resolver

Molekulare und virale Determinanten bei HIV-assoziierten neurokognitiven 

Störungen 

Molecular and viral determinants of HIV-associated neurocognitive disorders 

Dissertation zur Erlangung des Grades 

eines Doktors der Naturwissenschaften 

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie 

der Ruhr-Universität Bochum 

Internationale Graduiertenschule Biowissenschaften 

Ruhr-Universität Bochum 

Neuroimmunologisches Labor des St. Josef Hospitals Bochum, 

Medizinische Fakultät der Ruhr Universität Bochum 

vorgelegt von 

Björn Ambrosius 

aus 

Unna 

Bochum 

Oktober 2016 

Referent: Prof. Dr. Andrew Chan 

Korreferent: Prof. Dr. Stefan Wiese

Für 

Ilse Ambrosius 

(09.10.1920 – 24.08.2013) 

1

Zusammenfassung 

HIV assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) sind bei HIV-infizierten Patienten eine 

häufige Komorbidität. Seit Einführung der kombinierten antiretroviralen Therapie (cART) 

hat sich das Bild von HAND phänotypisch gewandelt; so sind Patienten heutzutage eher 

von milderen Formen der Erkrankung betroffen. Die Prävalenz von HAND ist jedoch 

unverändert, obwohl durch die Behandlung mit cART eine suffiziente Suppression der 

Viruslast erreicht werden kann. Das deutet darauf hin, dass nicht die Replikation und die 

daraus resultierende Viruslast Ursachen für die fortschreitende Neurodegeneration bei 

HAND sind. Vielmehr geht man in der sogenannten „bystander hypothesis“ davon aus, 

dass hauptsächlich infizierte Monozyten das Virus in das zentrale Nervensystem (ZNS) 

tragen und dort in Kontakt mit Mikroglia, den residenten Immunzellen des ZNS, eine 

persistierende Immunreaktion auslösen, in deren Verlauf es zu Neurodegeneration kommt. 

In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte ein Zellkultursystem entwickelt werden, mit 

dessen Hilfe die Interaktionen von Mikroglia mit HIV-transduzierten monozytären Zellen 

untersucht werden können. 

In der vorliegenden Dissertation sollte das Zellkultursystem durch den Einsatz einer 

mikroglialen Zelllinie ergänzt werden. Als Grundlage einer vollständigen Aktivierung im Co- 

Kultursystem war die Anwesenheit von HIV-transduzierten monozytären Zellen 

unabdingbar. Die molekularen Vorgänge, die sich bei der Transduktion der monozytären 

Zellen mit HIV ereignen, sind allerdings bis heute wenig verstanden. Deshalb sollten diese 

anhand der Veränderungen im Proteom näher untersucht werden. Die Aktivierung in der 

Co-Kultur sollte schließlich mittels Teriflunomid und Monomethylfumarat, zweier 

verschiedener Pharmaka, reduziert werden, was anhand der Freisetzung von Chemokinen 

und Zytokinen beobachtet werden konnte und konsekutiv Neurotoxizität verhindern sollte. 

Das angesprochene Zellkulturmodell wurde in dieser Dissertation modifiziert, indem die 

mikrogliale Zelllinie HMC3 eingeführt wurde. Die Vorteile gegenüber der zuvor 

verwendeten primären embryonalen Mikroglia lagen hierbei in der besseren Verfügbarkeit 

der Zellen und einer homogeneren Zellantwort. In der Co-Kultur wurde eine spezifische 

Hochregulation der proinflammatorischen Zytokine CXCL10 (p < 0,001), CCL5 (p < 0,01), 

CCL2 (p < 0,001) und IL-6 (p < 0,001) bei Anwesenheit HIV transduzierter monozytärer 

Zellen deutlich. Ebenfalls konnte beobachtet werden, dass die Anwesenheit HIV 

transduzierter monozytärer Zellen eine stärkere Immunantwort in der Co-Kultur auslöste, 

verglichen mit einer Kultur aus HMC3 und viralen Partikeln ohne Anwesenheit monozytärer 

Zellen (CXCL10, CCL5 und CCL2: p < 0,001; IL-6: p < 0,01). Um die mit der mikroglialen 

Zelllinie gewonnenen Ergebnisse weiter zu validieren, wurden adulte Mikroglia ex vivo 

verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die Zelllinie und die adulte Mikroglia 

2

qualitativ ähnlich in Co-Kultur mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen 

verhielten. 

Weitergehend sollte der Effekt der HIV-Transduktion auf monozytäre Zellen untersucht 

werden. Hierfür wurde eine unmarkierte Proteomanalyse durchgeführt, bei der das 

Gesamt-Proteom transduzierter monozytärer Zellen und nicht-transduzierter monozytärer 

Zellen verglichen wurde. So konnten Unterschiede in der Expression der Proteine 

aufgezeigt werden. Dabei wurde deutlich, dass es durch eine Transduktion mit HIV-Vektor 

zu einer Hochregulation von Proteinen kam, die allgemeinen zellulären Veränderungen im 

Kontext von Erkrankungen zuzuordnen sind (FDR: 8,76 * 10 -4 ). Generell konnte eine 

besonders starke Hochregulation der Proteine Superoxid dismutase (Ratio: 3,24; p = 8,3 * 

10 -14 ) und Transgelin-2 (Ratio: 2,98; p = 3,7 * 10 -6 ) beobachtet werden. Diesen Proteinen 

standen herunterregulierte Kandidaten gegenüber, die den Signalwegen der DNA- 

Replikation (FDR (false discovery rate): 8,83 * 10 -4 ) und der Genexpression (FDR: 4,21 * 

10 -2 ) zugeordnet werden können und mehrheitlich ribosomalen Ursprungs waren. 

Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass es zwischen mikroglialen und monozytären Zellen 

nicht zu einer Ausbildung eines statischen Zell-Zellkontakts, als Voraussetzung für eine 

vollständige Aktivierung der Co-Kultur, kommen musste. 

Abschließend wurde im Rahmen dieser Dissertation gezeigt, dass die inflammatorischen 

Prozesse im Rahmen der modifizierten Co-Kultur durch die immunmodulatorischen Stoffe 

Teriflunomid und Monomethylfumarat abgeschwächt werden konnten, die in der 

Behandlung von multipler Sklerose eingesetzt werden. Eine geringere Sekretion 

proinflammatorischer Zytokine konnte durch die Behandlung mit 30 µM Teriflunomid 

(CXCL10, CCL2 und IL-6, p < 0,001) und 100 µM Monomethylfumarat (CXCL10, p < 0,001) 

beobachtet werden. Die mit Teriflunomid oder Monomethylfumarat behandelten 

Überstände lösten in einem Neurotoxizitätsmodell fötaler humaner Neurone 20% weniger 

Zelltod aus, als die Überstände unbehandelter HIV transduzierter Co-Kulturen (p < 0,05). 

Die erhobenen Daten helfen bei dem weiteren Verständnis der molekularen und 

proteomischen Vorgänge, die sich bei HAND ereignen. Anhand des etablierten und hier 

weiter modifizierten Zellkulturmodells wurde deutlich, dass durch die Gabe der Stoffe 

Teriflunomid und Monomethylfumarat sowohl die Sekretion von proinflammatorischen 

Zytokinen, als auch die aus den Überständen resultierende Neurotoxizität gesenkt werden 

konnte. Das spricht für die potentiell vielversprechende Möglichkeit, bei HIV-Patienten, 

zusätzlich zu cART, immunmodulatorische Substanzen zu verabreichen, um einen 

positiven Effekt im Kontext von HAND zu erzielen. 

3

Summary 

HIV associated neurocognitive disorders (HAND) are a common comorbidity in HIV positive 

patients. Since introduction of combined antiretroviral therapy (cART), the phenotypic picture 

of HAND changed. Although treatment with cART leads to effective suppression of the viral 

load, the prevalence of HAND remained stable, which argues for virus independent 

mechanisms responsible for neurodegeneration. It is commonly proposed and postulated in 

the bystander hypothesis that mainly HIV infected monocytes enter the central nervous system 

(CNS) and activate microglia, the resident immune cells of the CNS, which causes a persistent 

inflammation and consequently neurodegeneration. In previous studies of our group, we 

developed a cell-culture model, mimicking the interactions of microglia with HIV transduced 

monocytoid cells and resulting inflammatory processes. 

This thesis aimed at modifying the established co-culture model by introducing a microglial cell 

line. In experiments with the modified cell culture model, presence of HIV-transduced 

monocytoid cells was crucial for full co-culture activation. Because the molecular processes 

occurring during the infection of monocytoid cells by HIV are not well understood, those 

processes should be further investigated by detecting changes in the proteome of the cells. 

Finally, taking advantage of two different pharmacological compounds, namely teriflunomide 

and monomethylfumarate, the release of proinflammatory chemokines and cytokines by coculture 

was targeted with the aim to reduce neurotoxicity. 

The developed cell-culture model was further modified by introducing the human microglial cell 

line HMC3. This resulted in a better availability of cells and a more homogeneous cell response 

to HIV transduced cells compared to human embryonic microglia. HMC3 in contact with HIVvector 

transduced monocytoid cells showed a specific upregulation of the cytokines CXCL10 

(p < 0.001), CCL5 (p < 0.01), CCL2 (p < 0.001) and IL-6 (p < 0.001) compared to control 

conditions. Furthermore, HMC3 showed a significant higher secretion in co-culture of HIVvector 

transduced monocytoid cells (CXCL10, CCL5 and CCL2: p < 0.001; IL-6: p < 0.01) 

compared to HMC3 in contact with HIV-vector particles without monocytoid cells. To further 

validate these obtained results, experiments with ex vivo primary adult microglia were 

performed. These experiments revealed similar response of HMC3 and adult microglia in 

contact with HIV transduced monocytoid cells. 

Furthermore, effects of HIV transduction on monocytoid cells were examined by a label-free 

proteome approach, in which the expression of proteins in HIV-transduced and nontransduced 

monocytoid cells was compared. Here, transduction with HIV-vector leads to an 

upregulation of proteins mainly involved in disease associated pathways (FDR (false discovery 

rate): 8.76 * 10 -4 ). Highest expression was found for the proteins superoxide dismutase (ratio: 

4

3.24; p = 8.3 * 10 -14 ) and transgelin-2 (ratio: 2.98; p = 3.7 * 10 -6 ). In contrast, downregulated 

proteins were mainly associated with DNA-replication (FDR: 8.83 * 10 -4 ) and gene expression 

(FDR: 4.21 * 10 -2 ) and especially connected to ribosomal activity. In further experiments it could 

be demonstrated that direct cell-cell contact of microglia and monocytoid cells was not crucial 

for full activation. 

Finally, inflammatory processes in co-culture settings could be attenuated using 

immunomodulatory drugs known from multiple sclerosis treatment, teriflunomide and 

monomethylfumarate. Treatment of HIV transduced co-culture with either 30 µM teriflunomide 

or 100 µM monomethylfumarate caused a decreased secretion of CXCL10 (teriflunomide: p < 

0.001; monomethylfumarate: p < 0.001), CCL2 (teriflunomide: p < 0.001) and IL-6 

(teriflunomide: p < 0.001) compared to untreated HIV transduced co-culture. Supernatant of 

HIV transduced co-culture treated with different concentrations of teriflunomide or 

monomethylfumarate caused 20 % less neuronal cell death in a culture of human fetal neurons 

compared to untreated HIV transduced co-culture supernatants (p < 0.05). 

These data help to further understand molecular and proteomic mechanisms in HAND. 

Interaction of HIV-transduced monocytoid cells and microglial cells lead to inflammatory 

processes which are potentially neurotoxic. Treatment with either teriflunomide or 

monomethylfumarate ameliorates inflammatory processes and occurring neurotoxicity. This 

argues for a potential treatment option of these immunomodulatory drugs additionally to cART, 

to obtain beneficial effects in the context of HAND. 

5

Inhaltsverzeichnis 

ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................ 2 

SUMMARY ............................................................................................................................ 4 

INHALTSVERZEICHNIS ....................................................................................................... 6 

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS: ............................................................................................ 9 

TABELLENVERZEICHNIS ..................................................................................................12 

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................13 

1. EINLEITUNG ....................................................................................................................14 

1.1 DIE EPIDEMIOLOGISCHEN ABLÄUFE EINER HUMANEN IMMUNODEFIZIENZ VIRUS (HIV)- 

INFEKTION ..........................................................................................................................14 

1.2 DER EINFLUSS VON HIV AUF DIE GESELLSCHAFT ............................................................15 

1.3 HIV-ASSOZIIERTE NEUROKOGNITIVE STÖRUNGEN (HAND)..............................................15 

1.4 HIV IM ZNS: DIE MOLEKULAREN GRUNDLAGEN VON HAND .............................................17 

1.5 DER MOLEKULARE AUFBAU VON HIV ..............................................................................19 

1.6 PHARMAKOLOGISCHE HEMMUNG VON HIV UND DESSEN BEDEUTUNG IM ZNS ...................21 

1.7 EIGENE VORARBEITEN ZU HAND ...................................................................................23 

1.8 ZIELSETZUNG DER DISSERTATION ..................................................................................24 

2. MATERIAL .......................................................................................................................26 

2.1 ZELLKULTUR .................................................................................................................26 

2.1.1 Medien .................................................................................................................26 

2.1.2 Medien-Zusätze ....................................................................................................26 

2.1.3 Zellkultur-Reagenzien ...........................................................................................26 

2.1.4 Zellen ...................................................................................................................27 

2.2 CHEMIKALIEN ................................................................................................................27 

2.3 KITS .............................................................................................................................28 

2.4 ANTIKÖRPER / ENZYME / PROTEINE ................................................................................29 

2.5 PLASMIDE .....................................................................................................................29 

2.6 HERSTELLUNG HIV-VEKTOR ..........................................................................................31 

2.7 HERSTELLUNG HIV-LEER ..............................................................................................31 

2.8 PUFFERZUSAMMENSETZUNG .........................................................................................31 

2.9 LABORGERÄTE ..............................................................................................................32 

2.10 VERBRAUCHSMATERIALIEN ..........................................................................................33 

2.11 SOFTWARE .................................................................................................................35 

6

3. METHODEN .....................................................................................................................36 

3.1 ZELLEN ........................................................................................................................36 

3.1.1. Monozytäre Zelllinie U937 ...................................................................................36 

3.1.2 Primäre humane embryonale Mikroglia ................................................................36 

3.1.3 HMC3 – humane mikrogliale Zelllinie ....................................................................37 

3.1.4 Adulte Mikroglia ....................................................................................................37 

3.1.5 HEK293A und HEK293T Zellen ............................................................................38 

3.2 PRODUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON VIRALEN PARTIKELN ..................................39 

3.2.1 Präparation von Plasmiden ...................................................................................39 

3.2.2 Transfektion von 293T-Zellen zur Partikelproduktion ............................................40 

3.2.3 Transduktion von 293A-Zellen zur Bestimmung des infektiösen Titers .................41 

3.2.4 Molekulare Beschaffenheit der viralen Partikel: gag-Gehalt und RNA ...................42 

3.2.5 Transduktionseffizienz bei monozytären Zellen und erfolgreiche Integration der 

viralen RNA in das Zielzellen-Genom ............................................................................43 

3.3 UNTERSUCHUNG VON PROTEOM-VERÄNDERUNGEN IM KONTEXT EINER HIV-VEKTOR 

TRANSDUKTION BEI MONOZYTÄREN ZELLEN .........................................................................44 

3.4 ZYTOTOXIZITÄT DURCH TERIFLUNOMID UND MMF ...........................................................46 

3.4.1 Viabilität von monozytären Zellen bei Behandlung mit Teriflunomid oder MMF ....46 

3.4.2 Viabilität von Mikroglia und mikroglialen Zellen bei Behandlung mit Teriflunomid 

oder MMF ......................................................................................................................47 

3.5 CO-KULTUR VERSUCHE ................................................................................................47 

3.5.1 Anlegen einer Co-Kultur .......................................................................................47 

3.5.2 Anlegen einer Mono-Kultur ...................................................................................48 

3.5.3 Pharmakologische Modifikation im Kontext der Co-Kultur und Mono-Kultur ..........48 

3.5.4 Der Einfluss von Zell-Zellkontakt in der Co-Kultur .................................................48 

3.5.5 Cytokine-Bead-Array (CBA) zur Detektion der sezernierten Zytokine ...................48 

3.6 MODELLE ZUR ÜBERPRÜFUNG DES NEUROTOXISCHEN POTENTIALS DER CO-KULTUR 

ÜBERSTÄNDE .....................................................................................................................49 

3.6.1 Primäre kortikale Rattenneurone ..........................................................................49 

3.6.2 Fötale humane Neurone .......................................................................................50 

3.7 STATISTISCHE AUSWERTUNG DER VERSUCHE ................................................................51 

4. ERGEBNISSE ..................................................................................................................52 

4.1 CHARAKTERISIERUNG DER VIRALEN PARTIKEL ................................................................52 

4.1.1 p24 gag-Gehalt und RNA-Gehalt der eingesetzten viralen Partikel .......................52 

4.1.2 Erfolgreiche Transduktion von monozytären Zellen ..............................................53 

4.2 PROTEOMISCHE VERÄNDERUNGEN IN MONOZYTÄREN ZELLEN NACH TRANSDUKTION ........54 

7

4.3 EINFLUSS VON CO-KULTURÜBERSTÄNDEN AUS PRIMÄRER EMBRYONALER MIKROGLIA UND 

MONOZYTÄREN ZELLEN AUF KORTIKALE RATTENNEURONE ....................................................62 

4.4 SPEZIFISCHE AKTIVIERUNG VON HMC3 IN DER CO-KULTUR MIT HIV-VEKTOR 

TRANSDUZIERTEN MONOZYTÄREN ZELLEN ............................................................................63 

4.5 DER EINFLUSS VON TERIFLUNOMID UND MMF AUF HMC3 UND MONOZYTÄRE ZELLEN ......65 

4.6 DER ANTIINFLAMMATORISCHE EFFEKT VON TERIFLUNOMID UND MMF AUF DIE CO-KULTUR 

.........................................................................................................................................65 

4.7 DER ANTIINFLAMMATORISCHE EFFEKT VON TERIFLUNOMID UND MMF AUF DIE MONO- 

KULTUR VON HMC3 MIT HIV-VEKTOR PARTIKELN ................................................................66 

4.8 Der antiinflammatorische Einfluss von MMF auf HIV-Vektor transduzierte 

monozytäre Zellen .........................................................................................................68 

4.9 Der antiinflammatorische Effekt von MMF auf adulte Mikroglia in Co-Kultur mit HIV- 

Vektor transduzierten monozytären Zellen ....................................................................69 

4.10 Der Einfluss von direktem Zell-Zellkontakt in der Co-Kultur aus HMC3 und HIV- 

Vektor transduzierten monozytären Zellen ....................................................................70 

4.11 DER EINFLUSS VON CO-KULTURÜBERSTÄNDEN AUS HMC3 UND MONOZYTÄREN ZELLEN 

AUF DEN ZELLTOD VON FÖTALEN HUMANEN NEURONEN UND BEHANDLUNG MIT TERIFLUNOMID 

ODER MMF ........................................................................................................................71 

5. DISKUSSION ...................................................................................................................73 

5.1 DIE CO-KULTUR INTERAKTIONEN IM KONTEXT VON HAND ..............................................73 

5.2 MOLEKULARE ABLÄUFE IN MONOZYTÄREN DURCH EINE TRANSDUKTION MIT HIV-VEKTOR .77 

5.3 PHARMAKOLOGISCHE MANIPULATION DER ABLÄUFE BEI HAND .......................................80 

5.4 INDIKATOREN DER IMMUNAKTIVIERUNG IM KONTEXT VON HAND ......................................82 

5.5 FAZIT ...........................................................................................................................83 

6. LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................86 

7. DANKSAGUNG ............................................................................................................. 101 

8. LEBENSLAUF ............................................................................................................... 102 

9. PUBLIKATIONSLISTE .................................................................................................. 103 

10. EIGENSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG ......................................................................... 106 

8

Abkürzungsverzeichnis: 

7AAD = 7-Aminoactinomycin D 

AIDS = acquired immune deficiency syndrome 

ANOVA = analysis of variance 

ANPD = asymptomatisches, HIV-assoziiertes neuropsychologisches Defizit 

BHS = Blut-Hirn-Schranke 

BSA = Rinderserumalbumin 

cART = combined antiretroviral therapy 

CBA = cytokine bead array 

CCL2 = C-C motif ligand 2 = MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) 

CCL5 = C-C motif ligand 5 = RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed and 

secreted) 

CNS = central nervous system 

CXCL10 = C-X-C motif chemokine 10 = IP-10 (Interferone gamma induced protein 10) 

DNA = deoxyribonucleic acid 

DMEM = Dulbecco`s Modified Eagle Media 

DMSO = Dimethylsulfoxid 

DPBS = Dulbecco`s Phosphate-buffered Saline 

DPEC = Diethyldicarbonat 

E.coli = Escherichia coli 

EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure 

ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay 

FCS = fötales Kälberserum 

FDR = false discovery rate 

g = g-Kraft 

9

GFP = green fluorescent protein 

GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor 

h = Stunde 

HAD = HIV-assoziierte Demenz 

HAND = HIV assoziierte neurokognitive Störungen 

HCAR2 = hydroxycarboxylic acid receptor 2 

HEK = human embryonic kidney cells 

HEPES = 2-Ethansulfonsäure 

HIV = humanes immundefizienz Virus 

HIV + = HIV positiv 

HMC3 = human microglial cell line 3 

IL-6 = Interleukin-6 

LB = Lysogeny broth 

LTR = long terminal repeats 

MAP = Microtubuli assoziiertes Protein 

MEM = Minimal Essential Media 

min = Minute 

MMF = Monomethylfumarat 

MMP = Matrix-Metalloproteinase 

MNCD = HIV-assoziiertes, mildes neurokognitives Defizit 

MS = Massenspektrometrie 

NFκβ = nuclear factor kappa-light-chain-enhancer 

NfH = Neurofilament heavy chain 

NfL = Neurofilament light chain 

NMDA = N-Methyl-D-Aspartat 

Nrf2 = nuclear factor erythroid 2-related factor 2 

10

PBS = Phosphate-Buffered Saline 

PCR = poly chain reaction 

PDL = Poly-D-Lysin 

PEI = Polyethylenimin 

PenStrep = Penicillin/Streptomycin 

PFA = Paraformaldehyd 

PI = Propidiumiodid 

RIPA = radioimmunoprecipitation assay 

ROS = reactive oxygen species 

rpm = revolutions per minute 

RPMI = Roswell Park Memorial Institute Media 

RNA = ribonucleic acid 

rt = real-time 

SAMHD1 = sterile alpha motif and histidine acid domain-containing protein 1 

SDF = stromal cell-derived factor 

SDS = sodium dodecyl sulfate 

SIN = self-inactivation 

SIV = simian immunodeficiency virus 

SOC = Super optimal broth 

SOD = Superoxid Dismutase 

SV40 = simian vacuolating virus 40 

UHPLC = ultra-high-performance liquid chromatography 

ZNS = zentrales Nervensystem 

11

Tabellenverzeichnis 

Tabelle 1: Plasmide und eingesetzte Restriktionsenzyme ....................................................40 

Tabelle 2: In HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen hochregulierte Proteine 

gegenüber nicht-transduzierten monozytären Zellen ............................................................58 

Tabelle 3: In HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen herunterregulierte Proteine 

gegenüber nicht-transduzierten monozytären Zellen. ...........................................................59 

12

Abbildungsverzeichnis 

Abbildung 1: Diversität von HIV-1 .........................................................................................14 

Abbildung 2: Prävalenz von HAND bei HIV + Patienten .........................................................16 

Abbildung 3: Schematische Darstellung von HIV im ZNS .....................................................19 

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines HIV-Partikels. ...............................................20 

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Infektion einer Zelle durch HIV .........................22 

Abbildung 6: Schematische Übersicht Percoll-Gradient ........................................................38 

Abbildung 7: Übersicht HIV CS-CG Plasmid .........................................................................42 

Abbildung 8: Übersicht der Arbeitsschritte bei den Proteomversuchen .................................46 

Abbildung 9:: Charakterisierung der viralen Partikel .............................................................53 

Abbildung 10: Integrierte und revers transkribierte virale RNA im Erbgut monozytärer Zellen, 

sowie Genexpression dieser .................................................................................................54 

Abbildung 11: Proteomanalyse von transduzierten monozytären Zellen verglichen mit nichttransduzierten 

monozytären Zellen.......................................................................................57 

Abbildung 12: Untersuchung der durch Co-Kulturüberstände ausgelösten Neurotoxizität ....63 

Abbildung 13: HMC3 in Co-Kultur mit monozytären Zellen und in Mono-Kultur mit infektiösen 

Überständen .........................................................................................................................64 

Abbildung 14: Zytotoxischer Effekt von Teriflunomid und MMF auf monozytäre Zellen und 

HMC3 ...................................................................................................................................65 

Abbildung 15: Einfluss der pharmakologischen Substanzen Teriflunomid oder MMF auf die 

Co-Kultur von HMC3 mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen .............................66 

Abbildung 16: Sekretion von Zytokinen durch HMC3 nach Behandlung mit Teriflunomid oder 

MMF .....................................................................................................................................67 

Abbildung 17: Sekretion von Zytokinen durch monozytäre Zellen nach Behandlung mit MMF 

.............................................................................................................................................68 

Abbildung 18: Sekretion von Zytokinen in Co-Kultur von adulter Mikroglia mit HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen. ......................................................................................69 

Abbildung 19: Einfluss von direktem Zell-Zellkontakt in der Co-Kultur aus HMC3 und 

monozytären Zellen ..............................................................................................................69 

Abbildung 20: Einfluss von Co-Kulturüberständen auf fötale humane Neurone.. ..................71 

Abbildung 21: Modifizierte schematische Darstellung von HIV im ZNS unter Berücksichtigung 

der Ergebnisse dieser Dissertation .......................................................................................85 

13

1. Einleitung 

1.1 Die epidemiologischen Abläufe einer humanen immunodefizienz Virus 

(HIV)-Infektion 

Generell wird HIV in die Familie der Retroviren eingeordnet und weiter klassifiziert als Mitglied 

der Gattung der Lentiviren. Charakteristisch für Retroviren besitzt auch HIV eine hohe 

Diversität, weshalb HIV in die Subtypen HIV-1 (im Kontext dieser Dissertation als HIV 

bezeichnet) und HIV-2 unterteilt wird (Modrow et al., 2008). Das weltweit deutlich verbreitetere 

und virulentere HIV-1 (Kannangai et al., 2012) wird weiterhin in die Gruppen M, N, O und P 

unterteilt (Murphy et al., 2014) (Abbildung 1). 

