Ablaufplan - Institut für Pharmakologie und Toxikologie

Pharmakologisch-Toxikologisches
Demonstrationspraktikum
für Pharmaziestudenten
8. FS
Sommersemester 2012
Praktikumsanleitung
1

Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Drackendorfer Str. 1 07747 Jena
Ansprechpartner: Dr. U. Merkel
� 03641/9 325653 Fax: 03641/9 325672
E-Mail: Ute.Merkel@med.uni-jena.de
27.04.2012
2

Ablaufplan Demonstrationspraktikum 2012
Pharmaziestudenten 8. Semester
Di., 15.05.2012 12 Uhr HS Philosophenweg
Einführungsveranstaltung
Dr. U. Merkel, AB Klinische Pharmakologie, Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Mo., 21.05.2012 13-17 Uhr HS Chirurgie
"Sind Tierversuche in der Pharmakologischen Forschung noch notwendig?“
Dr. H. Schubert, Institut für Versuchstierkunde
Di., 22.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
Mi., 23.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
Do., 24.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
Fr., 25.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
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Mo., 28.05.2012 Frei (Pfingstmontag).
Di., 29.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
Mi., 30.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
Do., 31.05.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
Fr., 01.06.2012 Demonstrationspraktika jeweils 13 – 17 Uhr (s. Plan)
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Mo., 04.06.2012 14:30-18:30 Uhr !!!
Studenten der Gruppen 1-4: HELIOS Klinikum, Erfurt, Nordhäuser Straße 74
„Aufgaben und Arbeitsweise des Giftinformationszentrums - Vergiftungsgeschehen -
Allgemeine Maßnahmen der Vergiftungsbehandlung - Akute Vergiftungen durch
Arzneimittel, Haushaltschemikalien und Pflanzen“
Dr. D. Prasa, Dr. H. Hentschel, Giftinformationszentrum HELIOS Klinikum Erfurt
Ort: AUDITORIUM HELIOS Klinikum
Treffpunkt: 14:25 Uhr Giftinformationszentrum (vgl. WEGBESCHREIBUNG)
Anschließend Rundgang durch das GGIZ - Informationsquellen –
Erläuterung der Arbeitsweise am Beispiel konkreter Vergiftungsfälle
WEGBESCHREIBUNG:
Bei Anreise mit der DB: Fahren Sie vom Hauptbahnhof mit den Straßenbahnlinien 3 (Richtung
Europaplatz) oder 6 (Richtung Rieth) bis zur Haltestelle Universität. Gegenüber der Uni ist der
Haupteingang zum HELIOS Klinikum. Nach der Schranke linkerhand um den Parkplatz in die
Sackstraße, dann stehen Sie vor dem Giftinformationszentrum.
Bei Anreise mit Pkw: Autobahn, Abfahrt Erfurt-Ost in Richtung Erfurt, dem Richtungshinweis
HAUPTKLINIKUM Nordhäuser Straße folgen.
Studenten der Gruppen 5-8: SocraTecR&D GmbH, Erfurt, Mainzerhofplatz 14,
Eingang B, 3. OG
„Grundlagen der biometrischen Planung Klinischer Studien“
Dr. M. Wonnemann
„Grundlagen der Bioverfügbarkeit - Bioäquivalenz unter dem Aspekt der galenischen
Optimierung bzw. der Nachentwicklung von Arzneimitteln“
Dr. F. Donath
3

WEGBESCHREIBUNG:
Vom Vorplatz des Erfurter Hauptbahnhofes mit der Linie 4 Richtung Bindersleben/Flughafen bis
zur Station "Theater" (ca. 8 min.). Beim Aussteigen nach rechts wenden, die Straße überqueren.
Benutzen Sie Eingang "B". Die Station befindet sich in der 3. Etage.
Di., 05.06.2012 14-18 Uhr !!!
Thema und WEGBESCHREIBUNG: s. 04.06.
Studenten der Gruppen 1-4: SocraTecR&D GmbH, Erfurt, Mainzerhofplatz 14, Eingang B,
3.OG
Studenten der Gruppen 5-8: HELIOS Klinikum, Erfurt, Nordhäuser Straße 74
Mi., 06.06.2012 13-17 Uhr HS KL 2000 HS 2
„HIV-Therapie“
Dr. Th. Seidel, Weimar
Do., 07.06.2012 13-17 Uhr HS Kinderklinik
„Pharmakotherapie im Kindesalter“
Frau Dr. G. Rönnefarth, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Fr., 08.06.2012 13-17 Uhr HS Kinderklinik
„Arzneimittelsicherheit / Klinische Studien“
PD Dr. T. Gräser, Jenapharm GmbH; Dr. A. Müller, Boehringer Ingelheim Pharma
___________________________________________________________________________________
Mo., 11.06.2012 13-17 Uhr HS Frauenklinik
“Aktuelle Aspekte des Dopings im Sport”
Frau Dr. B. Wanjek, Institut für Sportwissenschaften, Lehrstuhl für Sportmedizin
Di., 12.06.2012 13-17 Uhr HS HNO
"Medikamentöse Therapie von HNO-Erkrankungen"
Prof. Dr. S. Koscielny, HNO-Klinik
Mi., 13.06.2012 13-17 Uhr Lobeda, Konferenzraum Laborzentrum
„Standardimpfungen nach STIKO-Empfehlungen und ausgewählte Impfindikationen“
Prof. Dr. W. Pfister, Institut für Medizinische Mikrobiologie
Do., 14.06.2012 13-17 Uhr HS KL 2000 HS 1
„Therapie von Schlafstörungen und Epilepsie“
Prof. Dr. M. Schwab, Klinik für Neurologie
Fr., 15.06.2012 13-17 Uhr HS Kinderklinik
„Aktueller Stand der Gen- und Zelltherapie”
Prof. Dr. U. Kleeberg, Berlin
___________________________________________________________________________________
Mo., 18.06.2012 13-17 Uhr HS Frauenklinik
„Pharmakotherapie in der Schwangerschaft“
Frau OÄ Dr. M. Bulgay-Mörschel, Frauenklinik
Di., 19.06.2012 13-17 Uhr HS Psychiatrie
„Klinische Anwendungsgebiete von Psychopharmaka“
OA PD Dr. S. Smesny, Klinik für Psychiatrie
Mi., 20.06.2012 13-17 Uhr HS Frauenklinik
“Dentalpharmaka”
Frau PD Dr. F. Jahn, Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
Do., 21.06.2012 13-14:30 Uhr HS Chirurgie
Testat
4

Themenübersicht
Thema 1: Pharmakologische und toxikologische Bedeutung des Seite 8
Fremdstoffmetabolismus
PD Dr. A. Lupp
Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Drackendorfer Str. 1
Thema 2: Narkose und Schmerzbekämpfung Seite 12
Dr. H. Schubert
Institut für Versuchstierkunde und Tierschutz, Dornburger Straße 23
Thema 3: Demonstration des Elektroenzephalogramms bei verschiedenen Seite 25
Aktivitätszuständen
Herr Dr. R. Huonker
Biomagnetisches Zentrum, Klinik für Neurologie, Erlanger Allee 101
Thema 4: Klinische und Forensische Toxikologie, Grundlagen Seite 30
und Fallbeispiele
PD Dr. F. Peters, Dr. Ch. Sauer
Institut für Rechtsmedizin, Fürstengraben 23
Thema 5: Auswirkungen von akuter Hypoxie auf Kreislaufregulation Seite 32
und Säure-Basen-Haushalt
Prof. Dr. R. Bauer
Institut für Molekulare Zellbiologie, Zentrum für Molekulare Biomedizin,
Ebene 3, Hans-Knöll-Straße 2
Thema 6: Blut und Blutbestandteile und deren Charakterisierung Seite 42
Dr. S. Mosig, Dr. K. Rennert
AG Molekulare Hämostaseologie, Bachstr. 18
Thema 7: Diagnostische und therapeutische Anwendung von Antikörpern Seite 52
Prof. Dr. T. Kamradt, Dr. M. Gabler, U. Lehmann, PhD, Dr. S. Drube,
Dr. J. Stirnweiss, Dr. I. Irmler, Dipl. Biochem. M. Böttcher,
Dipl. Biol. Ch. Göpfert, I. Meininger
Institut für Immunologie, Leutragraben 3
Thema 8: Test zur verhaltensbiologischen Charakterisierung Seite 65
Dr. B. Günther
Service-Einheit Kleinnager, Forschungszentrum Lobeda,
Erlanger Allee 101
5

Ablaufplan der praktischen Übungen
IPT Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Drackendorfer Str. 1
IfR Institut für Rechtsmedizin, Fürstengraben 23
CMB Institut für Molekulare Zellbiologie, Zentrum für Molekulare Biomedizin, Hans-Knöll-Straße 2, Ebene 3
AGMH AG Molekulare Hämostaseologie, Bachstr. 18
IVTK Institut für Versuchstierkunde und Tierschutz, Dornburger Straße 23
SEK Service-Einheit Kleinnager, Forschungszentrum Lobeda, Erlanger Allee 101
Immunologie Institut für Immunologie, Leutragraben 3
BMZ Biomagnetisches Zentrum, Klinik für Neurologie, Erlanger Allee 101
13 -17 Uhr
Datum
Thema 1
PD Dr. A. Lupp
IPT
Thema 2
Dr. H. Schubert
IVTK
Thema 3
Dr. R. Huonker
BMZ
Thema 4
PD Dr. F. Peters
Dr. C. Sauer
IfR
Thema 5
Prof. Dr. R. Bauer
CMB
Thema 6
Dr. S. Mosig,
Dr. K. Rennert
AGMH
Thema 7
Dr. M. Gabler
U. Lehmann, PhD
Immunologie
Thema 8
Dr. B. Günther
22.05.2012 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8
23.05.2012 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1
24.05.2012 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2
25.05.2012 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3
29.05.2012 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4
30.05.2012 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5
31.05.2012 Gruppe 7 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6
01.06.2012 Gruppe 8 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7
SEK
6

TEILNEHMER
Gruppe 1 Gruppe 5
1. Kühn, Anne 31. Schubert, Gregor
2. Müller, Lisa 32. Hartwig, Manfred
3. König, Stefanie 33. Werner, Sebastian
4. Klinger, Stephan 34. Langenberg, Maximilian
5. Gabriel, Nils 35. Beitlich, Florian
6. Hauck, Markus 36. Zhong, Sicheng
7. Lihs, Anna 37. Maczewsky, Jonas
8. Knitsch, Sebastian 38. Löser, Konstantin
Gruppe 2 Gruppe 6
9. Hunger, Maike 39. Sturm, Michael
10. Kamm, Katrin 40. Eger, Julia
11. Marquardt, Stefanie 41. Schömburg, Kevin
12. Kraus, Manuela 42. Seidel, Christoph
13. Hofmann, Sarah 43. Hoffmann, Mario
14. Hilgenberg, Daniela 44. Striegel, Anne-Sophie
45. Oette, Stefan
46. Hoxha, Ana
Gruppe 3. Gruppe 7
15. Viehmeier, Verena 47. Wetzel, Diana
16. Fischer, Christoph 48. Ebert, Kerstin
17. Boydeva, Hristina G. 49. Wohlsdorf, Anja
18. Harnisch, Henrik 50. Bauer, Julia
19. Bachmann, Julia 51. Jestädt, Nadine
20. Grimm, Christiane 52. Höppner, Marlen
21. Zettl, Mareen 53. Brandenburger, Isabell
22. Lapp, Sissy 54. Jacob, Heike
Gruppe 4 Gruppe 8
23. Dörfer, Franziska 55. Weile, Carolin
24. Reif, Andrea 56. Petzel, Linda
25. Linhardt, Claudia 57. Heyen, Marie
26. Mücke, Marie-Sophie 58. Heidenreich, Pia
27. Gröpler, Christine 59. Weber, Daniela
28. Ernst, Julia 62.
29. März, Stefanie 63.
30. Frank, Franziska 64.
7

Thema 1 Pharmakologische und toxikologische Bedeutung des
Fremdstoffmetabolismus
PD Dr. A. Lupp
Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Drackendorfer Str. 1
1.1 Einführung
Der Organismus besitzt eine Reihe von Enzymen, die in der Lage sind, Fremdstoffe und
endogene Substanzen zu metabolisieren. Dieser Prozeß wird als Biotransformation bezeichnet.
Hauptort der Biotransformation ist die Leber. Allerdings sind auch in praktisch allen anderen
Organen und Geweben Biotransformationsaktivitäten nachweisbar. Man unterscheidet
Reaktionen der Phase I (Oxidation, Reduktionen, Hydrolysen) und der Phase II (Konjugationen,
z.B. Glucuronidierung, Sulfatierung, Kopplung an Glutathion).
Die durch Biotransformation entstehenden Metabolite sind meistens hydrophiler als die Ausgangssubstanz,
so dass überhaupt erst eine Ausscheidung über die Niere ermöglicht wird. Ohne
Biotransformation wäre die Verweildauer der meist lipophilen Fremdstoffe im Organismus sehr
lang. Damit ist die Biotransformation entscheidend für die Elimination der meisten Stoffe. Hinzu
kommt, dass viele Arzneimittel durch die Metabolisierung ihre Wirkung verlieren. Es ist aber
auch möglich, dass durch Biotransformation eine Substanz erst in die wirksame Form überführt
wird oder ein toxischer Metabolit entsteht.
Eine besondere Bedeutung besitzt die Cytochrom-P450 (CYP)-abhängige Monooxygenierung
von Fremdstoffen. Es gibt eine große Anzahl von CYP-Enzymen, die sich in ihrer
Substratspezifität und dementsprechend in ihrer Bedeutung für die Entgiftung oder Giftung von
Stoffen unterscheiden. Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass verschiedene
Fremdstoffe bestimmte CYPs induzieren und somit die Wirkung von Substanzen wesentlich
beeinflussen können. Manche Fremdstoffe können eine Hemmung von CYP-Enzymen
bewirken. Schließlich können Fremdstoffe auch die Leberfunktion ganz allgemein beeinflussen
und damit andere Prozesse, z.B. die Induzierbarkeit von CYP-Enzymen, verändern. Die
zugrunde liegenden Vorgänge sind meist sehr komplex und können die Ursache von
Fremdstoffinteraktionen sein. Solche Interaktionen sind unter anderem bei der Anwendung von
Arzneimitteln zu beachten.
Das CYP 1A1, das für die Bildung von kanzerogenen Metaboliten aus z.B. Benz(a)pyren
verantwortlich ist, wird durch polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. 3-Methylcholanthren
und β-Naphthoflavon) induziert. Andere CYP-Formen, die für den Metabolismus von
körpereigenen Stoffen (z.B. Steroidhormonen) oder von Pharmaka von besonderer Bedeutung
sind, werden durch andere bekannte Modellinduktoren (z.B. Phenobarbital oder Dexamethason)
induziert.
Wegen ihrer toxikologischen und pharmakologischen Bedeutung ist es wichtig, die Induktion
bestimmter CYP-Formen nachzuweisen. Das kann geschehen, indem man die
Biotransformation eines Fremdstoffes (Modellsubstrats) bestimmt, die relativ spezifisch nur von
einer (oder mehreren) interessierenden CYP-Form(en) katalysiert wird (z. B. ECOD, EROD oder
PROD, s. Versuch). Mithilfe von Antikörpern kann z.B. im Western-Blot direkt die Konzentration
spezifischer CYP-Enzyme bestimmt werden. Mittels Immunhistochemie ist es möglich, sowohl
die räumliche Verteilung der CYPs innerhalb der Leberläppchen als auch einen Induktionseffekt
zu beurteilen. Eine Aussage über die enzymatische Aktivität ist hiermit aber nicht unmittelbar
erreichbar. Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis einer stattgefundenen Induktion stellt die
Ermittlung der spezifischen CYP-mRNA-Expression dar. Hierzu sind moderne
molekularbiologische Methoden verfügbar wie die RT-PCR als semiquantitative Bestimmung
oder die kompetitive RT-PCR bzw. die Real-time-quantitative-PCR zur Quantifizierung der
mRNA-Konzentration.
8

1.2 Aufgabe
Einfluss von Modellinduktoren auf die hepatische CYP-Aktivität: Bestimmung der Dealkylierung
von Modellsubstraten mit Material aus Rattenlebern (Homogenat, 9.000g-Überstand oder
Mikrosomen) nach Vorbehandlung der Versuchstiere mit den Modellinduktoren β-Naphthoflavon
(BNF) und Phenobarbital (PB) in vivo.
1.3 Materialien
• verschiedene Puffer- und Substratlösungen sowie Kofaktoren
• nichtinduziertes und induziertes Lebermaterial von:
- 4 Kontrolltieren
- 4 β-Naphthoflavon-behandelten Ratten
- 4 Phenobarbital-behandelten Ratten
• Photometer
• Fluorimeter
1.4 CYP-Modellreaktionen
Es werden die CYP-Aktivitäten in den Lebern in vitro mit ausgewählten Modellsubstraten
bestimmt. Das Prinzip für die Bestimmung der Enzymaktivitäten besteht darin, dass das
Modellsubstrat durch das CYP in den Lebern dealkyliert wird und der gebildete Metabolit
fluorimetrisch bestimmt werden kann. Die Reaktion hängt je nach Modellsubstrat von
verschiedenen CYP-Formen ab. Beispiele:
Modellsubstrat Reaktion Metabolit CYP-Form
1. ECOD Ethoxycoumarin O-Deethylierung Hydroxycoumarin CYP1A u.a.
2. EROD Ethoxyresorufin O-Deethylierung Resorufin CYP1A
3. PROD Pentoxyresorufin O-Depentylierung Resorufin CYP2B
Die Reaktionsgleichungen lauten entsprechend
1., 2.: C2H5-O–〈(Ring) + O2 + NADPH + H + CYP HO–〈(Ring) + NADP + H2O + CH3CHO
3.: C5H11-O–〈(Ring) + O2 + NADPH + H + CYP HO–〈(Ring) + NADP + H2O + C4H9CHO
Die Reaktionen können entweder mit Gesamthomogenat durchgeführt werden oder mit
Fraktionen daraus, die die membrangebundenen CYP-Proteine enthalten (z.B. 9000g-
Überstand). In jedem Fall müssen Kofaktoren zugegeben werden, da keine intakten Zellen mehr
vorliegen.
1.5 Versuchsdurchführung
• Aus jeder Leber wurde vor dem Praktikum mit Na-Phosphatpuffer ein 1:3-Homogenat
hergestellt (1 Teil Gewebe + 2 Teile Puffer), im Eisbad gelagert und dann zentrifugiert, um
9.000g-Überstand zu gewinnen.
• Die 9.000g-Überstände werden mit Na-Phosphatpuffer sowohl 1:4 als auch 1:10 weiter
verdünnt, bevor die Dealkylierungsreaktionen durchgeführt und der Proteingehalt als
Bezugsgröße ermittelt werden kann. Die 9.000g-Überstände und ihre Verdünnungen werden
über die gesamte Versuchsdauer auf Eis gelagert.
9

