Versuch 3: Enzymologie
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Versuch 3: Enzymologie
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<strong>Versuch</strong>e:<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-1<br />
<strong>Versuch</strong> 3: <strong>Enzymologie</strong><br />
1. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase Aktivität<br />
- Acetylcholinesterase-Bestimmung im Serum<br />
- Hemmung des Enzyms mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)<br />
- Reaktivierung mit Pyridin-2-Aldoxim-Methyljodid (PAM)<br />
2. Enzymkinetik der Laktatdehydrogenase<br />
- Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration<br />
- Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration<br />
- Zeichnen des Michaelis Menten Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung<br />
- Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der ermittelten Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot<br />
und der Lineweaver-Burk-Darstellung<br />
Wissensgebiete<br />
Einteilung der Enzyme in Enzymklassen<br />
Aktivierungsenergie einer Reaktion<br />
Einfluss von Katalysatoren auf die Aktivierungsenergie<br />
Reaktionen 0. und 1. Ordnung<br />
Reaktionsgeschwindigkeit<br />
Enzymatische Reaktionen<br />
Enzymsubstrat-Komplex<br />
Substratspezifität<br />
Substrat- und Enzymkonzentrations-Diagramme<br />
Hemmsubstanzen, Mechanismus der Hemmung<br />
Kompetitive und nicht kompetitive Hemmung, Beispiele<br />
Quantitative Bestimmung der enzymatischen Aktivität<br />
Einheit der Enzymaktivität: Katal (neu), Units (alt)<br />
Lineweaver-Burk-Diagramme<br />
Km-Bestimmung<br />
Wechselzahl<br />
pH- und Temperatur-Einfluss auf enzymatische Reaktionen<br />
Isoenzyme<br />
Multienzym-Komplexe und multifunktionelle Enzyme<br />
Regulation der Enzymaktivität, Allosterie, negative Rückkopplung, Beispiele<br />
Neurotransmitter, Beispiele<br />
Acetylcholinesterase, Inhibitoren und Enthemmer<br />
Optische Eigenschaften sowie Coenzymfunktionen von NAD + , NADP + und FAD<br />
Optischer Test<br />
Kombinierter optischer Test (Kofaktor-gekoppelte Reaktion)
Einführung<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-2<br />
Bei reversiblen chemischen Reaktionen stellt sich ein Gleichgewicht ein. Im Gleichgewichtszustand ist<br />
die Geschwindigkeit von Hin- und Rückreaktion gleich schnell. Katalysatoren erhöhen nur die Geschwindigkeit<br />
der Reaktion und beschleunigen damit die Gleichgewichtseinstellung; sie beeinflussen<br />
aber nicht die Lage des Gleichgewichts. Enzyme sind in der Regel Proteine, die als Katalysatoren<br />
fungieren.<br />
Die International Union of Biochemistry and Molecular Biology hat 1961 und 1964 Regeln für die<br />
Nomenklatur der Enzyme aufgestellt. Die Enzyme werden in sechs Hauptklassen eingeteilt, die jeweils<br />
gleiche chemische Reaktionstypen katalysieren.<br />
1. Oxidoreduktasen<br />
übertragen Wasserstoff zwischen zwei Reaktionspartnern. Zu ihnen gehören die Dehydrogenasen,<br />
Hydroxylasen und Oxigenasen.<br />
2. Transferasen<br />
katalysieren die Übertragung von Atomgruppen oder ganzen Molekülen zwischen zwei<br />
Reaktionspartnern. Untergruppen dieser Klasse sind die "Kinasen": Carboxyl-Transferasen,<br />
Amino-Transferasen, Glycosyl-Transferasen und Acyl-Transferasen.<br />
3. Hydrolasen<br />
sind Ester-, Peptid- und Glycosylbindungen spaltenden Enzyme. Bekannte Enzyme wie Pepsin,<br />
Chymotrypsin, Trypsin, Renin und Papain gehören dazu.<br />
4. Lyasen<br />
katalysieren die nichthydrolytische Spaltung kovalenter Bindungen: Decarboxylasen, Aldolasen,<br />
Dehydratasen.<br />
5. Isomerasen<br />
epimerisieren ein optisch aktives C-Atom oder racemisieren optisch aktive Verbindungen.<br />
6. Ligasen<br />
führen zur Verknüpfung zweier Substratmoleküle unter gleichzeitiger Spaltung von ATP in<br />
AMP und Pyrophosphat. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind die Synthetasen, z.B. Aminoacyl-tRNS-Synthetasen,<br />
Acyl-CoA-Synthetasen oder auch die Carboxylasen.<br />
Die in Braunschweig angesiedelte Enzymdatenbank Brenda ist das zur Zeit ausführlichste<br />
Informationssystem für alle Aspekte der zur Zeit bekannten Enzyme.<br />
Die Enzymaktivität bestimmt man, indem Enzym und Substrat bei bestimmter Temperatur,<br />
bestimmtem pH-Wert, definierter Substrat- und Enzymkonzentration sowie in Gegenwart erforderlicher<br />
Kofaktoren inkubiert und die Reaktion in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Der Umsatz muss<br />
photometrisch zu verfolgen sein.