Abbildung 1: Diversität von HIV-1 mit Unterteilung in Gruppen M (major), N (non-M, non-O) und O (outlier). P (= 

pending the identification of further human cases) nicht einordbar und deswegen nicht in dieser Grafik gezeigt. 

Grafik beruht auf Genom-Analysen von HIV-1 und stellt anhand der Äste die Nachbarschaftsverhältnisse der HIV- 

Gruppen dar. Modifiziert nach (Letvin, 2006). 

Die große Diversität von HIV ist zum einen auf die hohe Mutationsrate des Virus 

zurückzuführen (Michelini et al., 2016; Modrow et al., 2008), zum anderen aber auch auf 

mehrere unabhängige Ereignisse, bei denen HIV in Form von Zoonosen des „simian 

immunodeficiency virus“ (SIV) von Primaten auf den Menschen übergegangen ist (D'arc et al., 

2015; Liegeois et al., 2014). Die anschließende Verbreitung des Virus, gerade in der 

westlichen Welt, wurde nicht durch den „Patient zero“ genannten Indexpatienten 

hervorgerufen, sondern wahrscheinlich über die Achse Afrika, Haiti und anschließend USA 

(Cohen, 2016). Dabei verbreitet sich HIV über Körperflüssigkeiten in Abhängigkeit der darin 

enthaltenen Viruskonzentration (Sagar, 2010). 

14

1.2 Der Einfluss von HIV auf die Gesellschaft 

Im Jahr 2014 waren weltweit etwa 37 Millionen Menschen mit HIV infiziert, zwei Millionen 

Menschen haben sich mit dem Virus neu infiziert und 1,2 Millionen Menschen sind an „acquired 

immune deficiency syndrome“ (AIDS)-bezogenen Erkrankungen gestorben (UNAIDS, 2015). 

Alleine die nüchterne Aufzählung dieser Zahlen verdeutlicht auch heute noch die 

gesellschaftlichen Auswirkungen einer Infektion mit HIV, die bereits 1981 das erste Mal von 

Gottlieb et al. beschrieben wurde (Gottlieb et al., 1981). Vergleicht man die aktuellen Zahlen 

mit denen des Jahres 2011, ist ein deutlicher Rückgang der Neuinfektionsraten und der AIDSbezogenen 

Todesfälle zu beobachten (2011). Diese positive Entwicklung ist mit Sicherheit auf 

die enormen Fortschritte in der HIV-Forschung und auf die Weiterentwicklung der zu Beginn 

der 1990er Jahre eingeführten kombinierten antiretroviralen Therapie (cART), zurückzuführen 

(Darbyshire, 1995b), die die klinischen Auswirkungen von HIV grundlegend veränderte. Die 

bis dato lebensverkürzende Erkrankung, die oft mit fatalen opportunistischen Co-Infektionen 

und damit einhergehenden großen Konsequenzen für das Sozialleben der Patienten verknüpft 

war, wandelte sich zu einer behandelbaren chronischen Infektion, die mit einer nahezu 

normalen Lebenserwartung assoziiert ist (Fauci and Marston, 2015). Allein durch die 

Einführung von cART als Behandlungsform von HIV wurden die Todesfälle durch AIDS halbiert 

(Maschke et al., 2000). Das führt dazu, dass in der heutigen Zeit viele HIV-positive (HIV + ) 

Patienten ein hohes Alter erreichen können. Nicht auf das Altern limitiert, aber dadurch 

begünstigt, rücken HIV assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) immer weiter in den 

Fokus der Forschung (Cody and Vance, 2016b) und werden in dieser Dissertation untersucht. 

1.3 HIV-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) 

Bereits während der Anfänge der HIV / AIDS Epidemie in den 1980er Jahren wurden teilweise 

weitreichende neurologische Beeinträchtigungen bei HIV + Patienten beschrieben (Navia and 

Price, 1987). Klinisch boten Patienten, die unter der am meist verbreiteten Form von HAND, 

der HIV assoziierten Demenz (HAD) litten, ein demenzielles Syndrom, welches der Alzheimer 

Demenz ähnelt (Levine et al., 2013). Das Bild dieser Erkrankungen hat sich mit der Zeit und 

besonders durch die Einführung der cART drastisch verändert (Gelman, 2015). 

Nichtsdestotrotz beträgt die Prävalenz von HAND bei HIV + Patienten auch heute noch 

ungefähr 50% und scheint mit einer alternden HIV + Population noch weiter anzusteigen 

(Valcour et al., 2011; Heaton et al., 2010) (Abbildung 2). HAND wird von der deutschen 

Gesellschaft für Neurologie und Bezug nehmend auf die Empfehlung der „American Academy 

of Neurology“ in die beiden leichten Formen „asymptomatisches, HIV-assoziiertes 

neuropsychologisches Defizit“ (ANPD) und „HIV-assoziiertes, mildes neurokognitives Defizit“ 

15

(MNCD), sowie in die schwere Form „HIV-assoziierte Demenz“ (HAD) unterteilt (Diener, 2012; 

Antinori et al., 2007). 

Abbildung 2: Prävalenz von HAND bei HIV + Patienten vor der Einführung von cART (links) und nach der Einführung 

von cART (rechts). Vor cART war HAD (HIV-assoziierte Demenz) die am stärksten verbreitete Form von HAND, 

gefolgt von ANPD (asymptomatisches, HIV-assoziiertes neuropsychologisches Defizit) und MNCD (HIVassoziiertes, 

mildes neurokognitives Defizit). Durch die Behandlung der HIV + Patienten mit cART ist ANPD die am 

meisten verbreitete Unterform von HAND, gefolgt von MNCD und HAD. Gezeigt ist die relative Verteilung. 

Modifiziert nach (Saylor et al., 2016). 

Wie eingangs bereits erwähnt, hatte die Einführung der cART großen Einfluss auf die 

phänotypische Ausprägung von HAND. In der prä-cART Zeit entwickelten bis zu 20% der HIV + 

Patienten HAD, was diese zur prominentesten Unterform der HAND machte. Im Zeitalter der 

cART konnte die Prävalenz von HAD auf unter 5% gesenkt werden (Becker et al., 2015). An 

die Stelle der HAD treten nun Formen der ANPD und der MNCD, sodass die ANPD die HAD 

als prominenteste Unterform der HAND ablösen konnte und nun 70% der HAND-Fälle 

ausmacht (Heaton et al., 2010) (Abbildung 2). Das ist gerade im Hinblick auf den weiteren 

Verlauf der HAND interessant, da Patienten mit ANPD ein zwei- bis sechsfach erhöhtes Risiko 

haben, schwerere Formen der HAND zu entwickeln (Grant et al., 2014). Hierdurch besteht die 

Gefahr, dass sich zukünftig die klinische Ausprägung der HAND wieder verschlimmert (Saylor 

et al., 2016). 

Nach wie vor sind die Ursachen für HAND unbekannt. Die Tatsache, dass cART zwar das 

Erscheinungsbild, nicht aber die Prävalenz von HAND verändert hat, deutet darauf hin, dass 

nicht die Viruslast entscheidend für die Ausprägung der neurokognitiven Störungen ist, 

sondern dass es andere Ursachen geben muss. Hier ist ein mannigfaltiges Spektrum an 

potentiellen Co-Faktoren beschrieben und mit HAND assoziiert. Kardiovaskuläre 

Risikofaktoren wie Übergewicht, Diabetes und Tabakkonsum korrelieren mit HAND 

(McCutchan et al., 2012; Fabbiani et al., 2013). Im Zusammenhang mit den kardiovaskulären 

Risikofaktoren und unterstützt durch epidemiologische Daten wird deutlich, dass das Alter der 

HIV + Patienten die Ausprägung von HAND zu begünstigen scheint (Cody and Vance, 2016a; 

16

Valcour et al., 2004). Daneben sind auch sozioökonomische Faktoren, wie etwa der 

Bildungsstand der Erkrankten, mit HAND korreliert (Foca et al., 2016). Auf einer zellulären 

Ebene sind andere Faktoren mit HAND in Verbindung gebracht. So ist beispielsweise ein 

signifikanter Zusammenhang zwischen der Höhe des CD4-Zellen Nadirs und der CD4 / CD8 

Ratio mit der Schwere der neurokognitiven Störungen verknüpft (Grauer et al., 2015; Heaton 

et al., 2010). Die Aufzählung der möglichen Faktoren und die Beobachtung der komplexen 

molekularen Abläufe bei HAND lassen den Schluss zu, dass es sich bei um ein so 

bezeichnetes dynamisches Puzzle handelt, an dessen Ende die Neurodegeneration bei dem 

Patienten steht (Zayyad and Spudich, 2015). 

1.4 HIV im ZNS: Die molekularen Grundlagen von HAND 

HIV mRNA ist bereits acht Tage nach der Übertragung auf den Patienten im ZNS detektierbar. 

Zu diesem Zeitpunkt sind ebenfalls erste Anzeichen einer Aktivierung des Immunsystems 

assoziiert mit neuropathologischen Vorgängen sichtbar (Valcour et al., 2012). Der 

Übertragungsweg von HIV aus der Peripherie über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist nach wie 

vor nicht bekannt. Zum einen wird vermutet, dass bei einem indirekten Vorgang infizierte 

Monozyten und T-Zellen über die BHS migrieren und im ZNS das Virus freisetzen (Trojan- 

Horse-Mechanismus) (Liu et al., 2000). Durch die ausgelöste Entzündung werden durch 

Chemotaxis verstärkt Monozyten und T-Zellen ins das ZNS rekrutiert, die den Prozess 

verstärken (push-and-pull Mechanismus) (Kraft-Terry et al., 2010; Yadav and Collman, 2009). 

Zum anderen wird aber auch ein direkter Einfluss von HIV auf die BHS diskutiert, bei dem es 

zu einer erhöhten Durchlässigkeit kommt, was ein Einwandern von HIV ins ZNS begünstigt 

(Awan et al., 2014). Versuche mit Natalizumab, einem Integrin-Inhibitor der das Einwandern 

von Immunzellen in das ZNS verhindert, führten bei einer SIV-Infektion in Rhesusaffen zu 

reduzierten Mengen an SIV-DNA im ZNS. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Infektion 

des ZNS durch HIV hauptsächlich auf infizierten Immunzellen basiert (Campbell et al., 2014). 

Bis heute sind die genauen molekularen Abläufe einer ZNS-HIV-Infektion nicht bekannt. Fest 

steht, dass die Ursache der Neurodegeneration in der Apoptose von Neuronen zu finden ist 

(Adle-Biassette et al., 1995). Als Erklärung wird sich häufig der „bystander hypothesis“ bedient, 

in der postuliert ist, dass infizierte einwandernde Monozyten und T-Zellen durch Mikroglia als 

residente Immunzellen des ZNS, erkannt werden. Hierdurch tritt eine persistierende 

Aktivierung der Mikroglia auf, in deren Verlauf es zu Neurodegeneration kommt (Gonzalez- 

Scarano and Martin-Garcia, 2005) (Abbildung 3). Im Verlauf der Aktivierung kommt es zur 

Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie Zytokinen, Chemokinen und reaktiven 

Sauerstoffmetaboliten (Block et al., 2007). Speziell im Kontext von HAND werden auch eine 

Fehl-Regulation von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren, aber auch eine 

17

Überexpression von Glutamat und Arachidonsäure als Auslöser der Neurodegeneration 

diskutiert (Ru and Tang, 2016; Gill et al., 2015; Samikkannu et al., 2011). Etwa 10% der ZNS- 

Zellen sind Mikroglia, denen die Aufgabe der angeborenen Immunantwort zukommt und die 

teils sehr komplex und mit vielen Nuancen der Aktivierung auf Pathogene reagieren können 

(Ransohoff and Cardona, 2010; Crotti and Ransohoff, 2016). Bereits sehr frühe Daten aus der 

HAND-Forschung zeigen, dass Mikroglia als Hauptmediatoren der inflammatorischen 

Prozesse im ZNS gelten und an der Neurodegeneration federführend beteiligt sind (Adle- 

Biassette et al., 1999) (Abbildung 3). Dabei besteht nicht nur eine Kausalität zwischen 

mikroglialer Aktivierung und Neurodegeneration, sondern Mikroglia können ebenfalls von HIV 

produktiv infiziert werden (Gonzalez-Scarano and Martin-Garcia, 2005). Mikroglia besitzen 

eine sehr niedrige Austauschrate, weshalb sie sich als Reservoir von HIV anbieten (Perry and 

Teeling, 2013). 

Allerdings mehren sich die Daten, dass die Neurodegeneration bei HAND nicht alleinig von 

Mikroglia bestimmt wird. Astrozyten und Oligodendrozyten scheinen am Prozess von HAND 

zumindest beteiligt zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass virale Proteine auf 

Oligodendrozyten wirken und die Expression von NMDA-Rezeptoren verändern, sowie die 

Kalzium Homöostase stören, was zu Neurodegeneration führen kann (Zou et al., 2015). Bei 

Astrozyten scheint die Rolle bei HAND noch deutlich komplexer zu sein. Astrozyten sind der 

am häufigste vorkommende Zelltyp im ZNS und für die Aufrechterhaltung der Homöostase und 

der Versorgung der Neuronen zuständig (Allaman et al., 2011). Zwar kann HIV Astrozyten 

infizieren, jedoch handelt es sich dabei im Gegensatz zu Mikroglia um keine produktive 

Infektion (Gorry et al., 2003). HIV-DNA ist in 20% der Astrozyten zu finden, doch sorgt die 

Ausbildung von zellulären Restriktionsfaktoren wie SAMHD1 (sterile alpha motif and histidine 

acid domain-containing protein 1) dafür, dass sich das Virus in Astrozyten nicht reproduzieren 

kann (Churchill et al., 2009; Pilakka-Kanthikeel et al., 2015). Es konnte jedoch gezeigt werden, 

dass es im Umfeld von infizierten Astrozyten zu erhöhten Zahlen von apoptotischen 

unifizierten Zellen kommt (Eugenin and Berman, 2013). Ebenfalls zeigen Astrozyten in Kontakt 

mit HIV-Proteinen eine starke proinflammatorische Antwort (Tewari et al., 2015) (Abbildung 3). 

Beides deutet darauf hin, dass Astrozyten an den neurodegenerativen Prozessen bei HAND 

beteiligt sind. 

18

Abbildung 3: Schematische Darstellung von HIV im ZNS. Einwanderung von infizierten Monozyten oder direkter 

Transfer über die BHS (gelbe Pfeile). HIV kann sowohl Monozyten als auch Mikroglia und Astrozyten infizieren (lila 

Pfeile). Durch Kontakt sowohl mit HIV Partikeln, als auch mit infizierten Monozyten, schütten hauptsächlich 

Mikroglia aber auch Astrozyten vermehrt proinflammatorische Mediatoren aus (rote Pfeile). 

Die Eigenheiten der im ZNS vorkommenden Zellen und die umschließende BHS führen zu 

einer Kompartimentierung von HIV im ZNS. Es wird davon ausgegangen, dass eine 

niederschwellige aber kontinuierliche Virusproduktion im ZNS stattfindet (Strickland et al., 

2014). Anhand von Genomanalysen wurde deutlich, dass es zu einer genetischen 

Veränderung des Virus gegenüber dem in der Peripherie vorliegenden Virus kommt (Dahl et 

al., 2014). Die Abläufe von HIV im ZNS sind somit gesondert von den Abläufen in der 

Peripherie zu betrachten um die Hintergründe von HAND zu verstehen. 

1.5 Der molekulare Aufbau von HIV 

Das von HIV kodierte Erbgut liegt in Form eines einzelnen 9000 Basenpaar langen RNA- 

Stranges vor, der während des Infektionsprozesses durch Virus-eigene Enzyme in DNA 

umgeschrieben und in das Erbgut der Zielzelle integriert wird (Modrow et al., 2008). Dabei 

ähnelt die vorliegende RNA durch ihre Eigenschaften stark derer von Eukaryoten, da auch die 

HIV-RNA über eine CAP-Struktur am 5`-Ende verfügt und mit einer Polyadenylierung am 3`- 

Ende abgeschlossen wird (Cochrane et al., 2006). An den Enden der viralen RNA liegen die 

„long-terminal-repeats“ (LTR), bei denen es sich um eine hoch-konservierte Sequenz handelt, 

die Bindestellen für regulatorische Proteine enthält und wichtige Funktionen bei der reversen 

Transkription, Insertion und Translation besitzt (Modrow et al., 2008). Die virale RNA kodiert 

19

die sechs kleineren, hauptsächlich regulatorischen Genprodukte vif, vpr, vpu, rev, tat und nef, 

die im Falle von rev und tat aus komplexen Splicing-Prozessen entstehen (Strebel, 2013). 

Daneben beinhaltet die virale RNA die Informationen für drei große Genprodukte, die die 

kritischen Informationen für das Fortbestehen des Virus beinhalten. In Reihenfolge der 5`-3`- 

Leserichtung ist zuerst das gag-Gen lokalisiert, das sowohl Matrix-, Kapsid-, Nukleokapsidund 

Linker-Proteine kodiert. Diese organisieren den Aufbau und die Struktur des 

Viruspartikels. An das gag-Gen schließt sich das pol-Gen an. Beide Genprodukte hängen 

durch eine slippery site zusammen, die um das Stopkodon des gag-Gens lokalisiert ist. Das 

führt in ungefähr 5% der Transkriptionsprozesse dazu, dass eben dieses Stopkodon 

übersprungen wird, was zu einer Transkription des pol-Gens führt. Pol kodiert für die viralen 

Enzyme reverse Transkriptase, Integrase und Protease, die der Umschreibung der viralen 

RNA in DNA, sowie der anschließenden Integration der umgeschriebenen DNA in das 

Zielzellenerbgut und der Prozessierung der viralen Genprodukte und somit Reifung der 

infektiösen Partikel dienen (Modrow et al., 2008). Env beinhaltet die Informationen über die 

Proteine gp41 und gp120, die an der Membran der Virus-Partikel lokalisiert sind und der 

Infektion von Zielzellen dienen (Abbildung 4). Dabei bindet gp120 an den CD4-Rezeptor der 

Zielzelle, was zu einer Konformationsänderung von gp41 führt und eine Fusion des Virus mit 

der Zielzelle ermöglicht. Bei diesem Prozess bindet gp120 nicht allein an den CD4-Rezeptor, 

sondern benötigt noch einen weiteren Co-Rezeptor. Da gp120 fünf variable Domänen besitzt, 

kann dieser variieren, sodass es dem Virus möglich ist, sowohl monozytäre Zellen via CCR5 

Co-Rezeptor als auch T-Zellen via CXCR4 Co-Rezeptor zu infizieren (Modrow et al., 2008). 

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines HIV-Partikels mit zwei RNA-Kopien, Nukleokapsid, Kapsid und 

Oberflächenmolekülen. RNA-Aufbau im Detail mit LTR`s und viralen Genen. Die drei Hauptgenprodukte sind 

durch rote Kästchen hervorgehoben. Modifiziert nach (Delenda, 2004). 

20

Gerade die Variabilität im env-Gen ermöglicht es HIV, sich der aktuellen Umgebung 

anzupassen. So sind HI-Viren charakterisiert, die beispielsweise eine sehr viel niedrigere 

Expression von CD4-Rezeptoren benötigen oder Viren, die sowohl CCR5 als auch CXCR4- 

trop sind (Vazquez-Santiago and Rivera-Amill, 2015). Diese speziellen Ausprägungen der 

Oberflächenproteine entstehen meist dort, wo es einen hohen Selektionsdruck gibt oder im 

zentralen Nervensystem (ZNS), in dem eine Kompartimentierung vorliegt (Vazquez-Santiago 

and Rivera-Amill, 2015). 

1.6 Pharmakologische Hemmung von HIV und dessen Bedeutung im ZNS 

Zu cART zählt man Substanzen, die spezifisch die Infektion durch HIV stoppen, bzw. die 

Replikation des Virus verhindern können, indem Vorgänge auf molekularer Ebene inhibiert 

werden (Darbyshire, 1995a) (Abbildung 5). Hierzu zählen Eintrittsinhibitoren wie CCR5- 

Antagonisten, aber auch Hemmstoffe für die spezifischen HIV-Enzyme, wie nonnukleosidische 

und nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren, Integrase-Inhibitoren 

und Protease-Inhibitoren. Bei der Therapie von HIV wird meist eine Kombination aus den 

verschiedenen Wirkklassen verwendet. 

21

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Infektion einer Zelle mit HIV und die unterschiedliche 

pharmakologische Hemmung durch cART. Gezeigt wird der Prozess der Infektion: die Bindung des HIV-Partikel 

an die Zielzelle, die reverse Transkription der viralen RNA und die Integration der neu produzierten DNA in das 

Zielzellengenom mit anschließender Genexpression und Abschnürung neuer Partikel. Die Ansatzpunkte der in 

der cART verwendeten Substanzen sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet. In den blauen Kästen sind die 

unterschiedlichen Substanzgruppen der cART angegeben. Modifiziert nach (Murphy et al., 2014). 

Trotz des starken Effektes von cART auf die Viruslast kann HIV im ZNS nicht eradiziert werden 

(Eden et al., 2010). Zwar bleiben unter cART dreiviertel der Patienten neurokognitiv stabil 

(Sacktor et al., 2016), doch wurde beschrieben, dass es bei HIV im ZNS zu sogenannten 

„blipping“-Ereignissen kommt, bei denen die Viruslast kurzzeitig trotz cART stark ansteigt. 

Diese sind auf eine Veränderung der Stabilität der viralen Reservoirs zurückzuführen (Wang 

and Rong, 2014). Die wiederkehrenden Ereignisse können für die persistierende Entzündung 

im ZNS verantwortlich sein. Es konnte gezeigt werden, dass eben diese Entzündung und die 

dabei ausgeschütteten Chemokine, Zytokine und Sauerstoffradikale mit der fortschreitenden 

Neurodegeneration bei HAND in Verbindung stehen, im Gegensatz zu der Menge an viraler 

RNA (Airoldi et al., 2012b). 

Ebenfalls ist bis heute nicht abschließend geklärt, ob die Behandlung mit cART nicht aktiv 

einen Teil des neuen Phänotyps von HAND fördert. Es konnte nachgewiesen werden, dass 

Bestandteile der cART Neurotoxizität hervorrufen können (Robertson et al., 2012). Zur 

Bekämpfung von HIV gibt es keine Alternativen, sodass zur Behandlung von HAND das 

therapeutische Spektrum erweitert werden muss. Dabei werden bereits Medikamente mit antientzündlicher 

Wirkung als Co-Therapeutikum bei HAND untersucht. Aspirin und Ibuprofen, 

zwei bekannte nichtsteroidale Antiphlogistika, konnten bereits positive Effekte bei HAND in 

Mensch und Tier zeigen (O'Brien et al., 2013; Rodrigo et al., 2010). Daneben sind 

insbesonders immunmodulatorische Medikamente interessant. Beispielsweise zeigen 

Teriflunomid als aktiver Bestandteil von Leflunomid und Monomethylfumarat (MMF) als aktiver 

Bestandteil von Dimethylfumarat im Kontext der autoimmunen Erkrankung Multiple Sklerose 

sehr gute anti-entzündliche und schubreduzierende Ergebnisse (Miller et al., 2014; Miller et 

al., 2015). 