1.5.1 Bestimmung des Proteingehaltes der 9.000g-Überstände
• Für jeden 9.000g-Überstand werden je 2 Zentrifugengläser für die Hauptwerte
•
(Doppelbestimmung) und ein Zentrifugenglas für den Trübungswert beschriftet und
bereitgestellt. Zusätzlich wird ein Zentrifugenglas für den Leerwert der Hauptwerte und ein
Zentrifugenglas für den Leerwert der Trübungswerte vorbereitet.
In die Zentrifugengläser der Hauptwerte und der Trübungswerte pipettiert man je 0,1 ml der
1:4-Verdünnung des jeweiligen 9000g-Überstandes.
• Anschließend pipettiert man in alle Zentrifugengläser 0,1 ml 5%ige Natriumdesoxycholatlösung,
schüttelt vorsichtig und inkubiert den Ansatz für 5 min bei Raumtemperatur.
• Danach werden in die Zentrifugengläser der Hauptwerte und des Leerwertes der Hauptwerte
1,8 ml Biuret-Lösung hinzugegeben. In die Zentrifugengläser der Trübungswerte und des
Leerwerts der Trübungswerte werden dagegen 1,8 ml 3%ige NaOH-Lösung pipettiert.
• Die Proben werden vorsichtig geschüttelt und anschließend für 20 min bei Raumtemperatur
inkubiert.
• Anschließend erfolgt die Messung der Proben gegen die jeweiligen Leerwerte am
Photometer.
• Die Eichkurve zur Ermittlung des Eichfaktors wird für jede Biuret-Charge mit
Rinderserumalbumin in den folgenden Konzentrationen erstellt: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
18, 20 mg/ml.
• Die Berechnung des Proteingehaltes der 9.000g-Überstände erfolgt mit der Formel:
mg Protein / ml = ΔE * VF * EF
E = Extinktion, ΔE = (E1+E2)/2 - ETr
VF = Verdünnungsfaktor, in diesem Fall: VF = 16
EF = Eichfaktor
1.5.2 CYP-Modellreaktionen
• Für jeden 9.000g-Überstand werden je 2 Zentrifugengläser für die Hauptwerte
•
(Doppelbestimmung) und ein Zentrifugenglas für den Leerwert beschriftet und bereitgestellt.
In die Zentrifugengläser pipettiert man 0,1 ml Substratlösung und verdampft das
Lösungsmittel Methanol im Wasserbad bei 90 - 95°C (dauert ca. 5 - 10 min).
• Anschließend pipettiert man:
+ 0,1 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer zum Volumenausgleich
+ 0,1 ml MgCl2
+ 0,1 ml Glucose-6-Phosphat-Lösung
+ 0,1 ml 9000g-Überstand (für Leerwerte Phosphatpuffer).
• Nach dem Mischen wird der Probeninhalt im Wasserbad (37°C) temperiert.
• Die Reaktion wird mit 0,1 ml NADPH-Lösung gestartet. Die Substratkonzentration beträgt in
diesem Ansatz 0,4 mM (ECOD) bzw. 2 µM (EROD) bzw. 10 µM (PROD).
• Die Reaktion lässt man bei 37°C für 10 min (ECOD, PROD) bzw. für 5 min (EROD) ablaufen,
stoppt danach durch Zugabe von 0,5 ml eiskalter 0,31 M Trichloressigsäure (ECOD) bzw. 1
ml Methanol (EROD, PROD) und stellt die Röhrchen ins Eisbad. Bei der ECOD müssen die
Proben noch mit 4 ml NaOH (0,05 M) versetzt werden (Metabolit fluoresziert im Alkalischen).
• Danach werden die Proben (außer ECOD) 5 min bei 4500 U/min zentrifugiert.
• Anschließend erfolgt die Messung (im Überstand) am Fluorimeter.
10

• Bei jeder Messung wird eine Eichkurve aus 4 definierten Metaboliten-Konzentrationen und
einem Eichkurvenleerwert mitgeführt. Der Eichprobenansatz setzt sich folgendermaßen
zusammen:
bei der ECOD: bei EROD und PROD:
0,1 ml Eichlösung* 0,1 ml Eichlösung in Methanol (wird
verdampft)**
0,4 ml Na-Phosphatpuffer 0,5 ml Na-Phosphatpuffer
0,5 ml TCA 1,0 ml Methanol
1,0 ml Ansatzvolumen 1,5 ml Ansatzvolumen
+ Zugabe von 4 ml NaOH vor der Messung
Eichreihen:
0 / 0,125 / 0,25 / 0,5 / 1,0 µg/Ansatz 0 / 500 / 1000 / 2000 / 4000 pmol/Ansatz
*(Verdünnungsreihe mit Puffer) **(in 50 / 100 / 200 / 400 µl Methanol)
1.6 Protokoll und Auswertung der Ergebnisse
Die gemessenen Umsätze werden in [pmol · min -1 · mg Protein -1 ] umgerechnet. Die Aktivitäten
werden in die Messprotokolle eingetragen, um nichtinduzierte und induzierte Lebern von
Kontrolltieren bzw. vorbehandelten Tieren zu vergleichen.
ECOD-Aktivität EROD- / PROD-Aktivität
ΔFI · EF · 10 6 · 10 ΔFI · EF · 10
162 · t · Prot. t · Prot.
ΔFI = Fluoreszenzmeßwert abzüglich Probenleerwert; EF = Eichfaktor; t = Inkubationszeit [min]
Prot = Proteingehalt in [mg/ml]
1.7 Fragen
a) Welche Bedeutung hat die Induktion der Biotransformation?
b) Welche Methoden kennen Sie, um eine Enzyminduktion nachzuweisen?
c) Warum werden bei der Bestimmung der Biotransformationsaktivität in vitro Kofaktoren
benötigt?
11

Thema 2 Narkose und Schmerzbekämpfung
Dr. H. Schubert
Institut für Versuchstierkunde und Tierschutz,
Dornburger Straße 23
2.1 Einfluss der Anästhetika/Analgetika auf Reflex- und Reaktionsparameter als
Kriterium für den Anästhesieverlauf und die Anästhesietiefe
2.1.1 Einführung
Narkose (Synonym: Allgemeinnarkose, Anästhesie) ist ein durch Zufuhr von Narkotika
induzierter reversibler Lähmungszustand des ZNS mit Reflexdämpfung (Sedation),
Muskelentspannung (Myorelaxation), Schmerzfreiheit (Analgesie) und Bewusstseinsverlust
(Hypnose) zur Durchführung von operativen und diagnostischen Eingriffen.
Neben der klassischen „Mononarkose“, bei der durch die Zufuhr von einem Pharmakon (z.B.
Barbiturat) in gefährlich hoher Dosierung den Zustand der Narkose erreicht wird, werden
heutzutage fast generell „Kombinationsnarkosen“ angewendet. Dabei werden spezielle
Medikamente (Hypnotika, Neuroleptika, Ataraktika, Analgetika und Muskelrelaxantien) gezielt
zur Beeinflussung einzelner Komponenten der Narkose „kombiniert“. Der Vorteil ist die selektive
und reversible Beeinflussung von Schmerz, Muskeltonus, Reflexaktivität und Bewusstseinslage
unter Vermeidung überhöhter Einzeldosierungen.
Zur Bewertung und Überwachung der Anästhesie (-tiefe) werden unterschiedliche Parameter
kontrolliert.
Bei der Mononarkose (Äther, Barbiturate) ist das GUEDEL-Schema anwendbar (Einteilung der
Narkosetiefe in verschiedene Narkosestadien. Die Zuordnung erfolgt anhand von speziellen
Parametern entsprechend der graduellen ZNS-Beeinflussung.)
Für die Kombinationsnarkose ist das GUEDEL-Schema meist nicht einsetzbar. Zur Überwachung
der Narkose werden deshalb, insbesondere bei den Kleinnagern spezielle Reflexe und
Reaktionen kontrolliert.
Die Auswahl der Reflex- und Reaktionsprüfungen als Anästhesieverlaufskriterien erfolgt nach
Angaben von GREEN (1981), SCHOLZ (1980) und WESTHUES/FRITSCH (1961).
Als Kriterium einer sedativ-hypnotischen Wirkung der Pharmaka werden der Stellreflex, der
Kornealreflex, die Lidreaktion und die Schnurrhaaraktivität ermittelt. Zur Prüfung der analgetischen
Wirkung dienen der Zwischenzehenreflex und der Ohrkneifreflex. Eine mögliche
muskelrelaxierende Wirkung der Pharmaka kann über die Muskeltonusprüfung erfasst werden.
2.1.2 Aufgabe
Kontrollieren Sie die Wirkung von Anästhetika/Analgetika nach parenteraler Applikation anhand
von Reflex- und Reaktionsbeobachtungen bei der Ratte.
2.1.3 Materialien/Pharmaka
- Etomidat (Hypnotikum)
- Xylazin (Sedativum, α2-Rezeptoragonist)
- Midazolam (Sedativum)
- Fentanyl (Analgetikum)
- Ketamin (Analgetikum - Dissoziatives Anästhetikum)
- Naloxon (Opioidantagonist)
- Flumazenil (Benzodiazepinantagonist)
- Atipamezol (α2-Rezeptorantagonist)
12

- Glasstab
- Pinzette
- Stoppuhr
- Beobachtungskäfig
2.1.4 Methodik
Den Versuchstieren wird jeweils ein Pharmakon appliziert. Entsprechend dem Zeitschema
erfolgt die Kontrolle der Reflexe/Reaktionen. Es werden Stellreflex (righting reflex = RR),
Cornealreflex (CR), Lidstellung/-reaktion (LR), Zwischenzehenreflex (ZZR), Ohrkneifreflex
(OKR), Schnurrhaaraktivität (ShA), Muskeltonus (MT) geprüft und protokolliert.
2.1.5 Versuchsdurchführung
- Die Versuchstiere werden zur Applikation der Substanzen aus den Einzelkäfigen
entnommen und erhalten die Präparate entweder intramuskulär (Xylazin, Ketamin,
Ketamin/Xylazin, Xylazin/Midazolam/Fentanyl) oder subkutan (Etomidat, Fentanyl,
Midazolam) injiziert.
- Nach der Injektion werden die Tiere wieder in ihre Einzelkäfige gesetzt.
- Zu den Messzeiten erfolgt zunächst die Auszählung der Atemfrequenz (pro Minute) ohne
das Tier dabei zu berühren. Direkt im Anschluss erfolgt die die Kontrolle der
Reflexaktivitäten:
- Stellreflex
- Kornealreflex
- Lidstellung
- Zwischenzehenreflex
- Ohrkneifreflex
- Schnurrhaaraktivität
- Muskeltonus
- Die Kontrollen erfolgen in der Anfolge: AF > LR > ShA > KR > RR > OKR > ZZR
- Die Kontrollzeiten: 5, 10, 15, 20, 25, 30 Minuten post applikationem
- Das Versuchstier mit der Fentanylverabreichung, erhält 20 Minuten post applikationem eine
subkutane Naloxon-Injektion, das Versuchstier mit der Xylazin/Midazolam/Fentanyl-Narkose
erhält ebenso subkutan ein Antidotgemisch aus Atipamezol/Flumazenil und Naloxon
ebenfalls 20 Minuten nach der Applikation der Narkosemittel.
Stellreflex
Zur Prüfung wird die Ratte in Rückenlage gebracht. Bleibt sie in dieser Stellung liegen, so ist der
Reflex negativ. Bringt die Ratte ihren Vorderkörper selbständig in Bauchlage, so ist der Reflex
positiv.
Kornealreflex
Die Kornea wird mit einem an der Spitze abgerundeten Glasstab kurz berührt. Reagiert das Tier
mit einer spontanen Lidbewegung, so ist der Reflex positiv. Erfolgt keine Reaktion, so ist der
Reflex negativ.
13

Lidreaktion
Die Lidreaktion gilt als positiv oder vorhanden, wenn zum Messpunkt der Augapfel nicht von den
Augenlidern bedeckt ist. Sind die Lider geschlossen, so ist die Reaktion negativ oder
aufgehoben. Bei halbgeschlossenem Lid gilt der Reflex als halbaufgehoben.
Zwischenzehenreflex
Dem Versuchstier wird mit einer chirurgischen Pinzette in die Zwischenzehenhaut gekniffen.
Reagiert das Tier mit einer Bewegung der Extremitäten, so ist der Reflex positiv. Ein Ausbleiben
der Bewegung gilt als negativ. Zu beachten ist dabei, dass die Hintergliedmaße zur Prüfung
dieses Reflexes genutzt wird, an der keine Narkoseapplikation erfolgte.
Ohrkneifreflex
Zur Prüfung des Reflexes wird dem Tier mit einer chirurgischen Pinzette in das Ohr ge-kniffen.
Als positiv gilt der Reflex, wenn das Tier daraufhin mit Ohrzucken oder einer Kopf-bewegung
reagiert. Erfolgt keine Reaktion, so ist der Reflex negativ.
Schnurrhaaraktivität
Die sichtbaren Bewegungen der Schnurrhaare zeigen ein positives Prüfergebnis an. Das
Ausbleiben der Schnurrhaarbewegungen wird als negativ oder nicht vorhanden eingeschätzt.
Eine vollständige, nicht herabgesetzte Schnurrhaaraktivität entspricht dem Zustand der Aktivität
der Schnurrhaare eines unbehandelten, nicht beeinflussten Tieres.
Muskeltonusprüfung
Zur Überprüfung des Grades der Muskelentspannung wird das Tier mit drei Fingern am
Übergang von Thorax und Abdomen umfasst und angehoben. Sinkt der Ober- und Unterkörper
gelöst nach unten, so ist das Prüfergebnis positiv. Jede Krümmung und Spannung des Körpers
gilt als negatives Ergebnis.
Die Bewertung der Reflexe und Reaktionen erfolgt mit der Einschätzung: positiv bzw. vorhanden
und negativ bzw. aufgehoben. Dazwischen liegende Stadien oder Aktivitäten werden als
teilweise vorhanden, teilweise aufgehoben, reduziert oder herabgesetzt bezeichnet.
2.1.6 Versuchsprotokoll
2.1.7 Auswertung
Die Daten werden in das Protokollblatt eingetragen und danach in die Abbildung eingezeichnet.
2.1.8 Fragen
1. Warum benötigen Kleintiere bezogen auf das Kilogramm Körpergewicht im Allgemeinen
relativ höhere Pharmakadosen als Großtiere?
2. Nennen Sie Anwendungsbereiche (Zielorte) von Lokalanästhetika in der Versuchstier-
Anästhesie.
3. Wie lässt sich eine Anästhesie steuern?
14

2.2 Einfluss der Anästhetika/Analgetika auf Herz-, Kreislaufparameter I
2.2.1 Einführung
Blutdruck:
Infolge der Herzkontraktionen weist der Druck u.a. in den Arterien des großen und kleinen
Kreislaufes periodische Schwankungen auf. Während der Austreibungsphase steigt der Druck in
den Arterien an. Der höchste Wert dieser Phase wird als systolischer Blutdruck bezeichnet.
Während der Diastole sinkt der Druck. Der tiefste Wert wird diastolischer Blutdruck genannt.
Die Differenz zwischen dem systolischen und diastolischen Druck eines Herzzyklus wird
Blutdruckamplitude genannt.
Unter dem mittleren Druck versteht man den Druck, der durchschnittlich während der Dauer
eines gesamten Schlagintervalls herrscht. Als Maß für die treibende Kraft der Blutströmung ist
die Angabe des mittleren Blutdruckes viel aussagekräftiger als die Angabe des systolischen
Druckes.
2.2.2 Aufgabe
Kontrollieren Sie die Wirkung von Ketamin, Xylazin und Fentanyl auf Herz- Kreislaufparameter
bei der leicht anästhesierten Ratte.
2.2.3 Materialien/Pharmaka
- Blutdruckmessgerät mit Blutdrucktransducer
- Aufzeichnungsgerät (Schreiber)
- EKG-Nadeln
- Wärmelampe / Wärmematte für das Versuchstier
- Prüfsubstanz: Ketamin, Xylazin, Fentanyl
- PVC-Katheter
- kleines Besteck (Instrumente) für Katheterverlegung
- Versuchstier: Ratte (3-4 Monate alt)
2.2.4 Methodik
Für die Blutdruckmessung stehen sowohl direkte Methoden, wobei das Blutgefäßsystem eröffnet
wird, als auch indirekt Methoden, ohne Eröffnung der Gefäße zur Verfügung.
Direkte Methode:
Dem anästhesierten Versuchstier wird eine Hohlnadel/Katheter in eine gut zugängliche und
ausreichend große Arterie (z.B. A.femoralis oder A.carotis) eingeführt und mit einem Elektromanometer
verbunden, dass die Eigenschaft besitzt, auch sehr rasche Druckschwankungen
genau zu registrieren.
2.2.5 Versuchsdurchführung
- Das Versuchstier wird in ein abgedecktes, mit Äther gesättigtes Glasgefäß gesetzt.
- Nach der Aufhebung des Stellreflexes wird das Tier auf den OP-Tisch gelegt.
- Es folgt die Fixierung des Tieres auf der Unterlage mit Klebestreifen bzw. Gummiband.
- Die Narkosegaszufuhr erfolgt (Sauerstoff/Lachgas/Isofluran) über eine Nase und Maul
bedeckende Narkosemaske (Spritzenkörper)
- Narkose a) Vertiefung: 1,2 Vol% Isofluran (N2O/O2 = 1,0/0,5 l/min)
b) Erhaltung: 0,75 Vol% Isofluran N2O/O2 = 1,0/0,5 l/min)
- Katheterverlegung
- Versuchstier (VT): Ratte, Anzahl: 2
15

