Versuch 3: Enzymologie
Versuch 3: Enzymologie
Versuch 3: Enzymologie
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-18<br />
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration<br />
� die Laktatdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat mit Hilfe von<br />
NADH, das dabei zu NAD + oxidiert wird<br />
� NADH besitzt im Gegensatz zu NAD + ein zusätzliches Extinktions-Maximum bei λ= 340nm;<br />
dadurch kann der Verbrauch von NADH photometrisch bestimmt werden<br />
� Photometer auf �=340nm einstellen<br />
� Photometer mit H2O nullen<br />
� Lösungen in die bereitgestellten Reagenzgläser pipettieren und mit einem Plastikspatel gut<br />
mischen! (Spatel zwischendurch abwischen)<br />
Pipettierschema:<br />
� Lösung Nr.1 in die Küvette pipettieren oder schütten und die Anfangsextinktion (E0) messen,<br />
indem die Küvette mit der Lösung ins Photometer gestellt wird, der Wert abgelesen und in die<br />
Tabelle 2.1 eingetragen wird<br />
� nach 30 Sekunden erneut den Wert ablesen und eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit<br />
im Photometer stehen)<br />
Tabelle: 2.1<br />
E(340nm)<br />
Lösung<br />
Zeit [s] 1 2 3 4 5<br />
15<br />
30<br />
� bei konstanter Extinktion: 0,1ml LDH (Laktatdehydrogenase) direkt in die Lösung geben und<br />
mit der Spitze umrühren<br />
Reagenzglas-Nr. 1 2 3 4 5<br />
Citrat-Puffer pH 6,0 [ml] 1,65 1,6 1,5 1,3 1,1<br />
0,5mM Natrium-Pyruvat-Lösung [ml] 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6<br />
1mM NADH [ml] 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2<br />
REAKTION STARTET JETZT! DIREKT ZEIT MESSEN!<br />
� alle 15 sec in einem Zeitraum von 2 min die Extinktion ablesen und in Tabelle 2.2<br />
eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit im Photometer stehen!)