1) Reaktionen 1. Ordnung<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-3<br />
Bei einer Reaktion 1. Ordnung hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur von der Konzentration des<br />
Substrats ab. Das gängige Beispiel ist der radioaktive Zerfall. Welche Enzymreaktion ist eine Reaktion<br />
erster Ordnung?<br />
Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k einer Reaktion 1. Ordnung<br />
[1]<br />
[2]<br />
v = Reaktionsgeschwindigkeit<br />
k = Geschwindigkeitskonstante<br />
[S] = Substratkonzentration<br />
t = Zeit<br />
Wenn x die Substratmenge ist, die in der Zeit t umgesetzt wurde, und a die Substrat-<br />
Anfangskonzentration bei t = 0 ist, so gilt:<br />
[3]<br />
[4]<br />
[5]<br />
[6]<br />
Bei der Halbwertszeit t½ ist x = a/2. Daraus ergibt sich:<br />
[7]<br />
2) Reaktionen 2. Ordnung<br />
Die enzymatischen Reaktionen sind Reaktionen 2. Ordnung: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von<br />
Konzentrationen zweier Komponenten ab, der Substrat- und der Enzymkonszentration.<br />
[8]<br />
[E] = Enzymkonzentration (mg Protein)<br />
[S] = Substratkonzentration (µMol/l)<br />
Die Berechnung der Substratkonzentration in der Zeit t wird jedoch kompliziert.
[9]<br />
Man kann die Behandlung dieses Systems vereinfachen, indem man:<br />
1. Substrat im Überschuss einsetzt oder<br />
2. die Enzymkonzentration konstant hält.<br />
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<strong>Enzymologie</strong> 3-4<br />
1. Substratüberschuss: Die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional der Enzymkonzentration<br />
[10]<br />
[E] = Enzymkonz. (mg Protein)<br />
[S] = Substratkonz.n (µMol/l)<br />
Die Geschwindigkeit bleibt konstant. Man nutzt dieses Experiment, um die Wechselzahl eines Enzyms<br />
zu bestimmen. Bei einem Enzym mit nur einer Wirkgruppe entspricht die Wechselzahl der Anzahl<br />
Substratmolekülen, die pro Molekül Enzym in einer Minute umgesetzt werden (z.B.: Fumarase 10 5 ,<br />
Acetylcholinesterase 2 x 10 7 mol Substrat/mol Enzym x Min).<br />
2. Enzymkonz. konstant: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Substratkonz. ab<br />
Hält man die Enzymkonzentration [E] konstant und steigert die Substratkonzentration [S], so erhält<br />
man folgendes Bild:<br />
Abbildung 3-1: Reaktionsgeschwindigkeit bei konstanter Enzym- und variabler Substratkonzentration.<br />
Zu Beginn steigt die Geschwindigkeit linear mit steigender Substratskonzentration (I). Mit steigender<br />
Substratkonzentration wird ein Plateau erreicht (II), d.h. das Enzym ist mit Substrat gesättigt. Die<br />
maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist erreicht, und eine weitere Zugabe von Substrat bei konstanter<br />
Enzymkonzentration steigert die Umsatzgeschwindigkeit nicht mehr. Eine solche zweiphasige Kurve<br />
kann man erklären, wenn man eine Komplexbildung zwischen Enzym und Substrat (Enzym-Substrat-<br />
Komplex, ES) annimmt, bevor das Reaktionsprodukt gebildet wird. Die abnehmende Reaktionsgeschwindigkeit<br />
(III) erklärt man durch Substrathemmung: Zu viele Substratmoleküle vermindern die<br />
Effizienz der Enzym-Substrat-Wechselwirkung.<br />
In der Praxis sind die genannten Extremfälle jedoch selten anzutreffen.<br />
Die Nettogeschwindigkeit der Bildung von [ES] = die Nettogeschwindigkeit des Zerfalls von [ES], P ist<br />
das Reaktionsprodukt:
[11]<br />
[12]<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-5<br />
Die Einführung der Konstanten Km (der Michaelis-Konstanten), der maximalen Reaktionsgeschwindig-<br />
keit vmax und die Umformulierung nach vo ergibt:<br />
[13] y = a.x + b<br />
Abbildung 3-2: Der Lineweaver-Burk-Plot.<br />
Trägt man 1/vo als Ordinate gegen 1/[S] als Abszisse auf, resultiert eine Gerade (Lineweaver-Burk-<br />
Plot). Die Gerade schneidet die Ordinate bei 1/vmax, die Abszisse bei -1/km. Ihre Steigung ist km/vmax.<br />
Die reziproken Anfangsgeschwindigkeiten werden gegen die reziproken Substratkonzentrationen<br />
aufgetragen.<br />
Eine andere Darstellungsart der Gleichung erhält man, wenn man beide Seiten der Gleichung mit [S]<br />
multipliziert. Zeichnet man vo gegen [S] auf, so erhält man eine Hyperbel. Bei dieser Darstellungsart<br />
wird die Bedeutung von Km deutlich, die bei der Ableitung der Gleichung eingeführt wurde.<br />
Km ist demnach die Substratkonzentration, bei der vo = vmax / 2 ist.<br />
Abbildung 3-3: Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.