2.2.5.1 Katheterverlegung (durch Kursleiter/-assistent) in die Arteria carotis
Rasur des Halses zwischen Kiefergelenk und Sternum, anschließend Desinfektion. Scharfe
Durchtrennung der Haut im Bereich der medianen Sagittallinie. Nach der Seitverlagerung beider
Mandibulardrüsen und Darstellung des Muskulus sternohyoideus (über der Trachea) folgt die
stumpfe Durchtrennung des M.sternohyoideus im rechten seitlichen Bereich. Darstellen der
Arteria carotis und des Truncus vagosympaticus. Aufträufeln von 0,2 ml 1% Lidocain.
Separierung der Arterie vom Nervenstamm. Abbinden des proximalen Teils der Arterie und
Anlage eines Haltefadens im distalen Abschnitt. Anschnitt und Einführen eines PVC-Katheters
(PVC; AD: 1,0/ ID: 0,5 mm; Länge: 40 cm) in herzwärtige Richtung. Blutaspirationskontrolle,
Katheterfixierung und Vernähen der Haut mit Einzelknopfnähten. Anschluss des Katheters über
einen Druckmesswandler an das entsprechende Messgerät.
2.2.5.2 Kontrolle des Blutdruckes und der Atemfrequenz
- Dem anästhesierten Tier werden subkutan Nadelelektroden zur Erfassung von EKG und
Atmung verlegt.
- Anschluss des Katheters über einen Druckmesswandler an das Messgerät.
- Aufzeichnung des Blutdruckes und dessen Verlauf am Aufzeichnungsgerät (mittlerer
arterieller Blutdruck) kontinuierlich mit 0,25mm/sec Aufzeichnungsgeschwindigkeit.
- Applikation von Ketamin (i.m.); Xylazin (i.m.); Fentanyl (i.v. - Schwanzvene)
- Aufzeichnung des Blutdruckes: 3, 6, 9, 12, 15, 18 Minuten post applikationem für jeweils
15sec mit 25mm/sec Aufzeichnungsgeschwindigkeit.
- Zu den jeweiligen Kontroll- und Messpunkten sind die entsprechenden Reflexe und die
Atemfrequenz zu kontrollieren, die Herzfrequenz wird aus EKG oder Blutdruckkurve
ausgezählt.
2.2.6 Versuchsprotokoll
2.2.7 Versuchsauswertung
Eintragen aller Ergebnisse (Reflexe, Atemfrequenz, Blutdruckwert, Herzfrequenz) in das
Versuchsprotokoll und Einzeichnen der Parameterverläufe entsprechend der Vorgabe.
2.2.8 Fragen
1. Welche Vor- und Nachteile besitzen invasive Methoden?
2. Wie erfolgt im Körper die Kontrolle und Regulierung des Blutdruckes?
3. Was versteht man unter einer Shuntverbindung? (Beispiel)
16

2.3 Einfluss von Anästhetika auf Herz-Kreislaufparameter II
2.3.1 Einführung
Bei der Beurteilung der Wirkung von Anästhetika und deren Adjuvantien auf verschiedene
Organe des Körpers spielt das Herz zweifellos eine dominierende Rolle. Nahezu alle im
Zusammenhang mit der Anästhsie gebräuchlichen Medikamente (Inhalationsanästhetika,
Injektionsanästhetika, Muskelrelaxantien u.a.) können das Herz beeinflussen. Das messbare
Ergebnis der Einflüsse der Narkose auf das Herz ist der Blutdruck, aus dessen Verhalten der
Anästhesist einige wichtige Hinweise auf das Zusammenspiel zwischen den verabreichten
Medikamenten und der Herzpumpfunktion erhält. Die Herzfrequenz und ihr Verhalten sind in
diesem Zusammenhang weniger zuverlässige Parameter, obwohl in einigen Situationen auch
eine direkte Beeinflussung des Herzleitungssystems und damit der Herzfrequenz durch
Anästhetika möglich ist.
2.3.2 Aufgabe
Kontrolle des Blutdruckes- und Herzfrequenzverlaufes nach Applikation von anästhesiologisch
wirksamen Pharmaka.
2.3.3 Materialien
- 2-Kanal-Blutdruckmeßsystem (einschließlich Schreiber)
- Blutdruckmanschette
- Blutdrucktransducer
- Versuchstier: Ratte
- Pharmaka: Ketamin (Analgetikum)
Xylazin (Sedativum)
- Spritzen, Kanülen
2.3.4 Methodik
Indirekte Methode:
Die palpatorische Methode nach RIVA-ROCCI:
Das Prinzip beruht auf der Überlegung, dass zum Zusammendrücken einer Arterie bzw. zur
Blockierung der Blutströmung der gleiche Druck aufgewendet werden muss, der in ihrem
Inneren herrscht. Zur Ausübung des erforderlichen Außendruckes benutzt man eine aufblasbare
Gummimanschette, deren Außenwand durch eine Auflage undehnbar gemacht ist. Zur Ablesung
des Druckes in der Manschette wird dieselbe mit einem Manometer verbunden. Die Manschette
wird im speziellen Fall um den Schwanzansatz des Versuchstieres gelegt und so lange
automatisch mit Luft aufgeblasen, bis der Puls bzw. die Blutströmung distal der
komprimierenden Manschette verschwindet.
Die Kontrolle des Pulses erfolgt mit einem elektrischen Druckwandler, die Registrierung mit
einem Schreibgerät. Ist peripher der Kompressionsstelle an der Arterie kein Puls mehr
festzustellen, dann ist der Druck in der Manschette höher als der maximale systolische Druck in
der Arterie. Der Druck in der Manschette wird nun langsam gesenkt. In dem Moment, in dem der
Puls in der peripheren Arterie wieder fühlbar wird, ist der Druck in der Manschette gerade ein
wenig kleiner als die systolische Druckspitze in der Arterie. Der nun herrschende
Manschettendruck wird am Manometer registriert (entspricht ca. dem systolischen Blutdruck).
17

2.3.5 Versuchsdurchführung
- Die Ratten werden in die Messkäfige gesetzt, die Käfige mit den Ratten in die temperierte
Versuchstierkammer eingebracht werden.
- Die Messung wird bei ca. 37 - 38° C durchgeführt.
- Am Rattenschwanzansatz wird zuerst die aufblasbare Manschette, dann der
Drucktransducer platziert.
- Der Drucktransducer muss eine solche Position besitzen, dass die Pulsrate (erkennbar am
Aufleuchten der roten Leuchtdiode) erkennbar wird.
- Sobald die Leuchtdiode rhythmisch blinkt, kann mit der Messung begonnen werden.
- Nach dem Anzeigen der Herzrate wird die Taste „Start“ gedrückt. Jetzt beginnt der
Messvorgang und endet mit dem Ausdruck von HR 1, HR 2, SAP 1 und SAP 2.
- Die Messung wird wiederholt (Drücken Taste: „Repeat“)
- Schema:
o Kontrollmessung: 5. und 10. Minute nach Versuchsbeginn jeweils 3 Messungen
o Applikation der Prüfsubstanzen (Ketamin, Xylazin)
o Versuchsmessung: 5, 10, 15, 20, 25, 30 Minuten post applikationem
o wenn möglich, sollte vor jeder Messung, die Atemfrequenz ausgezählt werden.
2.3.6 Versuchsprotokoll
2.3.7 Versuchsauswertung
Einzeichnen der Verläufe von Atemfrequenz, Herzfrequenz und systolischem Blutdruck in ein
Diagramm.
2.3.8 Fragen
1. Warum sollten die Versuchstiere konditioniert, d.h. an den Versuch gewöhnt werden?
2. Warum lassen sich mit der Methode Kreislaufinsuffizienzen und Schockzustände schlecht
beurteilen?
3. Was sind spontan hypertensive Ratten?
18

2.4 Kontrolle der Narkotika/Analgetika auf analgetische Potenz
2.4.1 Einführung
Unter Analgetika werden Stoffe verstanden, die die Schmerzempfindung unterdrücken. Starke
Analgetika wie Morphium sind dabei in der Lage, auch stärkste Schmerzgefühle (z.B.
postoperative Schmerzen) vollständig aufzuheben, während schwache Analgetika wie
Acetylsalicylsäure, die im Gegensatz zu den zentral wirksamen starken Analgetika vor allem
peripher an schmerzsensiblen Nervenendigungen wirken, im Vergleich deutlich schwächer
analgetisch wirken und vor allem bei entzündlich bedingten Schmerzzuständen eingesetzt
werden.
Die Testung der analgetischen Potenz eines Mittels kann am Tier über verschiedene Tests
erfolgen z.B. „tail flick-Test“ oder „hot plate-Test“
2.4.2 Aufgabe
Prüfung der schmerzbeeinflussenden Wirkung verschiedener Pharmaka mittels „hot plate-Test“
2.4.3 Materialien/Pharmaka
- aufheizbare, regelbare Metallplatte
- Stoppuhr
- Spritzen, Nadeln
- Etomidat (Hypnotikum) s.c.
- Xylazin (Sedativum) i.m.
- Fentanyl (Analgetikum) s.c.
- Ketamin (Analgetikum) i.m.
- Metamizol (Analgetikum) s.c.
- Versuchstier: Maus
2.4.4 Methodik
Zur Kontrolle des analgetischen Effektes einer Substanz kann u.a. der „Heiße Plattentest“ (hotplate-test)
angewandt werden. Die heiße Platte besteht aus einer aufheizbaren Metallplatte, die,
um das Entlaufen der Versuchtieres zu erschweren, von einem 15 cm hohen Glaszylinder
umgeben ist.
Wird eine Maus auf die angewärmte Heizplatte (52°C) gesetzt, so versucht sie sich zunächst in
ihrer neuen Umgebung zu orientierten. Wenig später reagiert sie auf die Hitze unter ihren Pfoten.
Sie läuft immer schneller hin und her, setzt sich schließlich auf die Hinterbeine und beginnt
zunächst an den Vorderpfoten, später auch an den Hinterpfoten zu lecken. Sehr schnelles Hin-
und Hereilen wird durch immer häufigere Leckreaktionen unterbrochen, bis sie schließlich der
Hitzeeinwirkung zu entfliehen sucht und aus dem Glaszylinder springt.
Die Zeit vom Aufsetzen der Maus bis zur Primärreaktion, dem Pfotenlecken (HP 1) und die Zeit
bis zur Flucht (HP 2) werden mit der Stoppuhr gemessen.
Zur Vermeidung stärkerer Erwärmung der Pfoten wird ein behandeltes VT, das nach Ablauf von
90 sec noch nicht aus dem Glaszylinder gesprungen ist, von der „heißen Platte“ genommen.
19

2.4.5 Versuchsdurchführung
- Kontrollwertbestimmung:
o 4 Mäuse werden auf die „Heiße Platte“ gesetzt
o Der HP 1 und HP 2 werden bestimmt, andere Verhaltensäußerungen registriert und
in das beiliegende Versuchsprotokoll eingetragen.
- Applikation der 5 Testsubstanzen (pro Substanz 2 Mäuse)
- Versuchsmessung: Die behandelten Tiere werden auf die Heizplatte gesetzt. HP 1 und HP 2
werden bestimmt, andere Verhaltensäußerungen werden registriert und eingetragen. Bei
keinerlei Reaktion werden die Tiere nach 90 sec von der Platte genommen.
2.4.6 Versuchsprotokoll
2.4.7 Versuchsauswertung
Die erfassten Zeitpunkte werden in das Protokoll eingetragen. Die erhaltenen Werte werden
gemittelt und in ein Diagramm eingezeichnet.
2.4.8 Fragen
1. Warum sollte bei der Prüfung eines Pharmakons auf analgetische Wirkung einen Test zur
Prüfung der sedativ hypnotischen Wirksamkeit angeschlossen werden?
2. Was sind endogene Opioide?
3. Welche Nebenwirkungen treten bei der Verwendung von „starken“ und „schwachen“
Analgetika auf?
Fragen zur Vorlesung Versuchstierkunde:
1. Wodurch unterscheiden sich individuelle- von kollektiven Tier-Mensch-Beziehungen in
Bezug auf Tierversuche?
2. Werden Tierversuche im Tierschutzgesetz geregelt, und wenn ja, in welchen Abschnitten /
Paragraphen?
3. Sind Tierversuche zur Prüfung von Tabakerzeugnissen, Waschmitteln oder Kosmetika nach
dem TSchG zulässig?
4. Wer erteilt die Genehmigung für einen Tierversuch?
5. Wer kontrolliert vor Ort d.h. im Institut / in der Einrichtung die Einhaltung der
tierschutzrelevanten Auflagen?
6. Wann ist ein Mäuse-/Rattenstamm ein Inzuchtstamm?
7. Wodurch unterscheiden sich Inzuchttiere von Auszuchttieren in Bezug auf den Inzuchtkoeffizienten?
8. Was bedeutet SPF-Tier?
9. In welchem Haltungssystem sind SPF-Tiere zu halten?
10. Wie gewinnt man SPF-Tiere?
11. Welche 3 Worte charakterisieren die 3-R-Regeln?
20

Etomidat (Hypnomidate)
Barbituratfreies Hypnotikum aus der Gruppe von Schlafmitteln mit Imidazol-Carboxylatstruktur
+ Zentralnervensystem:
Etomidat ist ein potentes Hypnotikum, verhindert jedoch nicht die infolge chirurgischer
Stimulation auftretenden Extremitätenbewegungen. Die autonomen Reaktionen sind nicht
blockiert. Die Hirndurchblutung ist herabgesetzt und beim prämedizierten Patienten sinkt der
intraokuläre Druck ab. Die EEG-Veränderungen sind denjenigen nach der Applikation von
Thiopental ähnlich. Die bei dem Einsatz Etomidat häufig festzustellenden Muskelbewegungen
stehen nicht mit epileptiformen Entladungen im Zusammenhang.
+ Kardiovaskuläres System:
Es erfolgt keine offenkundige Depression des kardiovaskulären Systems.
+ Atemsystem:
Nach der Verabreichung von Etomidat sinkt die Atemfrequenz vorübergehend ab, und das
Atemzugvolumen steigt an. Danach kann die Atmung flach sein. Eine eventuell auftretende
Apnoe ist nur von kurzer Dauer.
+ Magen-Darm-System:
Häufig treten Brechreiz und Erbrechen auf.
+ NW :
Etomidat blockiert dosisabhängig die Nebennierenrinde und sollte bei Patienten unter Schock
nur unter Cortisolsubstitution gegeben werden.
Ketamin HCl (Ketamin)
Dissoziative Anästhetika rufen einen kataleptischen Zustand eher durch eine zentralnervöse
Erregung als durch eine Depression hervor. Sie verursachen Analgesie, Sedation,
Immobilisation, Abspaltung (Dissoziation) von der Umwelt und Bewusstlosigkeit. Ketamin ist ein
Abkömmling der Phencyclidine.
+ Zentralnervensystem.
Ketamin scheint selektiv das thalamo-kortikale System zu dämpfen, während es sowohl das
retikulumaktivierende als auch das limbische System stimuliert. Ketamin erzeugt einen
anästhetischen Zustand während es das ZNS funktionell spaltet. Es scheint ein starker Inhibitor
der GABA-Bildung im ZNS zu sein. Es erhöht den zerebrospinalen Liquordruck.
+ Kardiovaskuläres System:
Ketamin neigt dazu, das Herz-Kreislaufsystem zu stimulieren und übt eine positiv inotrope
Wirkung auf den Herzmuskel aus (in vivo). Es verursacht einen Anstieg der Herzfrequenz, des
Herzminutenvolumes, des mittleren arteriellen Blutdruckes, des pneumonalen Druckes und des
zentralvenösen Druckes.
+ Atemsystem:
Ketamin verursacht eine apnoische Atmung, setzt die Atemfrequenz herab, beeinflusst jedoch
im Allgemeinen die Blutgase nicht. Die Larynx- und Pharynxreflexe werden durch Verabreichung
von Ketamin nicht unterdrückt. Ketamin vermehrt den Speichelfluss und die Sekretion im
Atemtrakt.
21

+ NW:
Ketamin verursacht einen Muskelspasmus und eine erhöhte Rigidität der Extremitäten. Lid- und
Kornealreflex bleiben bestehen, die Lidspalten bleiben offen. Es kann sowohl Hypothermie als
auch eine Hyperthermie beobachtet werden.
Midazolam (Dormicum)
Midazolam ist ein wasserlösliches Benzodiazepin mit ähnlicher Wirkung wie das Diazepam, hat
allerdings eine kürzere biologische Wirksamkeit als Diazepam. Wegen seiner Wasserlöslichkeit
verursacht Midazolam keine Venenreizung. Rasche und hochdosierte Midazolam-Injektionen
können zu Atmungsbeeinträchtigung führen. Selten werden Blutdruckabfälle registriert, ein
passagerer Anstieg der Leberwerte ist möglich.
Fentanylcitrat (FentanylR)
Fentanyl ist ein synthetisches Opiat, das etwa 100-150 mal stärker wirkt als Morphium.
+ Zentralnervensystem:
Fentanyl wirkt über stereospezifische Opiatrezeptoren in Gehirn und Rückenmark. Abhängig von
dem verwendeten Präparat, der Dosis und der Tierart können die Opiate ZNS- Dämpfungen
oder Erregung verursachen. Tierarten, die eine ZNS-Dämpfung nach Opiatgabe zeigen, haben
etwa doppelt so viele Opiatrezeptoren im Corpus amygdaleum und im Frontalkortex als
Tierspezies mit opioidbedingten Erregungserscheinungen.
+ Kardiovaskulares System:
Fentanyl hat nur eine geringe Wirkung auf Blutdruck und Herzminutenvolumen, kann aber eine
ausgeprägte Sinusbradykardie erzeugen, der durch Atropin entgegengewirkt werden kann.
+ Atemsystem:
Opiate sind starke Atemdepressoren (direkt an den Atemzentren in der Pons und in der Medulla
wirkend). Fentanyl verringert Atemfrequenz und Atemvolumen und verzögert und verringert die
Reaktion auf den arteriellen CO2-Gehalt.
+ NW:
Fentanyl führt nur zu geringer Histaminfreisetzung und induziert selten Erbrechen
Xylazin (Rompun)
Xylazin ist ein Thiazinderivat.
+ Zentralnervensystem:
Die sedative und kurze analgetische Wirkung beruht auf der alpha-2-adrenergen Stimulation im
Gehirn. Die muskelrelaxierende Wirkung entsteht durch Inhibition der interneuralen
Reizübertragung im Rückenmark. Xylazin erzeugt sowohl eine Aktivierung als auch eine
Hemmung des vegetativen Nervensystems und erhöht die zentralvagale- und
Barorezeptorenaktivität .
22