Für Teriflunomid konnte bereits ein anti-viraler Effekt anhand eines nicht-spezifischen 

Pyrimidin-Abbaus gezeigt werden (Bernhoff et al., 2010), wobei die genauen Mechanismen 

der Wirkung von Teriflunomid noch größtenteils unbekannt sind (Teschner et al., 2009). Durch 

die Behandlung mit Teriflunomid konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Sekretion des proinflammatorischen 

Zytokins IL-6 durch die ZNS-Zelllinie SY-SH5Y in Kontakt mit Enterovirus 

71 inhibiert wurde. Die Behandlung mit MMF ruft bei Monozyten und Mikroglia einen 

22

neuroprotektiven Effekt hervor, in dessen Verlauf es zu einer Hochregulation von antioxidativen 

Faktoren in den Zellen kommt (Linker et al., 2011). MMF wurde bereits im Kontext 

von HAND beschrieben. Dabei verringert es die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen 

in HIV-infizierten Monozyten (Gill et al., 2014). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass MMF 

die durch cART ausgelöste Neurotoxizität in Makaken und Ratten verringern kann (Akay et al., 

2014). 

1.7 Eigene Vorarbeiten zu HAND 

Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell entwickelt, mit dem die zellulären Abläufe bei HAND 

nachgebildet werden können (Faissner, Ambrosius et al., 2014). Embryonale Mikroglia wurde 

in Co-Kultur mit HIV-transduzierten monozytären Zellen gebracht und der Überstand wurde 

auf sezernierte Zytokine und Chemokine als Marker der Neuroinflammation untersucht. 

Anhand von HIV-basierten lentiviralen Partikeln konnte herausgefunden werden, dass virale 

Partikel mit der Zielzelle fusionieren müssen und in den Partikeln virale RNA enthalten sein 

muss, um eine vollständige Aktivierung der Co-Kultur hervorzurufen. Interessanterweise 

wurde beobachtet, dass lediglich die virale RNA für die LTRs von HIV kodieren muss, um bei 

der Transduktion von monozytären Zellen eine vollständige Aktivierung der Co-Kultur 

auszulösen und nicht das vollständige HIV-Genom vorliegen muss (Faissner, 2013; 

Ambrosius, 2012; Faissner, Ambrosius et al., 2014). Auch das Vorhandensein bzw. die 

pharmakologische Inhibition der viralen Enzyme und deren katalytische Tätigkeit waren für 

eine vollständige Aktivierung in der Co-Kultur nicht entscheidend (Ambrosius, 2012; Faissner, 

Ambrosius et al., 2014). Anhand des entwickelten Modells konnte gezeigt werden, dass es zu 

einer stärkeren Aktivierung in einer Co-Kultur von Mikroglia mit HIV-transduzierten 

monozytären Zellen kommt, verglichen mit einer Mono-Kultur aus Mikroglia in Kontakt mit 

viralen Partikeln oder in einer Mono-Kultur aus monozytären Zellen. Diese Ergebnisse 

unterstützen die im Kontext von HAND bekannte „bystander hypothesis“ (Ambrosius, 2012) 

und machen deutlich, dass den transduzierten monozytären Zellen eine „Verstärkerrolle“ im 

Rahmen der Co-Kultur-Aktivierung zukommt. Die im verwendeten Zellkulturmodell am 

deutlichsten sezernierten Chemokine und Zytokine CXCL10, CCL5, CCL2 und IL-6 ließen sich 

im Liquor von HIV + Patienten ohne kognitive Beeinträchtigung nachweisen und korrelierten mit 

dem Neurofilament heavy chain- (NFH) Protein, einem Marker für Neurodegeneration 

(Faissner, 2013; Ambrosius, 2012; Faissner, Ambrosius et al., 2014). Anhand des 

beschriebenen Modells konnte ebenfalls untersucht werden, dass auch Astrozyten spezifisch 

in einer Co-Kultur auf HIV-transduzierte monozytäre Zellen reagieren, jedoch nicht in einer 

solchen Qualität und Quantität, wie dies für Mikroglia gezeigt werden konnte (Ambrosius, 

2012). Diese Ergebnisse wurden im Rahmen einer Publikation mit geteilter Erst-Autorenschaft 

veröffentlicht (Faissner, Ambrosius et al., 2014). 

23

1.8 Zielsetzung der Dissertation 

Mit steigender Lebenserwartung und zunehmend höherem Lebensalter von HIV + Patienten 

rücken HAND mehr und mehr in den Fokus der Forschung, um den Patienten eine hohe 

Lebensqualität zu ermöglichen. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit, das Verständnis der 

molekularen Abläufe im Rahmen der ZNS-Infektion mit HIV zu verbessern. Diese Erkenntnisse 

sollen bei HIV + Patienten genutzt werden, um therapeutische Ansätze zu entwickeln, die die 

Neurodegeneration und damit das Auftreten von HAND minimieren. 

In der vorliegenden Arbeit sollen folgende Punkte erarbeitet werden: 

1) Modifizierung des Zellkultursystems, Einsatz einer mikroglialen Zelllinie: 

Da die molekularen Abläufe von HIV im ZNS schwer zu untersuchen sind und gerade 

die pharmakologische Modifikation von HAND nicht im Patienten untersucht werden 

kann, soll in dieser Arbeit das vorher entwickelte Zellkulturmodell weiterentwickelt 

werden. Neben dem Einsatz von primären humanen Zellen soll die Verwendung der 

mikroglialen Zelllinie HMC3 untersucht werden. Konkret soll das zuvor entwickelte 

Zellkulturmodell modifiziert werden und überprüft werden, ob sich die mikrogliale 

Zelllinie HMC3 im Kontext des oben genannten Modells verwenden lassen. Die 

Ergebnisse sollen anhand einer Co-Kultur aus primärer adulter Mikroglia mit HIV- 

Partikel transduzierten monozytären Zellen validiert werden. Abschließend soll 

untersucht werden, inwieweit direkter Zell-Zellkontakt zwischen Mikroglia und 

monozytären Zellen für eine Aktivierung notwendig ist. Im Rahmen einer betreuten 

Masterarbeit durch Frau Kirsten Schanzmann und durch eigene Arbeiten soll die 

funktionelle Relevanz der Co-Kulturüberstände anhand eines kortikalen 

Rattenneuronenmodels, beziehungsweise anhand eines fötalen humanen 

Neuronenmodels gezeigt werden. 

2) Unmarkierter Proteomansatz: 

Die Auswirkung der Transduktion mit einem HIV-Partikeln auf monozytäre Zellen ist 

weitgehend unbekannt. Um die Auswirkungen einer Transduktion mit einem lentiviralen 

minimalen HIV-Konstrukt besser zu verstehen, sollen transduzierte Monozyten in 

einem unmarkierten Proteom-Ansatz näher untersucht werden. Dabei sollen sowohl 

hoch- als auch herunterregulierte Proteine identifiziert werden um daraus das 

Verständnis der molekularen Abläufe im Rahmen der bystander hypothesis zu 

verbessern. 

24

3) Therapeutische Modulation: 

Das optimierte Zellkulturmodell soll eingesetzt werden, um den Einfluss der 

pharmakologischen Substanzen Teriflunomid und MMF auf mikrogliale/monozytäre 

Aktivierung zu untersuchen. Die funktionelle Relevanz der Manipulation der 

immunologischen Prozesse soll anhand eines Neurotoxizitätsmodells mit fötalen 

humanen Neuronen überprüft werden. 

Zusammenfassend soll die vorliegende Dissertation zum besseren Verständnis der 

molekularen Abläufe bei HAND beitragen, sowie mögliche therapeutische Optionen 

aufzeigen, die zukünftig für die Behandlung von HIV + Patienten im Kontext von HAND 

eingesetzt werden könnten. 

25

2. Material 

2.1 Zellkultur 

2.1.1 Medien 

Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM) 

Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM) 

high glucosis (HG) 

Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM) / 

F12 (50:50) 

Dulbecco`s Phosphate-Buffered Saline 

ohne Magnesium, ohne Kalzium (DPBS -/- ) 

Lysogeny broth Media (LB) 

Minimal-Essential Media (MEM) 

Neurobasal Media 

Phosphate-Buffered Saline (PBS) 

Roswell Park Memorial Institute Media 1640 

(RPMI 1640) 

Super optimal broth Media (SOC) 

Gibco, Invitrogen, Karlsruhe 




Carl Roth, Karlsruhe 





Invitrogen, Karlsruhe 

2.1.2 Medien-Zusätze 

Ampicillin 

B27 

Humaner Granulozyten- Monozyten Kolonie 

stimulierender Faktor (GM-CSF) 

Fötales Kälberserum (FCS) (endotoxinfrei) 

Glutamax 

L-Glutamin 

Penicillin / Streptomycin (PenStrep) 10.000 

U/ml 



PeproTech, Hamburg 

Sigma-Aldrich Chemie, München 




2.1.3 Zellkultur-Reagenzien 

0,05 % Trypsin in 1x EDTA Gibco, Invitrogen, Karlsruhe 

0,1 % Trypsin Gibco, Invitrogen, Karlsruhe 

0,5 % Trypsin in 1x EDTA Gibco, Invitrogen, Karlsruhe 

7-Aminoactinomycin D (7AAD) 

eBioscience, Frankfurt 

26

Accutase 

bisBenzimid H 33342 

DNase I (20.000 U) 

Dimethylsulfoxid (DMSO) 

Empigen 

Wasserstoffperoxid (H 2O 2) 

Monomethylfumarat 

Percoll 

Poly-D-Lysin (PDL) 

Polyethylenimin (PEI) 

Propidiumiodid (PI) 

Teriflunomid 

Träger DNS (Kalbsthymus) 

Triton X-100 

Tween-20 






J.T. Baker, Griesheim 

Biogen, Ismaning 




Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach 

Genzyme, Neu-Isenburg 




2.1.4 Zellen 

Escherichia Coli XL1-blue 

Human embryonic kidney cells (HEK) 293A 

Human embryonic kidney cells (HEK) 293T 

Humane adulte Mikroglia 

Humane embryonale Mikroglia 

Human microglial cell line 3 (HMC3) 

U937 

Agilent Technologies, Waldbronn 

ECACC, via Sigma-Aldrich Chemie, 

München 

ECACC, via Sigma-Aldrich Chemie, 

München 

PD Dr. von Lehe, Neurochirurgie, 

Knappschaftskrankenhaus Bochum 

Ethik-Antrag: Az.: 13-4821 

Clonexpress, Maryland, USA 

Zur Verfügung gestellt durch: 

Dr. Pocock, Department of 

Neuroinflammation, UCL, London (England) 


2.2 Chemikalien 

2-Ethansulfonsäure (HEPES) 

Agarose 

Bacillol 



VWR International, Darmstadt 

27

CSPD with Sapphire-II 

Chlorina 

DNA Leiter 1 kb 

DNA Leiter 100 bp 

Dinatriumhydrogenphosphat 

Ethanol 

Ethidiumbromid 

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 

Glucose 

Incidin 

Kaliumchlorid 

Kaliumhydrogenphosphat 

Ladepuffer (6x) 

Laminin 

Magermilchpulver 

Magnesiumchlorid 

Magnesiumsulfat 

Natriumchlorid 

Natriumhydrogencarbonat 

Natriumhydroxid 

Paraformaldehyd (PFA) 

Proteinaseinhibitor cOmplete 

Radioimmunoprecipitation assay (RIPA)- 

Puffer 

Rinderserumalbumin (BSA) 

Schaf-Serum 

Sucrose 

Tris-Acetat 

Tris-Trizma Base 


Lysoform, Berlin 





AppliChem, Darmstadt 



Ecolab, Düsseldorf 



New England Biolabs, Frankfurt a.M. 


Heirler, Radolfzell 







Roche, Basel (Schweiz) 

Thermo Fisher Scientific, Schwerte 




AppliChem, Darmstadt 


2.3 Kits 

Ambion Turbo-DNAse free kit 

Cytokine Bead Array (CBA) CXCL10, 

Position: B5 


BD Bioscience, Heidelberg 

28

Cytokine Bead Array (CBA) CCL5, Position: 

D4 

Cytokine Bead Array (CBA) CCL2, Position: 

D8 

Cytokine Bead Array (CBA) IL-6, Position: 

A7 

Gag p24 HIV-ELISA 

Human Soluble Protein Master Buffer Kit 

NucleoBond Xtra Maxi EF 

Qiagen Blood and Tissue Kit 

QIAamp Viral RNA Mini Kit 




Aalto Bioreagents, Dublin (Irland) 


Macherey-Nagel, Düren 

Qiagen, Hilden 

Qiagen, Hilden 

2.4 Antikörper / Enzyme / Proteine 

Age I 

Ava I 

BC 1071-AP 

D7320 

Nco I 

Rekombinantes HIV-p24 AG6054 

Xma I 








2.5 Plasmide 

Bezeichnung 

HIV CS-CG 

Beschreibung 

HIV CS-CG dient als Konstrukt eines 

minimalen HIV-Genoms, das einzig für die 

LTRs des HI-Virus kodiert. Dem 5`LTR 

wurde ein CMV Promotor vorgelagert. Das 

3`LTR wurde modifiziert, indem die 

Enhancer-Bindestelle deletiert wurde. 

Dadurch wurde ein self-inactivating (SIN)- 

LTR geschaffen, da bei der reversen 

Transkription und Integration die TATA-Box 

fehlt. Dies führt dazu, dass die viralen Gene 

nicht transkribiert werden können. Zwischen 

die LTR`s ist ein GFP-Gen mit 

29

HGP syn 

pcRev 

pcTat 

pHitG 

vorgelagertem CMV-Promotor inseriert 

(Miyoshi et al., 1998). 

HGP syn kodiert als kodonoptimiertes 

Plasmid für die HIV Gene gag und pol 

(Wagner et al., 2000). Gag kodiert für ein 

Vorläuferprotein, das später in die 

Matrixproteine, Kapsidproteine und 

Nukleokapsidproteine geschnitten wird. Pol, 

das über eine Poly-Uridin Sequenz an gag 

gebunden ist und nur in 5 % der Fälle 

transkribiert wird, kodiert für die viralen 

Enzyme reverse Transkriptase, Integrase 

und Protease (Modrow et al., 2008). 

pcRev kodiert für das regulatorische Protein 

rev, welches an das rev response Element 

der viralen RNA bindet und so einen 

ungespleißten und einfach gespleißten 

Export der RNA aus dem Zellkern 

ermöglicht (Strebel, 2003). Ebenfalls konnte 

gezeigt werden, dass pcRev eine um den 

Faktor 100 bis 1000 erhöhte Verpackung 

von genomischer RNA in die viralen Partikel 

ermöglicht (Ohs, 2010). 

pcTat kodiert für den viralen 

Transkriptionsfaktor tat, welcher bei HIV an 

die 5`LTR - Sequenz der integrierten DNA 

bindet und die Transkription verstärkt 

(Modrow et al., 2008; Debaisieux et al., 

2012). 

pHitG kodiert für das vesicular stomatitis 

virus glycoprotein (VSV-G), welches als 

Oberflächenmolekül auf den eingesetzten 

Partikeln fungiert und das HIV-typische 

gp120 und gp41 ersetzt. Durch VSV-G 

können deutlich höhere Transduktionsraten 

und höhere infektiöse Titer der Partikel 

erreicht werden (Burns et al., 1993). 

30

2.6 Herstellung HIV-Vektor 

Plasmid PEI-Transfektion CaCl 2-Transfektion 

HIV CS-CG 4 µg 5 µg 

HGP syn 2 µg 3 µg 

pcRev 1 µg 2 µg 

pcTat 1 µg 2 µg 

pHitG 2 µg 3 µg 

2.7 Herstellung HIV-leer 

Plasmid PEI-Transfektion CaCl 2-Transfektion 

HIV CS-CG 0 µg 0 µg 

HGP syn 2 µg 3 µg 

pcRev 1 µg 2 µg 

pcTat 1 µg 2 µg 

pHitG 2 µg 3 µg 

Träger DNA 4 µg 5 µg 

2.8 Pufferzusammensetzung 

CaCl 2-Transfektionsreagenz 29,4 g CaCl 2 

In 100 ml H 2O 

0,2 µM Filter 

steril-filtrieren 

2x HBS-Puffer (pH 7,1) 

0,25 M Hepes 

1,4 M NaCl 

10 mM Na 2HPO4 

steril-filtrieren 

PBS-Puffer (10-fach) 

25,6 g Na 2HPO 4 x 2 H 2O 

8,9 g NaH 2PO 4 x H 2O 

87,7 g NaCl 

in 1000 ml H 2O 

PBS-Puffer (1-fach) 

100 ml 10-fach PBS 

in 1000 ml H 2O 

PFA 4 % 

20 g PFA 

31

TAE-Puffer (50x) 

200 µl 10 mM NaOH 

50 ml PBS (10-fach) 

450 ml H 2O 

50 mM EDTA 

2 M Tris-Acetat 

H 2O 

2.9 Laborgeräte 

Bio-Photometer 

Eismaschine AF80 

ELISA-Lesegerät Tecan Spectra Classics 

FACS Canto II 

Kühl- und Eisschränke 

Gefrierschrank Liebherr comfort 

Gefrierschrank V.I.P. series ultra low 

Gefriertruhe Model 5820 

Kühlschrank Liebherr profi line 

H 2O-Bidest Gerät Millipore Progard 1 

Heizblock Bio TDB-100 Dry Block Heating 

Thermostat 

Magnetrührer RH basic 2 

Microplate Luminometer Orion 

Mikroskope 

Axiovert 25 

B3 Professional 

BX51 

CKX41 

IX51 

Mikrowelle M1001 

Neubauer Zählkammer 

Personal Computer Optiplex 960 

pH-Meter Vario pH plus 

Pipetten 

Multikanalpipette Research (300µl 

Hubvolumen) 

Accu-Jet Pro 

Eppendorf, Hamburg 

Scotsman, Illinois (USA) 

Tecan, Männedorf (Schweiz) 


Liebherr, Ochsenhausen 

Sanyo, München 


Liebherr, Ochsenhausen 

Merck Millipore, Darmstadt 

Biosan, Riega (Lettland) 

IKA, Staufen 

Berthold, Bad Wilbad 

Zeiss, Oberkochen 

Motic, Wetzlar 

Olympus, Hamburg 



Alaska, Viernheim 

Assistent, Erlangen 

Dell, Halle 

WTW, Weilheim 


Brand, Wertheim 

32

Research (1000 µl Hubvolumen) 

Research (200 µL Hubvolumen) 




Research (2,5 µl Hubvolumen) 

Schüttler 

Novotron 

MicroMix5 

3D05 Inkubator-Schüttler 

Vortex Genie 2 

Steril – und Sicherheitsbank Hera Safe 

Waagen: 

Elektronische Präzisionswaage Kern 572 

EMB 2200-0 Waage 

Feinwaage, BP1215 

Wärmeschrank Function line 

Wasserbad Typ 1008 

Wellwash 4 MK2 

Zentrifugen 

Biofuge fresco 

Biofuge pico 

Multifuge 3-S-R 

Multifuge X3R 

Sorvall Evolution RC 

Zellkulturschrank Hera Cell 







Infors HAT, Einsbach 

DPC Biermann, Bad Nauheim 

Ditabis AG, Pforzheim 

Scientific Industires, New York (USA) 

Heraeus Instruments, Hanau 

Kern & Sohn, Balingen-Frommern 

Kern & Sohn, Balingen-Frommern 

Sartorius, Göttingen 


GFL, Burgwedel 








2.10 Verbrauchsmaterialien 

Einmal-Handschuh 

Latex Gentle Skin Classic Powderfree 

Nitril 3000 Powderfree 

Flachboden – Vertiefungsplatten 

24-Loch Platte 

24-Loch NUNC Surface Platte 

96-Loch Platte 

96-Loch NUNC Surface Platte 

Meditrade, Kiefersfelden 

Meditrade, Kiefersfelden 

Sarstedt, Nümbrecht 




33

ELISA-Platten F96 Micro Well 

Dispensierspritzen CombiTips plus (0,5 ml; 

2,5 ml; 5 ml; 10 ml) 

Einwegspritzen (1 ml; 5 ml; 10 ml) 

Filtopur S (0,2 µM; 0,45 µM) 





Filtrier-Papier Trichter 

Mikro-Schraubröhrchen (0,5 ml; 1,5 ml, 2,5 

ml) 

Parafilm M 

Pasteurpipetten (7 ml) 

Petrischale (2 cm; 10 cm) 

Pipettenspitzen 

Filter – Pipettenspitzen (101 µl – 1000 µl) 



Filter – Pipettenspitzen (0,1 µl – 10 µl) 

Pipettenspitzen (101 µl – 1000 µl) 

Pipettenspitzen (20 µl – 300 µl) 

Reaktionsgefäße (0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml) 

Reaktionsröhre (15 ml; 50 ml) 

Röhre Durchflusszytometrie (5 ml) 

Serologische Pipetten 

Filter, steril, 25 ml 





Skalpell Cutfix 

Ultrazentrifugen-Röhrchen 

50 ml steril 

36 ml unsteril 

Wägeschale quadratisch 

Zellkulturflaschen 

25 cm 2 Primaria 

25 cm 2 TC 

Macherey-Nagel, Düren 


Pechiney Plastic Packaging, Illinois (USA) 



Sarstedt, Nümbrecht; Starlab, Ahrensburg 














B. Braun, Melsungen 

Herolab, Wiesloch 

Beranek Laborgeräte, Weinheim 

Brand, Wertheim 



34

75 cm 2 Primaria 

75 cm 2 TC 

150 cm 2 TC 

Zellsieb (70 µM; 100 µM) 





2.11 Software 

Cell^F 5.1 

Citavi 5.3 

Corel Draw X5 

Excel 365 

FACS DIVA 

FCAP Array 3.01 

Graph Pad Prism 6 

ImageJ 1.6 

Outlook 365 

Power Point 365 

Windows 10, Operating System 64 bit 

Word 365 

XRead Plus 

Olympus, Münster 

Swiss Academic Software, Wädenswill 

(Schweiz) 

Corel, München 

Microsoft, Unterschleißheim 


Soft Flow, Pècs (Ungarn) 

Graph Pad Software INC., La Jolla (USA) 

NIH, Bethesda (USA) 





Tecan, Männedorf (Schweiz) 

35

3. Methoden 

3.1 Zellen 

3.1.1. Monozytäre Zelllinie U937 

U937 wurden als monozytäre Zellen verwendet. Dabei handelt es sich um eine immortale 

Zelllinie mit monozytären Eigenschaften, die aus einem Lymphom eines männlichen Patienten 

gewonnen und erstmals 1976 beschrieben wurde (Sundstrom and Nilsson, 1976). U937 (von 

nun an benannt als monozytäre Zellen) wurden bereits im Kontext von HIV-Studien zur 

Transduktion mit lentiviralen Partikeln verwendet (Sen et al., 2016). Die Zellen wurden von 

Sigma-Aldrich bezogen und in RPMI mit 10 % fötalem Kälberserum (fetal calf serum, FCS), 

100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin (PenStrep) angezogen. Nach jeweils drei 

Tagen bei 37° C und 5% CO 2 wurden die Zellen passagiert, indem 3 ml der Zellsuspension in 

eine neue T75-Zellkulturflasche überführt wurde und diese mit dem oben beschriebenen 

Medium auf ein Volumen von 20 ml aufgefüllt wurde. 

3.1.2 Primäre humane embryonale Mikroglia 

Zur Etablierung des Zellkulturmodells wurde primäre embryonale Mikroglia in verwendet. Die 

Mikroglia wurde von Clonexpress INC. bezogen und dort zuvor aus 14-16 Wochen alten Föten 

gewonnen. Von der Firma wurde eine Reinheit von mindestens 96 % und eine Abstinenz von 

Humanpathogenen wie HIV oder Hepatitis garantiert. Die Zellen wurden gefroren geliefert und 

im Labor in 20 ml DMEM + 5 % FCS + 100 U/ml PenStrep gelöst. Danach wurde die 

Zellsuspension zwei Mal bei 400 g für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das 

Pellet in 10 ml frischem Medium resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation und Verwurf des 

Überstandes wurde das Pellet in DMEM angereichert mit 5 % FCS, 100 U/ml PenStrep und 

10 ng/ml GM-CSF (Granulozyten-Monozyten-Kolonie stimulierender Faktor) gelöst und die 

Zellen in T75-Primaria-Zellkulturflaschen ausgesät. Das Medium wurde alle vier Tage ersetzt. 