I. Acetylcholinesterase im Serum<br />
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<strong>Enzymologie</strong> 3-6<br />
Einführung:<br />
Synapsen sind spezialisierte Kontaktstellen für eine Kommunikation zwischen Neuronen oder<br />
zwischen Neuronen und z. B. einer Muskelzelle oder einer Drüsenzelle. Sie stellen auch die<br />
Verbindungen zwischen einem Umweltreiz und der Wahrnehmung im Hirn. Sie ermöglichen das<br />
Denken und die Kontrolle von Systemen des Körpers.<br />
Abbildung 3-5: Schema einer Synapse [Quelle: Wikipedia, modifiziert]<br />
Breitet sich die Erregung in Form eines Aktionspotenzials über ein Axon - kontinuierlich bei Myelinfreien<br />
und saltatorisch über myelinisierte Neuriten - bis hin zu den terminalen Synapsen aus, so wird<br />
dort eine chemische Transmitter-Substanz, z. B. Acetylcholin, aus synaptischen Vesikeln in den Synapsenspalt<br />
freigesetzt.<br />
Abbildung 3-6: Depolarisation der postsynaptischen Membran durch Acetylcholin<br />
Einführung:<br />
Der am längsten bekannte und am besten untersuchte Transmitter ist das Acetylcholin, andere sind<br />
die �-Aminobuttersäure und die Glutaminsäure. Der berühmte <strong>Versuch</strong> von Otto Loewi in 1921 bewies<br />
am perfundierten Froschherzen, dass bei Vagusreizung Acetylcholin an den Endigungen postganglionärer<br />
präsynaptischer Nervenfasern entsteht. Dale und Feldberg (1930) zeigten, dass Acetylcholin<br />
an vielen Synapsen des peripheren Nervensystems der Säuger entsteht. Auch an den motorischen<br />
Endplatten des Skelettmuskels wird Acetylcholin freigesetzt. Acetylcholin wird präsynaptisch in<br />
cholinergen Neuronen durch Cholin-Acetat-Transferase nach folgender Gleichung synthetisiert:<br />
CH3-CO~SCoA + HO-CH2-CH2-N + (CH3)3 � CH3-COO-CH2-CH2-N + (CH3)3 + CoASH
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<strong>Enzymologie</strong> 3-7<br />
Das Acetylcholin wird dann in Vesikeln gespeichert und bei Depolarisation der präsynaptischen Membran<br />
in "Quanten" in den Synapsenspalt ausgeschüttet. Nach Bindung an den Acetylcholinrezeptor<br />
der postsynaptischen Membran mit Öffnung der Natriumkanäle (Depolarisation) wird es durch die<br />
Cholinesterase hydrolysiert. Das Ruhepotenzial wird wieder aufgebaut.<br />
CH3-COO-CH2-CH2-N + (CH3)3 + H2O � CH3-COOH + HO-CH2-CH2-N + (CH3)3<br />
Das Enzym hat im aktiven Zentrum zwei charakteristische Wirkungszentren:<br />
1. die anionische Bindungsstelle, an die der quaternäre Stickstoff des Cholins bindet,<br />
2. die Esterase-Gruppe, die Elektronen auf den Acetatrest übertragen kann, wodurch ein<br />
acetyliertes Enzym entsteht, das anschließend hydrolysiert wird.<br />
Abbildung 3-7: Die enzymatische Spaltung von Acetylcholin zum Acetat und Cholin<br />
Acetylcholinesterase gehört, wie die Phosphatasen, zur Klasse der Hydrolasen. Man unterscheidet<br />
zwei Typen von Cholinesterasen. Wie aus der Tabelle hervorgeht, enthält vor allem Nervengewebe<br />
einen hohen Gehalt an echter Acetylcholinesterase. Die Rolle der Pseudocholinesterase dürfte im<br />
intermediären Stoffwechsel des Cholins und verwandter Verbindungen sowie in Entgiftungsvorgängen<br />
(Procain-Esterase, Aspirin-Esterase) zu suchen sein.<br />
Tabelle 3-4: Eigenschaften der Cholinesterase-Typen<br />
Kriterium Acetylcholinesterase<br />
Synonym<br />
Vorkommen<br />
pH-Optimum<br />
Spezifität<br />
(E C 3.1.1.7.) (E C 3.1.1.8)<br />
echte Cholinesterase<br />
Gehirn, Nerven, Erythrozyten, Schlangengifte<br />
7,8<br />
spaltet nur Ester der Essigsäure<br />
Enzym + DFP � gehemmtes Enzym<br />
Pseudo-Cholinesterase<br />
Leber, Pankreas, Blutserum<br />
8,5<br />
weiter Spezifitätsbereich
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<strong>Enzymologie</strong> 3-8<br />
Die Aktivität beider Cholinesterase-Typen kann durch spezifische Inhibitoren teilweise oder völlig gehemmt<br />
werden. Das Enzym mit Aktivitäten um 2000 U/l im Serum wird in der Leber synthetisiert. Daher<br />
sind bei schweren Lebererkrankungen die Werte im Serum erniedrigt. Pharmakologische und<br />
physiologische Studien haben zur Entwicklung vieler Enzym-Inhibitoren geführt, von denen einige<br />
sehr toxisch sind. Cholinesterasen werden von zahlreichen Insektiziden (z.B. E 605, p-Nitrophenyl-diethylester<br />
der Thiophosphorsäure) und von Physostigmin stark gehemmt. Praktische Bedeutung<br />
haben vor allem folgende Gruppen von Cholinesterase-Hemmern:<br />
a. Medikamente, die auf Grund einer gewissen Strukturanalogie die Acetylcholinspaltung kompetitiv<br />