+ Herz- Kreislaufsystem
Initial kommt es nach der Applikation von Xylazin zu einem kurzfristigen Blutdruckanstieg, der
von einer lang andauernden Phase der Hypotension und der Bradykardie gefolgt wird. Es
scheint das Herz empfindlich für Katecholamine zu machen (Arrhythmien).
+ Atmungssystem:
Bei manchen Tieren tritt eine bedeutende Abnahme von Atemfrequenz und Atemvolumen auf.
Xylazin verursacht eine Erschlaffung des Larynx.
+ NW:
Xylazin dämpft das Thermoregulationszentrum im Gehirn und hemmt durch Stimulation der
alpha-2-Rezeptoren in den pankreatischen ß-Zellen die Insulinfreisetzung (Hyperglykämie).
Metamizol (Novalgin)
Metamizol ist ein schwaches“ Analgetikum – Pyrazoloderivat.
Metamizol hat deutliche zentrale analgetische Wirkung und kann deshalb auch zur Behandlung
von nichtentzündlichen Schmerzen eingesetzt werden. Neben einer analgetischen weist es
zudem eine antipyretische und antiphlogistische Wirkung auf. Der Angriffspunkt der
analgetischen Wirkung wird im Thalamus angenommen, während der Angriffspunkt der
antipyretischen Wirkung in den Hypothalanischen Zentren liegt. Die analgetisch/spasmolytische
Wirkung von Metamizol wird zur Behandlung von Spasmen der glatten Muskulatur des Magen-
Darm-Traktes (v.a. bei Kolik) und anderen Bauchhöhlenorganen ausgenutzt. Bei einer
Dauerverabreichung kann es zu Blutbildschäden (bis hin zur Agranulocytose) und nach zu
schneller i.v. Applikation zu Schockzuständen kommen (instabile Kreislaufsituation, Hypotonie).
Naloxon
Naloxon ist ein starker Opioidantagonist und bindet kompetitiv an Opioidrezeptoren (vor allen an
μ-Rezeptoren), hat selbst aber keine zu den Opioiden agonistische Wirkung.
Bei normotensiven Patienten bewirkt Naloxon keine Veränderung des Blutdruckes. Eine
Verbesserung der kardiovaskulären Funktion wird bei verschiedenen Schockformen und
Spezies beschrieben. Zum einen scheint diese Wirkung katecholaminabhängig zu sein, zum
anderen ist sie durch die Antagonisierung körpereigener, hypotensiv wirkender ß-Endorphine zu
erklären. Naloxon antagonisiert alle Effekte der Opioidanalgetika, d.h. sowohl deren
atemdepressive Wirkung als auch die erzeugte Analgesie.
Flumazenil (Anexate)
Flumazenil ist ein spezifischer Benzodiazepinantagonist und hebt die zentral dämpfende
Wirkung von Benzodiazepinen durch kompetitive Hemmung (Verdrängungsreaktion) an den
Rezeptoren (Benzodiazepinrezeptoren) auf. Wechselwirkungen mit anderen zentral dämpfenden
Substanzen wurden nicht beobachtet. Nach der Anwendung von Flumazenil können Übelkeit
und Erbrechen auftreten. Nach zu rascher Injektion ist das Vorkommen von Angstgefühlen,
Herzklopfenn sowie Blutdruckschwankungen mit Veränderung der Herzfrequenz möglich.
Flumazenil kann die durch Benzodiazepine bedingte Senkung eines erhöhten intrakranialen
Druckes aufheben (evtl. kann ein überschießender Hirndruckanstieg auftreten!)
23

Antipamezol (Antisedan)
Antipamezol ist ein spezifischer α-2-Antagonist. Es hebt die Wirkung von an α-2-Rezeptoren
koppelnde Substanzen auf. Bim Hund und anderen Tieren wird die sedative Wirkung von α-2-
Agonisten aufgehoben. Während der ersten 10 Minuten nach Injektion können vorübergehende
Blutdrucksenkungen beobachtet werden, seltener kommt es zu Erbrechen, verstärkter Atmung
oder unkontrolliertem Harnabsatz.
24

Thema 3 Demonstration des Elektroenzephalogramms bei verschiedenen
Aktivitätszuständen
Herr Dr. R. Huonker
Biomagnetisches Zentrum, Klinik für Neurologie,
Erlanger Allee 101
• Ableitung des EEG von der Schädeloberfläche mehrerer Probanden bei verschiedenen
Aktivitätszuständen sowie Demonstration von biologischen und technischen Artefakten
im EEG.
• Ableitung von akustisch evozierten Potentialen (AEP) nach Stimulation mit reinen und
verstimmten Akkorden - Fehlerquotenbestimmung bei verschiedenen Aktivitätszu-ständen.
• Auswertung des EEG mit Frequenzanalyse.
3.1 Grundlagen der Elektroenzephalographie
Das EEG als Ausdruck kortikaler Hirntätigkeit kann beim Menschen direkt von der
Schädeloberfläche abgeleitet werden. Die relativ einfache Registriermöglichkeit des EEG am
Menschen führte nach ihrer Entdeckung durch H. BERGER (1929 in Jena) zur schnellen
Verbreitung dieser Methode und brachte im klinischen Bereich eine Vielzahl diagnostischer Anwendungen
und medizinischer Erkenntnisse, so zur Charakterisierung verschiedener Schlaf-
und Narkosestadien und für die Diagnostik pathologischer zerebraler Veränderungen, wie z.B.
raumfordernder Prozesse im ZNS.
Das Elektroenzephalogramm ist eine zeitabhängige bioelektrische Potentialdifferenz. Bei der
Elektroenzephalographie werden durch Membranpotential-Schwankungen verursachte kortikale
Feldpotentiale extrazellulär registriert. Die Aktivitäten tieferer Hirnstrukturen gehen nur insofern
in das EEG ein, wie sie die neuronale Funktion des Kortex beeinflussen. So werden z.B. die
Generatoren des synchronisierten Alpha-EEG in rhythmisch entladenden Schrittmacherzellen
sowie in periodisch hemmenden neuronalen Verschaltungen des Thalamus vermutet. Den von
der Kopfhaut (EEG) abgeleiteten Potentialdifferenzen liegen hauptsächlich summierte
postsynaptische Potentiale (EPSP und IPSP) zugrunde. Generatoren dieser Potentiale sind
die senkrecht zur Hirnoberfläche ausgerichteten Pyramidenzellen des Kortex, die durch
Synapsen vielfach untereinander verschaltet sind und sich so in ihrer Aktivität gegenseitig
beeinflussen. Die Entstehung der abgeleiteten Potentiale lässt sich mit Hilfe der Dipoltheorie
veranschaulichen: Das aufgezeichnete EEG besitzt einen unregelmäßigen, wellenförmigen
Charakter mit Amplituden zwischen 10 und 100 μV und hängt in seinem Verlauf stark vom
Ableitort ab. Zur Beschreibung des EEG bedient man sich der Auswertung von Amplituden,
Wellenformen und ihren Frequenzen. Man unterscheidet die folgenden klassischen
Frequenzbereiche:
• Delta-Wellen zwischen FU [Hz] = 0,5 FO [Hz] = 3
• Theta-Wellen zwischen FU [Hz] = 4 FO [Hz] = 7
Delta-Wellen und Theta-Rhythmus treten im Wach-EEG des Kindes, beim Erwachsenen
während des Schlafes und bei gespannter Aufmerksamkeit auf.
• Alpha-Wellen zwischen FU [Hz] = 8 FO [Hz] = 13
Der Alpha-Rhythmus ist besonders im relaxierten Wachzustand, bei geschlossenen Augen
und über der okzipitalen Region ausgeprägt. Das EEG zeigt einen regelmäßigen,
synchronisierten Verlauf mit einer (im adulten EEG) vorherrschenden Frequenz bei ca. 10
Wellen/s.
25

• Beta-Wellen zwischen FU [Hz] = 14 FO [Hz] = 30
Das Beta-EEG ist typisch für einen Zustand erhöhter Aktivität (z.B. Augen geöffnet,
Sinnesreize, geistige Tätigkeit, Orientierungsreaktionen). Es ist desynchronisiert und
besteht aus einer unregelmäßigen Überlagerung zahlreicher Wellen mit Frequenzen
zwischen 13 und 30 Hz.
Hochfrequente Gamma-Wellen >30 Hz können im aufmerksamen Wachzustand, bei
Wahrnehmungs- und Lernprozessen sowie im Traumschlaf auftreten.
3.2 Methode der Elektroenzephalographie
Bei der Ableitung von Biopotential-Differenzen wird zwischen unipolarer und bipolarer Ableitung
unterschieden.: Unipolare Ableitungen sind Ableitungen zwischen differenten EEG-Elektroden
über dem Kortex und einer indifferenten Referenz-Elektrode. Diese Bezugselektrode erfasst –
genau wie die EEG-Elektroden – unerwünschte Artefakte, d.h. andere Biopotentiale des
Körpers (wie EKG, EMG, EOG) und technische Störsignale (z.B. das 50 Hz-Wechselstrom-
“Brummen“), nicht aber das EEG als eigentliches Nutzsignal. Das wird z.B. durch das Setzen
der Referenzelektrode am Ohr erreicht. Dort wird das EEG-Signal vernachlässigbar klein. Die
elektronische Subtraktion im EEG-Differenzverstärker eliminiert dann weitgehend diese
biologischen und technischen Störsignale und verbessert somit den Signal-Rausch-Abstand
(SNR) des EEG.
Elektrodenersatzschaltbild mit:
R s - Ohmscher Widerstand der Elektrodenpaste und Elektrode,
C - Kapazität der elektrischen Doppelschicht der Elektroden,
R F - Faraday-Widerstand der chemischen Prozesse, die bei Stromfluss vor sich gehen.
Die Kopfhaut muss vorher an den Elektrodenpositionen gut gereinigt werden, um den
elektrischen Übergangswiderstand zwischen Kopfhaut und Elektrode so weit wie möglich zu
verringern. Je größer der in Reihenschaltung zum Eingangswiderstand des EEG-Verstärkers
liegende Elektroden-Übergangswiderstand ist, desto kleiner wird das spannungsgeteilte EEG-
Nutzsignal und umso stärker werden technische Störsignale mitverstärkt.
Zum Vergleich: Während beim EKG Übergangswiderstände

3.3 Versuchsdurchführung
Anlegen der Elektroden
Zum EEG – Versuch sollten die Studenten mit frisch gewaschenem Haar erscheinen, zumindest
die Probanden für diesen Versuch. Es wird dann eine der Kopfgröße entsprechende Kappe
ausgewählt, entsprechend der Anleitung wird diese Kappe aufgesetzt und die Elektroden
eingeklickt. Um den Hautübergangswiderstand < 5 kΩ zu halten ist es notwendig, die Stellen an
denen die Elektroden sitzen zunächst mit Alkohol zu reinigen und dann mit Abralytflüssigkeit zu
füllen. Es werden 28 EEG – Elektroden und 4 Elektroden für das Registrieren der
Augenbewegungen angeschlossen.
Mit Hilfe des Programms „ Brain Record“ kann kontrolliert werden wie hoch der
Übergangswiderstand der Elektroden ist.
Easy Cap System
Demonstration von Artefakten
Unter der Einwirkung innerer biologischer Faktoren (z.B. Lidschläge, Bulbusbewegungen,
Muskelanspannungen) sowie äußerer technischen Ursachen (z.B. Störspannungen,
elektromagnetische Störfelder) können EEG-Signale verändert, gestört bzw. überlagert werden.
Alle Nicht-EEG-Signale, die das EEG verfälschen, nennt man Artefakte. Vor Versuchsbeginn
werden die verschiedenen Artefakte demonstriert.
c. Registrierung des EEG unter verschiedenen Aktivitätszuständen
1. Augen geschlossen, bequemes ruhiges Sitzen - spontan EEG / 20 sec - AEP erkennen
von verstimmten Akkorden - Fehlerquote
2. 1 Tasse starken Kaffee trinken und erneut - spontanes EEG / 20 sec - AEP erkennen von
verstimmten Akkorden - Fehlerquote
EEG-Auswertung - Frequenzanalyse des Elektroenzephalogramms (FOURIER-
Spektralanalyse)
Grundlagen der EEG-Spektralanalyse
Im EEG des Menschen überlagern sich Wellen verschiedener Frequenzen, die mit
mathematischen Verfahren analysiert werden können. Allgemein durchgesetzt hat sich für
derartige periodische Biopotentialverläufe eine Zerlegung in Sinuswellen und Cosinuswellen
verschiedener Frequenzen – die Fourier-Analyse.
Zunächst wird ein EEG-Abschnitt der Dauer T (einige sec) digitalisiert. Dabei wird das analoge,
kontinuierliche Biopotential EEG (t) in diskreten Zeitabständen ti von z.B. 5 msec in eine Folge
digitaler Zahlenwerte EEG (t i) umgewandelt, was einer Digitalisierungs- oder Abtastfrequenz
von 200 Hz entspricht. Die so entstandene EEG-Zeitreihe wird durch Lösung des
Gleichungssystems:
N/2
EEG (t i) = Σ [a j ∗ COS (ω j ∗ t i) + b j ∗ SIN (ω j ∗ t i )] (1)
27

j = 1 mit ω j = 2 π ∗ j/T (2)
in eine Folge von COS- und SIN-Wellen einer Grundfrequenz ω 1 = 2π/T und höherer,
ganzzahliger Vielfacher der Grundfrequenz ω j (höhere Harmonische oder Oberwellen) zerlegt.
Ergebnis dieses Analyseverfahrens ist das so genannte Leistungsspektrum:
LSD (f j) = N/4π [a j 2 + b j 2 ] in [μV 2 ] (3)
Leistungsspektren des α- und des β-EEG
Es werden Zeitabschnitte des abgeleiteten Spontan - EEG bei geschlossenen Augen und bei
geöffneten Augen einer Spektralanalyse unterzogen - jeweils bei den verschiedenen
Aktivitätszuständen.
Dabei werden Leistungsspektren berechnet und dargestellt, es wird den Studenten demonstriert,
wie die Parameter gewählt werden müssen, damit Ergebnisse deutlich sichtbar werden. Das
unterschiedliche Aussehen der Leistungsspektren wird interpretiert und mit dem EEG
verglichen. Es ist auf artefaktfreie EEG-Abschnitte (keine Lidschläge, Bulbusbewegungen oder
EMG-Einstreuungen) zu achten.
Aus den Leistungsspektren des α-EEG und des -EEG sind die Frequenzen Fmax der
maximalen spektralen Leistung sowie die Maximalwerte LSDmax der spektralen Leistungsdichte
zu bestimmen:
Akustisch Evozierte Potentiale (AEP) als diagnostisches Hilfsmittel zur Überprüfung der
Funktion neuronaler Verschaltungen: Prinzip des AEP-Averaging und Aussage des AEP frühe
und späte Komponenten bei verschiedenen Aktivitätszuständen des Probanden .
Fehlerquoten beim Erkennen von verstimmten Akkorden
Es werden randomisiert reine und verstimmte Akkorde mit einer Lautstärke von 65 dB SPL im
freien Schallfeld appliziert ( n = 50/1:4) und der Proband muss eine Maustaste drücken, wenn
ein verstimmter Akkord zu hören ist - jeweils ohne und mit Kaffee. Die als richtig erkannten
verstimmten Akkorde werden gezählt und mit den dargebotenen ins Verhältnis gesetzt. Die
Fehlerquote mit und ohne Kaffe wird verglichen. Es ist jeweils ein musikalischer und ein nicht
musikalischer Proband auszuwählen.
Die Auswertung aller gemessenen Daten erfolgt mit Hilfe des Progammes Brain Analyszer
von der Firma Brain Products München.
28

Bitte beantworten Sie die folgenden Fragen mit einigen kurzen Sätzen schriftlich in Ihr
Protokoll:
1. Welche Veränderungen sind im EEG beim Öffnen bzw. Schließen der Augen zu erkennen?
2. Was ist kennzeichnend für den Berger-Effekt?
3. Welche Veränderungen sind im EEG bei mentaler Anspannung zu erwarten?
4. Welche Veränderungen sind im EEG bei Weck- und Orientierungsreaktionen zu erwarten?
5. Vergleichen Sie die Größe dieses Artefaktes in den einzelnen Ableitungen: Wie sehen die
Störsignale im EEG aus?
6. Wie stark sind EMG-Artefakte der Körpermuskulatur im EEG?
7. Vergleichen Sie den Verlauf der EEG-Spektren im α-Spektralband und im β-Band
miteinander!
8. Vergleichen Sie die Leistungsspektren und Fehlerquoten beim EEG und AEP bei den
verschiedenen Aktivitätszuständen mit und ohne Kaffee! Was können Sie daraus schließen?
9. Warum können die Wellen eines Beta-EEG nur schwierig und ungenau ausgezählt werden?
10. Was sind evozierte Potentiale?
11. Wie werden sie ausgelöst und beim Menschen registriert?
12. Was sagen die einzelnen Zeitbereiche nach dem Stimulus aus?
Substanzinfos Koffein:
Alkaloid in Kaffeebohnen, Tee- und Mateblättern, Kolanüssen und Guaranasamen.
Erscheinungsformen: in Cola-Getränken, Kaffee, Energydrinks; als Koffeintabletten oder als
reines (synthetisches) Koffein in Pulverform. Konsumformen: getrunken, geschluckt oder
geschnupft
Wirkung:
Koffein macht wach, beschleunigt den Herzschlag und steigert vorübergehend die geistige
Leistungsfähigkeit. In höheren Dosen (ca. 300 bis 600 mg = ca. 8 Tassen Kaffee) erzeugt es
Euphorie.
Wirkungseintritt: nach 10–60 Min.; Wirkdauer: 2–3 Std.
Risiken und Nebenwirkungen
Koffein entzieht dem Körper Flüssigkeit (Dehydration). Bei sehr hohen Dosen:
Schweissausbrüche, Herzflattern, Harndrang, Herzrhythmusstörungen, starke
Wahrnehmungsstörungen, Zittern, Nervosität und Schlafstörungen.
Langzeitrisiken:
Bei dauerhaftem, regelmäßigem Koffeinkonsum (auch bei Kaffee!) besteht die Gefahr
körperlicher Abhängigkeit. Mögliche Entzugssymptome: Kopfschmerzen, Nervosität, Müdigkeit,
Erbrechen bis hin zu Bewegungs- und Konzentrationsstörungen.
Der Säuregehalt des Kaffees fördert zudem langfristig die Bildung von Magengeschwüren. Der
Dauerkonsum von Koffein mit Schmerzmitteln kann zu schweren Nierenschäden mit
lebensbedrohenden Komplikationen führen.
Literatur:
- Beschreibung des Programms Brain Analyzer
- Physiologie der Menschen von Schmidt /Thews
- Sonderdrucke zum EEG und Aktivitätszuständen sowie zu Besonderheiten der auditiven
zentralen Verarbeitung von musikalischen Stimuli
29

