />
n<br />
n = Zahl der Versuchstiere<br />
x = Beobachtungswert (Schwimm- bzw. Ausstiegszeit)<br />
M<br />
h<br />
1<br />
2<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
∑<br />
x<br />
n<br />
=<br />
1 1 1<br />
+ + ... +<br />
x x x<br />
Für die Tiere, die das Kriterium Wasserausstieg innerhalb des Zeitlimits von 60 sec. nicht erfüllt<br />
1<br />
haben, wird die Schwimm- bzw. Ausstiegszeit x = ∞ gesetzt <strong>und</strong> es gilt = 0 .<br />
∞<br />
2. Es sind die Lernkurven der Mittelwerte der absoluten Schwimmzeiten <strong>für</strong> die unbehandelten<br />
<strong>und</strong> behandelten Versuchsgruppen zu zeichnen <strong>und</strong> zu diskutieren.<br />
3. Es ist der Anteil der Tiere pro Versuchsgruppe zu erfassen, die die Landungsrampe im<br />
vorgegebenen Zeitlimit nicht erreicht haben.<br />
4. Es ist zu prüfen, ob zwischen den absoluten Schwimmzeiten der unbehandelten <strong>und</strong><br />
behandelten Versuchsgruppe signifikante Unterschiede bestehen.<br />
n<br />
67
8.1.8 Fragen<br />
1. Was versteht man unter Bioindikator?<br />
2. Welche Rolle spielen Verhaltenstests bei der pharmakologischen <strong>und</strong> toxikologischen<br />
Testung?<br />
Hinweis: Bei Verhaltenstests ist auf absolute Ruhe zu achten!<br />
68
8.2 open-field-Test<br />
8.2.1 Einführung<br />
Der open-field-Test wurde 1934 von C. S. Hall entwickelt, um anhand der Kot- <strong>und</strong> Harnabgabe<br />
die Emotionalität bei Ratten in einer neuen Umgebung zu testen. Heute ist der open-field-Test<br />
der bei verhaltenstoxikologischen Routineuntersuchungen am häufigsten benutzte Test. Er ist<br />
technisch unkompliziert, einfach <strong>und</strong> schnell durchführbar <strong>und</strong> er ermöglicht Aussagen über<br />
Verhaltensänderungen als Folge von Störungen der Motorik, der räumlichen Orientierung, des<br />
stoffwechselbedingten Verhaltens, des Komfortverhaltens <strong>und</strong> des Erk<strong>und</strong>ungsverhaltens. Mit<br />
dem open-field wird das motorische Verhalten in seiner Komplexität als raum-zeitliches<br />
Phänomen erfaßt.<br />
8.2.2 Aufgabe<br />
Prüfen Sie anhand des Verhaltens im open-field, ob Ethanol eine verhaltensändernde Wirkung<br />
hervorruft.<br />
8.2.3 Materialien<br />
� open-field (55 x 27,5 x 21,5cm), mit auswechselbaren Laufflächen<br />
� digitale Stoppuhr<br />
� Käfige zum Aufbewahren der Tiere<br />
� 2 Wischlappen (1 x feucht, 1 x trocken)<br />
� Zellstoff zum Aufnehmen der Kotballen<br />
� sterile Spritzen <strong>und</strong> Schl<strong>und</strong>sonden<br />
� Protokollblätter, Kugelschreiber<br />
� 2,5%ige Fesiamonlösung<br />
� 96%iges Ethanol, unvergällt<br />
� Tierwaage<br />
� C57BL/6-Mäuse (Böcke oder Weibchen) ca. 4 Wochen alt<br />
8.2.4 Methoden<br />
Das open-field besteht aus einem rechteckigen Kunststoffkasten, der eine herausnehmbare<br />
Bodenfläche besitzt. Die Bodenfläche ist in 6 x 8 Quadrate von 6,8 x 6,8cm Größe eingeteilt. Im<br />
open-field werden 5 verschiedene Verhaltensparameter: - Ambulation<br />
- freies Aufrichten<br />
- Aufrichten mit Wandkontakt<br />
- Putzen<br />
- Defäkation<br />
von 2 Mitarbeitern beobachtet <strong>und</strong> in Form einer Strichliste gezählt.<br />
69
8.2.5 Durchführung des Versuches<br />
Die Versuchstiere werden am Praktikumstag vor Praktikumsbeginn mit Ethanol (1,69g/kgKM,<br />
p.o., 3 x 15ml/kgKM, behandelte Gruppe) behandelt oder erhalten Leitungswasser (3 x<br />
15ml/kgKM, p.o., Kontrollgruppe).<br />
Das open-field wird <strong>für</strong> den Verhaltenstest aufgestellt <strong>und</strong> vorbereitet, dabei ist insbesondere auf<br />
eine gleichmäßige Ausleuchtung der Laufflächen zu achten. Zum Test wird ein Ohr-markiertes<br />
Versuchstier aus dem Käfig entnommen <strong>und</strong> in eines der 4 im Zentrum des open-field<br />
befindlichen Quadrate gesetzt. Die Testdauer beträgt 3 min.<br />