hemmen. Dazu gehören die als Parasympathikomimetika verwendeten Pharmaka wie<br />
Prostigmin, Biotin, Eserin.<br />
b. Organische Phosphorsäure- oder Thiophosphorsäure-Ester, welche als Insektizide in der<br />
Landwirtschaft verbreitet Anwendung finden, z. B. Parathion. Ähnlich in Bau und Wirkung sind<br />
die in der experimentellen Forschung verwendeten Cholinesterase-Blocker DFP oder DIFP (=<br />
Diisopropylfluorophosphat). Es handelt sich dabei um äußerst gefährliche Nervengifte.<br />
c. Nervengifte vom Typ der Trilone, deren Verwendung als chemische Kampfstoffe (Sarin, Soman,<br />
Tabun) nach der Genfer-Konvention verboten sind.<br />
Enzym-DFP-Komplex + PAM � Reaktivierung des Enzyms<br />
Während die Wirkung von Stoffen der Gruppe a) auf einer reversiblen Veränderung beruht, kommt es<br />
bei denen der Gruppe b) zu einer festen Bindung des Blockers an das Serin des Enzymproteins. Die<br />
völlige Hemmung der Acetylcholinesterase im zentralen und peripheren Nervensystem durch solche<br />
"Blocker" führt zu einem stetigen Ansteigen der Acetylcholinkonzentration im Bereich der cholinergischen<br />
Synapsen und Nervenendigungen. Die Folge ist eine starke Parasympathikusreizung und<br />
eine Störung der neuromuskulären Reizübertragung. Der Tod infolge Atemlähmung kann innerhalb<br />
einer Stunde eintreten.<br />
Da Vergiftungsfälle durch Inhibitoren relativ häufig sind (Verwechslungen, Unachtsamkeit, Suizidversuche),<br />
sei kurz auf den biochemischen Aspekt von Diagnose und Therapie dieser Vergiftung<br />
eingegangen. Die Formel einiger Cholinesterase-Substrate und Inhibitoren sowie des Deblockers<br />
PAM werden hier aufgeführt.
DFP<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
Physostigmin-Eserin<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-9<br />
Die Diagnose hat in erster Linie auf Grund des allgemeinen klinischen Bildes und des Augenbefundes<br />
(kleine, stecknadelkopfgroße, reaktionslose Pupillen!) zu erfolgen. Als Ergänzung vermag auch die<br />
Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität des Serums im Schnelltest (Testpapierstreifen) wertvolle<br />
Hinweise zu geben. Bei der Behandlung derartiger Vergiftungsfälle sollen neben Atropin (in hoher<br />
Dosierung!) spezifisch auf den Cholinesterase-Inhibitor-Komplex einwirkende Substanzen wie Picolinhydroxansäure<br />
oder PAM (Pyridin-2-Aldoxim-Methojodid) verwendet werden. Der therapeutische Effekt<br />
von PAM beruht auf einer Befreiung des Enzyms vom anhaftenden Inhibitor.<br />
Auch zur Erkennung der nicht allzu seltenen Fälle von Dyscholinesterasämie leistet die Bestimmung<br />
der Cholinesterase-Aktivität im Serum wertvolle Dienste. Bei dieser genetisch determinierten Anomalie<br />
wird eine atypische Variante von Cholinesterase mit einem unterschiedlichen Spezifitätsbereich syn-<br />
PAM
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-10<br />
thetisiert. Die strukturanaloge Verbindung Succinyldicholin wird beispielsweise infolge einer etwa 100fach<br />
geringeren Affinität von dem atypischen Enzym kaum umgesetzt. Die Träger dieser Anomalie<br />
sind nicht in der Lage, Succinyldicholin zu spalten bzw. zu inaktivieren. Wird diese Substanz als Muskelrelaxans<br />
bei der Operationsvorbereitung injiziert, kommt es zu einem lebensbedrohenden Zustand<br />
(Apnoe). Die Untersuchung der Serum-Cholinesterase auf atypisches Verhalten gehört daher zu einer<br />
gewissenhaften Operationsvorbereitung, sofern die Verabreichung von Succinyldicholin beabsichtigt<br />
ist.<br />
Prinzip:<br />
Als Substrat dient Acetylthiocholinjodid und als Indikator für freigesetztes Thiocholin wird 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure<br />
verwendet, die zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert<br />
wird. Zur Bestimmung der Pseudocholinesteraseaktivität wird der Thiocholinester der Buttersäure<br />
verwendet.<br />
In alkalischem Medium vertieft sich die gelbe Farbe des 5-Mercapto-2-nitro-benzoesäure unter<br />
Bildung der chinoiden Verbindung:<br />
Abbildung 3-8:<br />
Bestimmung der Acetylcholinesterase-<br />
Aktivität<br />
1) Zeit-Umsatzkurve der Serum-<br />
Cholinesterase<br />
2) Hemmung mit DIFP<br />
3) Reaktivierung mit PAM
II. Laktatdehydrogenase<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-11<br />
Einführung:<br />
Die Laktatdehydrogenase (LDH) gehört zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen und kommt praktisch<br />
in allen Geweben vor. Hohe Aktivitäten lassen sich im Herzmuskel, in der Leber, im Skelettmuskel, in<br />