Thema 4 Klinische und Forensische Toxikologie, Grundlagen
und Fallbeispiele
PD Dr. F. Peters, Dr. Ch. Sauer
Institut für Rechtsmedizin, Fürstengraben 23
4.1 Einführung
Unter Vergiftung versteht man die schädliche Einwirkung toxischer Substanzen (Gifte) auf den
Organismus sowie die daraus resultierende Symptomatik. Die weitaus meisten der
dokumentierten Vergiftungsverdachtsfälle werden durch Arzneimittel verursacht, vor allem
solche mit mittelschwerem bis tödlichem Verlauf. Andere Gifte, die relativ häufig zu schweren bis
tödlichen Vergiftungen führten, waren chemische Produkte, Pestizide, Drogen oder Pflanzen.
Viele Vergiftungen, vor allem bei Kindern, sind akzidenteller Natur. Darüber hinaus sind
Vergiftungen im Rahmen von Suizid(versuch)en von Bedeutung.
Die Klinische Toxikologie beschäftigt sich mit der Diagnose und Therapie von Vergiftungen,
insbesondere solchen akuter Natur. Neben einer sorgfältigen (Fremd)anamnese kann die
Symptomatik u. U. Hinweise auf die mögliche Vergiftungsursache geben. In der Regel erfordert
die eindeutige Diagnose einer Vergiftung jedoch den Einsatz analytischer Methoden. So muss
vor allem bei unklarem Vergiftungsverdacht zunächst die Noxe identifiziert werden, die für die
Vergiftung verantwortlich ist. Dies erfolgt in der Regel durch eine Systematische Toxikologische
Analyse (STA) einer Urinprobe des Patienten mit dem Ziel möglichst viele Substanzen in
möglichst kurzer Zeit zu erfassen. Wegen ihrer hohen Trennleistung und Identifizierungskraft ist
hiefür die GC-MS die Methode der Wahl. Alternativ oder ergänzend kommen auch häufig HPLC-
PDA basierte Verfahren zum Einsatz. Nach Identifizierung der Noxe sollte diese, sofern möglich,
in einer Blutprobe des Patienten quantitativ bestimmt werden, um die Schwere und Prognose
der Vergiftung abzuschätzen. Dies kann z.B. mittels immunchemischer oder
chromatographischer Verfahren erfolgen. Die Ergebnisse der klinisch-toxikologischen Analyse
werden gemeinsam mit dem behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von Symptomatik und
Vergiftungsverslauf interpretiert. Auf dieser Basis kann dann die (gezielte) Therapie des
Patienten z.B. mit Antidota erfolgen.
Die Forensische Toxikologie beschäftigt sich mit allen toxikologischen Fragestellung von
rechtlicher Relevanz, angefangen bei Fragen zur Fahr(un)tüchtigkeit durch Alkohol und Drogen
im Straßenverkehr über Fragen der Schuldfähigkeit bei Straftaten unter Einfluss berauschender
Mittel bis hin zur post-mortem Toxikologie in der Abklärung unklarer Todesursachen oder eines
Vergiftungsverdachts. Bei der Bearbeitung all dieser Fragestellungen sind analytischtoxikologische
Methoden von entscheidender Bedeutung. Die Verfahren können dabei auf einen
einzelnen Analyten (z.B. Ethanol), auf eine definierte Gruppe von Substanzen (z.B. Fahren unter
Drogeneinfluss gemäß §24a StVG) oder im Sinne einer STA auf eine Vielzahl von Substanzen
(z.B. post-mortem Toxikologie) ausgerichtet sein. Im letzteren Fall kommen prinzipiell ähnliche
Methoden zum Einsatz wie bei der STA in der klinisch-toxikologischen Analytik. Allerdings ist zu
beachten, dass aufgrund häufig fehlender Angaben zur Symptomatik quantitativen
Bestimmungen der involvierten Substanzen eine ungleich höhere Bedeutung zukommt, da die
Schwere der Vergiftung und somit ihre Bedeutung als potentielle Todesursache in solchen
Fällen praktisch ausschließlich über die gemessenen Konzentrationen erfolgen kann.
30

4.2 Ablauf der Veranstaltung
Einführungsvortrag durch den/die Dozenten
Zunächst werden in einem Einführungsvortrag die Grundlagen der Klinischen und Forensischen
Toxikologie vermittelt. Bezüglich der Klinischen Toxikologie werden u.a. wichtige Fragen für die
Anamnese, häufige Vergiftungssymptome, Therapieoptionen wie primäre und sekundäre
Giftelimination sowie wichtige Antidota besprochen. Bezüglich der Forensischen Toxikologie
werden Ordnungswidrigkeits- und Straftatbestände bezüglich Alkohol und Drogen im
Straßenverkehr sowie Aspekte der Schuld(un)fähigkeit kurz besprochen. Spezielle Probleme in
der post-mortem Analytik werden ebenfalls kurz besprochen.
Bearbeitung von Fallbeispielen
In diesem Teil sollen authentische Fälle in der Gruppe bearbeitet werden. Hierzu erhalten die
Studierenden zunächst die zugrunde liegenden Fallgeschichten und die entsprechenden
Analysendaten. In der Folge werden diese Informationen im Hinblick auf die entsprechende
klinische oder forensische Fragestellung ausgewertet und interpretiert. Dazu gehören im
klinisch-toxikologischen Fall insbesondere die Zuordnung von Symptomen zu nachgewiesenen
Substanzen sowie die Erstellung von Therapievorschlägen. Im forensisch-toxikologischen Fall
ist zu klären, welcher Ordnungswidrigkeits- oder Straftatbestand erfüllt sein könnte, bzw. ob den
vorliegenden post-mortem Befunden eine (mit) todesursächliche Bedeutung zukommen könnte.
Für die Bearbeitung der Fälle können die Studierenden auf ihre eigne Fachliteratur, auf vom
Institut für Rechtsmedizin zur Verfügung gestellte Literatur und/oder auf in der nahe gelegenen
ThULB verfügbare Literatur zurückgreifen.
Abschlussbesprechung
In der Abschlussbesprechung soll die Gruppe ihre Lösungsvorschläge präsentieren und
gemeinsam mit dem Dozenten diskutieren. Dabei wird neben den neu erlernten Inhalten auch
die Anwendung des pharmakologisch-toxikologischen Grundlagenwissens im Focus stehen.
31

Thema 5 Auswirkungen von akuter Hypoxie auf Kreislaufregulation und
Säure-Basen-Haushalt
Prof. Dr. R. Bauer
Institut für Molekulare Zellbiologie, Zentrum für Molekulare
Biomedizin, Ebene 3, Hans-Knöll-Straße 2
5.1 Ziel
Die Studenten sollen lernen, pathogenetisch relevante Kompensationsmechanismen des
Organismus bei akuter Störung des Gasaustausches quantitativ zu erfassen und zu beurteilen.
Dabei soll die Einsicht über die neuro-humorale Steuerung der Kreislaufumstellung zur
Sicherung vitaler Funktionen (Gewährleistung zerebraler O2 Versorgung) auf Kosten anderer
Organfunktionen vertieft werden.
Die Wirkung von Inhalationsnarkotika, Katecholaminen, Muskelrelaxatien, Antikoagulanzien und
Blutersatz wird im Verlauf des Experiments jeweils demonstriert und dokumentiert.
Versuchsdurchführung: Demonstration des Versuchsablaufs durch Videoclips und
Darstellung des Verlaufs der Vitalparameter an Originaldaten
Die Untersuchungen wurden an Schweinen (neugeborene Ferkel (Alter 7 Tage) im Rahmen
eines Forschungsprojektes („Hirnprotektion bei frühkindlicher hypoxisch-ischämischer
Encephalopathie“) durchgeführt.
Die Wahl der Spezies erfolgte aufgrund methodischer Notwendigkeiten und der weitgehenden
Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den humanen Bereich. Die Untersuchungen erfordern eine
fortlaufende Kontrolle und intensivmedizinische Beeinflussung einer Reihe von Vitalparametern,
häufige Blutentnahmen und eine künstliche Beatmung. Das Schwein ist hinsichtlich der
perinatalen Reifung von Funktionen des autonomen Nervensystems und metabolischer
Funktionen dem Menschen ähnlich.
Alle Untersuchungen wurden am narkotisierten Tier durchgeführt. Es wurde eine
Inhalationsnarkose (0,9-1,2 % Isofluran in 70 % Lachgas und 30% Sauerstoff) angewandt. Die
Narkoseeinleitung erfolgte bei den neugeborenen Ferkeln mittels des Narkosegas-Gemisches
(Isoflurankonzentration 2 %) über eine Gesichtsmaske. Hautdurchtrennungen erfolgten jeweils
nach zusätzlicher Lokalanästhesie mit 2% Lidokain (s.c.).
Die Instrumentierung dauerte etwa 2h und die Durchführung & Auswertung des Experimentes
dauert 3h.
Beschreibung der Instrumentierung:
• Tracheotomie und Muskelrelaxation (Pancuroniumbromid 0,1 mg/kg); künstliche Beatmung
(Servo-Ventilator 900C, Siemens-Elema ® ).
• Verlegen von Kathetern: A. femoralis zur fortlaufenden Messung des arteriellen Blutdruckes
und zur Entnahme von arteriellen Blutproben für die Blutgasanalyse und Erfassung des
Säure-Basen-Status; venöser Katheter via V. jugularis in die obere Hohlvene für
Flüssigkeitsersatz und zur Arzneimittelgabe.
• Fortlaufende Messung der Rektaltemperatur; Konstanthalten der Körpertemperatur mit Hilfe
einer rückgekoppelten Wäremeeinheit (Wärmeplatte und Rotlichtlampe) bei 38° C ± 0,3° C.
• Erfassung der Hirndurchblutung (CBF) mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF). Hierfür wird
der Schädelknochen freigelegt, durch Bohrloch- Trepanation die harte Hirnhaut (Dura mater)
dargestellt und eine LDF-Sonde mittels Knochenwachs und Kaltpolymerisat (Kallocryl ® )
fixiert.
• Erfassung der Nierendurchblutung (NBF) mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF). Hierfür
wird auf der rechten Seite ein Flankenschnitt durchgeführt und der untere Nierenpol
dargestellt. Nachfolgend wird eine LDF- Sonde mittels Sekundenkleber auf der Niere
befestigt.
32

• Erfassung des EEG mittels unipolarer Schraubenelektroden, die im Schädelknochen
eingebracht und durch Kaltpolymerisat (Kallocryl ® ) fixiert und isoliert werden.
• Ableitung des EKG mittels Einstichelektroden an beiden Vorderläufen und dem rechten
Hinterlauf (Einthoven-Ableitung) und fortlaufende Kalkulation der Herzfrequenz.
5.2 Versuchsablauf
Nach Beendigung der Instrumentierung wurde den Versuchstieren eine ca. 1-stündige
Erholungsperiode eingeräumt. In dieser Zeit wurden die Beatmungsparameter adjustiert und die
erforderlichen Kalibrierungen durchgeführt. Dabei werden den Studenten die notwendigen
Mess- und Qualitätssicherungsprozeduren erläutert und demonstriert, wie sie bei der
Durchführung komplexer Untersuchungsvorhaben unabdingbar sind.
Die Studenten werden dabei mit der Nutzung von Erfassungs-Software vertraut gemacht und
lernen dabei einige Qualitätsmerkmale aktueller Online-Datenerfassung und –analyse kennen.
Außerdem werden die Studenten in den Umgang mit Blutgas- und Säure-Basen Analysegeräten
eingeführt.
Unter Benutzung formalisierter Versuchsablaufbögen wird von den Studenten eine
eigenständige Protokollierung des Versuchsablaufes vorgenommen. Das Versuchsprotokoll
bildet die Grundlage für die nachgeschaltete Auswertung des Versuchs mit Abgabe des
Protokolls.
Nachfolgend beginnt die Demonstration des Experimentes. Zunächst wurden über 15 min unter
normoxischen Ausgangsbedingungen die Parameter zur Kennzeichnung der systemischen
(ABP, HF) und regionalen (CBF, NBF) Kreislaufdynamik aufgezeichnet. Außerdem wurde der
Blutgas- und Säure- Basenstatus durch Gewinnung einer arteriellen Blutprobe erfasst.
Nachfolgend erfolgte die Umstellung auf eine schwere hyperkapnische Hypoxie durch
Verminderung des FiO2 von 0.30 auf 0.06 und Zusatz von ~10% CO2 zum Atemgas für 15 min.
Dabei wurden die Veränderungen in den systemischen und regionalen Kreislaufparametern
aufgezeichnet und für die nachfolgende quantitative Analyse gespeichert. Nach jeweils 5, 10
und 15 min wurden Blutproben entnommen und der Blutgas- und Säure- Basenstatus ermittelt.
Im Anschluss an die Periode „schwere hyperkapnische Hypoxie“ wurde die
Beatmungsgaszusammensetzung wieder auf den prähypoxischen Zustand eingestellt und über
weitere 15 min die Normalisierung der Kreislaufparameter während der Reoxignierungsperiode
erfasst. Außerdem wurde nach jeweils 5, 10 und 15 min Blutproben entnommen und der
Blutgas- und Säure- Basenstatus ermittelt.
Zum Abschluss des Experiments wurde die Wirkungen von Medikamenten demonstriert, die bei
kardiopulmonaler Reanimation (CPR) eingesetzt werden. So wird zunächst die Wirkung von
Natriumbikarbonat zur Pufferung einer metabolischen Azidose nach schwere hypoxische
Hypoxie gezeigt. Nachfolgend wird die systemische und regionale Kreislaufreaktion auf
intravenöse Applikation von Adrenalin (0,05 mg/Kg Körpergewicht) erfasst.
33

5.3 Auswertung
Herzkreislauf:
Die ermittelten Daten der kontinuierlichen Aufzeichnung werden einer Off-line Datenanalyse
unterzogen. Dazu wird eine Mehrkanal-Analyse der aufgezeichneten Parameter ABP, HF, CBF
und NBF unter Nutzung der Software „Watisa for Windows“ und „MS Excel“ durchgeführt.
Zunächst werden vorgegebene Zeitabschnitte festgelegt und von repräsentativen
Kurvenabschnitten deskriptive Parameter zur zusammenfassenden Dokumentation des
Untersuchungsablaufes ermittelt. Diese Parameter werden nachfolgend in geeigneter
numerischer und graphischer Form dargestellt und dienen der im Anschluss an die
Datenanalyse stattfindenden Interpretation der Versuchsergebnisse.
Blutgas- und Säure- Basenstatus, Elektrolyt- und metabolische Daten:
Die ermittelten Daten der Blutprobenanalytik werden von den Studenten in analoger Weise in
vorgegebene Tabellenvorlagen in „MS Excel“ übertragen und in geeigneter numerischer und
graphischer Form dargestellt.
Interpretation der Versuchsergebnisse
In einer abschließenden Diskussionsrunde werden die Studenten Gelegenheit haben, die
ermittelten Ergebnisse zu erörtern. Dabei wird schwerpunktmäßig zur Sprache kommen, wie die
Verlaufsbeurteilung der ermittelten Kreislaufdaten zu bewerten sind. Darüber hinaus werden die
Mechanismen der zugrunde liegenden Kompensationsvorgänge erörtert werden und die Rolle
der erfassten Stoffwechselveränderungen, insbesondere die erheblichen Auswirkungen auf den
Säure- Basenhaushalt besprochen.
Vorausgesetzes Wissen
• Pathophysiologie systemischer Kreislaufregulation bei akutem O2 Mangel
• Adaptation und Kompensation bei Hypoxie
• Störungen des Säure- Basenhaushaltes
Fragen:
1. Nenne und charakterisieren Sie die 4 Grundtypen von Hypoxie!
2. Welche Grundmechanismen sind für Redistribution des zirkulierenden Blutvolumens bei
akuter hypoxischer bzw. hyperkapnischer Hypoxie verantwortlich?
3. Wodurch ist metabolische Azidose gekennzeichnet? Welche Kompensationsmechanismen
hat der Säugetierorganismus, die Auswirkungen von vermehrtem Anfall fixer Säuren zu
reduzieren?
Literatur:
34