Es werden die unter Punkt 10.2.6. aufgeführten Verhaltensparameter durch Beobachtung<br />
registriert. Nach dem Abschluß des Tests wird das Tier herausgenommen <strong>und</strong> in den Käfig<br />
zurück gesetzt. Nach jedem getesteten Tier wird die Lauffläche mit Fesiamonlösung abgewischt<br />
<strong>und</strong> im Anschluß daran trocken gerieben.<br />
Analog wird mit allen Tieren der unbehandelten <strong>und</strong> behandelten Versuchsgruppen verfahren.<br />
Wenn alle Tiere im 1. Test getestet sind, wird im Abstand von 40 min zum 1. Tier des 1. Testes<br />
ein 2. Testdurchgang mit allen Tieren durchgeführt.<br />
8.2.6 Auswertung<br />
1. Es sind die arithmetischen Mittelwerte der entsprechenden Verhaltensparameter <strong>für</strong> den 1.<br />
<strong>und</strong> 2. Testdurchgang der unbehandelten <strong>und</strong> behandelten Versuchsgruppen zu berechnen.<br />
2. Es ist zu prüfen, ob sich innerhalb einer Versuchsgruppe(behandelt oder unbehandelt) die<br />
Verhaltensparameter des 1. Tests vom 2. Test signifikant unterscheiden.<br />
3. Es ist weiterhin zu prüfen, ob sich die Verhaltenparameter des 1. <strong>und</strong> 2. Tests der<br />
unbehandelten Tiere von denen der behandelten Tiere signifikant unterscheiden.<br />
8.2.7 Fragen<br />
1. Was versteht man unter klassischer Konditionierung?<br />
2. Was bedeutet operante Konditionierung?<br />
Hinweis: Bei Verhaltenstests ist auf absolute Ruhe zu achten!<br />
70
8.2.8 Protokoll<br />
open-field<br />
1. Test<br />
Gruppe C = Ethanoltiere<br />
Parameter-<br />
Nr.<br />
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x<br />
1 FE Ambulation = Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)<br />
2 FA Freies Aufri chten<br />
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt<br />
4 P<br />
Putzen<br />
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3<br />
minutigen Testung erfaßt werden<br />
Gruppe A = Kontrolltiere<br />
Parameter-<br />
Nr.<br />
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x<br />
1 FE Ambulation = Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)<br />
2 FA Freies Aufri chten<br />
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt<br />
4 P<br />
Putzen<br />
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3<br />
minutigen Testung erfaßt werden<br />
Es empfiehlt sich, dass der Mitarbeiter, der die Ambulation bestimmt, auch die Zeit stoppt. Der 2. Mitarbeiter erfasst die Parameter 2-4 in einer<br />
Strichliste, die Daten sind nach Testende in das Protokoll zu übernehmen. Die Defäkation wird am Ende des Tests bestimmt.<br />
71
8.2.8. Protokoll<br />
open-field<br />
2. Test<br />
Gruppe C = Ethanoltiere<br />
Parameter-<br />
Nr.<br />
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x<br />
1 FE Anbulation=Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)<br />
2 FA Freies Aufri chten<br />
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt<br />
4 P<br />
Putzen<br />
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3<br />
minutigen Testung erfaßt werden<br />
Gruppe A = Kontrolltiere<br />
Parameter-<br />
Nr.<br />
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x<br />
1 FE Anbulation=Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)<br />
2 FA Freies Aufri chten<br />
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt<br />
4 P<br />
Putzen<br />
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3<br />
minutigen Testung erfaßt werden<br />
Es empfiehlt sich, dass der Mitarbeiter, der die Ambulation bestimmt, auch die Zeit stoppt. Der 2. Mitarbeiter erfasst die Parameter 2-4 in einer<br />
Strichliste, die Daten sind nach Testende in das Protokoll zu übernehmen. Die Defäkation wird am Ende des Tests bestimmt.<br />
72
8.3 Chimney – Test<br />
8.3.1 Einführung<br />
Der Chimney – Test dient der Charakterisierung des Reflexes der negativen Geotaxis, der<br />
neuromuskulären Koordination sowie der muskulären Aktivität. Dieser Test wurde 1960 von<br />