Erythrozyten und Thrombozyten nachweisen.<br />
Für LDH sind fünf Isoenzyme bekannt. Isoenzyme unterscheiden sich in ihren physikalischen<br />
Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Denaturierungstemperatur) wie auch in ihren<br />
katalytischen Eigenschaften (KM, pH-Optimum, Wechselzahl). Das LDH-Holoenzym ist aus vier<br />
Untereinheiten aufgebaut, die entweder dem Typ M (Muskeltyp) oder dem Typ H (Herztyp)<br />
entsprechen. Diese Untereinheiten werden durch nicht-kovalente Bindungen zusammengehalten. Die<br />
Kombination dieser beiden Untereinheiten zu einem Tetramer in unterschiedlicher Relation ergibt die<br />
fünf Isoenzyme: H4, H3M, H2M2, HM3 und M4, die auch als LDH 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet werden.<br />
Die Anteile der fünf LDH-Isoenzyme im Cytosol sind von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich,<br />
innerhalb eines Organs jedoch relativ konstant.<br />
� LDH 1 und 2: Herzmuskel, rote Blutkörperchen<br />
� LDH3: Lunge, Milz, Lymphknoten, Thrombozyten, Schilddrüse, Nebennierenrinde<br />
� LDH 4 und 5: Leber und Skelettmuskulatur<br />
Die Verteilung der LDH-Isoenzyme in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu deren O2-<br />
Versorgung auf. Das H4-Isoenzyme arbeitet relativ langsam und wird durch einen Überschuss an<br />
Pyruvat gehemmt. Das M4-Enzym hat dagegen eine wesentlich höhere Wechselzahl und wird kaum<br />
durch Pyruvat gehemmt.<br />
PDH<br />
Abbildung 3-8: Die metabolische Funktion der LDH.<br />
Die Zelle gewinnt viel mehr ATP durch die Verstoffwechselung des Pyruvats im Citronensäurezyklus<br />
als durch die Umsetzung zu Laktat. Dazu ist allerdings Sauerstoff nötig, um das produzierte NADH<br />
reoxidieren zu können und damit in der Atmungskettenphosphorylierung ATP zu synthetisieren. In<br />
einem aeroben Gewebe, wie im Herzen, steht Sauerstoff immer in genügenden Mengen zur<br />
Verfügung, so dass jede Umwandlung von Pyruvat zu Laktat, das heißt Abzug dieses Metaboliten vom<br />
10<br />
10
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-12<br />
Citronensäurezyklus, einen Energieverlust darstellen würde. Deshalb dominieren in diesem Gewebe<br />
die Isoenzyme H4 und H3M, deren Aktivität unter physiologischen Bedingungen durch Pyruvat<br />
gehemmt wird. Als Konsequenz wird Pyruvat nicht zu Laktat umgesetzt, sondern im<br />
Citronensäurezyklus verstoffwechselt.<br />
In anaeroben Geweben mit limitiertem Sauerstoffangebot, wie z.B. in kontrahierenden Skelettmuskeln,<br />
wird ATP unabhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff während der Umwandlung von Glucose in<br />
Pyruvat produziert. Wenn die ATP-Konzentration sinkt, steigt der Fluss der Glykolyse um ein<br />
vielfaches an, um die notwendige Menge ATP zu synthetisieren. Unter diesen Bedingungen muss<br />
NADH schnell in NAD + überführt werden, weil es sonst zum Stopp der Glykolyse kommen würde.<br />
NAD + kann aber durch die LDH-Reaktion schnell regeneriert werden. Deshalb herrscht in solchen<br />
anaeroben Geweben das Isoenzym M4 mit hoher Wechselzahl vor, dessen Aktivität Pyruvat nicht<br />
hemmt. Als Produkt der Reaktion akkumuliert Laktat, was schließlich im Cori-Zyklus der<br />
Gluconeogenese benutzt werden kann.<br />
Klinische Anwendung:<br />
Die im Serum messbare LDH-Aktivität stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen<br />
stammenden Isoenzyme dar. Deswegen kann aus einer einfachen Aktivitätsmessung nicht unbedingt<br />
auf die Organherkunft des Enyzms geschlossen werden. Da aber im Falle der LDH das Verhältnis der<br />
einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ unterschiedlich ist, spiegelt sich die Schädigung eines<br />
bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzymmuster im Serum wider. Eine solche<br />
Differenzierung der LDH-Isoenzyme nach Organen ist mit Elektrophorese möglich. Auf diese Weise<br />
lässt sich z.B. unterscheiden, ob eine Erhöhung der LDH-Aktivität im Serum auf eine Schädigung des<br />
Herzmuskels oder der Leberzelle zurückzuführen ist.<br />
Abbildung 3-9: Eiweiß-Elektrophorese der<br />
LDH-Isoenzyme aus menschlichen Seren
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-13<br />
Die LDH-Aktivität im Blut wird aus verschiedenen Gründen bestimmt:<br />
� Als Teil einer Routinelaboruntersuchung<br />
� Bei Gelbsucht (Ikterus)<br />
� Bei Lebererkrankungen<br />
� Verdacht auf Infektiöse Mononukleose (Pfeiffersches Drüsenfieber)<br />
� Verdacht auf Hämolyse (Zerfall von Erythrozyten)<br />