Thema 6 Blut und Blutbestandteile und deren Charakterisierung
Dr. S. Mosig, Dr. K. Rennert
AG Molekulare Hämostaseologie, Bachstr. 18
Plasmatische und zelluläre Bestandteile des Blutes und deren Zusammenwirken spielen eine
wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des menschlichen Organismus;
angeborene oder erworbene Defekte einzelner Komponenten führen zu einer Einschränkung der
jeweiligen Funktionen und können eine Manifestation sehr verschiedenartiger Krankheitsbilder
von Störungen der Blutgerinnung bis zu immunologischen Erkrankungen bedingen.
Ziel des Praktikums soll sein, anhand einzelner Methoden Kenntnisse sowohl zur Bedeutung
auch zur Rolle der verschiedenen Blutzellen zu gewinnen. Das Praktikum gliedert sich in 2 Teile:
6.1 Blutzellen
Einführung:
Blut besteht aus den zellulären Bestandteilen (Hämatokrit) und dem Plasma. Frauen weisen
typischerweise einen Hämatokrit von 41- 43% auf, Männer haben in der Regel einen höheren
zellulären Anteil von 44 – 46%. Die zellulären Anteile des Bluts bestehen aus Erythrozyten (rote
Blutzellen), Leukozyten (weiße Blutzellen) und Thrombozyten (Blutplättchen). Die Aufgabe der
Erythrozyten besteht im Transport von Sauerstoff und Kohlendioxid, wohingegen die
Thrombozyten in erster Linie für die Wundheilung und die Initiation der Gerinnungskaskade
verantwortlich sind. Die Leukozyten unterteilen sich ihrerseits in die Granulozyten, Monozyten
und Lymphozyten. Aufgrund des Färbeverhaltens des Protoplasmas lassen sich Granulozyten in
drei Subpopulationen, die eosinophilen, basophilen und neutrophilen Granulozyten unterteilen.
Ähnlich wie Monozyten sind Granulozyten für die unspezifische Immunabwehr verantwortlich.
Leukozyten, die sich in die drei Hauptgruppen T- , B- und Natürliche Killerzell (NK)–
Lymphozyten einteilen lassen, sind im Gegensatz dazu für eine spezifische Abwehr von
Pathogenen verantwortlich. Eine schematische Darstellung der einzelnen Blutbestandteile
finden Sie nachstehend.
42

Erythrozyten
Quelle: Uniklinikum des
Saarlands
Thrombozyten
Quelle: Universität Heidelberg
Funktion: Sauerstoff- und Kohlendioxid-Transport
Konzentration: Frauen 4,1 – 5,2 Mio./µl; Männer 4,6 – 5,9 Mio./µl
Gesamtmenge eines Erwachsenen: zwischen 24-30 Billionen
gehen aus Retikulozyten hervor
besitzen keinen Zellkern, nur bedingt zur Proteinbildung befähigt
Durchmesser: ca. 7,5µm, Dicke: ca. 2µm
Lebensdauer: 120 Tage, Neubildung: ca. 1% am Tag = 200 Milliarden pro
Tag = 2 Millionen pro Sekunde
durchflusszytometrische Detektion durch CD235a Färbung
Funktion: Wundheilung durch Thrombusbildung infolge von
Thrombozytenaggregation durch fibrin-vermittelte Bindung an andere
Thrombozyten
Konzentration: 150.000 – 380.000 /µl
Gesamtmenge: 0,68 – 1,71 Billionen
entstehen im Knochenmark durch Abschnürung von Megakaryozyten
besitzen keinen Zellkern, nur bedingt zur Proteinbildung befähigt
Durchmesser: 1,5 – 3µm
Lebensdauer: 8 - 12 Tage, Abbau in Milz, Lunge und z.T. Leber
durchflusszytometrische Detektion durch CD41a Färbung
Leukozyten
Funktion: Abwehr von Krankheitserregern, z.B. Bakterien, Viren, Würme, Pilze aber auch
Tumorzellen und körperfremde Partikel
Bildung im roten Knochenmark (Medulla osseum rubrum) in Brustbein und Becken, bei Kindern
zusätzlich in den langen Röhrenknochen von Armen und Beinen
gehen aus Vorläuferstammzellen hervor:
Abbildung: University of Minnesota
43

Granulozyten Funktion: unspezifische Immunabwehr von Bakterien, Pilzen und Parasiten
polymorphkernige Leukozyten mit gelapptem, chromatinreichen Kern; bilden
45-75% aller Leukozyten; Lebensdauer: 2 bis 3 Tage; sind amöboid beweglich
und zur Phagozytose befähigt; 10 – 15µm im Durchmesser;
durchflußzytometrische Detektion durch CD66b Färbung; werden im
Knochenmark gebildet und bilden entsprechend ihrem Anfärbeverhalten
3 Unterarten:
neutrophile Granulozyten
Halbwertszeit im Blut: 6 – 7 Stunden
ein Erwachsener produziert 10 11 Neutrophile pro Tag, wenn Neutrophile 6–8
Stunden nach Eintritt nicht in den Kontakt mit Pathogenen kommen oder an
Entzündungsreaktionen teilnehmen, werden sie durch Makrophagen in der
Leber oder Milz abgebaut
besitzen Schlüsselrolle bei akuten Enzündungsreaktionen durch Phagozytose
von Bakterien und Viren
eosinophile Granulozyten
Halbwertszeit im Blut: 8 Stunden
anfärbbar mit Eosin, haben wichtige Funktion bei der Parasitenabwehr: binden
und phagozytieren mit IgE Antikörpern markierte Pathogene
basophile Granulozyten
Halbwertszeit im Blut: 5 – 6 Stunden
anfärbbar mit basischen Farbstoffen wie Methylenblau
besitzen unregelmäßige Granula, die unter anderem Histamin und Heparin
enthalten genaue Funktion noch nicht vollständig geklärt, weisen
Ähnlichkeiten mit Mastzellen auf
Monozyten Funktion: haben wichtige Funktion bei der unspezifischen Immunabwehr
durch Phagozytose von Pathogenen, ähnliche Funktion wie neutrophile
Granulozyten, treten jedoch zeitlich versetzt am Infektionsort auf
Konzentration: 180 – 550/µl
entstehen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark unter dem
Einfluss von Wachstumsfaktoren wie M-CSF oder GM-CSF
zwei Subpopulationen: inflammatorische CD14 ++ CD16 - Monozyten und
geweberesidente CD14 + CD16 + mit unterschiedlichen Aufgaben
Durchmesser: 10 – 18 µm, Zellen enthalten einen nierenförmigen Kern
Lebensdauer: 1 bis 3 Tage
durchflusszytometrische Detektion durch CD14 Färbung
44

Lymphozyten
Quelle: Dr. Triche National Cancer Institute
• T-Lymphozyten
Funktion: spezifische adaptive Immunabwehr
durchflusszytometrische Detektion durch CD3 oder CD45 Färbung
• T-Helferzellen
CD4-positive T-Zellen; Sezernierung von Zytokinen und Modulation der TH1 und TH2
Immunantwort
• zytotoxische T-Killerzellen
CD8-positive T-Zellen; erkennen über MHCI-Komplexe präsentierte virale Antigene;
vermitteln die Induktion der Apoptose viral infizierter Zellen über Fas/FasL und
Perforin/Gramzym Signalwege
• Gedächtnis T-Zellen
verbleiben im Blut als immunologische Gedächtniszellen; können sowohl CD4+- als auch
CD8+-positiv sein; nach ihrer erneuten antigenspezifischen Aktivierung kann ihre Anzahl
um das 10 – 100 fache in sehr kurzer Zeit ansteigen
• regulatorische T-Zellen
auch „Suppressor T-Zellen“, steuern das Entzündungsgeschehen, indem sie
überschießende Immunreaktion unterdrücken
B-Lymphozyten
NK-Lymphozyten
Quelle:
Universität Köln,
Institut für Mikrobiologie,
Immunologie und Hygiene
Funktion: erkennen mittels B-Zell-Rezeptoren in der Regel
körperfremde Antigene und produzieren daraufhin Antikörper, die
gegen diese Antigene gerichtet sind
nach Bindung eines Antigens und gleichzeitigem kostimulatorischen
Signal durch Helfer-T-Zellen wandern B-Zellen in Lymphknoten oder
Milz, beginnen dort zu proliferieren und anschließend zur antigenproduzierenden
Plasmazelle zu differenzieren
ein Erwachsener besitzt 10 9 bis 10 10 verschiedene
antigenspezifische B-Lymphozyten
gehen aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks
hervor durchflussytometrische Detektion durch CD19 Färbung
Funktion: können Tumorzellen und virusinfizierte Zellen durch
Freisetzung von Granzymen und Perforinen abtöten
sind Teil des angeborenen Immunsystems und besitzen keine
antigenspezifischen Immunrezeptoren
gehen aus Vorläuferzellen des Knochenmarks hervor
durchflusszytometrische Detektion durch CD56 Färbung
45

Kurzer Überblick zur Durchflusszytometrie
Prinzip: Detektion antikörper-markierter Einzelzellen mittels laser-angeregter Fluorochrome.
In der Probenvorbereitung erfolgt die Markierung von Oberflächenproteinen durch Fluorochromgekoppelte
Antikörper.
Die markierten Zellen werden in einem Flüssigkeitsstrom in eine Messküvette transportiert und
die Fluorochrome durch Laserlicht angeregt. Es können neben den Fluoreszenzsignalen noch
das Vorwärtsstreulicht (FSC) als Maß für die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht als Maß für
die Granularität der Zelle gemessen werden.
46

Anhand der Lage der Zellen im FSC – SSC Dot Plot sind bereits einzelne Zellpopulation
identifizierbar:
Fluorochrome:
1. Schritt: 2. Schritt:
Anregung des Fluorochroms Emission des absorbierten
mit Laserlicht (Absorbtion) Laserlichts als Photon mit
z.B. Anregung von FITC mit einer größeren Wellenlänge
blauem Laser (λ = 488nm)
47

Es können mehrere Fluorochrome gleichzeitig verwendet werden, diese können sich jedoch in
ihren Emissionswellenlängen gegenseitig überlagern.
blauer Laser:
roter Laser:
violetter Laser:
Zur Signaltrennung ist eine Kompensation der Fluoreszenzsignale notwendig.
Für ein spezifisches Einzelsignal muss der jeweilige Anteil überlappender Signale vom
Gesamtsignal abgezogen werden.
48

Optisches System des FACSCanto II
49

Erfassung und Umwandlung in digitale Signale
Aufgabenstellung:
Es sollen die einzelnen zellulären Bestandteile der weißen Blutzellen aus Vollblut präpariert,
durchflusszytometrisch erfasst und analysiert werden.
Durchführung:
Das Vollblut wird zur Verhinderung einer nachfolgenden Gerinnung in einer Lithium-Heparin
Monovette abgenommen. Zur Entfernung der enthaltenen Erythrozyten erfolgt zunächst eine
Zerstörung (Lyse) der Erythrozyten durch Zusatz eines Erythrozytenlysis-Puffers. Durch Zusatz
dieses niedermolaren Puffers entsteht ein osmotischer Gradient. Da Erythrozyten eine
verhältnismäßig dünne Zellmembran besitzen, können auf diese Weise Erythrozyten spezifisch
zerstört und weiße Blutzellen angereichert werden. Nach zweimaligem Waschen mit
isotonischem Waschpuffer können die verbleibenden weißen Blutzellen mit spezifischen
Antikörpern angefärbt werden. Das Zellpellet wird in 50µl Waschpuffer resuspendiert und es
werden jeweils 2µl der folgenden Antikörper zugesetzt:
50

Antikörper gekoppeltes Fluorochrom spezifische Zelldetektion
CD66b FITC Granulozyten
CD16 PE Monozyten/NK Zellen
CD14 PerCP Monozyten
CD56 PE/Cy7 NK Zellen
CD41a APC Thrombozyten
CD19 APC/Cy7 B-Lymphozyten
CD3 Horizon V450 T-Lymphozyten
Die Färbung erfolgt 15 min in der Dunkelheit. Die Messung der Probe erfolgt am BD FACSCanto
II Durchflusszytometer.
51

Thema 7 Diagnostische und therapeutische Anwendung von Antikörpern
Prof. Dr. T. Kamradt, Dr. M. Gabler, U. Lehmann, PhD, Dr. S. Drube,
Dr. J. Stirnweiss, Dr. I. Irmler, Dipl. Biochem. M. Böttcher,
Dipl. Biol. Ch. Göpfert, I. Meininger
Institut für Immunologie, Leutragraben 3
7.1 Diagnostische und therapeutische Anwendung von Antikörpern
Die meisten immunologischen Methoden erfordern einen oder mehrere spezifische Antikörper.
Es wird zwischen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern unterschieden.
Polyklonale Antikörper (Ak) besitzen eine Antigenspezifität, aber unterschiedliche
Epitopspezifitäten. Nach Immunisierung eines Tieres mit einem Antigen (Ag) wird eine Mischpopulation
von Antikörpern erzeugt. Diese Antikörper werden nach der Aufreinigung aus dem
Serum als polyklonal bezeichnet. Bei der unaufgereinigten Variante spricht man dagegen von
einem polyklonalen Antiserum. Die Vorteile polyklonaler Ak liegen in der schnellen,
unkomplizierten und somit preisgünstigen Gewinnung. Durch die Immunisierung großer Tiere
lassen sich große Mengen von Antiserum gewinnen. Polyklonale Seren eignen sich v.a. für den
Nachweis sehr kleiner Moleküle, die wenige Epitope aufweisen. Die Nachteile polyklonaler Ak
bestehen in den chargenabhängigen Schwankungen und der somit aufwendigen
Qualitätskontrolle. Außerdem enthalten polyklonale Antiseren oft ungewünschte Ak, die z.B. von
Infektionen des immunisierten Tieres herrühren. Diese führen durch ihre Unspezifität oft zu
Kreuzreaktionen.
Monoklonale Ak werden von ein und demselben B-Zell-Klon gebildet. Sie besitzen nur eine
Epitopspezifität. Für die Generierung monoklonaler Ak-produzierender Zellen, sogenannten
Hybridomazelllinien, wird eine Plasmazelle mit einer Myelomazelle fusioniert. Diese
Hybridomazelle vereinigt nun in sich die Fähigkeit einer Plasmazelle zur Produktion eines
spezifischen monoklonalen Ak und die Eigenschaft einer Tumorzelle, sich unbegrenzt teilen zu
können. Die Vorteile monoklonaler Ak liegen in ihrer Herstellung: Hybridomazellen lassen sich
unendlich vermehren und die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper aus dem
Zellkulturmedium ist einfacher als aus dem Serum, da dieses weniger störende Begleitproteine
enthält. Durch den Herstellungsprozess ist eine gleichbleibende Qualität gewährleistet. Dadurch,
dass ein monoklonaler Ak nur eine Epitop erkennt, treten nur äußerst selten Kreuzreaktionen
auf.
Die Wahl eines polyklonalen oder eines monoklonalen Ak hängt letztendlich vom
Verwendungszweck ab.
7.1.1 Therapeutischer Einsatz von Ak
Der folgende Abschnitt soll einen Einstieg in die komplexe Thematik des therapeutischen
Einsatzes von Ak in der Medizin bieten, die im Rahmen dieses Praktikums nicht erschöpfend
behandelt werden kann.
In den letzten Jahren haben in den verschiedensten Bereichen der Medizin wie z.B. Therapie
von malignen und Autoimmun-Erkrankungen, Infektionen, aber auch bei Verhinderung von
Transplantatabstoßungen sogenannte „Biologicals“ mehr und mehr an Bedeutung gewonnen.
Zu den „Biologicals“ zählen neben löslichen Rezeptoren und molekularen Mimetika auch
monoklonale Antikörper (mAk).
Die mAk stellen eine besonders erfolgreiche Gruppe von Arzneimitteln dar: 29% der chimären
Antikörper und 25 % der humanisierten Antikörper schaffen es von der Entwicklung bis zur
Zulassung, während die Erfolgsquote bei herkömmlichen Arzneimitteln nur bei 11 % liegt.
Die Limitationen bei der Therapie mit mAk liegen in den möglichen Targets: als Target kommen
lediglich Strukturen in Frage, die für Ak zugänglich sind, sich also zumeist auf der Oberfläche
von Zellen befinden.
Entscheidend für die therapeutischen Effekte der mAk ist ihre Struktur, z.B. agglutinieren F(ab´)2
Fragmente Bakterien und Viren und sind so in der Lage, diese zu neutralisieren; Fc-Fragmente
52

dagegen verstärken Phagocytoseprozesse (Opsonierung) und wirken toxisch via ADCC
(antibody-dependant cellular cytotoxicity).
In ersten Versuchen, die zunächst moderaten klinischen Effekte von mAk zu verbessern,
wurden Toxine, Radionukleotide oder andere biologische Effektormoleküle chemisch an mAk
gekoppelt.
Die Fc-Region eines Ak ist entscheidend für seine Halbwertszeit und Stabilität und beeinflusst
so entscheidend seine Pharmakokinetik. Darüber hinaus vermittelt die Fc-Region die
Effektorfunktionen der Ak wie ADCC und CDCC (complement-dependent-cellular cytotoxicity).
Der Fortschritt in der Biotechnologie ermöglicht z.B. den Austausch einzelner Aminosäuren oder
eine Veränderung der Glycosylierung der Fc-Region. So konnten durch den Austausch weniger
AS in der Fc-Region die in vitro Effektorfunktionen der anti-Tumor mAk Rituximab und
Trastuzumab um das zweifache gesteigert werden.
Im Allgemeinen sind mAk gut verträglich, obwohl bei der ersten Applikation oft
Infusionsreaktionen (wie Fieber und Schüttelfrost) auftreten, die aber zumeist leicht in den Griff
zu bekommen sind.
Um die Immunogenizität der xenogenen mAk zu reduzieren, ist man zum Design chimärer Ak
übergegangen: dabei wird durch homologe Rekombination z.B. ein Fab-Fragment aus einem
Nagetier (z.B. der Maus) mit einem humanen Fc-Fragment verbunden. Die Phage-Display-
Technik ermöglicht sogar die Generierung kompletter humaner mAk jeder beliebiger Spezifität
(s. Abbildung 1).
Abbildung 1: Darstellung humanisierter und chimärer mAK
Diese Techniken ermöglichen die Reduktion von Nebenwirkungen und eine Verbesserung der
klinischen Wirksamkeit.
Abbildung 2 zeigt eine Auswahl therapeutischer mAk, die in Deutschland bereits zur Therapie
zugelassen sind.
53

Abbildung 2: In Deutschland zur Therapie zugelassene monoklonale Antikörper
Trotz aller Forschritte beim Einsatz von mAk zu Therapiezwecken müssen die enormen Kosten
berücksichtigt werden, die durch die aufwendige Entwicklung der mAk sowie deren Herstellung
und die aufwändigen Qualitätskontrollen entstehen.
Abbildung 3 erläutert die Nomenklatur der Arzneimittelnamen monoklonaler Ak.
Abbildung 3: Nomenklatur der mAk
Bei allen Erfolgen in der Therapie sind bei der Entwicklung von mAk auch Rückschläge zu
verzeichnen (s. Abbildung 4).
54