Bei Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen mit DPBS -/- (Dulbecco`s 

Phosphate-Buffered Saline ohne Kalzium und Magnesium) gewaschen und anschließend für 

10 min mit 0,05 % Trypsin und EDTA bei 37°C inkubiert, um die sehr adhärenten Zellen 

abzulösen. Das Trypsin wurde durch Gabe von 10 ml DMEM mit 5 % FCS und 100 U/ml 

PenStrep gehemmt und die gelösten Zellen 5 min bei 400 g zentrifugiert. Anschließend wurden 

die Zellen im Verhältnis von 1:2 in neuen T75-Zellkulturflaschen ausgesät. Bei Verwendung 

der primären embryonalen Mikroglia in Co-Kultur-Versuchen wurden 200 µl der Zellsuspension 

(100.000 Zellen/ml) in eine Vertiefung einer Primaria 96-Loch-Platte pipettiert um eine 

Konzentration von 20.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten. Die embryonalen Zellen wurden zwei 

Tage in der 96-Loch-Platte bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert, bevor die monozytären Zellen im 

Rahmen der Co-Kultur hinzugegeben wurden. 

36

3.1.3 HMC3 – humane mikrogliale Zelllinie 

HMC3 (human microglia cell line 3) ist eine mikrogliale Zelllinie, die durch Transfektion von 

humanen embryonalen Gehirn-Makrophagen mit dem T-Antigen des SV40 (Simian 

Vacuolating Virus 40) hervorgegangen ist. Die Zellen bilden mikrogliale und makrophagen 

spezifische Oberflächenmoleküle aus (Janabi et al., 1995). HMC3 reagieren auf Pathogene 

mit einer ausgeprägten Sekretion von Zytokinen und Chemokinen (Etemad et al., 2012). 

Daneben konnte bereits gezeigt werden, dass HMC3 spezifisch auf HIV-Proteine mit einer 

Hochregulation von reaktiven Sauerstoffmetaboliten reagiert (Jadhav et al., 2014). Zur 

Anzucht der Zellen wurden diese in Minimal Essential Medium (MEM), angereichert mit 10 % 

FCS und 100 U/ml PenStrep bei 37° C und 5 % CO 2 kultiviert. Nach vier Tagen wurde das 

Medium einer T75-Zellkulturflasche durch frisches Medium ersetzt. Nach sieben Tagen 

wurden die adhärenten Zellen passagiert. Dazu wurde das vorhandene Medium abgegossen 

und die Zellen einmal mit DPBS -/- gespült. Anschließend wurden die Zellen 5 min mit dem 

Enzym Accutase inkubiert, um diese von den T75-Zellkulturflaschen zu lösen. Danach wurde 

zu Accutase 10 ml MEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep gegeben, um die Accutase 

durch einen Überschuss an Substrat zu hemmen. Das Zellgemisch wurde 5 min bei 400 g 

zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet in MEM mit 10 % FCS und 100 

U/ml PenStrep resuspendiert. Die Zellen wurden 1:2 in eine neue T75-Zellkulturflasche 

transferiert und auf ein Volumen von 20 ml mit MEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep 

aufgefüllt. 

3.1.4 Adulte Mikroglia 

Primäre adulte Mikroglia wurde aus dem Sicherheitsgewebe von Patienten isoliert, bei denen 

ein epileptischer Fokus im Kontext einer therapierefraktären Epilepsie entfernt wurde (Chan et 

al., 2003). Diese wurde über eine Kooperation mit der Neurochirurgie des 

Knappschaftskrankenhauses Bochum (PD Dr. von Lehe) zur Verfügung gestellt (Ethikantrag: 

Az.: 13-4821). Das erhaltene Gewebe wurde makroskopisch von Blut, Gefäßen und Meningen 

befreit und mechanisch zerkleinert. Über das mehrmalige Absinken in einem 50 ml Reaktions- 

Röhrchen in jeweils frischem DPBS -/- wurde es gereinigt und anschließend in 15 ml DBPS -/- 

in eine sterile Glasflasche überführt. Um den chemischen Verdau einzuleiten, wurden 15 ml 

0,5 % Trypsin mit EDTA und 2 µl DNAse I (277,3 U/ml) hinzugegeben und bei 37° C unter 

ständigem Rühren inkubiert. Der Verdau wurde nach 30 min durch die Zugabe von 3 ml 100 

% FCS gestoppt. Um größere noch verbleibende Gewebestücke auszusondern, wurde das 

Gemisch durch ein 132 µm Nylonnetz gefiltert und anschließend bei 300 g für 10 min 

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 21 ml DPBS -/- resuspendiert. 

Anschließend wurde das Zellgemisch mit 9 ml Percoll vermengt, sodass eine 30 % Percoll- 

37

Lösung entstand. Diese wurde 30 min bei 4° C und 27.000 g zentrifugiert. Bei der Prozedur 

kam es zu einer Schichtbildung anhand eines durch Percoll begünstigten Dichtegradienten. 

Die oberste Schicht, bestehend aus DPBS -/- und Myelin wurde verworfen und die 

nachfolgende Schicht mit den ZNS residenten Zellen, unter anderem der Mikroglia, wurde in 

50 ml Reaktions-Röhrchen überführt, ohne die darunterliegende Schicht mit Erythrozyten zu 

berühren (Abbildung 6: Schematische Übersicht Percoll-Gradient. Oben DPBS -/- und Myelin. 

Darunter Percoll- und Zellgemisch mit den gewünschten Mikroglia. Unterste Schicht pelletierte 

Erythrozyten.) 

Abbildung 6: Schematische Übersicht Percoll-Gradient. Oben DPBS -/- und Myelin. Darunter Percoll- und 

Zellgemisch mit den gewünschten Mikroglia. Unterste Schicht pelletierte Erythrozyten. 

Die Zellen wurden anschließend mit DPBS -/- gewaschen und in MEM mit 10 % FCS, 100 U/ml 

PenStrep und 10 % Glukose resuspendiert und in T25-Zellkulturflaschen ausgesät. Nach zwei 

Tagen wurden die Zellkulturflaschen 5 min bei 40 rpm geschüttelt um nicht-adhärente 

Oligodendrozyten und wenig-adhärente Astrozyten abzulösen. Die Mikroglia wurden mit 

frischen Medium versehen und weitere fünf Tage bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Danach 

wurden die Zellen mit DPBS -/- gespült und für 10 min mit 0,5 % Trypsin und EDTA inkubiert, 

um diese vom Flaschenboden abzulösen. Die Zellen wurden bei 400 g 5 min zentrifugiert und 

resuspendiert. Im Anschluss wurden 20.000 Zellen pro Vertiefung einer 96-Loch Platte (200 

µl; 100.000 Zellen/ml) ausgesät und für 48 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. 

3.1.5 HEK293A und HEK293T Zellen 

HEK293T Zellen wurden zur Produktion von lentiviralen Partikeln verwendet, deren infektiöser 

Titer anhand einer Transduktion von HEK293A Zellen bestimmt wurde. HEK293 Zellen wurden 

durch die Transfektion von humanen embryonalen Nierenzellen mit Teilen des Adenovirus 5 

erzeugt (Zur Hausen, 1967) und sind für die Produktion von lentiviralen Partikeln gut 

beschrieben (Pear et al., 1993; Merten et al., 2016). Bei HEK293 Zellen handelt es sich um 

adhärente Zellen, die in DMEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep bei 37° C und 5 % CO 2 

38

kultiviert wurden. Nach drei Tagen wurden die Zellen je nach Konfluenz 1:3 bis 1:6 in eine 

neue T150 Zellkulturflasche transferiert, indem die Zellen einmal mit PBS (phosphate buffered 

saline) gewaschen und anschließend mit 0,05 % Trypsin in EDTA gelöst wurden. Die Zellen 

wurden 5 min bei 300 g zentrifugiert und anschließend in einem Volumen von 30 ml 

resuspendiert. 

3.2 Produktion und Charakterisierung von viralen Partikeln 

3.2.1 Präparation von Plasmiden 

Die zur Transfektion benötigten Plasmide wurden in Escherichia coli (E. coli) Bakterien 

amplifiziert und mittels Maxi-Präparation isoliert. Dabei wurde vorher von ultrakompetenten E. 

coli Bakterien des Stammes XL2 blue mittels Re-Transformation das gewünschte Plasmid 

aufgenommen. Von diesen Bakterien wurden vorherig Kulturen erstellt und bei -80°C gelagert. 

Die Kulturen wurden von der Arbeitsgruppe „molekulare Virologie“ der Ruhr-Universität 

Bochum unter der Leitung von Professor Klaus Überla zur Verfügung gestellt. 

Mit den gefrorenen Bakterien wurde 1 ml LB-Medium mit 100 mg/ml Ampicillin angeimpft und 

über Nacht bei 37° C auf einem Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Die für diese Versuche 

interessanten Plasmide kodierten ebenfalls für eine Ampicillin-Resistenz der Bakterien. 

Bakterienwachstum wurde anhand einer Trübung des LB-Mediums nach 24 h festgestellt. 300 

ml frisches LB-Medium versetzt mit 100 mg/ml Ampicillin wurde mit 300 µl Bakterienlösung 

angeimpft und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag und ebenfalls durch eine Trübung des 

Mediums indiziert, wurden die gewachsenen Bakterien durch Zentrifugation bei 6000 g für 15 

min bei 4° C geerntet und die amplifizierten Plasmide aus diesen isoliert. Dafür wurde eine 

Maxi-Präparation nach dem Herstellerprotokoll (NucleoBond Xtra Kit) durchgeführt. Die Zellen 

wurden pelletiert und mittels Lysepuffer aufgeschlossen. Danach wurden die Plasmide über 

Separation in einer Säule gewonnen und in EF-Puffer eluiert und verdünnt. Der DNA-Gehalt 

wurde photometrisch bestimmt und auf eine Konzentration zwischen 1-2 µg/µl eingestellt. Im 

Anschluss wurde ein Kontrollverdau der Plasmide durchgeführt und mittels Vektorkarten und 

Kontroll-Plasmiden verglichen. Dafür wurde 1 µg Plasmid mit 0,5 µl Restriktionsenzymen und 

2 µl korrespondierendem Restriktionspuffer versetzt und inkubiert (Tabelle 1). 

39

Tabelle 1: Plasmide und eingesetzte Restriktionsenzyme, sowie erzeugte Fragmente 

Plasmid Restriktionsenzym Ungefähre Fragmentgrößen 

HIV CS-CG Xma I 5100 bp 

3100 bp 

200 bp 

HGP syn Nco I 5600 bp 

3300 bp 

730 bp 

pcRev Ava I 2950 bp 

500 bp 

pcTat Nco I 3250 bp 

480 bp 

pHitG Age I 1000 bp 

650 bp 

Die geschnittenen Plasmide wurden mit 6x Ladepuffer versetzt und auf ein 1 % Agarose-Gel 

aufgetragen. Mittels Gelelektrophorese bei 110 Volt wurden die Plasmide nach Größe der 

Fragmente aufgetrennt. Durch vorheriges Anfärben des Agarose-Gels mit 0,1 µg/µl 

Ethidiumbromid konnte die Schnittmuster unter UV-Licht visualisiert und mit den vorliegenden 

Vektorkarten der Plasmide verglichen werden. Dadurch wurde sichergestellt, dass die für die 

Transfektion von HEK293T-Zellen verwendeten Plasmide keine Veränderungen aufwiesen. 

3.2.2 Transfektion von 293T-Zellen zur Partikelproduktion 

Die isolierten Plasmide wurden zur Transfektion von 293T-Zellen verwendet. Dabei wurden 

sowohl Transfektionen nach der Polyethylenimid (PEI)-Methode (Aricescu et al., 2006) als 

auch nach der Kalzium-Chlorid (CaCl 2)-Methode (Soneoka et al., 1995) angewendet. Bei 

beiden Methoden wurden die vorher genannten Plasmide in HEK293T Zellen gebracht und 

dort von der Zelle translatiert. Je nach Zusammensetzung der Plasmide wurden virale Partikel 

mit unterschiedlichen Eigenschaften produziert. Bei der Transfektion wurden die Plasmide: 

HIV CS-CG, HGP syn , HG syn , pcRev, pcTat und pHitG eingesetzt, die alle im Kapitel 2.5 dieser 

Dissertation näher beschrieben sind. 

Beide Transfektionsmethoden zeigen hinsichtlich der Transfektionsrate ähnliche Resultate 

(Ambrosius, 2012; Faissner, 2013). Da jedoch im Hinblick auf sezernierte Zytokine eine basale 

Aktivierung der Zellen, welche zuvor mit der CaCl 2-Methode transfiziert wurden, geringer 

ausfiel, wurde diese für die weiteren Versuche im Kontext dieser Dissertation verwendet. 

40

Bei der PEI Methode wurden 1,5x10 6 HEK293T Zellen in einer T25 Zellkulturflasche ausgesät 

und über Nacht in DMEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep bei 37° C und 5 % CO 2 

inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde das Medium zu DMEM mit 1,5 % FCS und 100 U/ml 

PenStrep gewechselt, da FCS den Transfektionsprozess stören kann. Für die Transfektion 

wurden 500 µl DMEM mit 100 U/ml PenStrep in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 

die vorher aufgezählten Plasmide wurden je nach den gewünschten Eigenschaften der 

späteren Partikel hinzu pipettiert (Kapitel 2.5). Anschließend wurde der Ansatz mittels Träger- 

DNA aus Kalbsthymus auf 10 µg pro Ansatz aufgefüllt, um eine vergleichbare Transfektion zu 

ermöglichen. Zu jedem Ansatz wurden 10 µl PEI hinzugegeben, der Ansatz gevortext und 10 

min bei Raumtemperatur inkubiert. Der fertige Ansatz wurde zu den adhärenten HEK293T 

Zellen in den T25-Zellkulturflaschen pipettiert und über Nacht bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. 

Am nächsten Morgen wurde das Medium erneut zu DMEM mit 10 % FCS und 100 U/ml 

PenStrep gewechselt. Nach Aufnahme der Plasmide durch die Zellen über Nacht konnte durch 

die Erhöhung des FCS das Zellwachstum und die Plasmid-Translation angeregt werden. Die 

Zellen wurden in dem frischen Medium für weitere 24 h inkubiert. 

Bei der CaCl 2-Methode wurden ebenfalls 1,5x10 6 HEK293T Zellen in eine T25 

Zellkulturflasche ausgesät und über Nacht in DMEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep bei 

37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Analog zur PEI Methode wurde kurz vor der Transfektion das 

Medium erneuert, jedoch wurde bei der CaCl 2-Methode der Medium-Typ beibehalten. Für die 

Transfektion wurde 15 µg DNA verwendet und diese auf die eingesetzten Plasmide aufgeteilt 

(Kapitel 2.6 und 2.7). Es wurden 31 µl 2 M CaCl 2 hinzugegeben und mit H 2O auf 250 µl pro 

Ansatz aufgefüllt. Unter leichtem vortexen wurde tropfenweise 2x HBS-Puffer (pH 7,1) 

hinzugegeben und der Ansatz für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Ansatz wurde in 

die entsprechende T25 Zellkulturflasche pipettiert und die Zellen über Nacht bei 37° C und 5 

% CO 2 inkubiert. Am nächsten Morgen wurde das Medium gewechselt, um einem toxischen 

Effekt durch das CaCl 2 auf die Zellen vorzubeugen. Die Zellen wurden für weitere 24 h bei 37° 

C und 5 % CO 2 inkubiert. 

Bei der Partikelernte wurde bei beiden Methoden gleich vorgegangen. Der Überstand der 

produzierenden Zellen wurde in ein 15 ml Reaktionsrohr gefüllt und für 5 min bei 300 g 

zentrifugiert, um etwaige gelöste Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde anschließend 

durch einen 0,45 µm Filter gegeben, um weiteren Zell-Debris zu entfernen. Das Filtrat wurde 

in 1 ml Aliquots aufgeteilt und bei -80° C bis zur weiteren Verwendung gelagert. 

3.2.3 Transduktion von 293A-Zellen zur Bestimmung des infektiösen Titers 

Nach der Produktion der viralen Partikel mussten diese charakterisiert werden. Hierzu wurde 

zunächst der infektiöse Titer bestimmt. Das Plasmid HIV CS-CG kodiert neben den LTR`s des 

Virus auch für ein GFP-Gen (Kapitel 2.5) (Abbildung 7). 

41

Abbildung 7: Schematische Übersicht des HIV CS-CG Plasmids, bestehend aus Cytomegalovirus (CMV) – 

Promotor, den long-terminal repeats (LTRs) des Virus, sowie eines modifizierten 3`Endes, sodass es keine 

Transkription über die LTRs geben kann (self-inactivation (SIN)-LTR). Dazwischen liegt ein CMV-Promotor mit 

GFP-Gen. Modifiziert nach (Björn Ambrosius, 2012). 

Nach erfolgreicher Transduktion der Zielzelle wurde die durch HIV CS-CG kodierte RNA 

umgeschrieben und in das Erbgut inseriert, transkribiert und translatiert. Hierdurch wurden 

GFP-Proteine in der Zelle angereichert. Auf diese Weise konnten erfolgreich transduzierte 

Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und gezählt werden. Bei der 

Titerbestimmung wurden 50.000 HEK293A Zellen pro Vertiefung einer 24-Loch-Platte 

ausgesät und diese für 24 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Das Medium wurde von den 

Zellen genommen und durch den Überstand oder eine Verdünnung des Überstandes in DMEM 

mit 100 U/ml PenStrep ersetzt und für 2 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Im Anschluss 

wurde 1 ml DMEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep zu den Zellen gegeben und diese 

weitere 48 h inkubiert. Die Insertion der viralen RNA in das Genom der Zielzelle sowie die 

Bildung der Genprodukte benötigte bis zu 48 h (Cavrois et al., 2002). Die Zellen wurden unter 

einem Fluoreszenz-Mikroskop gezählt. Es wurden unter 10-facher Vergrößerung in vertikaler 

Richtung grün fluoreszierende Zellen in 7,5 Gesichtsfeldern gezählt. Der Mittelwert wurde mit 

dem Faktor 57 multipliziert, der sich bei der Verwendung von 24-Loch-Platten ergab. Dieses 

Ergebnis wurde mit dem Verdünnungsfaktor und anschließend mit dem Faktor 5 multipliziert, 

um die infektiösen Partikel pro Milliliter zu berechnen. 

Neben den HIV CS-CG beinhaltenden infektiösen Partikeln (HIV-Vektor) wurden 

Kontrollpartikel erstellt, die keine virale RNA enthielten (HIV-leer). Dabei wurde anstelle des 

Plasmids HIV CS-CG, Träger-DNA bei der Transfektion verwendet. Damit wurde bezweckt, 

Partikel zu produzieren, die nicht infektiös waren und somit keine GFP-Expression induzieren 

konnten. 

3.2.4 Molekulare Beschaffenheit der viralen Partikel: gag-Gehalt und RNA 

Neben der Bestimmung des infektiösen Titers wurde der gag-Gehalt und die virale RNA 

quantifiziert (Grewe et al., 2012). Dabei wurden die Überstände der partikelproduzierenden 

Zellen, wie unter Kapitel 3.2.2 beschrieben, zentrifugiert und durch einen 0,45 µM Filter 

gegeben. In Ultrazentrifugenröhrchen wurde 2,5 ml sterile 30 % Sucroselösung vorgelegt und 

vorsichtig die Überstände aufgeschichtet um eine Verwirbelung mit der Sucrose zu vermeiden. 

42

Die Röhrchen wurden bei 60.000 g und 4° C für 2 h zentrifugiert. Im Anschluss wurde der 

Überstand verworfen und das Partikelpellet am Boden des Röhrchens in 150 µl PBS 

resuspendiert. Von den 150 µl wurden 25 µl wurden für einen späteren gag-ELISA 

abgenommen und bei -20° C gelagert (Patience et al., 1994). Die restlichen 125 µl wurden zur 

Isolation der RNA mittels „QIAamp viral RNA mini Kit“ nach Herstellerprotokoll verwendet. 

Dabei wurden die Partikel lysiert und die RNA mittels Säulensystem isoliert und in DEPC- 

Wasser (Diethyldicarbonat-Wasser) eluiert. Die RNA-Proben wurden im Anschluss mit dem 

„AMBION Turbo-DNase free kit“ behandelt. Dabei wurde die RNA für 2 h mit DNase bei 37° C 

inkubiert und anschließend für 5 min bei Raumtemperatur mit AMBION Reaktivierungsreagenz 

inkubiert. Dieses wurde durch Zentrifugation von der Probe getrennt und der Überstand wurde 

für die spätere Detektion der RNA aliquotiert. 

Die isolierte RNA wurde durch den Kooperationspartner Professor Thomas Gramberg 

(klinische und molekulare Virologie Erlangen) mittels spezifischem 3´gag-rev Primer mit dem 

Enzym „Superscript II reverse transcriptase“ in DNA umgeschrieben. Die Vermessung der 

DNA wurde durch quantitative „real-time (rt) poly chain reaction“ (PCR) mit dem „forward“- 

Primer MH531 und dem „reverse“-Primer MH532, sowie einer HIV-1 spezifischen LRT-Sonde 

durchgeführt. Die amplifizierte DNA wurde mit einer Standardkurve, beruhend auf proviralem 

NL43-Plasmid, verdünnt in 125 ng DNA uninfizierter Zellen, verglichen. 

Der gag-Gehalt wurde mittels kommerziell erhältlichen „AALTO-gag-ELISA-Kits“ nach 

Herstellerprotokoll vermessen. Die Partikel wurden mit Empigen lysiert und zu einem Gemisch 

von drei polyklonalen Schaf-Anti-Gag-Antikörpern (D7320) gegeben, die an eine 96-Loch- 

Platte gebundenen waren. Nach der Inkubation wurde ein monoklonaler Maus-Anti-Gag- 

Antikörper (BC 107-AP) hinzugegeben, der mit einer alkalischen Phosphatase konjugiert war. 

Anschließend wurde ein Substrat für das Enzym hinzugegeben (CSPD with Sapphire-II) und 

die Platte nach 30 min mit einer 1 Sekunden-Messung in einem Luminometer bei einer 

Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die Lumineszenz wurde mit einer Standardkurve aus 

rekombinantem HIV-1 p24 gag-Protein verglichen. 

3.2.5 Transduktionseffizienz bei monozytären Zellen und erfolgreiche Integration der 

viralen RNA in das Zielzellen-Genom 

Um die Transduktionseffizienz der eingesetzten viralen Partikel in unserem System zu 

untersuchen, wurden 50.000 U937 in RPMI mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep pro 

Vertiefung einer 24-Loch-Platte ausgesät und für 1 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. In dieser 

Zeit konnten die Zellen auf den Boden der 24-Loch-Platte absinken und das Medium 

abgenommen werden. Pro Vertiefung wurden 200 µl infektiöser Überstand oder 

43

korrespondierende Kontrollüberstände gegeben und die Zellen für 2 h bei 37° C und 5 % CO 2 

inkubiert. Im Anschluss wurde 1 ml RPMI mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep hinzugegeben 

und die Zellen, analog zu den Transduktionsversuchen der HEK293A Zellen (Kapitel 3.1.5) für 

48 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die U937 in ihrem Medium 

resuspendiert und in Durchflusszytometer-Röhren überführt. In diesen wurden die Zellen zwei 

Mal bei 400 g für 5 min pelletiert und mit DPBS -/- gewaschen. Im Anschluss wurden die Zellen 

in 400 µl DPBS -/- resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie, anhand des AlexaFluor 488 

Detektors, auf das Vorhandensein von GFP überprüft. 

Um den Prozess weiter zu charakterisieren, wurde bereits 24 h nach Transduktion die 

monozytären Zellen, wie beschrieben, pelletiert. Die Zellen wurden mit 15 U/ml DNase für 

eine Stunde behandelt, um etwaige Plasmid-DNA im Medium abzubauen. Anschließend 

wurde mittels „Qiagen Blood and Tissue Kit“ die DNA der Zellen extrahiert. Vorhergehend 

wurden. Die extrahierte DNA wurde bei -20° C gelagert und durch den Kooperationspartner 

Professor Thomas Gramberg (Klinische und molekulare Virologie, Erlangen), mittels 

quantitativer rtPCR, wie unter 3.2.4 beschrieben, untersucht. 