� Verdacht auf Blutarmut<br />
� Verlaufsbeurteilung maligner Erkrankungen (Krebs, Lymphdrüsen, Leukämien)<br />
(Referenzbereiche: Männer: 135-225 U/l Frauen: 135-215 U/l)<br />
Die Bestimmung der LDH zur Erkennung und Beobachtung von Herzerkrankungen und<br />
Muskelerkrankungen ist durch den Ersatz besserer Marker (z.B. Troponin, CK-MB) abgelöst worden.<br />
Stark erhöhte Werte der LDH-Aktivität finden sich bei Hämolyse, Vitamin B12/Folsäuremangel,<br />
Herzinfarkt, Lebererkrankungen und malignen Erkrankungen. Ebenso können körperliche Arbeit und<br />
Leistungssport zur Erhöhung führen.<br />
Prinzip:<br />
Die Pyridinnukleotide NAD + und NADP + können reversibel Wasserstoff aufnehmen. Ihre Funktion als<br />
Coenzym vieler Dehydrogenasen (Oxidoreduktasen) beruht auf dieser Fähigkeit. Bei der Hydrierung<br />
wird der aromatische Charakter des Nikotinsäureamid-Ringsystems aufgehoben. Das entstandene Dihydropyridin-Ringsystem<br />
besitzt eine spezifische Lichtabsorption mit einem Maximum von 340 nm, die<br />
bei NAD + fehlt. Man kann daher die Umwandlung von NAD + in NADH und umgekehrt mit dem<br />
Photometer messen.<br />
NAD+ NADH
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-14<br />
Abbildung 3-10: Absorptionsspektren von NADH und NAD + . Die Konzentration des gebildeten bzw.<br />
verbrauchten NADH oder die Konzentration der entsprechenden Reaktionspartner<br />
der Enzyme werden mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet.<br />
Pyruvat wird von Laktatdehydrogenase (LDH) in Gegenwart von NADH nach folgender Gleichung zu<br />
L + -Laktat reduziert.<br />
CH3-CO-COO - + NADH + H + � CH3-CH(OH)-COO - + NAD +<br />
Die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion ist bei 25 °C:<br />
K = [Laktat]/[Pyr] = 3,6 . 10 11 l/mol<br />
Pyruvat wird daher praktisch vollständig zu Laktat reduziert.<br />
Abbildung 3-11: NADH Verbrauch als indirekter Nachweis der Pyruvat-Umsetzung nach Zugabe der<br />
LDH
Durchführung der <strong>Versuch</strong>e<br />
I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität<br />
1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-15<br />
2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)<br />
3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)<br />
II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase<br />
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration<br />
2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration<br />
3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung<br />
4. Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der beiden Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot und<br />
der Lineweaver-Burk-Darstellung
I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität<br />
1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-16<br />
2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)<br />
3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)<br />
� die Acetylcholinesterase katalysiert die Umsetzung von Acetylthiocholinjodid zu Thiocholin<br />
� indirekter kolorimetrischer Nachweis von Thiocholin mit 5,5‘-Dithio-bis-(2-nitro-benzoesäure)<br />
als Indikator, welches zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert wird<br />
� Photometer auf λ= 405 nm einstellen<br />
� in vier beschriftete Küvetten werden folgende Lösungen pipettiert:<br />
Küvetten-Nr. 1<br />
Leerwert<br />
5,5‘-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure)<br />
Serum (enthält<br />
Acetylcholinesterase)<br />
2<br />
Aktivität<br />
3<br />
Hemmung<br />
� Photometer vor jeder Zeitmessreihe mit Küvette 1 (Leerwert) nullen!<br />
� nach 1, 3, 5, 10, 15, 20 min Extinktionen der Küvetten 2-4 im Photometer messen, indem die<br />
Küvette ins Photometer gestellt und der Wert abgelesen wird<br />
� Werte in die Tabelle 1.1 eintragen<br />
Achtung: DIFP ist hoch toxisch!!!!<br />
4<br />
Reaktivierung<br />
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml<br />
20 �l 20 �l 20 �l 20 �l<br />
DIFP (Hemmstoff) 50 �l - 50 �l 50 �l<br />
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 5 min warten, dann PAM in die<br />
angegebenen Küvetten geben !!<br />
PAM (Enthemmer) 50 �l - - 50 �l<br />
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 10 min warten, dann Substrat in<br />
die angegebenen Küvetten geben!!<br />
Acetylthiocholinjodid (Substrat) - 100 �l 100 �l 100 �l<br />
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen!<br />
Achtung Reaktion startet jetzt, da Substratzugabe!!!! Zeit nehmen!!