Abbildung 4: Verlauf der Phase I Studie des mAk anti-CD28 (TGN1412) [2]
7.1.2 Ak-basierte Methoden in der Diagnostik
Antikörper bilden die Basis für zahlreiche diagnostische Verfahren in allen Bereichen der
Medizin und in der medizinischen Forschung. Zu den zahlreichen analytischen und präparativen
Techniken zählen z.B. die Immunhistochemie, Immunfluoreszenz (FACS,
Fluoreszenzmikroskop), Immunoassays (ELISA, ELISPOT, Immunoblot, Immunopräzipitation)
und Affinitätschromatographie.
Im Praktikum sollen Seren auf Antikörper mittels ELISA untersucht werden und Lymphozyten
mittels einer FACS-Färbung charakterisiert werden.
Darüber hinaus wird auf die Methoden SDS-PAGE, Immunoblot und MACS eingegangen.
7.1.2.1 ELISA
Der ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) ist einer der am häufigsten verwendeten
quantitativen Immunoassays. Der Substratumsatz eines an einen Antikörper gekoppelten
Enzyms ist dabei proportional zur Antigenkonzentration. Mit Hilfe des ELISAs können Proteine,
Viren aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide in einer
Probe (Blutserum, Milch, Urin etc.) nachgewiesen werden. In der Diagnostik wird der ELISA zur
Bestimmung von Ak-Titern in Patientenseren, Nachweis von Hormonen oder Bestimmung von
Serumproteinen eingesetzt.
Es gibt verschiedene ELISA-Typen: den direkten, den kompetitiven und den Sandwich-ELISA.
Die folgende Tabelle stellt die Unterschiede der verschiedenen Typen dar:
55

Direkter ELISA Sandwich ELISA Kompetitiver ELISA
1 Adsorption des Ag an 1 Adsorption des Ak an 1 Adsorption des Ak an
Mikrotiterplatte
Mikrotiterplatte
Mikrotiterplatte
2 Blocken freier
2 Blocken freier
2 Blocken freier
Proteinbindestellen
Proteinbindestellen
Proteinbindestellen
3 Inkubation mit Probe (z.B. 3 Inkubation mit Probe 3 Inkubation mit markiertem
Serum)
Antigen und der Probe
4 Inkubation mit Detektions- 4 Inkubation mit Detektions- 4 Inkubation mit Detektions-
Ak
Ak
Ak
5 Farbreaktion 5 Farbreaktion 5 Farbreaktion
6 Messung im Photometer 6 Messung im Photometer 6 Messung im Photometer
Zwischen den einzelnen beschriebenen Schritten erfolgen Waschschritte.
Im Allgemeinen zeichnet sich der Sandwich-ELISA durch seine hohe Sensitivität aus. Der
direkte ELISA findet bei der Bestimmung von Antigenspezifischen Antikörpern in Seren
Anwendung.
Mittels ELISA soll die Antikörperantwort gegen humanes G6PI (rhG6PI) im Serum von Mäusen
nach rhG6PI Immunisierung gemessen und gleichzeitig der Isotyp der gebildeten Antikörper
untersucht werden. Das Prinzip des Tests beruht auf der Immobilisierung von rhG6PI als
Antigen an die feste Phase von Mikrotiterstreifen (Polystyrol) und anschließender Zugabe des
Serums (mit anti-rhG6PI-Antikörpern, die spezifisch an das Antigen binden). Während der sich
anschließenden Waschschritte bleiben nur anti-rhG6PI Antikörper an dem immobilisierten
Antigen gebunden und werden mit einem zweiten Antikörper, der spezifisch Antikörper eines
bestimmten Isotyps erkennt, inkubiert. Der Nachweis der so gebundenen Antikörper erfolgt
mittels eines weiteren enzymmarkierten Antikörpers. Nach Zugabe einer Substratlösung
entwickelt sich ein Farbstoff, dessen Farbintensität proportional der Konzentration und/ oder der
Aktivität der Antikörper ist.
Fragen zur Vorbereitung:
• Was würden Sie zum Blocken verwenden?
• Welcher ELISA-Typ wird im Praktikum demonstriert?
• In untenstehender Abbildung ist der schematische Ablauf des ELISAs dargestellt.
+ Ziege-anti + Esel-anti- + Substrat
+ Serum Maus (IgM IgG1) Ziege IgG
rhG6PI Esel-anti-Ziege IgG Konjugat
Maus- anti-rhG6PI-Antikörper POD
Ziege- anti-Maus (IgM, IgG1) Substrat
Abbildung 5: Prinzip des ELISAs
56

Die Schritte 1-5 werden durch Ihre Praktikumsbetreuer/-in durchgeführt.
Durchführung:
• 1. Beschichtung der Platte: 100µl der rhG6PI (5µg/ml) in PBS werden in die Wells der
Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platten werden über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer
inkubiert.
• 2. Waschen und Blockieren: Platte ausleeren, Flüssigkeitsreste durch kräftiges
Aufschlagen der umgedrehten Platte auf ein sauberes, trockenes Tuch (z.B. Zellstoff)
entfernen. Danach 200µl /Well Blockierungspuffer einpipettieren und 1h auf der Platte zum
Blockieren stehen lassen. Anschließend wird die Platte geleert und noch 3x durch Füllen mit
200 µl Waschpuffer/Well, und erneutem Ausschlagen gewaschen.
• 3. Reaktion mit Mäuseserum: Das Mausserum wird seriell von 1:100 – 1: 102.400 mit
Wasch-puffer verdünnt und jeweils 100µl der unterschiedlichen Verdünnungen als Dupletts
in die Wells eingefüllt. Anschließend erfolgt eine 1h Inkubation bei Raumtemperatur.
• 4. Waschen: s.o.
• 5. Inkubation mit Ziege-anti-Maus-IgG1, und IgM Antikörper: jeweils 100 µl der einzelnen
Antikörper werden in einer Verdünnung von 1:1000 in Waschpuffer für 1h bei
Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubiert.
• 6. Waschen: s.o.
• 7. Inkubation mit Peroxidase-gekoppelten Esel-anti-Ziege-IgG Antikörper: Der
Peroxidase-gekoppelte Antikörper wird 1:3000 mit Waschpuffer verdünnt und jeweils
100µl/Well für 20 min bei 37°C in der feuchten Kammer inkubiert.
• 8. Waschen: s.o.
• 9. Substratreaktion: 10mg ortho-Phenylendiamin (OPD) wird in 10 ml Substratpuffer gelöst.
Danach werden 5µl 30% Wasserstoffperoxid-Lösung zugesetzt und gut gemischt. 100µl
dieser Lösung werden in jede Vertiefung der Platte einpipettiert. Die Farbentwicklung durch
Zusatz von 50µl Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wird bei 492nm in einem ELISA-
Plattenreader gemessen.
Auswertung:
Bestimmen Sie den Titer der immunisierten und der unimmunisierten Maus. Der Titer ist die
höchste Serumverdünnung bei der anti-rhG6PI Antikörper noch detektierbar sind. Dabei werden
OD-Werte, die dreifach höher als die Standardabweichung des Leerwertes (wells ohne
Mausserum) sind, als positiv eingeschätzt.
Die Antikörpertiter der einzelnen Subtypen sind als Säulendiagramm grafisch darzustellen.
Haben Sie dieses Ergebnis erwartet?
57

7.1.2.2 Western-Blot
Der Western-Blot (WB) dient der Identifizierung und/oder Quantifizierung spezifischer Proteine
innerhalb eines Proteingemisches. Die Detektion erfolgt mittels eines Ak, der spezifisch an
antigene Epitope des auf einer Membran fixierten Zielproteins bindet. Man spricht daher auch
von Immunoblot.
In Abhängigkeit vom verwendeten Detektionssystem liegt die Nachweisgrenze im Piko- bis
Nanogrammbereich.
Abbildung 6: Kammer für SDS-PAGE und Gel nach Coomassie-Färbung
Dem Western-Blot geht in der Regel eine SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
voraus. Die SDS-PAGE ermöglicht die Auftrennung von Proteingemischen. SDS ist ein
anionisches Detergenz, das die Eigenladung von Proteinen überdeckt. Durch den Überschuss
an SDS werden Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine zerstört. Die stark negativ
geladenen Proteine wandern dann im elektrischen Feld nur noch entsprechend ihrer Masse. Da
eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichts und der
Wanderungsgeschwindigkeit der SDS-Polypeptid-Micellen besteht, kann mit Hilfe eines
Standard-Protein-Markers das Molekulargewicht eines Proteins bestimmt werden. Zum
Nachweis der Proteine direkt im Gel wird häufig eine Coomassiefärbung verwendet (s.
Abbildung 6).
Nach der SDS-PAGE erfolgt der eigentliche Blot. Dabei werden die separierten Proteine in
einem „Blot-Sandwich“ auf eine Trägermembran übertragen.
Abbildung 7: „Blot-Sandwich“
58

Im Anschluss erfolgt der Detektion der Proteine auf der Membran mittels Antikörper. Dabei ist
der praktische Ablauf ähnlich dem ELISA:
1 Blocken der unspezifischen Bindungsstellen
2 Waschen
3 1. AK
4 Waschen
5 2. AK (enzym-markiert)
6 Waschen
7 Substratumsetzung
In der Diagnostik wird der Western-Blot z.B. zum Nachweis HIV-spezifischer Antikörper
verwendet.
Abbildung 8: Western Blot am Beispiel des Nachweises von Ak gegen verschiedene Bestandteile von
HIV im humanen Serum
7.1.2.3 FACS ( Fluorescent activated cell sorting)
Die Durchflusszytometrie wird in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, um einzelne Zellen
näher zu charakterisieren. Fluoreszenzmarkierte Zellen werden hierbei durch eine, die Probenflüssigkeit
umgebende Mantelflüssigkeit (Sheath) vereinzelt. Anschließen werden sie durch eine
Messküvette gedrückt, in der sie den Strahl eines oder mehrer Lasers passieren. Die
auftretende Lichtstreuung sowie die Emission der Fluoreszenzfarbstoffe werden mit
Photodetektoren (PMTs) gemessen, digitalisiert und können dann mit Hilfe spezieller Software
analysiert werden. Auf diese Art kann man gleichzeitig mehrere physikalische und Fluoreszenz-
Parameter einer großen Zellmenge auf Einzelzellebene analysieren. Im Folgenden ist der
schematische Aufbau eines FACS-Gerätes dargestellt:
59

Abbildung 9: Schematische Darstellung,
wie mit Hilfe von Druck die Mantelflüssigkeit
aus dem Vorratsbehälter (Sheath) die
Zellen vereinzelt an dem fokussierten
Laserlicht vorbeiführt. In der Messküvette
(Flow Chamber) trifft das Laserlicht auf die
Zellen und die abgestrahlten Lichtsignale
werden dann von entsprechenden PMT-
Detektoren aufgefangen und in digitalisierter
Form an einen Computer übermittelt.
Es werden Informationen über die Morphologie der Zellen gesammelt, indem das
durchgelassene und das im 90° Winkel abgestrahlte Licht gemessen werden. Damit
können Rückschlüsse auf die Größe der Zellen und auf die Granularität der Zellen (granuläre
Strukturen streuen das Licht stärker) gezogen werden. Wenn man Oberflächenmoleküle durch
Antikörper markiert, an welche ein fluoreszierender Farbstoff gekoppelt wurde, dann kann die
Expression dieser Moleküle durch die Messung der emittierten Lichtsignale nachgewiesen
werden.
Die folgende Abbildung bietet eine Zusammenfassung dieser Messparameter.
Informationen über:
Zellgröße (FSC)
Granularität (SSC)
Fluoreszenz (z.B. FITC)
D
FITC
539
SSC
90°
488
FSC
2°-16°
Abbildung 10: Der von der Zelle modifizierte Laserstrahl
wird mit den entsprechenden Detektoren
• FSC (Forward-Scatter Channel: Zellgröße) in
Laserstrahl in Vorwärtsrichtung,
• SSC (Side-Scatter Chanel: Zellgranularität) für
das im 90° Winkel durch die Zelle gestreute
Licht
• und einem Messkanal für die Fluoreszenz einer
bestimmten Wellenlänge (z.B. FITC-gekoppelter
Ak) gemessen.
60

SSC
tote
Zellen
Granulozyten
Mø
Lymphozyten
FSC
Abbildung 11:
Schematische Dot Plot-Darstellung der
FSC und SSC Charakteristika von Zellen
des peripheren Bluts.
Wenn man die Messwerte für die Intensität der FSC-Signale (X-Achse) und der SSC Signale (Y-
Achse) in einem sogenannten DOT-PLOT darstellt, kann man erkennen, dass aufgrund der
unterschiedlichen Morphologie Zellpopulationen des peripheren Blutes identifizierbar sind. Die
eher kleinen Lymphozyten mit wenig intrazellulären Granula geben weder im FSC noch im SSC
ein starkes Signal; Granulozyten dagegen geben, wegen ihrer reichlich vorhandenen Granulae,
ein starkes Signal im SSC ab.
Für die weitere Unterscheidung der Zellfraktionen reichen diese morphologischen Parameter
nicht aus; weswegen man hier unterschiedliche Fluorochrom-markierte Antikörper verwendet.
Diese Antikörper binden beispielweise an bestimmten Oberflächenmolekülen und durch
Kombinieren von mehreren mit unterschiedlichen Fluorochromen gekoppelten Antikörpern
können auch kleine Zell-Subpopulationen identifiziert werden.
61

Gebräuchliche Fluorochrome, welche häufig in Kombinationen zusammen verwendet werden,
sind in folgender Tabelle aufgeführt (FLUOROCHROM-AUSWAHL).
Fluorochrom Ex (nm) Em(nm) PMT Detektor
FITC (fluoresceinisothiocyanat) 495 519 530/30
CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) 495 519 530/30
PE (R-phycoerythrin) 480 578 575/26
pi (propidium iodid) 530 617 575/26, 695/40
PerCP (peridinin chlorophyllprotein) 490 670 695/40
APC (allophycocyanin) 650 660 660/20
Cy5 (Cyanine 5)
Cy5-bis-OSU, N,N'-biscarboxypentyl-5,5'disulfonatoindodicarbocyanine
488
FLUORESCENCE DETECTOR FILTER PASSBANDS
green FITC orange PE
red PerCP
530/30 575/26 695/40
530 580 630 660 n
650 670 660/20
Abbildung 12 :
Emissionskurven von FITC, PE und
PerCP sowie die Filter der PMTs für
die Detektion dieser Signale.
Die Emission der einzelnen Fluorochrome stellt eine Kurve dar (vgl. Abbildung 12). Daraus
resultiert, dass die Emissionssprektren der hier ausgewählten Fluorochrome FITC, PE und
PerCP überlappen, was in der praktischen Arbeit am FACS Komplikationen verursacht. Die
Detektoren messen die Lichtsignale innerhalb ihres festgelegten Wellenlängenbereiches
unabhängig vom Ursprung dieser Signale. Die unerwünschten Signale können während der
Messung vom Computer ´herausgerechnet´ werden, so dass dann in jedem Kanal nur noch
Signale eines einzelnen Fluorochromes angezeigt werden. Diese extrem fehleranfällige
Operation nennt man Kompensation. Eine korrekte Kompensation wird mit Kontrollproben der
zu analysierenden Zellen durchgeführt, die mit jeweils nur einem der für die Analyse
kombinierten Fluorochrom-gekoppelten Antikörper gefärbt wurden.
In der Diagnostik wird die FACS –Färbung z B. zur Bestimmung der Frequenz von CD4+
T-Helferzellen verwendet (s. Abbildung 9).
62

Abbildung 13: 30jähriger Patient mit bekannter HIV-Infektion, mit drastisch reduzierter CD4 positiver Th-
Zellpopulation
Im Praktikum werden die T-Lymphozyten in der Milz einer Maus mittels FACS-Färbung
charakterisiert.
Die Färbung erfolgt mit folgenden Antikörpern:
anti-CD3-PE (CD3=cluster of differentiation = Oberflächenprotein T-Lymphocyten)
anti-CD4-PacBlue (CD4 Oberflächenprotein charakteristisch für T-Helferzellen)
anti-CD8-Dy647 (CD8 Oberflächenprotein, cytoxische T-Lymphocyten)
Durchführung:
Oberflächenfärbung:
1 CD3-PE, CD4-PacBlue, CD8-D647
2 CD3-PE 1 :200
3 CD4-PacBlue 1:100
4 CD8-D647 1:100
5 ungefärbt
• Es werden 1x 10 6 Zellen pro Färbung eingesetzt
• Alle Schritte werden auf Eis, in relativer Dunkelheit durchgeführt
• 1ml PBA zu den Zellen geben, 5´@ 4°C bei 400xg zentrifugieren, Überstand abkippen
und Zellpellet resuspendieren (= Waschen)
• Blockieren der unspezifischen Bindungen: Zugabe von antiCD16/CD32 (2.4G2, 10
µg/ml) sowie aufgereinigtem Ratten-IgG (Jackson, 10 µg/ml ) zum resuspendierten
Zellpellet und 8min inkubieren
• zwischenzeitlich: Vorbereiten der Antikörper-Färbelösungen (Titer s. Tabelle)
• für die Oberflächenfärbung in die entsprechenden tubes anti-CD3-PE, anti-CD4-PacBlue
und anti-CD8-Dy-647 dazugeben und 10 min inkubieren
• Waschen mit PBA
• Zellen in 300µl PBA aufnehmen
• Die Proben können nun im FACS gemessen werden.
63