3.3 Untersuchung von Proteom-Veränderungen im Kontext einer HIV-Vektor 

Transduktion bei monozytären Zellen 

Um die molekularen Veränderungen in monozytären Zellen besser zu verstehen, wurden HIV- 

Vektor transduzierte und nicht-transduzierte monozytäre Zellen in einer markierungsfreien 

(label free) Proteomstudie mittels Massenspektrometrie (MS)-basierter Techniken untersucht. 

Bei dieser Methode können relative Proteinexpressionen verglichen werden, ohne dass die 

Zellen mit Indikatoren, wie beispielsweise schweren Aminosäuren behandelt werden müssen. 

Diese Versuche wurden im Rahmen einer FORUM-geförderten Kooperation 

(Förderkennzeichen: F859-15) mit der Arbeitsgruppe „Funktionelle Proteomics“ am 

Medizinischen Proteom-Center (Dr. Claudia Lindemann) durchgeführt. 

Für die Versuche wurden 100.000 monozytäre Zellen verwendet und, wie unter Punkt 4.2.5 

beschrieben, mit infektiösen oder Kontrollüberstanden transduziert. Nach 24 h wurden die 

Zellen in ihrem Medium resuspendiert und in 1,5 ml Reaktionsgefäße transferiert. Die Zellen 

wurden 5 min bei 1400 g pelletiert, der Überstand verworfen und 1 ml DPBS -/- hinzugefügt. 

Dieser Schritt wurde zwei Mal wiederholt. Im Anschluss wurde das Pellet in 80 µl 

„radioimmunoprecipitation assay“ (RIPA) und 20 µl 7 x Proteinaseinhibitor resuspendiert und 

durch 20-maliges Pipettieren mit einer 100 µl Pipette gelöst. Das Lysat wurde für 15 min auf 

Eis bei 50 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Im Anschluss wurde der Ansatz für 30 min bei 

44

13.000 g zentrifugiert um Zell-Debris zu pelletieren. 80 µl des Überstandes wurden 

abgenommen und bei -80° C gelagert. 

Die weiteren Versuche wurden durch den Kooperationspartner durchgeführt. Dabei wurde 

zunächst die Proteinkonzentration der Proben mittels Bradford-Tests bestimmt (Bradford, 

1976). Im Anschluss wurden die Proben in gleichen Konzentrationen auf ein „sodium dodecyl 

sulfate“ (SDS)-Gel aufgetragen und mittels „kurz-1D-Gelelektrophorese“ in das Gel einlaufen 

lassen. Die Proteinbanden wurden anhand einer Coomassiefärbung identifiziert und mit einem 

tryptischen Verdau aus dem Gel extrahiert. Die gelbasierte Proteinauftrennung wurde 

durchgeführt um etwaige Störsubstanzen aus den Proben zu entfernen, bevor diese mittels 

„ultra-high-performance-liquid“ chromatography (UHPLC) massenspektrometrisch analysiert 

wurden. Zur Betrachtung von zellulären Veränderungen auf Proteinebene in Monozyten nach 

HIV-Transduktion wurde eine „label-free“ Massenspektrometrie (MS) basierte 

Quantifizierungs-methode angewandt. Die „label-free“ basierte Quantifizierung beruht auf der 

Kalkulation einer Ratio für jedes Protein, welche sich aus der normalisierten Intensität des 

Proteins unter Bedingung A (z. B. nach HIV-Transduktion) dividiert durch die normalisierte 

Intensität des Proteins unter Bedingung B (z. B. ohne HIV-Transduktion) zusammensetzt. Ein 

Protein mit einer erhöhten Ratio weist auf eine Hochregulation, während eine erniedrigte Ratio 

auf eine Herunterregulation des Proteins unter Bedingung A hinweist. In der vorliegenden 

Studie wurde die „label-free“ Quantifizierung Software-basiert mittels MaxQuant durchgeführt 

(Cox and Mann, 2008) (Abbildung 8). Dabei wurden nur Proteine berücksichtigt, die in allen 

Replikaten mindestens ein uniques Peptid aufwiesen. Unique Peptide sind Peptidsequenzen, 

welche nur einem Protein in einem Organismus zugeordnet werden können. Damit sichern 

unique Peptide eine korrekte Identifizierung eines Proteins. Ebenfalls musste die Regulation 

mindestens den Faktor 1,5 übersteigen bzw. 0,67 unterschreiten. Nur anhand eines t-Tests 

berechnete signifikante Regulationen mit einem p-Wert kleiner 0,01 wurden bei der 

Auswertung berücksichtig. Der t-Test betrachtet, ob ein signifikanter Unterschied in den 

Proteinintensitäten zwischen HIV-transduzierten und nicht-transduzierten Proben vorliegt 

(Abbildung 8). 

45

Abbildung 8: Übersicht der Arbeitsschritte in den Proteomversuchen. Links: Probenaufbereitung, einschließlich 

Transduktion der monozytären Zellen, Zellaufschluss, 1D-Gelelektrophorese und LC/MS Analyse, rechts: 

markierungsfreie Quantifizierung anhand der Intensitäten der detektierten Peptide, die verwendet werden um die 

Ratio der Peptidregulation zu berechnen. 

Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels Signalweg-Analysen (www.reactome.org) 

(Fabregat et al., 2016; Croft et al., 2014) in den biologischen Kontext der Zelle eingeordnet. 

Bei den Signalweg-Analysen wurde die FDR (false discovery rate) berücksichtig, die den 

Fehler beschreibt, dass identifizierte Proteine einem Signalweg fälschlicherweise zugeordnet 

wurden. 

3.4 Zytotoxizität durch Teriflunomid und MMF 

3.4.1 Viabilität von monozytären Zellen bei Behandlung mit Teriflunomid oder MMF 

Um einen zytotoxischen Effekt von Teriflunomid und MMF auf monozytäre Zellen 

auszuschließen, wurden diese in verschiedenen Konzentrationen mit den pharmakologischen 

Substanzen behandelt. Dabei wurden 50.000 U937 in RPMI mit 10 % FCS und 100 U/ml 

PenStrep in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte gesät und 24 h bei 37° C und 5 % CO 2 

inkubiert. Im Anschluss wurde Teriflunomid oder MMF in verschiedenen Konzentrationen 

hinzugegeben. Beide Substanzen lagen in Pulverform vor und wurden in Dimethylsulfoxid 

(DMSO) gelöst. Die Zellen wurden 24 h mit den pharmakologischen Substanzen inkubiert, 

bevor die Zellen in ihrem Medium resuspendiert und in Durchflusszytometer-Röhren überführt 

wurden. Die Zellen wurden 5 min bei 400 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und diese 

46

mit 1 ml DPBS -/- aufgefüllt. Der Vorgang wurde zwei Mal wiederholt, bevor die Zellen in 100 µl 

DPBS -/- resuspendiert und mit 0,5 µl 7-Aminoactinomycin D (7AAD), als Marker für 

apoptotische Zellen, für 10 min behandelt wurden. Kommt es im Zuge von apoptotischen 

Prozessen der Zelle zu einer erhöhten Permeabilität der Zellmembran, dringt 7AAD in die Zelle 

ein und interkaliert mit der DNA, wodurch es zu einer Konformationsänderung von 7AAD 

kommt und dieses bei Anregung durch UV-Licht im roten Bereich fluoresziert. Die prozentuale 

Menge an apoptotischen Zellen wurde durchflusszytometrisch mittels PE-Cy5 Detektor 

bestimmt. 

3.4.2 Viabilität von Mikroglia und mikroglialen Zellen bei Behandlung mit Teriflunomid 

oder MMF 

Es sollte ebenfalls ausgeschlossen werden, dass etwaige Effekte der pharmakologischen 

Substanzen auf einem zytotoxischen Effekt auf Mikroglia und mikrogliale Zellen beruhten. 

Dafür wurden 20.000 HMC3 oder adulte Mikroglia in eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte 

gesät und 48 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Das Medium wurde abgenommen und durch 

Medium mit verschiedenen Konzentrationen an Teriflunomid oder MMF ersetzt. Nach weiteren 

24 h wurde das Medium abgenommen und die Zellen einmal mit DPBS -/- gewaschen. Die 

Zellen wurden mit 4 µg/ml bisBenzimide H 33342 in DPBS -/- für 2 h bei 37° C und 5 % CO 2 

inkubiert. BisBenzimide H 33342 ist membrangängig und interkaliert sowohl mit der DNA von 

lebenden als auch von toten Zellen. Nach Anregung mit UV-Licht zeigen angefärbte Zellen 

eine blaue Fluoreszenz. Nach der Färbung wurde die Lösung abgenommen und durch 100 µl 

DPBS -/- + 0,5 µl 7AAD pro Vertiefung ersetzt. Die Platte wurde weitere 10 min bei 37° C und 

5 % CO 2 inkubiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 20x Vergrößerung fotografiert. 

Anschließend wurde die Fläche der blau und rot fluoreszierenden Zellen mittels dem 

Programm ImageJ ermittelt und der Prozentsatz an toten Zellen berechnet, indem die Fläche 

der rot fluoreszierenden Zellen pro Vertiefung mit dem Faktor 100 multipliziert wurde und durch 

die Fläche der blau fluoreszierenden Zellen geteilt wurde. 

3.5 Co-Kultur Versuche 

3.5.1 Anlegen einer Co-Kultur 

Sowohl bei der Verwendung von embryonaler primärer Mikroglia, HMC3 als auch bei adulter 

Mikroglia wurde bei der Erstellung der Co-Kultur nach demselben Protokoll vorgegangen um 

eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Die Mikroglia, bzw. mikroglialen Zellen wurden wie in 

Kapitel 3.1.2 – 3.1.4 beschrieben abgelöst und in einer Dichte von 20.000 Zellen in 200 µl pro 

Vertiefung einer 96-Loch-Platte ausgesät. Am darauf folgenden Tag wurden wie in Kapitel 

47

3.2.5 monozytäre Zellen mit viralen Partikeln transduziert und diese weitere 24 h inkubiert. 

Das Medium der Mikroglia oder mikroglialen Zellen wurde abgenommen und durch 

monozytäre Zellen ersetzt. Dafür wurden die monozytären Zellen in ihrem Medium 

resuspendiert und 200 µl der monozytären Zellsuspension (entspricht 10.000 Zellen pro 

Vertiefung) zu den Mikroglia bzw. mikroglialen Zellen gegeben. Nach 24 h wurden 180 µl des 

Überstandes pro Vertiefung abgenommen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Dieses 

wurde 5 min bei 3500 g zentrifugiert um Zellen und Zell-Debris zu pelletieren. Aus dem 

Überstand einer Vertiefung wurden zwei 70 µl Aliquots erstellt und bei -80° C gelagert. 

3.5.2 Anlegen einer Mono-Kultur 

Die Mono-Kultur wurde ähnlich der in Kapitel 3.5.1 beschriebenen Co-Kultur erstellt. Dabei 

wurden 200 µl infektiöser Überstand unter Abwesenheit von monozytären Zellen, wie in Kapitel 

3.2.5 beschrieben, für 2 h bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert. Anschließend wurde 1 ml RPMI 

mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep hinzugegeben. Die verdünnten Überstände wurden 

weitere 24 h inkubiert. Im Anschluss wurden 200 µl hiervon, wie In Kapitel 3.5.1 beschrieben, 

zu den Mikroglia bzw. mikroglialen Zellen pipettiert und diese weitere 24 h inkubiert, bevor 

analog zu 3.5.1 die Überstände abgenommen und gelagert wurden. 

3.5.3 Pharmakologische Modifikation im Kontext der Co-Kultur und Mono-Kultur 

Um den Einfluss von pharmakologischen Substanzen auf die Abläufe in der Co-Kultur und 

Mono-Kultur zu überprüfen, wurden die transduzierten monozytären Zellen, bzw. die 

verdünnten viralen Überstände direkt vor der Zugabe zu den Mikroglia, bzw. mikroglialen 

Zellen mit Teriflunomid oder MMF behandelt. Die Substanzen wurden in verschiedenen 

Konzentrationen zu den monozytären Zellen gegeben und diese im Anschluss resuspendiert. 

Die behandelten monozytäre Zellen, bzw. der verdünnte infektiöse Überstand, wurde in einem 

Volumen von 200 µl zu den Mikroglia, bzw. den mikroglialen Zellen gegeben. 

3.5.4 Der Einfluss von Zell-Zellkontakt in der Co-Kultur 

Um den Effekt von direktem Zell-Zellkontakt in der Co-Kultur zu überprüfen, wurde eine Co- 

Kultur von HMC3 mit monozytären Zellen angelegt. Dabei wurden zwei identische Platten 

hergestellt, wobei eine der Platten, wie in Kapitel 3.4.1 beschrieben, statisch für 24 h bei 37° 

C und 5 % CO 2 inkubiert wurde. Die korrespondierende zweite Platte wurde bei 37° C und 5 

% CO 2 bei 40 rpm geschüttelt und ebenfalls 24 h inkubiert. Die Überstände wurden wie zuvor 

beschrieben abgenommen und bei -80° C gelagert 

3.5.5 Cytokine-Bead-Array (CBA) zur Detektion der sezernierten Zytokine 

CBAs wurden verwendet, um die in der Co-Kultur sezernierten Zytokine 

durchflusszytometrisch zu detektieren (Chen et al., 1999). In Vorarbeiten konnten die Zytokine 

CXCL10, CCL5, CCL2 und IL-6 als am deutlichsten regulierte Stoffe in dem Modell identifiziert 

48

werden (Faissner, 2013; Ambrosius, 2012). Der CBA wurde nach Herstellerprotokoll 

durchgeführt. Zusammengefasst werden Latexkugeln mit angeheftetem Erstantikörper, der 

spezifisch gegen das zu detektierende Zytokin ist, mit den Co-Kulturüberständen inkubiert. 

Danach wird ein Zweitantikörper hinzugegeben, der mit einem Fluorochrom konjugiert ist. Die 

Latexkugeln können im Durchflusszytometer erkannt werden und die Menge der daran 

gebundenen Fluorochrome gibt im Vergleich mit einer Standardkurve Aufschluss über die 

darin enthaltene Konzentration der Zytokine. Pro Zytokin wurden mindestens 300 Ereignisse 

gemessen. Dabei wurde ein BD FACS CANTO II verwendet und die Ergebnisse mit der 

Software FCAP Array V.3.0 ausgewertet. 

3.6 Modelle zur Überprüfung des neurotoxischen Potentials der Co-Kultur 

Überstände 

3.6.1 Primäre kortikale Rattenneurone 

Die Überstände aus der Co-Kultur der embryonalen Mikroglia mit den monozytären Zellen 

wurden auf zytotoxisches Potential hin überprüft. Dafür wurden im Rahmen einer betreuten 

Masterarbeit (Schanzmann, 2013) die Überstände auf primäre kortikale Rattenneurone 

gegeben und dort 48 h belassen. Die embryonalen kortikalen Rattenneurone wurden wie 

vorher ausführlich beschrieben, präpariert und kultiviert (Xu et al., 2012). Zusammengefasst 

wurden 17 – 20 Tage alte Rattenembryonen verwendet und nach Öffnung des Schädels die 

beiden Kortexhälften präpariert. Es wurden die Hirnhäute und Blutgefäße entfernt und das 

Gewebe mechanisch mit einem Skalpell zerkleinert. Anschließend wurden die 

Kortexfragmente durch Absinken in frischen DPBS -/- gewaschen und mit 0,1 % Trypsin und 

300 U/ml DNase für 30 min bei 37° C chemisch verdaut. Die enzymatische Spaltung wurde 

mittels Zugabe von DMEM mit 10 % FCS und 100 U/ml PenStrep gestoppt und die 

Zellsuspension durch einen 100 µM Filter filtriert. Danach wurde bei 300 g 5 min lang die 

Zellsuspension zentrifugiert. Das Pellet wurde in Neurobasal mit 2 % B27, 0,25 % Glutamax 

und 100 U/ml PenStrep resuspendiert. Es wurden 100.000 Zellen/Vertiefung in einer vorher 

mit 50 µl Poly-D-Lysin (10 µg/ml) beschichteten 96-Loch-Vertiefungsplatte ausgesät. Nach 

jeweils 15 h und 48 h wurde 50 % des Mediums abgenommen und durch frisches Medium 

ersetzt. Nach 5 Tagen wurde das Medium in den Vertiefungen abgenommen und durch 50 µl 

Co-Kultur Überstand ersetzt, der wie eingangs berichtet, für 48 h auf den Neuronen belassen 

wurde. 2 % Triton und verschiedene Konzentrationen von H 2O 2 in Medium, sowie reines 

Medium, wurden als Positiv- und Negativkontrolle für den Zelltod verwendet. 

Nach 48 h wurden die Überstände von den Neuronen genommen und diese einmal mit DPBS 

-/- 

gewaschen, bevor die Zellen 2 h mit 2 µg/ml Hoechst 33258 (wurde von Sigma im Verlauf 

49

ersetzt durch bisBenzimide H33342) bei 37° C und 5 % CO 2 inkubiert wurden. Anschließend 

wurden die Zellen für 10 min mit 100 µl DPBS -/- und 1 µg PI pro Vertiefung inkubiert. PI 

interkaliert analog zu 7AAD mit der DNA von Zellen, nachdem es im Rahmen von 

zytotoxischen Prozessen zu erhöhter Permeabilität der Zellmembran gekommen ist. Im 

Anschluss wurden, analog zu Kapitel 3.4.2, die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 

20-facher Vergrößerung fotografiert und mit dem Programm ImageJ ausgewertet. 

3.6.2 Fötale humane Neurone 

Um die funktionelle Relevanz der Überstände aus einer Co-Kultur von HMC3 mit 

transduzierten monozytären Zellen und unter pharmakologischer Manipulation hinsichtlich 

Neurotoxizität zu untersuchen, wurden Überstände mit fötalen humanen Neuronen inkubiert. 

Diese Versuche wurden nach zuvor etablierter Methode durchgeführt (Vecil et al., 2000) in 

Kooperation mit dem Labor von Prof. Dr. V. Wee Yong (Hotchkiss Brain Institute and 

Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary, Kanada) von Dr. Simon Faissner 

in Einklang mit der dortigen Ethik-Kommission durchgeführt. Neurone wurden aus den 

Gehirnen von 18-20 Wochen alten therapeutisch abgetriebenen Föten isoliert. Die Neurone 

wurden in MEM-Medium angereichert mit 10 % FCS, 1 µM Sodiumpyruvat, 10 µM Glutamin, 

1X nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 % Dextrose und 100 U/ml PenStrep in poly-L-Ornithin 

beschichteten T75-Zellkulturflaschen kultiviert. Um eine Reinheit von >80 % zu gewährleisten, 

wurde dem Medium in 2-3 Zyklen 25 µM Zytosin Arabinosid zugesetzt, um sich teilende 

Astrozyten zu töten. Für die Neurotoxizitätsversuche wurden 100.000 Neurone in einer poly- 

L-Ornithin beschichteten 96-Lochplatte ausgesät. Nach 2 Tagen wurde das Medium der Zellen 

abgenommen und für 5 h durch MEM mit 100 U/ml PenStrep ersetzt. Im Anschluss wurde das 

Medium abermals abgenommen und durch 70 µl der Co-Kultur Überstände ersetzt. Als Positivund 

Negativ- Kontrolle wurde Überstand der nicht-transduzierten Co-Kultur sowie Medium mit 

3 µM H 2O 2 verwendet und analog zu den Co-Kultur Überständen für 48 h auf den Neuronen 

belassen. Im Anschluss wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach einmaligem 

Waschen mit PBS wurden die fixierten Zellen mit einem anti-Microtubuli-assoziierten Protein- 

2 Antikörper (MAP-2) als Marker für lebende Neurone über Nacht inkubiert. Nach zweimaligem 

Waschen wurde der Erstantikörper mit einem Alexa Fluor 488 konjugierten Zweitantikörper 

sichtbar gemacht und die Zellkerne mit dem Farbstoff Hoechst S769121 (Nuclear yellow) 

gefärbt um die Gesamtzellzahl zu ermitteln. Die gefärbten Zellen wurden mit dem 

ImageXpress Mikroskopiersystem fotografiert und die Bilder mit der Software MetaXpress 

ausgewertet. 

50

3.7 Statistische Auswertung der Versuche 

Die Ergebnisse der Versuche wurden mit der Software GraphPad Prism Version 6 statistisch 

ausgewertet und graphisch aufbereitet. Alle Experimente, wenn nicht genauer spezifiziert, 

wurden in Triplikaten in mehreren unabhängigen Versuchen durchgeführt. Signifikanzen 

wurden, wenn nicht anders benannt, in Form einer Einweg-Varianzanalyse (one-way ANOVA) 

in Kombination mit einem Tukey`s multiple comparison test durchgeführt. P-Werte kleiner als 

0,5 wurden als statistisch signifikant angesehen und mit einem * verdeutlicht. Höhere 

Signifikanzwerte wurden angegeben als ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 und **** = p < 0,0001. 

51

4. Ergebnisse 

4.1 Charakterisierung der viralen Partikel 

4.1.1 p24 gag-Gehalt und RNA-Gehalt der eingesetzten viralen Partikel 

Die mit den HEK293T Zellen produzierten viralen Partikel wurden auf p24 gag-Gehalt und auf 

die verpackte RNA hin untersucht. Es sollte überprüfen werden, ob bei der Partikelproduktion 

vergleichbare Mengen an viralen Partikeln vorlagen. Bei der Produktion von HIV-Vektor und 

HIV-leer Partikeln konnte signifikant mehr gag im Überstand detektiert werden verglichen mit 

der Kontrolle, in der die HEK293T-Zellen nur mit dem Transfektionsreagenz inkubiert wurden 

(p < 0,001). Das zeigte deutlich, dass virale Partikel nur in den Konditionen vorlagen, in denen 

mit dem Plasmid gag transfiziert wurde (Kapitel 2.5, 2.6, 2.7). Zwischen HIV-Vektor und HIVleer 

Partikeln konnte kein Unterschied in der Menge an vorhandenem gag gemessen werden, 

was für eine vergleichbare Partikelproduktion spricht (Abbildung 9 A). HIV-Vektor Partikel 

zeigten signifikant mehr verpackte RNA als die Kontrollkonditionen HIV-leer und die 

Behandlung mit Transfektionsreagenz (p < 0,001). Das verdeutlicht, dass in den produzierten 

viralen Partikeln virale RNA vorlag, wenn das Plasmid HIV CS-CG bei der Transfektion 

Verwendung fand (Kapitel 2.6) (Abbildung 9 B). Die produzierten Überstände wurden auf 

HEK293A Zellen gegeben, um die Transduktionseffizienz zu ermitteln. Es wurde deutlich, dass 

eingesetzte HIV-Vektor Partikel in der Lage waren, HEK293A Zellen erfolgreich zu 

transduzieren, wohingegen die Kontrollen keine erfolgreiche Transduktion hervorriefen (p < 

0,001) (Abbildung 9 C). 

52

Abbildung 9 A-C: Charakterisierung der viralen Partikel im Hinblick auf die Menge an gag, enthaltener RNA und 

Infektiösität. P24 gag Protein wurde mittels ELISA quantifiziert. Keine signifikanten Unterschiede zwischen HIV- 

Vektor und HIV-leer, jedoch signifikant mehr p24 gag gegenüber der Kontrolle, bei der die HEK293T-Zellen 

lediglich mit Transfektionsreagenz behandelt wurden (A). Virale RNA konnte in HIV-Vektor Partikeln mittels 

spezifischer rtPCR gegen die LTR`s detektiert werden, wohingegen HIV-leer und die Behandlung mit 

Kontrollreagenz keine eingebauten RNA-Kopien zeigten (B). Eine erfolgreiche Transduktionseffizienz und somit 

ein Indikator für erfolgreich eingebaute RNA und Genexpression von GFP konnte lediglich mit HIV-Vektor gezeigt 

werden, die Anhand einer Transduktion von HEK293A Zellen bestimmt wurde (C). *** = p < 0,001, one-way 

ANOVA (p < 0,0001) in Kombination mit Tukey`s multiple comparisons test. Signifikanzen werden gezeigt 

gegenüber Kontrollkondition. Die Daten werden in einer Logarithmus-Skala mit zugehörigem Standardfehler 

gezeigt. Für die Detektion von gag und der RNA wurden 5 bis 6 unabhängige Versuche durchgeführt. Bei der 

Bestimmung der Transduktionseffizienz wurden 3 bis 6 unabhängige Experimente durchgeführt. 

4.1.2 Erfolgreiche Transduktion von monozytären Zellen 

Um den Einfluss der viralen Partikel speziell auf die verwendeten monozytären Zellen zu 

überprüfen, wurde 24 h nach Transduktion die DNA der monozytären Zellen extrahiert und 

anhand spezifischer LTR-Sonden auf integrierte und umgeschriebene virale RNA hin 

untersucht. Nach Transduktion mit HIV-Vektor konnte um den Faktor 10.000 mehr integriertes 

virales Erbgut in der DNA der Zielzelle mittels rtPCR detektiert werden als in der Kontrolle mit 

Transfektionsreagenz (Abbildung 10 A). Nach 48 h wurden die transduzierten monozytären 

Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Dabei konnte in ungefähr 4 % der Zellen GFP 

detektiert werden, was als Indikator für Genexpression der viralen RNA HIV CS-CG zu werten 

war (Abbildung 10 B/C/D). 