Tabelle: 1.1<br />
Zeit nach<br />
Substratzugabe<br />
1 min<br />
3 min<br />
5 min<br />
10 min<br />
15 min<br />
20 min<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
Werte für<br />
Aktivität<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-17<br />
Werte für<br />
Hemmung<br />
Werte für<br />
Reaktivierung<br />
a) Stellen Sie die Ergebnisse graphisch dar. (Extinktion gegen Zeit)<br />
b) Berechnen Sie die Acetylcholinesterase-Aktivität in der Einheit U/l im normalen,<br />
gehemmten und reaktivierten Zustand.<br />
c) Diskutieren Sie die Graphen für Aktivität, Hemmung und Reaktivierung. Was sind die<br />
Unterschiede? Welche Aussage kann man anhand der Ergebnisse machen ?<br />
Die Aktivität wird mit Hilfe von Steigungsdreiecken aus dem linearen Bereich der Kurven bestimmt, die<br />
Extinktionsveränderung der Kurve pro Minute (�E/�t) angegeben und mit Hilfe des Lambert-<br />
Beerschen Gesetz berechnet. Wichtig: Wählen Sie für alle drei Fälle (Normalzustand, gehemmter<br />
und reaktivierter Zustand) den gleichen Zeitraum (z.B. immer zwischen der 1. und 5. Minute).<br />
E=�*c*d<br />
∆E<br />
c/min [U/l] = x VF<br />
d * � * �t<br />
�E : aus Kurve ablesen [Steigung] oder aus Werten errechnen [E(405nm)5 min - E(405nm)1min]<br />
�t : aus Kurve ablesen [Steigung] oder aus Werten errechnen [5 min - 1min]<br />
d : 1 cm<br />
� : 13,3 * 10 3 [l/mol * cm]<br />
c/min : umgesetztes Substrat/min [mol/l * min]<br />
VF : Verdünnungsfaktor (Enzym) � s. Plastikküvette I (3120 �l : 20 �l = 156)<br />
Unit : 1 �mol Substratumsatzerhöhung / min [Vorsicht: mol in �mol umrechnen (x 10 6 )]
II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-18<br />
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration<br />
� die Laktatdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat mit Hilfe von<br />
NADH, das dabei zu NAD + oxidiert wird<br />
� NADH besitzt im Gegensatz zu NAD + ein zusätzliches Extinktions-Maximum bei λ= 340nm;<br />
dadurch kann der Verbrauch von NADH photometrisch bestimmt werden<br />
� Photometer auf �=340nm einstellen<br />
� Photometer mit H2O nullen<br />
� Lösungen in die bereitgestellten Reagenzgläser pipettieren und mit einem Plastikspatel gut<br />
mischen! (Spatel zwischendurch abwischen)<br />
Pipettierschema:<br />
� Lösung Nr.1 in die Küvette pipettieren oder schütten und die Anfangsextinktion (E0) messen,<br />
indem die Küvette mit der Lösung ins Photometer gestellt wird, der Wert abgelesen und in die<br />
Tabelle 2.1 eingetragen wird<br />
� nach 30 Sekunden erneut den Wert ablesen und eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit<br />
im Photometer stehen)<br />
Tabelle: 2.1<br />
E(340nm)<br />
Lösung<br />
Zeit [s] 1 2 3 4 5<br />
15<br />
30<br />
� bei konstanter Extinktion: 0,1ml LDH (Laktatdehydrogenase) direkt in die Lösung geben und<br />
mit der Spitze umrühren<br />
Reagenzglas-Nr. 1 2 3 4 5<br />
Citrat-Puffer pH 6,0 [ml] 1,65 1,6 1,5 1,3 1,1<br />
0,5mM Natrium-Pyruvat-Lösung [ml] 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6<br />
1mM NADH [ml] 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2<br />
REAKTION STARTET JETZT! DIREKT ZEIT MESSEN!<br />
� alle 15 sec in einem Zeitraum von 2 min die Extinktion ablesen und in Tabelle 2.2<br />
eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit im Photometer stehen!)
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-19<br />
� mit den Lösungen 2-5 gleichermaßen verfahren (vorher jedes Mal neu das Photometer mit<br />
H2O nullen)<br />
Tabelle 2.2<br />
E(340nm)<br />
Lösung<br />
Zeit [s] 1 2 3 4 5<br />
15<br />
30<br />
45<br />
60<br />
75<br />
90<br />
105<br />
120<br />
2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration<br />
a) Für jede Pyruvatkonzentration (Lösungen 1-5) einen Graphen zeichnen. (Extinktion gegen<br />
Zeit)<br />
b) Die Anfangsgeschwindigkeit (v0) mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetz für jeden<br />
Graphen ermitteln. Eine Beispielrechnung pro Substratkonzentration ist für das Protokoll<br />
ausreichend. Bitte machen Sie kenntlich, welche Extinktionswerte Sie für die Berechnung<br />
benutzt haben. Wichtig: verwenden Sie immer den gleichen Zeitraum.<br />
ΔE=�*�c*d<br />
�<br />
�E = Extinktionsabnahme<br />
�� = molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 340nm=6,2*10 3 (l*mol -1 *cm -1 )<br />
d = Schichtdicke, 1cm<br />
�c = Änderung der NADH-Konzentration<br />
Linearen Anfangsbereich der einzelnen Graphen ermitteln und die Extinktionsabnahme (�E) pro Zeit<br />
(�t), die in diesem Bereich liegt, berechnen. Daraus ergibt sich dann folgende<br />