7.1.2.4 MACS® – Magnetic Cell Sorting
Zellpopulationen können unter geringem Zeitaufwand mit Hilfe des MACS ® (magnetic cell
sorting) Verfahrens aus gemischten Zellsuspensionen isoliert werden. Dafür werden
superparamagnetische Mikropartikel (ca. 50 nm Durchmesser) mit Antikörpern, welche für die
spezifische Zellpopulation charakteristische Oberflächenmoleküle erkennen, konjugiert (MACS-
Beads). Mit den Bead-Antikörpern werden die gewünschten Zellen markiert und auf eine
spezielle Trennsäule gegeben, die mit Stahlkügelchen gefüllt ist und zwischen den Magnetpolen
eines Hochleistungsmagneten eingehängt werden kann. Innerhalb des Magnetfeldes entsteht
ein Hochgradientenfeld, so dass die markierten Zellen in der Säule festgehalten werden,
während unmarkierte Zellen durch die Säule gespült und als negative Fraktion aufgefangen
werden können. Die markierten Zellen werden durch Elution von der Säule ´außerhalb´ des
Magnetfelds gewonnen.
Literatur:
Abbildung 14: Auftrennung von
zwei unterschiedlichen
Zellpopulationen mit Hilfe einer
MACS-Trennsäule. Solange sich die
Säule innerhalb des Magnetfeldes
befindet, werden die Beadsbeladenen
Zellen zurückgehalten.
Die nicht-markierten Zellen werden
aus der Säule gespült. Wird die
Säule aus dem Magnetfeld entfernt,
können auch die markierten Zellen
eluiert werden.
[1] Chatenoud, L. (2006) Immune therapie of autoimmune diseases: are we approaching a real cure? Curr
Op Immunol 18: 710-717
[2] Logtenberg, T. (2007) Antibody cocktails: next generation biopharmaceuticals with improved potency.
TREND in Biotechnology 25:9
[3] Melero, I. Et al. (2007) Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy. Nat Rev Cancer
7:95-106
[4] Nepom, G.T. (2002) Therapy of autoimmune diseases: clinical trials and new biologics. Curr Op
Immunol 14:812-815
[5] Mix, E. et al. (2006) Immunoglobulins-Basic considerations. J Neurol 253 [suppl S] V/9-V/17
[6] Carter, P.J. (2006) Potent antibody therapeutic by design. Curr Op Immunol 6:343-357
[7] Experimentator Immunologie
.
64

Thema 8 Test zur verhaltensbiologischen Charakterisierung
Dr. B. Günther
Service-Einheit Kleinnager, Forschungszentrum Lobeda,
Erlanger Allee 101
8.1 Wasserausstiegslerntest
8.1.1 Einführung
Dieser Lerntest wurde 1961 von Essmann und Jarvik beschrieben und stellt ein Beispiel für
operante Konditionierung dar. Lernexperimente zur operanten Konditionierung sind in der Regel
aufwendig und erfordern bei Nagern in Abhängigkeit von der Methode 10-100 Übungen, bis ein
Lernerfolg nachweisbar ist. Durch positive und negative Verstärkung läßt sich die Anzahl der
notwendigen Übungen verringern. Beim Wasserausstiegslerntest sind auf Grund der negativen
Bekräftigung durch den Aufenthalt im Wasser nur 3 Übungen notwendig, um einen Lernerfolg zu
zeigen. Dieser Test eignet sich zum Nachweis von Lern- und Gedächtnisschwächen und kann
bei verhaltensbiologischen Untersuchungen eingesetzt werden.
8.1.2 Aufgabe
Ermitteln Sie die Lernkurve für das Wasserausstiegsverhalten bei unbehandelten und
behandelten C57BL/6-Mäusen.
8.1.3 Materialien
� Makrolonkäfig Typ III (42 x 28 x 15cm – M3)
� Landungsrampe
� Thermometer
� auf 27 – 28°C temperiertes Wasser
� Handtuch
� digitale Stoppuhr
� Käfige zum Aufbewahren der Tiere
� Protokollblätter, Kugelschreiber
� C57BL/6-Mäuse (Böcke oder Weibchen) ca. 4 Wochen alt
� 96% iges Ethanol, unvergällt, Leitungswasser, sterile Spritzen und Schlundsonden
� Tierwaage
8.1.4 Methoden
Der Makrolonkäfig Typ III dient als Schwimmbecken und wird mit 27 – 28°C warmen Wasser
gefüllt. Die Wasserhöhe soll ca. 8 – 10cm betragen. In eine Käfigecke wird die Landungsrampe
im Winkel von 32 Grad eingehängt. Die Rampe soll ca. 0,5 – 1,0cm in das Wasser eintauchen.
Im Wasserausstiegstest wird die Schwimmzeit bzw. die Zeit bestimmt, die die Tiere benötigen,
um das Schwimmbecken zu verlassen.
65

8.1.5 Durchführung des Versuches
Die Versuchstiere werden am Praktikumstag vor Praktikumsbeginn mit Ethanol (1,69g/kgKM,
p.o., 3 x 15ml/kgKM, behandelte Gruppe) behandelt oder erhalten Leitungswasser (3 x
15ml/kgKM, p.o., Kontrollgruppe).
Für den Verhaltenstest wird ein Ohr-markiertes Versuchstier aus dem Käfig entnommen und
gegenüber der Rampe mit dem Kopf zur Käfigwand bzw. –ecke in das Schwimmbecken gesetzt
und die Zeit genommen, bis das Tier mit allen 4 Pfoten auf der Rampe steht.
Das Tier wird mit dem Handtuch abgetrocknet und in den Käfig zurück gesetzt. Analog wird mit
allen anderen Versuchstieren verfahren. Ist der 1. Testdurchgang beendet, wird im 10 minutigen
Abstand zum Tier 1 ein 2. und danach ein 3. Testdurchgang ebenfalls in 10 minutigen Abstand
mit allen Tieren durchgeführt.
Wenn alle Tiere im 1. Test getestet sind, wird im Abstand von 40 min zum 1. Tier des 1. Testes
ein 2. Test mit allen Tieren durchgeführt.
Es wird für diesem Test ein Schwimmzeitlimit von 60 sec. festgelegt. Erreicht ein Tier während
dieser Zeit nicht die Rampe, wird es aus dem Becken genommen und als „nicht geschafft“
geführt.
8.1.6 Protokoll
1. Test
Versuchstier-
Nr.
1. Durchgang 1
2
3
4
5
2. Durchgang 1
2
3
4
5
3. Durchgang 1
2
3
4
5
Schwimmzeiten
Gruppe C = Ethanoltiere
∑
x
∑
x
∑
x
Schwimmzeiten
Gruppe A = Kontolltiere
∑
x
∑
x
∑
x
66

2. Test
Versuchstier-
Nr.
1. Durchgang 1
2
3
4
5
2. Durchgang 1
2
3
4
5
3. Durchgang 1
2
3
4
5
Schwimmzeiten
Gruppe C = Ethanoltiere
∑
x
∑
x
∑
x
Schwimmzeiten
Gruppe A = Kontolltiere
8.1.7 Auswertung
1. Es werden der arithmetische (Ma) und der harmonische (Mh) Mittelwert berechnet.
M
a
x1
+ x2
+ ... + xn
=
n
n = Zahl der Versuchstiere
x = Beobachtungswert (Schwimm- bzw. Ausstiegszeit)
M
h
1
2
∑
x
∑
x
∑
x
n
=
1 1 1
+ + ... +
x x x
Für die Tiere, die das Kriterium Wasserausstieg innerhalb des Zeitlimits von 60 sec. nicht erfüllt
1
haben, wird die Schwimm- bzw. Ausstiegszeit x = ∞ gesetzt und es gilt = 0 .
∞
2. Es sind die Lernkurven der Mittelwerte der absoluten Schwimmzeiten für die unbehandelten
und behandelten Versuchsgruppen zu zeichnen und zu diskutieren.
3. Es ist der Anteil der Tiere pro Versuchsgruppe zu erfassen, die die Landungsrampe im
vorgegebenen Zeitlimit nicht erreicht haben.
4. Es ist zu prüfen, ob zwischen den absoluten Schwimmzeiten der unbehandelten und
behandelten Versuchsgruppe signifikante Unterschiede bestehen.
n
67

8.1.8 Fragen
1. Was versteht man unter Bioindikator?
2. Welche Rolle spielen Verhaltenstests bei der pharmakologischen und toxikologischen
Testung?
Hinweis: Bei Verhaltenstests ist auf absolute Ruhe zu achten!
68

8.2 open-field-Test
8.2.1 Einführung
Der open-field-Test wurde 1934 von C. S. Hall entwickelt, um anhand der Kot- und Harnabgabe
die Emotionalität bei Ratten in einer neuen Umgebung zu testen. Heute ist der open-field-Test
der bei verhaltenstoxikologischen Routineuntersuchungen am häufigsten benutzte Test. Er ist
technisch unkompliziert, einfach und schnell durchführbar und er ermöglicht Aussagen über
Verhaltensänderungen als Folge von Störungen der Motorik, der räumlichen Orientierung, des
stoffwechselbedingten Verhaltens, des Komfortverhaltens und des Erkundungsverhaltens. Mit
dem open-field wird das motorische Verhalten in seiner Komplexität als raum-zeitliches
Phänomen erfaßt.
8.2.2 Aufgabe
Prüfen Sie anhand des Verhaltens im open-field, ob Ethanol eine verhaltensändernde Wirkung
hervorruft.
8.2.3 Materialien
� open-field (55 x 27,5 x 21,5cm), mit auswechselbaren Laufflächen
� digitale Stoppuhr
� Käfige zum Aufbewahren der Tiere
� 2 Wischlappen (1 x feucht, 1 x trocken)
� Zellstoff zum Aufnehmen der Kotballen
� sterile Spritzen und Schlundsonden
� Protokollblätter, Kugelschreiber
� 2,5%ige Fesiamonlösung
� 96%iges Ethanol, unvergällt
� Tierwaage
� C57BL/6-Mäuse (Böcke oder Weibchen) ca. 4 Wochen alt
8.2.4 Methoden
Das open-field besteht aus einem rechteckigen Kunststoffkasten, der eine herausnehmbare
Bodenfläche besitzt. Die Bodenfläche ist in 6 x 8 Quadrate von 6,8 x 6,8cm Größe eingeteilt. Im
open-field werden 5 verschiedene Verhaltensparameter: - Ambulation
- freies Aufrichten
- Aufrichten mit Wandkontakt
- Putzen
- Defäkation
von 2 Mitarbeitern beobachtet und in Form einer Strichliste gezählt.
69

8.2.5 Durchführung des Versuches
Die Versuchstiere werden am Praktikumstag vor Praktikumsbeginn mit Ethanol (1,69g/kgKM,
p.o., 3 x 15ml/kgKM, behandelte Gruppe) behandelt oder erhalten Leitungswasser (3 x
15ml/kgKM, p.o., Kontrollgruppe).
Das open-field wird für den Verhaltenstest aufgestellt und vorbereitet, dabei ist insbesondere auf
eine gleichmäßige Ausleuchtung der Laufflächen zu achten. Zum Test wird ein Ohr-markiertes
Versuchstier aus dem Käfig entnommen und in eines der 4 im Zentrum des open-field
befindlichen Quadrate gesetzt. Die Testdauer beträgt 3 min.
Es werden die unter Punkt 10.2.6. aufgeführten Verhaltensparameter durch Beobachtung
registriert. Nach dem Abschluß des Tests wird das Tier herausgenommen und in den Käfig
zurück gesetzt. Nach jedem getesteten Tier wird die Lauffläche mit Fesiamonlösung abgewischt
und im Anschluß daran trocken gerieben.
Analog wird mit allen Tieren der unbehandelten und behandelten Versuchsgruppen verfahren.
Wenn alle Tiere im 1. Test getestet sind, wird im Abstand von 40 min zum 1. Tier des 1. Testes
ein 2. Testdurchgang mit allen Tieren durchgeführt.
8.2.6 Auswertung
1. Es sind die arithmetischen Mittelwerte der entsprechenden Verhaltensparameter für den 1.
und 2. Testdurchgang der unbehandelten und behandelten Versuchsgruppen zu berechnen.
2. Es ist zu prüfen, ob sich innerhalb einer Versuchsgruppe(behandelt oder unbehandelt) die
Verhaltensparameter des 1. Tests vom 2. Test signifikant unterscheiden.
3. Es ist weiterhin zu prüfen, ob sich die Verhaltenparameter des 1. und 2. Tests der
unbehandelten Tiere von denen der behandelten Tiere signifikant unterscheiden.
8.2.7 Fragen
1. Was versteht man unter klassischer Konditionierung?
2. Was bedeutet operante Konditionierung?
Hinweis: Bei Verhaltenstests ist auf absolute Ruhe zu achten!
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8.2.8 Protokoll
open-field
1. Test
Gruppe C = Ethanoltiere
Parameter-
Nr.
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x
1 FE Ambulation = Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)
2 FA Freies Aufri chten
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt
4 P
Putzen
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3
minutigen Testung erfaßt werden
Gruppe A = Kontrolltiere
Parameter-
Nr.
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x
1 FE Ambulation = Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)
2 FA Freies Aufri chten
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt
4 P
Putzen
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3
minutigen Testung erfaßt werden
Es empfiehlt sich, dass der Mitarbeiter, der die Ambulation bestimmt, auch die Zeit stoppt. Der 2. Mitarbeiter erfasst die Parameter 2-4 in einer
Strichliste, die Daten sind nach Testende in das Protokoll zu übernehmen. Die Defäkation wird am Ende des Tests bestimmt.
71

8.2.8. Protokoll
open-field
2. Test
Gruppe C = Ethanoltiere
Parameter-
Nr.
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x
1 FE Anbulation=Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)
2 FA Freies Aufri chten
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt
4 P
Putzen
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3
minutigen Testung erfaßt werden
Gruppe A = Kontrolltiere
Parameter-
Nr.
Abk. Bezeichnung Tier-Nr.1 Tier-Nr.2 Tier-Nr.3 Tier-Nr.4 Tier-Nr.5 x
1 FE Anbulation=Zahl der überlaufenen Felder (Quadrate)
2 FA Freies Aufri chten
3 WA Aufrichten mit Wandkontakt
4 P
Putzen
5 D Defäkation = Zahl der abgegebenen Kotballen, die zum Abschluß der 3
minutigen Testung erfaßt werden
Es empfiehlt sich, dass der Mitarbeiter, der die Ambulation bestimmt, auch die Zeit stoppt. Der 2. Mitarbeiter erfasst die Parameter 2-4 in einer
Strichliste, die Daten sind nach Testende in das Protokoll zu übernehmen. Die Defäkation wird am Ende des Tests bestimmt.
72

8.3 Chimney – Test
8.3.1 Einführung
Der Chimney – Test dient der Charakterisierung des Reflexes der negativen Geotaxis, der
neuromuskulären Koordination sowie der muskulären Aktivität. Dieser Test wurde 1960 von
Boissier als ein Test zum Screening der Wirkung von Psychopharmaka in Mäusen beschrieben.
8.3.2 Aufgabe
Ermitteln Sie die Kletterzeiten von unbehandelten und Ethanol– behandelten C57BL/6–Mäusen
im Chimney – Test.
8.3.3 Materialien
� Glasröhren von 30cm Länge (die eine Markierung bei 20cm aufweisen) mit unterschiedlichen
Durchmessern entsprechend der Größe der C57BL/6-Mäuse
� digitale Stoppuhr
� Käfige zur Aufbewahrung der Tiere
� Protokollblätter und Kugelschreiber
� Filterpapierbogen
� C57BL/6-Mäuse (Böcke oder Weibchen) im Alter von 4 Wochen
� 96%iges Ethanol, unvergällt, Leitungswasser, sterile Spritzen und Schlundsonden
� Tierwaage
8.3.4 Methoden
Die Glasröhren dienen als Kletterröhren („Schornstein“). Im Chimney - Test wird die Zeit
bestimmt, die die Tiere benötigen, um rückwärts aus der Glasröhre zu klettern.
8.3.5 Durchführung des Versuches
Die Versuchstiere werden am Praktikumstag vor Praktikumsbeginn mit Ethanol (1,69g/kgKM,
p.o., 3 x 15ml/kgKM, behandelte Gruppe) behandelt oder erhalten Leitungswasser (3 x
15ml/kgKM, p.o., Kontrollgruppe).
Geeignete Glasröhren werden entsprechend der Größe der zu verwendenden C57BL/6-Mäuse
ausgewählt und auf ein Filterpapierbogen gelegt. Die 20cm-Markierung soll sich dabei auf der
rechten Seite befinden. Eine Ohr-markierte Maus wird aus dem Käfig entnommen und mit dem
Kopf zuerst in die rechte Öffnung der Glasröhre gesetzt. Mittels eines Glasstabes wird das Tier
vorsichtig zum linken Rand der sich in waagerechter Position befindlichen Röhren geschoben.
Im Anschluß daran wird die Glasröhre schnell aufgerichtet, so daß sich das Tier mit dem Kopf
nach unten (die „Nasenspitze“ berührt den Boden) im unteren Teil der Röhre befindet. Das Tier
versucht nun, rückwärts aus der Röhre zu klettern. Es wird die „Kletterzeit“ vom Aufrichten der
Röhre bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Maus mit ihrer „Nasenspitze“ die Markierung erreicht
hat, bestimmt. Erreicht die Maus die Markierung innerhalb eines Kletterzeitlimits von 60 sec.
nicht, wird sie aus der Röhre genommen und als „nicht geschafft“ geführt analog dem WAT.
Sind alle Ethanol - behandelten und unbehandelten Tiere getestet worden, wird im 40 minutigen
Abstand zum 1. getesteten Tier ein 2. Test durchgeführt.
73

8.3.6 Protokoll
1. Test
Versuchstier-
Nr.
1
2
3
4
5
2. Test
Versuchstier-
Nr.
1
2
3
4
5
Kletterzeit in sec.
Gruppe C = Ethanoltiere
∑
x
Kletterzeit in sec.
Gruppe C = Ethanoltiere
∑
.x
8.3.7 Auswertung
Kletterzeit in sec.
Gruppe A = Kontolltiere
∑
x
Kletterzeit in sec.
Gruppe A = Kontolltiere
1. Analog dem Wasserausstiegstest sind die harmonischen und arithmetischen Mittelwerte der
Kletterzeiten der unbehandelten und Ethanol- behandelten Tiere für den 1. und 2. Test zu
berechnen.
2. Es ist zu prüfen, ob sich die Kletterzeiten der Ethanoltiere von denen der Kontrolltiere im 1.
und 2. Test unterscheiden.
3. Es ist des weiteren zu prüfen, ob sich die Kletterzeiten innerhalb einer Behandlungsgruppe
(Ethanoltier- oder Kontrolltiergruppe) im 1. und 2. Test unterscheiden.
∑
x
74

8.3.8 Fragen
1. Was versteht man unter negativer Geotaxis?
2. Was ist eine chemische Synapse?
Hinweis: Bei Verhaltenstests ist auf absolute Ruhe zu achten!
75