53

Abbildung 10 A-D: Integrierte und revers transkribierte virale RNA im Erbgut der monozytären Zellen (A), sowie 

Genexpression dieser (B) und exemplarische FACS-Gate Resultate transduzierter Zellen (C) und nicht 

transduzierter Zellen (D) Zellen wurden nach 24 h lysiert, DNA extrahiert und mittels spezifischer rtPCR auf das 

Vorhandensein der viralen LTR`s überprüft. Die Daten werden pro 125 ng DNA nicht transduzierter Zellen mit 

zugehörigem Standardfehler gezeigt. N = 2 unabhängige Experimente, dadurch keine signifikanten Unterschiede 

sichtbar (A). Bei einer erfolgreichen Transduktion und Expression des durch HIV CS-CG kodierten Gen-Produkts 

GFP wurde die Menge der fluoreszierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie nach 48 h detektiert. Dabei wird 

die prozentuale Menge an GFP-exprimierenden Zellen mit zugehörigem Standardfehler gezeigt. N = 2 

unabhängige Experimente in 3 Wiederholungen pro Experiment. Es wurde ein one-way-ANOVA (p < 0,0001) in 

Kombination mit Tukey`s multiple comparisons test zur Berechnung der Statistik angewandt. Gezeigt wird der 

prozentuale Anteil an GFP-positiven Zellen mit zugehörigem Standardfehler. *** = p < 0,001. 

4.2 Proteomische Veränderungen in monozytären Zellen nach Transduktion 

In Massenspektrometrieanalysen wurden sowohl in den HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen als auch in den nicht transduzierten monozytären Zellen durchschnittlich 

mehr als 2000 Proteine mit mindestens einem uniquen Peptid und somit einzigartiger 

Sequenz, in allen biologischen Replikaten (n=3) reproduzierbar identifiziert (Abbildung 11 

A/B). In der Quantifizierungsstudie „HIV-Vektor transduzierte monozytäre Zellen versus nicht 

transduzierte monozytäre Zellen“ konnten 29 hochregulierte Proteine (Ratio > 1,5) und 93 

herunterregulierte Proteine (Ratio < 0,67) in HIV-Vektor transduzierten Monozyten identifiziert 

werden (Tabelle 2, Tabelle 3). Die statistische Auswertung durch einen t-Test bestätigte die 

Signifikanz der Proteinregulation mit einem p-Wert < 0,01. 

Betrachtet man die Signalwege, an denen regulierte Proteine involviert waren, fällt auf, dass 

besonders Proteine hochreguliert wurden, die in den Bereichen „disease“ (FDR: 8,76 * 10 -4 ), 

„gene expression“ (FDR: 4,12 * 10 2 ), „DNA replication“ (FDR: 8,83 * 10 -4 ) und „cell cycle“ (FDR: 

4,3 * 10 -1 ) involviert waren (Abbildung 11 C). Fokussiert auf den Bereich „disease“, hängen 

besonders hochregulierte Proteine mit dem Signalweg „HIV-infections“ zusammen (FDR: 1,04 

* 10 -3 ). In diesem Kontext sind ebenfalls Proteine des Immunsystems (FDR: 2,14 * 10 -1 ) und 

der Signaltransduktion (FDR: 9,28 * 10 -1 ) stärker exprimiert als in den nicht-transduzierten 

Kontrollen (Abbildung 11 C). Durch HIV-Vektor herunterregulierte Proteine finden sich 

hauptsächlich im Kontext der „DNA-replication“ (FDR: 8,83 * 10 -4 ), und der „gene expression“ 

(FDR: 4,21 *10 -2 ) (Abbildung 11 D). 

54

55

56

Abbildung 11 A-D: Proteomanalyse von transduzierten monozytären Zellen verglichen mit nicht-transduzierten 

monozytären Zellen. Anzahl der identifizierten Proteine in nicht transduzierten und HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen, gezeigt mit dazugehörigem Standardfehler (A). Einordnung der gesamten identifizierten 

Proteine in Signalwege in Signalwege der Zellen, erstellt über reactome.org (B). Hochregulierte Proteine (C) und 

herunterregulierte Proteine (D) in der Übersicht erstellt über reactome.org. Analyse ohne Konvertierung von nichthumanen 

Proteinen zu humanen Äquivalenten. Eine farbliche Hervorhebung verdeutlicht eine Beteiligung von 

identifizierten Proteinen an abgebildeten Signalwegen in den Zellen. Dadurch wird deutlich, dass hochregulierte 

Proteine besonders im Kontext „Disease“ zu finden sind, wohingegen herunterregulierte Proteine hauptsächlich 

der „DNA replication“ und „gene expression“ zugeordnet werden können. Farbgebung der hervorgehobenen 

Signalwege bei der Abbildung ohne Bedeutung. 

Betrachtet man die regulierten Proteine, konnte einzig das Protein Coilin nur in den HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen identifiziert werden, nicht jedoch in den nichttransduzierten 

monozytären Zellen (p = 1,9*10 -6 ). Es handelt sich um ein Protein, dass an dem 

Aufbau von Cajal-Körpern beteiligt ist und an der post-transkriptionellen Modifikation von RNA 

mitwirkt (Machyna et al., 2015). Weitere regulierte Proteine wurden bereits im Kontext einer 

HIV-Infektion von Monozyten in der Literatur beschrieben wurden. Dabei sind besonders 

deutlich die Proteine Superoxid dismutase (Ratio: 3,24; p = 8,3*10 -14 ), Transgelin-2 (Ratio: 

2,98; p = 3,7 * 10 -6 ), Calreticulin (Ratio: 2,11; p = 3,3 * 10 -4 ), Beta-hexosaminidase subunit 

alpha (Ratio: 2,07; p = 8,2 * 10 -6 ), Coronin-1C (Ratio: 2,07; p = 1,1 * 10 -5 ), Myosin regulatory 

light chain 12A/B (Ratio: 2,01; p = 9,3 * 10 -7 ) und Sequestosome-1 (Ratio: 2,01; p = 1,7 * 10 - 

10 

) hochreguliert (Tabelle 2). 

57

Tabelle 2: In HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen hochregulierte Proteine gegenüber nichttransduzierten 

monozytären Zellen. Es wurden nur Proteine berücksichtigt, deren Regulation eine Signifikanz von 

p < 0,01 unterschreitet. Gezeigt wird der Protein-Name, sowie der Gen-Name, die Ratio gegenüber nichttransduzierten 

monozytären Zellen (HIV transduziert / nicht-transduziert) und der p-Wert der Regulation. 

Protein Gen Name ratio p-Wert 

Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial SODM 3,24 8,3E-14 

Nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1 NOLC1 3,20 1,2E-05 

Transgelin-2 TAGL2 2,98 3,7E-06 

Tripeptidyl-peptidase TPP1 2,82 2,4E-08 

Actin-related protein 2/3 complex subunit 1B ARC1B 2,74 3,9E-07 

Perilipin-3 PLIN3 2,56 8,6E-12 

Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal K22E 2,56 6,2E-05 

60S acidic ribosomal protein P2 RLA2 2,33 1,2E-06 

Calreticulin CALR 2,11 3,3E-04 

Beta-hexosaminidase subunit alpha HEXA 2,07 8,2E-06 

Neutrophil cytosol factor 1 NCF1 2,07 2,9E-09 

Coronin-1C COR1C 2,07 1,1E-05 

Long-chain-fatty-acid CoA ligase ACSL1 2,06 2,1E-06 

Myosin regulatory light chain 12A/B ML12A/B 2,01 9,3E-07 

Sequestosome-1 SQSTM 2,01 1,7E-10 

Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 AN32A 1,96 5,7E-11 

ATP synthase subunit d ATP5H 1,82 5,0E-06 

Nuclear pore glycoprotein p62 NUP62 1,81 4,9E-06 

Prefoldin subunit 2 PFD2 1,76 2,1E-07 

Dynactin subunit 2 DCTN2 1,72 5,2E-07 

Histone H1.2 H12 1,67 1,8E-06 

Ubiquilin-4 UBQL4 1,67 1,4E-07 

SUMO-conjugating enzyme UBC9 1,67 1,7E-04 

Proteasome activator complex subunit 2 PSME2 1,63 1,8E-07 

Brain acid soluble protein 1 BASP1 1,62 2,0E-05 

Integrin beta-2 ITB2 1,62 3,1E-07 

Histone H1.5 H15 1,61 7,5E-07 

glucosamine (N-acetyl)-6-sulfatase GNS 1,56 1,3E-08 

LDLR chaperone MESD 1,55 2,6E-03 

58

Bei den Analysen wurden deutlich mehr herunterregulierte Proteine in HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen gegenüber nicht transduzierten monozytären Zellen 

detektiert. Diese waren mehrheitlich ribosomalen Ursprungs (Tabelle 3). Die bereits im Kontext 

von HIV beschriebenen Proteine Profilin (Ratio: 0,42; p = 4,9*10 -4 ), Small nuclear 

ribonucleoprotein (Ratio: 0,46; p = 7,9*10 -5 ) und DNA-directed RNA polymerase (Ratio: 0,47; 

p = 1,1*10 -3 ) zeigten eine besonders deutliche Herunterregulation (mindestens Faktor 0,67, 

Tabelle 3). 

Tabelle 3: In HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen herunterregulierte Proteine gegenüber nichttransduzierten 

monozytären Zellen. Es wurden nur Proteine berücksichtigt, deren Regulation eine Signifikanz von 

p < 0,01 unterschreitet. Gezeigt wird die Ratio gegenüber nicht-transduzierten monozytären Zellen (HIVtransduziert 

/ nicht-transduziert) und der p-Wert der Regulation. 

Protein Gen ratio p-Wert 

GTP-binding protein Rheb RHEB 0,30 6,5E-03 

Profilin PROF1 0,43 4,9E-04 

Putative RNA-binding protein RBM3 0,44 9,8E-05 

60S ribosomal protein L23a RL23A 0,45 1,4E-04 

Glia maturation factor gamma GMFG 0,46 2,9E-03 

Small nuclear ribonucleoprotein SMD3 0,46 7,9E-05 

Cysteine and histidine-rich domain-containing 

protein 1 CHRD1 0,47 1,8E-05 

HUMAN 40S ribosomal protein S27-like RS27L 0,47 3,9E-04 

DNA-directed RNA polymerases I, II, and III 

subunit RPAB1 0,47 1,1E-03 

40S ribosomal protein S24 RS24 0,47 4,2E-05 

60S ribosomal protein L23 RL23 0,48 1,4E-04 


Microsomal glutathione S-transferase 1 MGST1 0,50 1,4E-03 


Cell division control protein 42 CDC42 0,53 2,9E-04 


Surfeit locus protein 4 SURF4 0,53 1,3E-03 

Signal recognition particle 54 kDa protein SRP54 0,54 9,9E-05 

Cleavage and polyadenylation specificity 

factor subunit 6 CPSF6 0,54 6,0E-05 

59

Cold-inducible RNA-binding protein 

(Fragment) K7ELV6 0,54 3,9E-06 

Casein kinase I isoform alpha KC1A 0,54 2,5E-05 


Tropomyosin alpha-3 chain Q5VU61 0,56 1,6E-04 

Ras-related protein Rap-1b RAP1B 0,57 2,1E-03 

Proliferating cell nuclear antigen PCNA 0,57 5,4E-04 

Eukaryotic translation initiation factor 3 

subunit M EIF3M 0,57 7,2E-04 


Splicing factor U2AF 65 kDa subunit U2AF2 0,57 4,0E-04 

DAZ-associated protein 1 DAZP1 0,57 1,8E-03 

Signal peptidase complex catalytic subunit 

SEC11A SC11A 0,57 2,4E-03 

Translationally-controlled tumor protein TCTP 0,57 2,2E-04 

Protein NipSnap homolog 3A NPS3A 0,57 4,9E-04 

Glucosamine-6-phosphate isomerase 1 GNPI1 0,57 1,8E-05 

ADP-ribosylation factor 1 ARF1 0,57 3,1E-05 

Thioredoxin domain-containing protein 9 F8WBV5 0,58 2,1E-04 

Transcription factor BTF3 BTF3 0,58 1,1E-04 

Small nuclear ribonucleoprotein Sm D1 SMD1 0,58 2,7E-04 


Coatomer subunit zeta-1 COPZ1 0,58 4,9E-04 

Hypoxanthine-guanine 

phosphoribosyltransferase HPRT 0,58 7,1E-04 

DNA-directed RNA polymerases I and III 

subunit RPAC1 RPAC1 0,58 2,7E-05 

Cyclin-dependent kinase 6 CDK6 0,58 3,6E-04 

Small nuclear ribonucleoprotein E RUXE 0,58 2,0E-03 

TIP41-like protein TIPRL 0,58 2,3E-04 

ADP-ribosylation factor-like protein 8B ARL8B 0,59 6,3E-03 

N-alpha-acetyltransferase 10 NAA10 0,59 6,2E-04 

Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske UCRI 0,59 8,5E-04 

TGF-beta receptor type-1 TGFR1 0,59 2,1E-03 


Thioredoxin THIO 0,60 8,4E-05 

60

Galectin-1 LEG1 0,60 9,7E-03 

Suppressor of G2 allele of SKP1 homolog SUGT1 0,60 1,7E-05 

Apoptosis inhibitor 5 API5 0,61 3,9E-03 

Proteasome subunit beta type-4 PSB4 0,61 3,9E-03 

Spermidine synthase SPEE 0,61 5,0E-05 

Dolichol-phosphate mannosyltransferase 

subunit 1 DPM1 0,61 1,5E-05 

26S proteasome non-ATPase regulatory 

subunit 14 PSDE 0,61 3,2E-03 


U1 small nuclear ribonucleoprotein A SNRPA 0,62 3,6E-04 

Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial CY1 0,62 4,9E-03 

UPF0687 protein C20orf27 CT027 0,62 3,8E-05 

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2 HNRH2 0,62 1,4E-03 

ATP synthase subunit e, mitochondrial ATP5I 0,62 3,6E-05 

Eukaryotic translation initiation factor 1A, X- 

chromosomal IF1AX 0,62 1,9E-03 

26S protease regulatory subunit 8 PRS8 0,62 2,6E-05 

Thioredoxin-dependent peroxide reductase, 

mitochondrial PRDX3 0,62 2,7E-05 

Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7 PP1R7 0,62 3,6E-03 

ATP synthase F(0) complex subunit B1, 

mitochondrial AT5F1 0,62 2,2E-05 

Regulator of chromosome condensation RCC1 0,63 4,2E-07 

Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic THIC 0,63 1,7E-04 

Ras-related protein Rab-2A RAB2A 0,63 1,7E-03 


40S ribosomal protein S15a RS15A 0,64 4,1E-03 

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L HNRPL 0,64 1,4E-05 


Ribosome maturation protein SBDS SBDS 0,64 7,6E-05 

Mitochondrial import receptor subunit TOM40 TOM40 0,64 2,6E-04 

GTP-binding protein SAR1a SAR1A 0,64 1,1E-02 

Non-POU domain-containing octamer-binding 

protein NONO 0,64 9,0E-04 

60S ribosomal protein L10a RL10A 0,65 4,0E-05 

61

Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, 

mitochondrial ECH1 0,65 1,1E-05 


L-lactate dehydrogenase B chain LDHB 0,65 1,8E-04 

Polypyrimidine tract-binding protein 1 PTBP1 0,65 5,1E-06 

KAD2_HUMAN Adenylate kinase 2, 

mitochondrial KAD2 0,65 6,2E-05 


Actin-related protein 2/3 complex subunit 4 ARPC4 0,66 9,0E-03 


SWI/SNF complex subunit SMARCC1 SMRC1 0,66 1,9E-04 

RNA-binding protein Raly RALY 0,66 1,2E-05 

Proteasome assembly chaperone 1 PSMG1 0,66 1,8E-05 


Nuclear receptor coactivator 5 NCOA5 0,66 6,8E-05 

4.3 Einfluss von Co-Kulturüberständen aus primärer embryonaler Mikroglia und 

monozytären Zellen auf kortikale Rattenneurone 

In eigenen Vorarbeiten konnte ein Zellkulturmodell entwickelt werden, in dem die 

Wechselwirkung zwischen Mikroglia und HIV-transduzierten monozytären Zellen abgebildet 

wird (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013). Dabei konnte gezeigt werden, dass im Rahmen der 

„bystander hypothesis“ embryonale Mikroglia in Kontakt mit HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen mit einer stärkeren Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen 

reagieren (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013). Im Rahmen einer betreuten Masterarbeit wurde 

die funktionelle Relevanz der beobachteten Aktivierung in der Co-Kultur untersucht 

(Schanzmann, 2013). Hierfür wurde überprüft, ob die entsprechenden Co-Kulturüberstände 

(Ambrosius, 2012) in einer Primärkultur von kortikalen Rattenneuronen Zelltod auslösten. 

Überstände der Co-Kultur aus embryonaler Mikroglia mit HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen löste signifikant mehr Zelltod aus als Überstände von embryonaler 

Mikroglia mit HIV-leer transduzierten monozytären Zellen (p < 0,01) oder nicht-transduzierten 

monozytären Zellen (p < 0,001). Dabei kam es zu einem Anstieg um den Faktor 2 bei der 

Zelltodrate (Abbildung 12). 

62

Abbildung 12: Untersuchung der durch Co-Kulturüberstände ausgelösten Neurotoxizität. Überstände von HIV- 

Vektor transduzierten monozytären Zellen in Co-Kultur mit primärer embryonaler Mikroglia lösten signifikant mehr 

Zelltod in einer primären kortikalen Rattenneuronenkultur aus, verglichen mit Überständen aus einer Co-Kultur mit 

HIV-leer transduzierten monozytären Zellen oder nicht-transduzierten monozytären Zellen (Schanzmann, 2013). 

Gezeigt werden ´zwei unabhängige Experimente in 3 (nicht-transduziert), 5 (HIV-leer) oder 6 (HIV-Vektor) 

Wiederholungen. Daten werden als prozentualer Zelltod mit dazugehörigem Standardfehler gezeigt. Signifikanzen 

wurden mit einem one-way ANOVA (p < 0,0001) und anschließendem Tukey`s multiple comparison test 

berechnet. ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. 

4.4 Spezifische Aktivierung von HMC3 in der Co-Kultur mit HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen 

Ähnlich wie in der Co-Kultur aus embryonaler Mikroglia und monozytären Zellen (Faissner, 

2013; Ambrosius, 2012; Faissner, Ambrosius et al., 2014) zeigen auch Zellen der mikroglialen 

Zelllinie HMC3 eine spezifische Aktivierung durch die Anwesenheit von HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen. An Abbildung 13 wird deutlich, dass es durch Anwesenheit 

von HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen in der Co-Kultur zu einer signifikant 

höheren Sekretion von CXCL10, CCL5, CCL2 und IL-6 gegenüber den Kontrollkonditionen 

kommt. In vorhergehenden Versuchen konnten diese vier Zytokine als besonders deutlich 

regulierte Zytokine im Kontext des entwickelten Co-Kultursystems identifiziert werden 

(Faissner, 2013; Ambrosius, 2012; Faissner, Ambrosius et al., 2014). In der Mono-Kultur aus 

HMC3 Zellen mit infektiösen Überständen kam es nur bei CXCL10 und IL-6 zu einer 

signifikanten Hoch-Regulation gegenüber den Kontrollen (Abbildung 13 A/D), wohingegen bei 

CCL5 keine Unterschiede zu erkennen waren (Abbildung 13 B). Interessanterweise kam es 

ohne Anwesenheit von monozytären Zellen zu keiner Sekretion von CCL2 (Abbildung 13 C). 

In der Co-Kultur mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen wurden die Zytokine 

CXCL10, CCL5, CCL2 (p < 0,001) und IL-6 (p < 0,01) stärker sezerniert als in der Mono-Kultur. 

63

Das unterstützt die „bystander-hypothesis“, in der postuliert wird, dass es durch Kontakt mit 

infizierten Zellen zu einer persistierenden Immunreaktion kommt. 

Abbildung 13 A-D: HMC3 in Co-Kultur mit monozytären Zellen (links) und in Mono-Kultur mit infektiösen 

Überständen (rechts). Gemessen wurden die Zytokine CXCL10 (A), CCL5 (B), CCL2 (C) und IL-6 (D). Gezeigt 

sind drei unabhängige Experimente in Triplikaten. Signifikanzen sind im Vergleich zu HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen in Co-Kultur mit HMC3 (*) sowie im Vergleich zu HMC3 in Mono-Kultur mit HIV-Vektor 

Überständen (+) gezeigt. Werte sind in pg/ml mit korrespondierendem Standardfehler angegeben. Signifikanzen 

wurden berechnet mit einem one-way ANOVA (p < 0,0001) kombiniert mit einem Tukey`s multiple comparison 

test. *** bzw. +++ = P < 0,001; ** = p < 0,01. 

64

4.5 Der Einfluss von Teriflunomid und MMF auf HMC3 und monozytäre Zellen 

Anhand der Co-Kultur aus HMC3 und monozytären Zellen sollte der Einfluss der 

pharmakologischen Substanzen Teriflunomid und MMF untersucht werden. Dabei wurde 

zunächst überprüft, ob Teriflunomid und MMF in den eingesetzten Konzentrationen 

zytotoxisch auf monozytäre Zellen und HMC3 wirkte. Bei monozytären Zellen wurde durch die 

Gabe der supra-physiologischen Konzentration von 1000 µM MMF ein signifikanter Anstieg 

der Zelltodrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle detektiert, wohingegen bei niedrigeren 

Konzentrationen von Teriflunomid und MMF kein verstärkter Zelltod gemessen werden konnte 

(Abbildung 14 A). Bei Zugabe zu den HMC3 Zellen konnte kein Anstieg der Zelltodrate durch 

die beiden Substanzen in verschiedenen Konzentrationen detektiert werden (Abbildung 14 B). 

Ebenfalls zeigten adulte Mikroglia nach Behandlung mit den verwendeten Konzentrationen 

keinen erhöhten Zelltod (Daten nicht gezeigt). 

Abbildung 14 A-B: Zytotoxischer Effekt von Teriflunomid und MMF in verschiedenen Konzentrationen auf 

monozytäre Zellen (A) und HMC3 (B). Zellen wurden für 24 h mit 10-100 µM Teriflunomid oder 30-1000 µM MMF 

behandelt. Zelltod wurde via Durchflusszytometrie und 7AAD-Färbung (A) oder mittels bisBenzimide H33342 / 

7AAD Doppelfärbung (B) analysiert. Es wurden drei unabhängige Experimente in Triplikaten durchgeführt. 

Signifikanzen wurden in Abhängigkeit zu unbehandelten Zellen berechnet und mittels one-way ANOVA (p < 

0,0001) und Tukey`s multiple comparison test analysiert. *** = p < 0,001 (A). one-way ANOVA nicht signifikant 

(B). Daten zeigen prozentualen Anteil an Zelltod in Verbindung mit dem dazugehörigen Standardfehler. 

4.6 Der antiinflammatorische Effekt von Teriflunomid und MMF auf die Co-Kultur 

Die Co-Kultur aus HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen und HMC3 wurde 

verwendet, um den Einfluss von Teriflunomid und MMF auf die Sekretion der Zytokine 

CXCL10, CCL5, CCL2 und IL-6 zu untersuchen. Durch die Gabe von 30 µM Teriflunomid 

konnte die Sekretion von CXCL10, CCL2 und IL-6 signifikant (p < 0,001) gegenüber der HIV- 

Vektor transduzierten Kontrolle verringern werden, die nur mit der Trägersubstanz DMSO 

65

ehandelt wurde (Abbildung 15 B/C/D). 100 µM MMF konnte die Sekretion von CXCL10 in der 

Co-Kultur gegenüber der HIV-Vektor transduzierten Kontrolle signifikant (p < 0,001) verringern 

(Abbildung 15 A). Beide Substanzen konnte einen, wenn auch nicht signifikanten Dosis 

abhängigen Effekt in der Co-Kultur hervorrufen. 

Abbildung 15 A-D: Einfluss der pharmakologischen Substanzen Teriflunomid und MMF auf die Co-Kultur von 

HMC3 mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen. 30 µM Teriflunomid verringerte die Sekretion von 

CXCL10 (A), CCL2 (C) und IL-6 (D), wohingegen 100 µM MMF die Sekretion von CXCL10 (A) verringerte. 