Boissier als ein Test zum Screening der Wirkung von Psychopharmaka in Mäusen beschrieben.<br />
8.3.2 Aufgabe<br />
Ermitteln Sie die Kletterzeiten von unbehandelten <strong>und</strong> Ethanol– behandelten C57BL/6–Mäusen<br />
im Chimney – Test.<br />
8.3.3 Materialien<br />
� Glasröhren von 30cm Länge (die eine Markierung bei 20cm aufweisen) mit unterschiedlichen<br />
Durchmessern entsprechend der Größe der C57BL/6-Mäuse<br />
� digitale Stoppuhr<br />
� Käfige zur Aufbewahrung der Tiere<br />
� Protokollblätter <strong>und</strong> Kugelschreiber<br />
� Filterpapierbogen<br />
� C57BL/6-Mäuse (Böcke oder Weibchen) im Alter von 4 Wochen<br />
� 96%iges Ethanol, unvergällt, Leitungswasser, sterile Spritzen <strong>und</strong> Schl<strong>und</strong>sonden<br />
� Tierwaage<br />
8.3.4 Methoden<br />
Die Glasröhren dienen als Kletterröhren („Schornstein“). Im Chimney - Test wird die Zeit<br />
bestimmt, die die Tiere benötigen, um rückwärts aus der Glasröhre zu klettern.<br />
8.3.5 Durchführung des Versuches<br />
Die Versuchstiere werden am Praktikumstag vor Praktikumsbeginn mit Ethanol (1,69g/kgKM,<br />
p.o., 3 x 15ml/kgKM, behandelte Gruppe) behandelt oder erhalten Leitungswasser (3 x<br />
15ml/kgKM, p.o., Kontrollgruppe).<br />
Geeignete Glasröhren werden entsprechend der Größe der zu verwendenden C57BL/6-Mäuse<br />
ausgewählt <strong>und</strong> auf ein Filterpapierbogen gelegt. Die 20cm-Markierung soll sich dabei auf der<br />
rechten Seite befinden. Eine Ohr-markierte Maus wird aus dem Käfig entnommen <strong>und</strong> mit dem<br />
Kopf zuerst in die rechte Öffnung der Glasröhre gesetzt. Mittels eines Glasstabes wird das Tier<br />
vorsichtig zum linken Rand der sich in waagerechter Position befindlichen Röhren geschoben.<br />
Im Anschluß daran wird die Glasröhre schnell aufgerichtet, so daß sich das Tier mit dem Kopf<br />
nach unten (die „Nasenspitze“ berührt den Boden) im unteren Teil der Röhre befindet. Das Tier<br />
versucht nun, rückwärts aus der Röhre zu klettern. Es wird die „Kletterzeit“ vom Aufrichten der<br />
Röhre bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Maus mit ihrer „Nasenspitze“ die Markierung erreicht<br />
hat, bestimmt. Erreicht die Maus die Markierung innerhalb eines Kletterzeitlimits von 60 sec.<br />
nicht, wird sie aus der Röhre genommen <strong>und</strong> als „nicht geschafft“ geführt analog dem WAT.<br />
Sind alle Ethanol - behandelten <strong>und</strong> unbehandelten Tiere getestet worden, wird im 40 minutigen<br />
Abstand zum 1. getesteten Tier ein 2. Test durchgeführt.<br />
73
8.3.6 Protokoll<br />
1. Test<br />
Versuchstier-<br />
Nr.<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
2. Test<br />
Versuchstier-<br />
Nr.<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
Kletterzeit in sec.<br />
Gruppe C = Ethanoltiere<br />
∑<br />
x<br />
Kletterzeit in sec.<br />
Gruppe C = Ethanoltiere<br />
∑<br />
.x<br />
8.3.7 Auswertung<br />
Kletterzeit in sec.<br />
Gruppe A = Kontolltiere<br />
∑<br />
x<br />
Kletterzeit in sec.<br />
Gruppe A = Kontolltiere<br />
1. Analog dem Wasserausstiegstest sind die harmonischen <strong>und</strong> arithmetischen Mittelwerte der<br />
Kletterzeiten der unbehandelten <strong>und</strong> Ethanol- behandelten Tiere <strong>für</strong> den 1. <strong>und</strong> 2. Test zu<br />
berechnen.<br />
2. Es ist zu prüfen, ob sich die Kletterzeiten der Ethanoltiere von denen der Kontrolltiere im 1.<br />
<strong>und</strong> 2. Test unterscheiden.<br />
3. Es ist des weiteren zu prüfen, ob sich die Kletterzeiten innerhalb einer Behandlungsgruppe<br />
(Ethanoltier- oder Kontrolltiergruppe) im 1. <strong>und</strong> 2. Test unterscheiden.<br />
∑<br />
x<br />
74
8.3.8 Fragen<br />
1. Was versteht man unter negativer Geotaxis?<br />
2. Was ist eine chemische Synapse?<br />
Hinweis: Bei Verhaltenstests ist auf absolute Ruhe zu achten!<br />
75