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, v0,:<br />
�c �E �E [mol] �E * 0,16 [µmol]<br />
v0= = = =<br />
�t �*d*�t ( 6,2*10 3 *�t) [min* l ] �t [min * ml]
Tabelle 2.3<br />
Lösung<br />
Extinktionsabnahme<br />
pro Zeit ( ……… min)<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-20<br />
Anfangsgeschw.<br />
v0<br />
1/v0<br />
Substratkonz.<br />
[S]<br />
(in der Lösung) 1/[S]<br />
Nr. �E/�t �mol/(ml*min)� (ml*min)/�mol mmol/l l/mmol<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
Berechnung der Pyruvatkonzentration:<br />
Verdünnungsfaktor [1-5] =<br />
Pyruvatvolumen [ml]<br />
Gesamtvolumen [ml]<br />
Pyruvatkonzentration (1-5) [mmol/l] = Ausgangskonzentration [0,5mmol/l] * Verdünnungsfaktor [1-5]<br />
3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung<br />
a) Für den Michaelis-Menten-Plot werden die Anfangsgeschwindigkeiten (v0) gegen die<br />
Pyruvatkonzentrationen [S] aufgetragen und die Michaelis-Menten Konstante (KM), sowie die<br />
Maximalgeschwindigkeit der Reaktion, die bei Substratsättigung erreicht wird (vmax), ermittelt.<br />
b) Der Lineweaver-Burk Plot ist eine doppel-reziproke Darstellung von v0 und [S], also in Form von<br />
1/vo und 1/[S]. KM wird als x-Achsen Schnittpunkt im negativen Bereich (-1/KM ) und vmax als y-<br />
Achsen Schnittpunkt (1/ vmax) abgelesen und umgerechnet.<br />
4. Ermittelung von KM und vmax<br />
a) Vergleichen Sie die ermittelten Werte KM und vmax zwischen Michaelis Menten Plot und<br />
Lineweaver-Burk-Darstellung. Rechnen Sie gegebenenfalls die Werte in die erforderlichen<br />
Einheiten um und tragen Sie diese in die Tabelle 4 ein. Wenn sich KM und vmax voneinander<br />
unterscheiden, welchen Grund könnte das haben? Führen Sie hierfür die Vor-und Nachteile des<br />
jeweiligen Darstellungsverfahrens (Michaelis-Menten-Plot bzw. Lineweaver-Burk-Darstellung) an.<br />
Tabelle 4<br />
Michaelis-Menten-Plot<br />
Lineweaver-Burk-Darstellung<br />
KM<br />
[mol/l]<br />
Vmax<br />
[mmol / l * min ]
Übungsaufgaben<br />
� 2011 Zentrum Biochemie<br />
<strong>Enzymologie</strong> 3-21<br />
1. Eine reine Enzymlösung (100 µg Enzym/ml, MG 80.000) hat eine Aktivität von 50 U/ml. Wie groß<br />
ist die Wechselzahl?<br />
2. Hexokinase hat im Gehirn ein KM von 10 -5 mol/l und in der Leber ein Km von 10 -3 mol/l.<br />
a) In welchem der beiden Organe läuft bei ständig abnehmender Glc-Konzentration die Reaktion<br />
länger mit maximaler Geschwindigkeit ab?<br />
b) Wie groß muss die Glucose-Konzentration in mg/ml intrazellulärer Flüssigkeit in beiden<br />
Organen sein, damit die Reaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit abläuft ? (MG Glc = 180)<br />
3. Formulieren Sie die Reaktionsgleichung der<br />
a) Alkoholdehydrogenase (ADH) mit Coenzym.<br />
b) Die Reaktion zeigte mit verschiedenen Konzentrationen Äthanol [S] folgende<br />
Geschwindigkeiten:<br />
[Äthanol] mM Vo ( E340/5 min)<br />
0,75 0,094<br />
1,00 0,115<br />
1,50 0,148<br />
3,00 0,206<br />
12,00 0,293<br />
Ermitteln Sie graphisch KM für Äthanol und Vmax der ADH.<br />
c) Einen Umsatz von 0,356 105 µmol NADH/l min mg Protein errechnet man aus Vmax. 1 % der<br />
für die Messung verwendete Proteinfraktion war ADH. MG = 80.000. Berechnen Sie die<br />
Wechselzahl der ADH<br />
4. Eine Reaktion 1. Ordnung beginnt mit einer Anfangskonzentration des Substrates von 10 -5 mol/l.<br />
Sie ist eine Reaktion 1. Ordnung. Nach 6 Minuten ist die Hälfte des Substrates umgesetzt.<br />
a) Wie groß ist k;<br />
b) Wie groß ist die Konzentration nach 10 Minuten?<br />
5. In einer Isomerase Reaktion werden 2,5 mg Enzym vom Molekulargewicht 125.000 eingesetzt. KM<br />
wurde zu 3.10 -3 mol/l bestimmt und Vmax zu 275 µmol/Min.<br />
a) Wie groß ist die Wechselzahl?<br />
b) Berechnen Sie die Anfangsgeschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 7,5 mmol/l<br />
6. a) Für welche Reaktion wird Vitamin K als Cofaktor benötigt?<br />
b) Für welchen physiologischen Vorgang ist diese Reaktion von Bedeutung?<br />
7. a) Wie beinflusst ein erhöhter ADP-Gehalt die Umlaufgeschwindigkeit im Citratzyklus?<br />
b) Auf welche Enzyme des Citratzyklus wirkt ADP?<br />
8. a) Welches Organell der Zelle enthält vor allem Hydrolasen?<br />
b) Nennen Sie drei Stoffklassen, die dort hydrolysiert werden.<br />
9. Stellen Sie den Effekt, den ein Enzym auf die Aktivierungenergie einer Reaktion hat, in einer<br />
einfachen Graphik dar<br />
10. Wie beinflusst ein kompetitiver Inhibitor Vmax und KM einer enzymatischen Reaktion?<br />
11. a) Nennen Sie einen Inhibitor der Acetylcholinesterase, der eine kovalente Bindung mit dem<br />
Enzym eingeht.<br />
b) Nennen Sie die betroffene Aminosäure.