Gezeigt sind drei unabhängige Experimente in Triplikaten. Signifikanzen wurden gegenüber DMSO behandelten 

Zellen berechnet. Zwischen DMSO behandelten Zellen und unbehandelten Zellen kam es zu keinen 

Unterschieden (Daten nicht gezeigt). Daten werden als pg/ml sezernierter Zytokine mit dazugehörigem 

Standardfehler gezeigt. Die Statistik wurde mit Hilfe eines one-way ANOVA (p < 0,0001) (A/C/D; B nicht 

signifikant) in Verbindung mit einem Tukey`s multiple comparison test durchgeführt. *** = p < 0,001. 

4.7 Der antiinflammatorische Effekt von Teriflunomid und MMF auf die Mono- 

Kultur von HMC3 mit HIV-Vektor Partikeln 

Nachdem bereits der Einfluss der Substanzen Teriflunomid und MMF auf die Co-Kultur aus 

HMC3-Zellen und HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen gezeigt werden konnte, 

sollte in einem nächsten Schritt untersucht werden, ob diese Effekte Co-Kultur-spezifisch 

66

waren oder ob ein direkter Einfluss auf die HMC3 der Reduktion der sezernierten Zytokine zu 

Grunde lagen. Dafür wurde eine Mono-Kultur von HMC3 mit HIV-Vektor Partikeln angelegt 

und Teriflunomid und MMF in diesem Umfeld getestet. 30 µM Teriflunomid reduzierte nur die 

Sekretion von CXCL10 signifikant (p < 0,01) (Abbildung 16 A). Interessanterweise reduzierte 

100 µM MMF die Sekretion von CXCL10, CCL5 und IL-6 signifikant (p < 0,001) verglichen mit 

HMC3 Zellen in Kontakt mit HIV-Vektor Partikeln (Abbildung 16 A/B/C). Somit ergibt sich ein 

konträres Bild zu der Wirkweise der pharmakologischen Substanzen in der Co-Kultur. Wie 

bereits unter 4.4 beschrieben, sezernierten HMC3 in Abwesenheit von monozytären Zellen 

kein CCL2. 

Abbildung 16 A-C: Sekretion von Zytokinen durch HMC3 bei Behandlung mit Teriflunomid oder MMF. Gabe von 

30 µM Teriflunomid verringert die Ausschüttung von CXCL10 (A). Die Sekretion der Zytokine CXCL10 und IL-6 

durch HMC3 ist durch die Gabe von 100 µM MMF signifikant verringert (A/C). Gezeigt werden 3-6 unabhängige 

Experimente in Triplikaten. Signifikanzen werden im Verhältnis zu HMC3 in Kontakt mit HIV-Vektor Partikeln 

gezeigt. Daten werden als pg/ml mit dazugehörigen Standardfehler dargestellt. One-way ANOVA mit 

nachfolgendem Tukey`s multiple comparison test wurde verwendet um Signifikanzen zu berechnen (p < 0,0001) 

(A/B/C). *** = p < 0,001. 

67

4.8 Der antiinflammatorische Einfluss von MMF auf HIV-Vektor transduzierte 

monozytäre Zellen 

Die monozytären Zellen sezernierten weniger Zytokine in Anwesenheit von HIV-Vektor 

Partikeln als HMC3 oder wie in den Co-Kulturen beobachtet. Die Anwesenheit von HIV-Vektor 

Partikeln führte bei den untersuchten monozytären Zellen im Gegensatz zu HMC3 zu keiner 

Sekretion von IL-6. Zwar kam es auch in den monozytären Zellen zu einer spezifischen 

Hochregulation von CXCL10, CCL5 und CCL2 durch Transduktion mit HIV-Vektor (Abbildung 

17 A/B/C), jedoch in einem geringeren Maße als vorherig gezeigt (Kapitel 4.6 und Kapitel 4.7). 

Dies verdeutlicht die Aussage, dass den transduzierten monozytären Zellen eine 

Verstärkerrolle der Immunreaktion zukommt, wie sie verglichen mit den Co-Kultur 

Experimenten anhand der deutlich höheren Sekretion von Zytokinen zu sehen ist. Durch die 

Gabe von 100 µM MMF konnte die Sekretion von CXCL10 (Abbildung 17 A) und CCL5 

(Abbildung 17 B) signifikant gesenkt werden (p < 0,05). Durch die Gabe von MMF kam es zu 

einer erhöhten Sekretion von CCL2 (p < 0,001) verglichen mit HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen (Abbildung 17 C). 

Abbildung 17 A-C: Sekretion von Zytokinen durch monozytäre Zellen nach Behandlung mit MMF. 100 µM MMF 

reduzierte die Sekretion von CXCL10 (A) und CCL5 (B), wohingegen die Sekretion von CCL2 erhöht wurde (C). 

Versuch wurde in ein (30 µM MMF) bis zwei unabhängigen Experimenten mit 2-3 Wiederholungen durchgeführt. 

Daten werden als pg/ml mit dazugehörigem Standardfehler gezeigt. Zur Berechnung der Statistik wurde ein oneway 

ANOVA (CXCL10: p < 0,01; CCL5, CCL2: p < 0,0001) mit einem Tukey`s multiple comparison test 

durchgeführt. * = p < 0,05; ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. 

68

4.9 Der antiinflammatorische Effekt von MMF auf adulte Mikroglia in Co-Kultur mit HIV- 

Vektor transduzierten monozytären Zellen 

Um die Ergebnisse aus der Co-Kultur von HMC3 und HIV-Vektor transduzierten monozytären 

Zellen unter Einfluss von MMF anhand von primären Zellen zu überprüfen, wurde MMF in der 

Co-Kultur von adulten Mikroglia mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen eingesetzt. 

Wegen der wenigen verfügbaren Zellen konnte in dieser Arbeit lediglich der Einfluss von MMF, 

nicht aber von Teriflunomid auf die adulte Mikroglia überprüft werden. 100 µM MMF konnte 

die Sekretion von CXCL10 (p < 0,05) (Abbildung 18 A) und CCL5 (p < 0,01) (Abbildung 18 B) 

in der Co-Kultur reduzieren, sowie in der Konzentration von 30 µM MMF CCL5 (p < 0,05) 

(Abbildung 18 B). Die Sekretion von CCL2 (Abbildung 18 C) und IL-6 (Abbildung 18 D) wurde 

durch die Gabe von MMF nicht signifikant beeinflusst. 

Abbildung 18 A-D: Sekretion von Zytokinen in Co-Kultur aus adulter Mikroglia und HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen. Die Gabe von 100 µM MMF reduzierte die Sekretion von CXCL10 (A) und CCL5 (B) in der 

Co-Kultur signifikant (p < 0,05, bzw. p < 0,01). 30 µM MMF reduzierte die Sekretion von CCL5 signifikant (p < 

0,05). CCL2 und IL-6 wurden durch die Gabe von MMF nicht beeinflusst (C/D). Gezeigt werden ein (CCL5, CCL2 

und IL-6) bis zwei (CXCL10) unabhängige Experimente mit 2 Wiederholungen. Die Berechnung der Signifikanzen 

erfolgte mit einem one-way ANOVA (p < 0,0001) in Kombination mit einem Tukey`s multiple comparison test. * = 

p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). 

69

4.10 Der Einfluss von direktem Zell-Zellkontakt in der Co-Kultur aus HMC3 und HIV- 

Vektor transduzierten monozytären Zellen 

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Sekretion von Zytokinen in einer Co-Kultur am 

stärksten ist und die monozytären Zellen in diesem Prozess eine Verstärkerrolle einzunehmen 

scheinen, stellte sich die Frage, ob für den Prozess der Verstärkung direkter Zell-Zellkontakt 

nötig ist. Dafür wurde eine Co-Kultur aus HMC3 Zellen mit monozytären Zellen angelegt und 

diese wie vorherig beschrieben (Kapitel 3.5.4) statisch oder unter ständigem Schütteln 

inkubiert um die Ausbildung von direktem Zell-Zellkontakt zu minimieren. 

Durch das Schütteln der Co-Kultur kam es zu einer stärkeren Sekretion von CXCL10 

(Abbildung 19 A) (p < 0,05) und IL-6 (Abbildung 19 D) (p < 0,001), sowie zu einer geringeren 

Sekretion von CCL2 (Abbildung 19 C) (p < 0,001) im Vergleich zur statischen Co-Kultur. 

Interessanterweise betraf dies nicht die Sekretion von CXCL10, CCL5 und IL-6 in den 

Kontrollkonditionen CaCl und nicht-transduziert (Abbildung 19 A/B/D). Lediglich bei CCL2 kam 

es zu einer generell niedrigeren Sekretion in der geschüttelten Co-Kultur bei den 

Kontrollkonditionen verglichen mit der statischen Co-Kultur (Abbildung 19 C). 

Abbildung 19 A-D: Einfluss von direktem Zell-Zellkontakt auf die Co-Kultur aus HMC3 und monozytären Zellen. 

Durch Inkubation der Co-Kultur unter Schütteln kam es zu einer stärkeren Sekretion von CXCL10 (p < 0,05) (A) 

70

und IL-6 (p < 0,001) (D) verglichen mit der statischen Kultur bei Anwesenheit von HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen. Konträr zu CXCL10 und IL-6 kam es zu geringerer Sekretion von CCL2 (p < 0,001) (C). Zur 

Bestimmung der Signifikanzen wurde ein one-way ANOVA (p < 0,0001) mit angeschlossenem Tukey`s multiple 

comparison test durchgeführt. * zeigt Signifikanzen gegenüber statischer Co-Kultur aus HMC3 mit HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen, wohingegen + Signifikanzen gegenüber geschüttelter Co-Kultur aus HMC3 

mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen indizieren. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. 

4.11 Der Einfluss von Co-Kulturüberständen aus HMC3 und monozytären 

Zellen auf den Zelltod von fötalen humanen Neuronen und Behandlung mit 

Teriflunomid oder MMF 

Der Einfluss von Co-Kulturüberständen aus HMC3 und monozytären Zellen sollte auf fötalen 

humanen Neurone untersuchen werden. Dabei sollte die Menge an lebenden Neuronen mittels 

MAP-2 Färbung bestimmt und so der prozentuale Zelltod abgeleitet werden (Abbildung 20). 

Die Neurone, behandelt mit den Kontrollüberständen, zeigten signifikant weniger Zelltod als 

die Neurone, die mit Co-Kulturüberstand von HMC3 und HIV-Vektor transduzierten 

monozytären Zellen behandelt wurden (p < 0,001). Dieser Effekt konnte durch die vorherige 

Behandlung der Co-Kultur mit 30 µM MMF, 10 µM MMF und 10 µM Teriflunomid signifikant 

abgeschwächt werden (p < 0,05). HIV-Vektor in Monokultur von HMC3 löste im Vergleich zu 

Co-Kulturüberständen signifikant weniger Zelltod aus (p < 0,001). 

Abbildung 20: Einfluss von Co-Kulturüberständen auf fötale humane embryonale Neurone. Zellen wurden mit 

Überständen für 48 h inkubiert und danach die Anzahl der lebenden Neurone mittels MAP-2 Färbung bestimmt. 

Die Zellzahl wurde auf die Kondition Neurone mit Überstand von HMC3 mit nicht-transduzierten monozytären 

71

Zellen normalisiert. Überstand aus der Co-Kultur von HMC3 mit HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen 

verringerte die Anzahl der lebenden Neurone (p < 0,001). Dieser Effekt konnte durch die Gabe von 30 µM MMF, 

10 µM MMF und 10 µM Teriflunomid abgeschwächt werden. Überstände von HMC3-Monokulturen verringerten 

nicht die Anzahl der lebenden Neurone (p < 0,001). Signifikanzen wurden im Vergleich zu HMC3 in Co-Kultur mit 

HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen angegeben. Medium mit zugesetztem 3 µM H2O2 diente der 

Zelltod-Induktion und somit als Positiv-Kontrolle. Es wurde Überstand von 3 unabhängigen Experimente in 

Triplikaten eingesetzt. Zur Berechnung der Signifikanzen wurde ein one-way ANOVA (p < 0,0001) mit 

kombiniertem Dunnett`s multiple comparisons test verwendet. * = p < 0,05, *** = p < 0,001. 

72

5. Diskussion 

Ziel dieser Doktorarbeit war, die durch HIV ausgelösten inflammatorischen Prozesse im ZNS 

näher zu charakterisieren. Früh wurde in der Literatur beschrieben, dass es bei HAND zu 

Entzündungsreaktionen im ZNS kommt, in deren Verlauf Neurodegeneration auftritt und deren 

Grundlage nicht alleinig die Viruslast ist (Adle-Biassette et al., 1999; Adle-Biassette et al., 

1995; Gonzalez-Scarano and Martin-Garcia, 2005). Dieses berücksichtigend, wurde die 

„bystander hypothesis“ postuliert, in der beschrieben wird, dass residente Immunzellen des 

ZNS durch einwandernde HIV-infizierte Zellen persistierend aktiviert werden und dies in 

kausalem Zusammenhang mit Neurodegeneration als Grundlage von HAND steht (Gonzalez- 

Scarano and Martin-Garcia, 2005). Auf dieser Hypothese aufbauend, wurde in der eigenen 

Arbeitsgruppe ein Zellkulturmodell entwickelt, das eben diese molekularen und zellulären 

Abläufe anhand von humaner embryonaler Mikroglia und HIV-transduzierten Zellen abbildet 

(Ambrosius, 2012; Faissner, 2013; Faissner, Ambrosius et al., 2014). 

In dieser Arbeit wurde das entwickelte Modell modifiziert und die Interaktionen zwischen den 

Zelltypen weiter beleuchtet. Die viralen Partikel wurden näher charakterisiert und darüber 

hinaus deren Einfluss auf Veränderungen des Proteoms bei der Transduktion von 

monozytären Zellen untersucht. Die funktionelle Relevanz der Co-Kultur Aktivierung wurde 

mittels Neurotoxizitäts-Assays anhand fötaler humaner Neurone nachgewiesen. Das 

neurotoxische Potential der Überstände konnte durch vorherige Behandlung der Co-Kultur mit 

den immunmodulatorischen Substanzen Teriflunomid und MMF vermindert werden. 

5.1 Die Co-Kultur Interaktionen im Kontext von HAND 

Die molekularen Abläufe bei HAND sind mannigfaltig und nicht genau beleuchtet. Viele 

Arbeiten diskutieren den direkten neurotoxischen Effekt von HIV und dessen Proteinen (Shah 

and Kumar, 2016; Rao et al., 2016). Dabei wird besonders den viralen Proteinen gp120, vpr 

und tat die Eigenschaft zugesprochen, oxidativen Stress als körpereigene Antwort auszulösen 

(Ronaldson and Bendayan, 2008; Deshmane et al., 2009; Turchan-Cholewo et al., 2009). 

Auch die isolierte Antwort von glialen Zellen, wie Mikroglia und Astrozyten auf HIV und die 

daraus resultierenden Immunreaktionen konnten bereits anhand von Zellkulturmodellen 

nachgewiesen werden (Zenon et al., 2015; Jin et al., 2016). Das von uns entwickelte und hier 

modifizierte Modell zielt speziell auf die Interaktion von Mikroglia und Monozyten im Kontext 

einer HIV-Infektion ab (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013; Faissner, Ambrosius et al., 2014). 

Neben den Wechselwirkungen HIV infizierter Zellen mit Mikroglia (Faissner, Ambrosius et al., 

2014), sind auch zu Interaktionen mit anderen Zelltypen, wie beispielsweise Astrozyten, 

bekannt. So zeigen Astrozyten eine stärkere Aktivierung im Kontext einer Co-Kultur mit HIV- 

73

Vektor transduzierten monozytären Zellen (Ambrosius, 2012; Muratori et al., 2010). In 

vergleichenden Studien der zellspezifischen Aktivierung konnten Mikroglia als Haupt- 

Mediatoren im Kontext von HAND identifiziert werden (Ambrosius, 2012; Faissner, Ambrosius 

et al., 2014). Diese Erkenntnis wird gestützt von ex vivo Ergebnissen, die zeigten, dass im 

Liquor von HIV + Patienten ohne vorherig diagnostizierte neurokognitive Beeinträchtigungen 

bereits monozytäre und mikrogliale Aktivierungsmarker mit Markern für Neurodegeneration 

korrelierten (Faissner, Ambrosius et al., 2014; McGuire et al., 2015; Kamat et al., 2012a). Aus 

diesem Grund wurden in dieser Arbeit die mikroglialen und monozytären Interaktionen 

adressiert. 

Zusätzlich zur monozytären und mikroglialen Beteiligung konnte gezeigt werden, dass in 

diesem Kontext die proinflammatorischen Zytokine in cART behandelten Patient deutlich 

erhöht blieben, nachdem bereits die Viruslast abgenommen hatte (Kamat et al., 2012b). Dies 

unterstützt die Aussage, dass nicht die Viruslast im ZNS entscheidend ist für die bei HAND 

zugrundeliegenden inflammatorischen Prozesse, sondern viel mehr die Interaktionen 

zwischen den residenten Immunzellen und den eingewanderten HIV infizierten Zellen. Anhand 

des etablierten Zellkulturmodells konnte nachgestellt werden, dass die Interaktion von 

Mikroglia und HIV transduzierten monozytären Zellen zu einer stärkeren Aktivierung der Co- 

Kultur führten, verglichen mit der isolierten Aktivierung von embryonaler Mikroglia oder 

monozytären Zellen durch die Anwesenheit von HIV-Partikeln (Ambrosius, 2012; Faissner, 

Ambrosius et al., 2014). Diese Erkenntnis, dass virale Partikel keine vollständige Aktivierung 

auslösen, stehen im Einklang mit Daten aus HIV + Patienten, bei denen nach Therapiebeginn 

zwar eine Verminderung des Virus im ZNS, nicht jedoch eine verminderte Immunaktivierung 

gezeigt werden konnte (Airoldi et al., 2012a). 

In HIV + Patienten führt die Beteiligung der Mikroglia im Kontext der HIV-Infektion zu einer 

Aktivierung des Inflammasoms und mündet konsekutiv in neurotoxischen Prozessen (Walsh 

et al., 2014). Die funktionelle Relevanz der Co-Kultur Überstände im Hinblick auf induzierte 

Neurotoxizität wurde anhand kortikaler Neuronen zum einen durch Zugabe des Co-Kultur 

Überstandes des ursprünglichen Modells auf Rattenneurone (Schanzmann, 2013) und zum 

anderen durch Zugabe des modifizierten Co-Kultur Überstandes auf fötale humane Neurone 

untersucht. Interessanterweise lösten in beiden Modellen die Überstände der Co-Kultur aus 

HIV-Vektor transduzierten monozytären Zellen und mikroglialen Zellen eine erhöhte Induktion 

von Zelltod bei den Neuronen aus. Anhand des modifizierten Modells konnte auch gezeigt 

werden, dass durch den Überstand von mikroglialen Zellen mit HIV-Vektor Partikel bei 

Abwesenheit monozytärer Zellen kein erhöhter Zelltod der fötalen humanen Neurone 

ausgelöst werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die funktionelle Relevanz der 

Aktivierung in der Co-Kultur und stützen somit die „bystander hypothesis“, bei der eine 

74

verstärkte Aktivierung durch die Interaktion von Mikroglia und Monozyten postuliert wird 

(Gonzalez-Scarano and Martin-Garcia, 2005). 

Neben der gezeigten potentiellen Verstärkerfunktion der monozytären Zellen wird besonders 

dem HIV-Protein tat eine verstärkende Funktion im Kontext immunologischer Prozesse bei 

einer HIV-Infektion zugesprochen. Es wurde postuliert, dass freigesetztes tat unter anderem 

auf nicht infizierte Zellen wirkt und dort eine ausgelöste Immunreaktion verstärken kann (Ruiz 

and Prasad, 2016). Bei der Herstellung viraler Partikel in unserem System wurde mit tat cotransfiziert. 

Das hatte zur Folge, dass das virale Protein ebenfalls in dem verwendeten Modell 

vorlag. Bei dem Einsatz der viralen Partikel in der Co-Kultur und in der Mono-Kultur wurden 

gleiche Mengen an tat hinzugefügt. Trotzdem konnte ein unterschiedlicher Grad der 

Aktivierung in den Kulturen beobachtet werden. Erst die Anwesenheit von monozytären Zellen 

in der Co-Kultur sorgte für eine verstärkte Sekretion von Zytokinen und signifikant erhöhtem 

Zelltod bei Neuronen durch den korrespondierenden Überstand. Bezüglich der Aktivierung und 

der induzierten Neurotoxizität in unserem Modell scheinen somit die transduzierten 

monozytären Zellen und nicht das virale Protein tat eine wichtige Verstärkerfunktion 

einzunehmen. Der Einfluss von tat auf das entwickelte Co-Kultur Modell kann jedoch nicht 

abschließend geklärt werden. Es wurde beschrieben, dass tat einen direkten Einfluss auf 

monozytäre Zellen hat und eine Veränderung der Genexpression hervorruft (Lin et al., 2012). 

Inwieweit generell ein virales Protein auf die monozytären Zellen wirkt und originär für die 

spätere Verstärkerfunktion in der Co-Kultur, beziehungsweise für die ausgelöste Neurotoxizität 

durch die Co-Kultur Überstände verantwortlich ist, kann durch diese Arbeit nicht beantwortet 

werden. 

Ebenfalls bleibt die Frage offen, wie der vermutete Verstärkereffekt, den die monozytären 

Zellen einnehmen, auf die mikroglialen Zellen wirkt, beziehungsweise wie die mikroglialen und 

monozytären Zellen interagieren. Dabei ist sowohl eine Kommunikation via direktem Zell- 

Zellkontakt oder anhand von löslicher Mediatoren denkbar. In einem Model aus HIV infizierten 

T-Zellen und dendritischen Zellen ist die Notwendigkeit direkten Zell-Zellkontakts beschrieben, 

um eine immunologische Antwort anhand von Interferonen zu detektieren (Bego et al., 2015). 

Allerdings konnte in dem hier verwendeten Zellkulturmodell keine erhöhten Mengen an 

Interferonen detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Virale RNA in Monozyten kann anhand 

der LTR`s durch TLR8 erkannt werden und eine Interferon-unabhängige Aktivierung auslösen 

(Chattergoon et al., 2014). Für einen Interferon-unabhängigen Aktivierungsweg sprechen auch 

eigene vorhergehende Arbeiten, in denen gezeigt werden konnte, dass die Anwesenheit der 

viralen RNA, lediglich bestehend aus den LTR`s, in monozytären Zellen ausschlaggebend für 

die spätere vollständige Aktivierung der Co-Kultur war (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013; 

Faissner, Ambrosius et al., 2014). Ebenfalls einhergehend mit der unterschiedlichen Art der 

75

Aktivierung, konnte anhand der in dieser Dissertation durchgeführten Versuche gezeigt 

werden, dass Co-Kulturen die unter konstantem Schütteln inkubiert wurden, eine höhere 

Zytokinsekretion zeigten als nicht geschüttelte Vergleichskulturen. Durch die Inkubation einer 

Co-Kultur unter konstantem Schütteln können Zell-Zellkontakte minimiert werden. Das konnte 

in Kulturen aus Lymphozyten und dendritischen Zellen beobachtet werden (Sourisseau et al., 

2007; Lepelley et al., 2011). Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zeigten, dass es 

ohne Ausbildung eines statischen Zell-Zellkontakts zu einer erhöhten Aktivierung der Co- 

Kultur kam, was anhand der Sekretion der Zytokine CXCL10, CCL5 und IL-6 zu erkennen war. 

Diese Daten sollten allerdings eher dahingehend interpretiert werden, dass ein direkter und 

statischer Zell-Zellkontakt zwischen mikroglialen Zellen und monozytären Zellen für die 

vollständige Aktivierung der Co-Kultur nicht zwingend notwendig war, als dass ausbleibender 

Zell-Zellkontakt in diesem Model die Sekretion sogar erhöhen kann. Um dies zu validieren und 

potentielle Zellkultur Artefakte auszuschließen, sollten zukünftig Experimente mit einem 

Transwell-System durchgeführt werden, durch das es zu einer strikten Trennung zwischen den 

Zelltypen kommt. 

