Versuch 3: Enzymologie

II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase
� 2011 Zentrum Biochemie
Enzymologie 3-18
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration
� die Laktatdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat mit Hilfe von
NADH, das dabei zu NAD + oxidiert wird
� NADH besitzt im Gegensatz zu NAD + ein zusätzliches Extinktions-Maximum bei λ= 340nm;
dadurch kann der Verbrauch von NADH photometrisch bestimmt werden
� Photometer auf �=340nm einstellen
� Photometer mit H2O nullen
� Lösungen in die bereitgestellten Reagenzgläser pipettieren und mit einem Plastikspatel gut
mischen! (Spatel zwischendurch abwischen)
Pipettierschema:
� Lösung Nr.1 in die Küvette pipettieren oder schütten und die Anfangsextinktion (E0) messen,
indem die Küvette mit der Lösung ins Photometer gestellt wird, der Wert abgelesen und in die
Tabelle 2.1 eingetragen wird
� nach 30 Sekunden erneut den Wert ablesen und eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit
im Photometer stehen)
Tabelle: 2.1
E(340nm)
Lösung
Zeit [s] 1 2 3 4 5
15
30
� bei konstanter Extinktion: 0,1ml LDH (Laktatdehydrogenase) direkt in die Lösung geben und
mit der Spitze umrühren
Reagenzglas-Nr. 1 2 3 4 5
Citrat-Puffer pH 6,0 [ml] 1,65 1,6 1,5 1,3 1,1
0,5mM Natrium-Pyruvat-Lösung [ml] 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6
1mM NADH [ml] 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
REAKTION STARTET JETZT! DIREKT ZEIT MESSEN!
� alle 15 sec in einem Zeitraum von 2 min die Extinktion ablesen und in Tabelle 2.2
eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit im Photometer stehen!)