Generell hat das verwendeten Zellkulturmodells einige Limitationen, wie den Einsatz 

mikroglialer und monozytärer Zelllinien. Hierbei ähneln die Zelllinien den primären Zellen zwar 

stark, doch handelt es sich um modifizierte primäre Zellen (Etemad et al., 2012; Sundstrom 

and Nilsson, 1976). Im Falle der mikroglialen Zellen brachte der Einsatz der Zelllinie HMC3 

eine bessere Verfügbarkeit der Zellen und eine höhere Homogenität der Co-Kulturüberstände 

mit sich, verglichen mit der ursprünglich verwendeten und schwer zu bekommenden 

embryonalen humanen Mikroglia (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013; Faissner, Ambrosius et 

al., 2014). Um die anhand der mikroglialen Zelllinie gewonnenen Ergebnisse zu validieren, 

wurden Schlüsselexperimente in dieser Arbeit mit isolierter adulter Mikroglia wiederholt. Dabei 

konnte der bystander hypothesis folgend, eine sich ähnelnde Antwort beider Zelltypen in dem 

entwickelten Model beobachtet werden. Diese Validierung anhand ex vivo gewonnener 

Mikroglia war notwendig, da bereits kleine Veränderungen in den Bedingungen der Zellkultur 

zu unterschiedlichem Verhalten der Mikroglia führen kann (Tam et al., 2016). Die Verfügbarkeit 

der adulten Mikroglia war allerdings sehr gering, weshalb nur MMF und nicht Teriflunomid an 

diesen Zellen getestet werden konnte. Hier bedarf es weiterer Versuche um dies in Zukunft 

nachzuholen. 

Trotz der Schwächen des Zellkulturmodels bleiben wenig Alternativen zur Erforschung der hier 

untersuchten Zell-Zellinteraktionen. Zwar bieten sich zur Erforschung der HIV Pathogenese 

und der zellulären Abläufe bei HAND besonders Primatenmodelle an, in denen das HIVähnliche 

SIV verwendet wird (Sharer et al., 1988; Zink et al., 2010), jedoch gehen diese 

Versuche mit großem logistischen Aufwand einher und bergen die Schwierigkeit der ethischen 

76

Beurteilung von Primatenversuchen. Zur Erforschung von HAND werden ebenfalls 

Nagermodelle verwendet, die allerdings deutliche Limitationen mit sich bringen. Diese Modelle 

basieren auf transgenen Tieren, die meist unter einem ZNS spezifischen Promotor HIV 

Proteine exprimieren (Toggas et al., 1994; Kim et al., 2003). Diese Modelle zeigen allerdings 

nur die Auswirkungen der Expression bestimmter viraler Proteine und nicht molekulare und 

zelluläre Abläufe, wie sie sich bei HAND ereignen. Um dies abzubilden, erhalten immer mehr 

humanisierte Mausmodelle Einzug in die HIV-Forschung. Dabei wurde das tiereigene 

Immunsystem durch humane Zellen ersetzt, so dass eine HIV-Infektion der Tiere möglich wird 

(Marsden and Zack, 2015; Akkina et al., 2016). In diesen Tieren kann es zu 

Abstoßungsprozessen der Immunzellen kommen und somit zu artifiziellen Immunprozessen, 

was zu Limitationen des Modells führt. Nur die Kombination verschiedener Modelle scheint 

eine gute Grundlage zur Erforschung der komplexen Prozesse bei HAND zu sein. Die 

humanisierten Mausmodelle bieten sich zukünftig an, die in unserem Zellkulturmodell 

postulierten isolierten Interaktionen zwischen Mikroglia und HIV transduzierten monozytären 

Zellen und der daraus resultierenden Neurotoxizität im Tiermodel zu untersuchen und zu 

validieren. 

5.2 Molekulare Abläufe in monozytären durch eine Transduktion mit HIV-Vektor 

Im Gehirn von HIV + Patienten konnten post-mortem 1-12% HIV-infizierte Monozyten 

nachgewiesen werden (Bagasra et al., 1996). Das deckt sich mit den erzielten 

Transduktionsergebnissen in dieser Arbeit, die ungefähr 4 % transduzierte monozytäre Zellen 

zeigten. Wie vorherig berichtet, konnte anhand der p24 gag-Menge davon ausgegangen 

werden, dass die monozytären Zellen mit homogenen Mengen an viralen Partikeln transduziert 

wurden (Logan et al., 2004) und die Partikel die postulierten Eigenschaften, wie z.B. enthaltene 

RNA, besaßen. Neben der Detektion des Reportergenprodukts GFP konnten ebenfalls die 

LTR`s im Erbgut der monozytären Zellen nachgewiesen werden. Das zeigt, dass sowohl die 

reverse Transkription der viralen RNA, als auch deren Integration in das Wirtszell-Genom mit 

anschließender Genexpression und Translation funktionierte. Neben dem Nachweis viraler 

RNA / DNA in den monozytären Zellen und der Expression des Reportergens GFP, konnte 

anhand der unmarkierten Proteomanalyse verdeutlicht werden, dass es durch die 

Transduktion mit HIV zu signifikanten Veränderungen in der Proteinexpression der Zellen kam. 

Die stärkste Hochregulation nach der Transduktion zeigte die Superoxid Dismutase (SOD), 

welche in der Zelle eine Schutzfunktion vor oxidativem Stress ausübt. Im Kontext von HAND 

ist bekannt, dass es zu einer Hochregulation von ROS (reactive oxygen species) durch eine 

Vielzahl an Zellen kommt und diese in Zusammenhang mit Neurotoxizität steht (Zayyad and 

Spudich, 2015). Eine pharmakologische Hemmung der SOD resultierte ebenfalls in erhöhter 

77

ROS Produktion und folglich in erhöhtem oxidativen Stress (Riera et al., 2015). Andersherum 

konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion von Zellen des ZNS mit einem für SOD 

kodierenden Vektor in einem Tiermodell besagtes Enzym hochreguliert werden konnte, was 

die durch ROS ausgelöste Apoptose von Neuronen signifikant verringerte (Louboutin et al., 

2012; Agrawal et al., 2012). Es klingt kontrovers, dass in Folge einer HIV-Infektion monozytäre 

Zellen mit der Hochregulation des anti-oxidativen Enzyms SOD beginnen, das im ZNS eine 

protektive Rolle einzunehmen scheint. Dieser Effekt konnte jedoch im Liquor von Patienten mit 

kognitiven Beeinträchtigungen bestätigt werden, in dem die SOD Expression noch zusätzlich 

erhöht war (Laspiur et al., 2007). Boven und Kollegen konnten zeigen, dass eine HIV-Infektion 

in Monozyten zu einer erhöhten Expression von SOD und somit zu anti-oxidativen 

Eigenschaften führte (La Boven et al., 1999). In anderen Zellen des ZNS, nämlich Astrozyten, 

wurde beschrieben, dass HIV eine Erhöhung von SOD bewirkte, was eine stärkere 

Widerstandskraft gegenüber der durch HIV ausgelösten ROS Produktion auslöste. Diese 

Erkenntnisse eingeordnet in den Kontext der „bystander hypothesis“ lassen vermuten, dass 

die Hochregulation von SOD in infizierten Monozyten ein Schutzmechanismus des Virus bei 

der Infektion darstellen kann und somit der Verbreitung im ZNS dient. Auch an diesem Prozess 

wurde bereits eine Beteiligung des viralen Proteins tat gezeigt. Es aktiviert den nuclear factor 

erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)-Signalweg, in dessen Folge es zu einer verstärkten 

Expression von SOD und der daraus resultierenden anti-oxidativen Eigenschaften kommt 

(Mastrantonio et al., 2016). Wie vorhergehend bereits diskutiert, kann der isolierte Einfluss der 

viralen Proteine auf die monozytären Zellen und somit auf die Veränderungen des Proteoms 

nicht abschließend geklärt werden. Bereits publizierte Ergebnisse zeigen, dass eine 

vollständige Aktivierung in dem entwickelten Zellkultursystem nur bei der Verwendung von 

viralen Partikeln beobachtet werden konnte, die mit der Zielzelle fusionierten und virale RNA 

enthielten (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013; Faissner, Ambrosius et al., 2014). Dies spricht 

gegen eine hervorgehobene Rolle eines isolierten viralen Proteins, kann aber nicht 

beantworten, ob tat diese potentiellen Schutzmechanismen in den Zellen induziert. 

Eine deutliche Hochregulation zeigte auch das Protein Transgelin-2 in HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen. Bisher ist wenig über die Funktion dieses Proteins bei 

einer HIV-Infektion bekannt. Allerdings stehen die hier erhobenen Daten im Einklang mit denen 

einer anderen Forschergruppe, die ebenfalls eine Hochregulation im Kontext einer HIV- 

Infektion detektieren konnte (Perez et al., 2010). Im Zusammenhang mit einer Hepatitis B 

Infektion konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des Proteins Transgelin-2 zu einer 

Erhöhung der Transkription viraler Gene führte und eine Replikation des Virus verstärkte (Yu 

et al., 2016). Es liegt nahe, dass die Regulation von Transgelin-2 im Kontext einer HIV- 

Infektion ebenfalls der Verstärkung der Transkription HIV-eigener Gene dient. Daran 

anschließend konnte eine Hochregulation von Calreticulin beobachtet werden, das in der Zelle 

78

membrangebunden vorliegt und dem die Funktion eines Chaperons zu kommt. Es wurde 

beschrieben, dass im Kontext einer HIV-Infektion dieses Enzym verwendet wird, um virale 

Proteine zu prozessieren (Otteken and Moss, 1996). 

Neben den vorher beschriebenen hochregulierten Proteinen konnte in HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen eine deutliche Herunterregulation von Proteinen 

beobachtet werden, die ribosomalen Ursprungs waren. Dies wird gestützt durch Ergebnisse, 

in denen eine Herunterregulation von Genen durch HIV beschrieben wurde, die im 

Zusammenhang mit der Biogenese von Ribosomen stehen (Kleinman et al., 2014). Ebenfalls 

konnte in Drosophila melanogaster gezeigt werden, dass die Expression von dem viralen 

Protein tat zu signifikant weniger zytoplasmatischen Ribosomen führte (Ponti et al., 2008). In 

einer T-Zelllinie führte eine Infektion mit HIV zu einer Unterdrückung der Translation von 

Wirtszellen mRNA, wohingegen die Translation von strukturellen Proteinen des Virus 

unbeeinflusst blieb. Diese Ergebnisse konnten ebenfalls mit reduzierten Mengen an 

Ribosomen in Verbindung gebracht werden (Xiao et al., 1998). Es wird ein neuer, noch 

unverstandener komplexer Mechanismus beschrieben, durch den das Virus die 

Genexpression der Wirtszelle beeinflusst (Kleinman et al., 2014). Die hier beschriebenen 

regulierten Proteine in monozytären Zellen lassen vermuten, dass es im Zuge einer 

Transduktion mit HIV-Vektor zu Prozessen in der Zielzelle kommt, die eine Expression viraler 

Proteine fördern und dabei die Expression von zelleigenen Proteinen deutlich einschränken. 

An diesen Ergebnissen anknüpfend lässt die Hochregulation anti-oxidativer Enzyme in den 

Zellen vermuten, dass diese während der intensiven Virusproduktion geschützt werden sollen. 

Interessanterweise konnte hier beobachtet werden, dass bereits virale Partikel, beruhend auf 

dem minimalen HIV-Konstrukt CS-CG, in der Lage waren, diese modulatorischen Prozesse 

bei der Translation in den Wirtszellen zu induzieren. Um diese aufgestellte Hypothesen zu 

untersuchen, müssen die hier gesammelten Ergebnisse zukünftig anhand von unabhängigen 

Methode validiert werden. So kann beispielsweise anhand von Western Blots auf 

Proteinebene und rtPCR auf Genexpressionsebene überprüft werden, ob die hier beobachtete 

Regulation reproduziert werden kann. Ebenfalls muss einschränkend erwähnt werden, dass 

eine unmarkierte Proteomanalyse, wie sie hier durchgeführt wurde, einige Limitationen birgt. 

Durch den Vergleich der relativen Expression des Gesamtproteoms der unterschiedlichen 

Konditionen können Veränderungen detektiert werden. Diese setzen im Probenvergleich eine 

äußerst niedrige Varianz voraus, da andernfalls ein Teil der Expressionsänderungen, die nicht 

dominant ausfallen, sich nicht auflösen lassen. Um zukünftig eine bessere Auflösung der 

Proteinexpressionsänderungen zu gewährleisten, kann eine SILAC (stable-isotope labeling by 

amino acids in cell culture)-Methode verwendet werden. Bei der Methode werden durch 

Einsatz schwerer und leichter Aminosäuren, die während der Transduktion der Zellen 

hinzugegeben werden, spezifischere Veränderungen detektiert. In einer so durchgeführten 

79

Studie über den Einfluss des viralen Proteins vpr auf monozytäre Zellen und anschließender 

Validierung anhand eines Western Blots, konnte unter anderem eine Verstärkung des viralen 

Expressionsapparats aufgezeigt werden (Barrero et al., 2013). In dieser Arbeit wurde das 

virale Protein vpr nicht co-transfiziert, beziehungsweise verwendet. Dennoch kann auch durch 

die hier eingesetzten viralen Partikel eine Verstärkung des viralen Expressionsapparts 

vermutet werden. Das spricht für die hier gezeigten Ergebnisse und lässt die Hypothese 

entstehen, dass dieser Prozess durch mehrere virale Proteine unterschiedlich orchestriert 

wird. 

5.3 Pharmakologische Manipulation der Abläufe bei HAND 

Durch Einführung der cART wurde die Lebenserwartung von HIV + Patienten deutlich 

verlängert. Die Behandlung von HIV + Patienten mit cART ist unerlässlich, doch scheinbar nicht 

ausreichend zur Bekämpfung von HAND. Im Gegensatz zu der durch cART beeinflussten 

Viruslast in den Patienten korrelieren proinflammatorische Zytokine als Indikatoren einer 

fortschreitenden Neuroinflammation mit den Anzeichen einer Neurodegeneration. Die in dieser 

Arbeit gemessenen Zytokine CXCL10, CCL2 und IL-6 korrelieren mit beginnender und 

fortschreitender Neurodegeneration in HIV + Patienten (Ambrosius, 2012; Faissner, 2013; 

Dhillon et al., 2008; Thames et al., 2015). Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Level von 

CCL2 als auch von IL-6 durch Behandlung mit cART nicht beeinflusst wurden (Yuan et al., 

2013; Lake et al., 2015b). CCL5 hingegen wird mit HAND assoziiert. Allerdings kommt diesem 

natürlichen Antagonisten des HIV-Proteins gp120 neben einer chemotaktischen Funktion auch 

eine neuroprotektive Rolle zu (La Campbell et al., 2015a; Rozzi et al., 2014). Anhand der trotz 

cART nach wie vor hohen Konzentration an proinflammatorischen Mediatoren in HIV + 

Patienten wird die Notwendigkeit deutlich, das therapeutische Spektrum zur Behandlung von 

HAND weiter auszudehnen. In dieser Arbeit wurden die pharmakologischen Substanzen 

Teriflunomid und MMF auf ihren Einfluss bei HAND getestet. Die Fähigkeit der Substanzen, 

die Sekretion der vorher genannten Zytokine zu senken, wurde untersucht. Sowohl 

Teriflunomid als auch MMF inhibieren den nuclear factor kappa-light-chain-enhancer (NF-κβ) 

– Signalweg, jedoch mit unterschiedlichen Auswirkungen (Breedveld and Dayer, 2000; 

Tsubaki et al., 2014). Die unterschiedliche Wirkweise konnte bei den hier durchgeführten 

Ergebnissen beobachtet werden. Teriflunomid wirkte primär auf die Aktivierung der Co-Kultur, 

wohin MMF hauptsächlich auf die Aktivierung der mikroglialen Zellen wirkte, wie aus den 

sezernierten Mengen an Zytokinen geschlossen werden konnte. Es ist bekannt, dass 

Teriflunomid auf die Matrix-Metalloproteinase (MMP) 2 und MMP9 wirkt, was eine Reduktion 

der mRNA proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat (Huang et al., 2011). Eine Reduktion 

von sezernierten proinflammatorischen Zytokinen durch die Co-Kultur nach Behandlung mit 

Teriflunomid konnte in dieser Arbeit bestätigt werden. Ein Einfluss von MMP2 und MMP9 bei 

80

HAND ist ebenfalls schon lange postuliert. So zeigen sich in cART behandelten HIV + Patienten 

erhöhte Spiegel an MMP2 und MMP9 im Liquor, die mit fortschreitender Neurodegeneration 

korrelierten (Li et al., 2013; Liuzzi et al., 2000). MMPs sind in dem hier verwendeten Modell 

ein denkbarer Mediator für die Aktivierung in der Zellkultur, beziehungsweise für das 

neurotoxische Potential der Co-Kultur Überstande, da auch MMPs die Fähigkeit besitzen, 

vermehrt Zelltod auslösen zu können (Johnston et al., 2001). Es wurde postuliert, dass MMPs 

für die Informationsweiterleitung zwischen Monozyten und Astrozyten bei einer HIV- 

Infektionen verantwortlich sein können und der Bildung proinflammatorischer mRNA dienen 

(Okamoto et al., 2005). Ein Einfluss von Teriflunomid auf MMPs kann sowohl die beobachtete 

verringerte Aktivierung der Co-Kultur, als auch das verminderte neurotoxische Potential des 

korrespondieren Überstandes erklären. Um die Wirkweise von Teriflunomid besser zu 

verstehen und einen möglichen Einfluss auf MMPs oder andere Mediatoren zu validieren, 

bedarf es zukünftig weiterer Versuche. 

In den hier gezeigten Ergebnissen konnte ein Einfluss von MMF primär auf mikrogliale Zellen 

und adulte Mikroglia gezeigt werden. MMF wirkt speziell auf Mikroglia über die Aktivierung des 

„hydroxycarboxylic acid receptor 2“ (HCAR2), der eine Modulation des proinflammatorischen 

Status hin zu einem neuroprotektiven Status vermittelt (Parodi et al., 2015). Ob durch den 

Statuswechsel induziert oder unabhängig von diesem Prozess, reduziert die Behandlung mit 

MMF die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, reduziert die Freisetzung von Glutamat 

und erhöht die Regulation des anti-oxidativen Enzyms Hämoxygenase-1 (Gill et al., 2014). 

Hämoxygenase-1 ist im ZNS von HIV + Patienten reduziert und korreliert mit 

Aktivierungsmarkern von Monozyten (Gill et al., 2015). Neben der Erhöhung von 

Hämoxygenase-1 wird durch die Behandlung mit MMF auch über eine verringerte Freisetzung 

von Glutamat durch infizierte Zellen berichtet (Gill et al., 2014). Im Zuge einer HIV-Erkrankung 

wurde die erhöhte Freisetzung von Glutamat durch infizierte Zellen detektiert, das im 

Kompartiment des ZNS Neurotoxizität auslöste (Wu et al., 2015). Im Gegensatz zu dem in der 

Literatur beschriebenen Einfluss von MMF auf Monozyten oder Makrophagen wurde in dieser 

Arbeit der Einfluss von MMF auf eine Co-Kultur von monozytären und mikroglialen Zellen 

beschrieben. Dabei wurde deutlich, dass eine verringerte Aktivierung zwar vornehmlich in 

mikroglialen Zellen zu beobachten war, jedoch die Überstände der Co-Kultur weniger 

neuronalen Zelltod induzierten. Ob somit eine Hochregulation des anti-oxidativen Enzyms 

Hämoxygenase-1, eine verminderte Freisetzung von potentiell neurotoxischem Glutamat oder 

die Regulation eines unbekannten Mediators durch die Behandlung der Co-Kultur mit MMF 

der entscheidende Faktor ist, kann an dieser Stelle nicht geklärt werden. 

Nach wie vor kontrovers diskutiert wird der potentiell neurotoxische Einfluss von cART. Sowohl 

der direkte negative Einfluss von cART auf Neurone wurde beschrieben (Abers et al., 2014) 

81

als auch die These, dass durch cART keine neurotoxischen Effekte zu verzeichnen sind und 

diese auf verbleibende virale Reservoirs zurückzuführen sind (Brier et al., 2015). Es konnte 

jedoch sowohl in Affen als auch in Ratten gezeigt werden, dass die Behandlung mit cART zu 

vermehrten oxidativen Stress führte, was in neurotoxischen Prozessen resultiert. Die 

Behandlung mit MMF führte zu einer Abschwächung dieser zellschädigenden Prozesse (Akay 

et al., 2014). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MMF ein geeigneter Kandidat ist, um 

zusätzlich zu einer notwendigen cART verabreicht zu werden. Anhand der in dieser Arbeit 

gewonnen Erkenntnisse kann keine Aussage über den direkten Einfluss von MMF auf 

Neurone, beziehungsweise den zusätzlichen Einfluss von MMF bei cART, getroffen werden. 

Dennoch deuten die hier erhobenen Daten darauf hin, dass MMF im Kontext von HAND einen 

positiven Einfluss besitzt. 

5.4 Indikatoren der Immunaktivierung im Kontext von HAND 

In dieser Arbeit wurde das Expressionsniveau proinflammatorischer Zytokine als Indikator für 

eine ausgelöste Immunreaktion verwendet. Die gemessenen Zytokine katalysieren allerdings 

auch selber mannigfaltige Prozesse. So zeigt CXCL10, das in der Co-Kultur von HIV-Vektor 

transduzierten monozytären Zellen und Mikroglia stark erhöht war, ein neurotoxisches 

Potential. Es wurde beschrieben, dass erhöhte Mengen an CXCL10 zu einer Kalzium- 

Dysregulation im ZNS führen, was Neurodegeneration hervorruft (Sui et al., 2006). CXCL10 

wirkt als starkes Chemoattraktant und rekrutiert vornehmlich Monozyten und T-Zellen zum Ort 

der Sekretion hin (Kolb et al., 1999; Sorensen et al., 2002). Eine ebenfalls stark induzierende 

chemotaktische Funktion für Monozyten und T-Zellen besitzt CCL2 (Conductier et al., 2010). 

Im Kontext von HAND konnte gezeigt werden, dass speziell CCL2 eine Rekrutierung von 

Leukozyten über die BHS ermöglicht, welche durch CXCL10 oder CCL5 allerdings nicht 

ausgelöst werden konnte (Eugenin et al., 2006). CCL5 wirkt chemoattraktiv auf Monozyten 

und fördert deren Rekrutierung zum Ort der Sekretion hin (Slimani et al., 2003). In einem 

Mausmodell konnte neben der chemoattraktiven Funktion noch die Fähigkeit beschrieben 

werden, die durch das virale Protein gp120 in Neuronen ausgelöste Apoptose zu verhindern 

(La Campbell et al., 2015b). In dem in dieser Arbeit verwendeten Modell wurden virale Partikel 

verwendet, die kein gp120 exprimierten, sodass diese Eigenschaft hier vernachlässigt werden 

kann. Das neben CXCL10, CCL2 und CCL5 gemessene IL-6 orchestriert einen Wechsel der 

Rekrutierung von Neutrophilen zu Monozyten anhand von Chemokinen (Hurst et al., 2001). IL- 

6 ist bei einer HAND in hohen Konzentrationen im ZNS zu detektieren (Nixon and Landay, 

2010). Die Erkennung von infizierten Monozyten und T-Zellen im ZNS von HIV + Patienten 

durch residente Immunzellen führt zu einer verstärkten Sekretion der vorher genannten 

Zytokine, die in dem hier modifizierten Zellkulturmodell ebenfalls stark reguliert waren. Im HIV + 

82

Patienten führen diese chemotaktischen Zytokine dazu, dass vermehrt Immunzellen und somit 

auch infizierte Zellen ins ZNS rekrutiert werden. Bei diesem Vorgang spricht man von dem 

sogenannten „push and pull“ Mechanismus (Yadav and Collman, 2009). 

Neben den immunologischen Aspekten deuten aktuelle Forschungsansätze auf einen 

weiteren interessanten Punkt bei HAND hin. So konnten Verhaltensänderungen mit einem 

erhöhten Zytokin-Level im ZNS verknüpft werden. Hohe Konzentrationen von IL-6 im ZNS bei 

HIV + Patienten stehen in Verbindung mit auftretenden Einschlafstörungen (Gay et al., 2015; 

Wirth et al., 2015). Schlafstörungen, die bei HIV + Patienten beschrieben wurden (Byun et al., 

2016) können zumindest teilweise die Konzentrationsdefizite bei HAND Patienten mit ANPD 

erklären. Neben dem Einfluss von IL-6 auf das Schlafverhalten konnte auch ein 

Zusammenhang von IL-6, sowie dem für das Hungergefühl zuständigen Hormons Adiponectin 

mit neurokognitiven Defiziten beobachtet werden (Lake et al., 2015a). Das konnte durch eine 

Studie unterstützt werden, nach der Adipositas und hohe IL-6 Konzentrationen bei HIV + 

Patienten mit neurokognitiven Defiziten signifikant in Verbindung stehen (Sattler et al., 2015). 

Ebenfalls konnten die Zytokine CXCL10 und CCL2 mit Adipositas assoziiert werden (Ishii et 

al., 2016). All das kann darauf hindeuten, dass die im Kontext einer HIV-Inflammation erhöhten 

Konzentrationen von Zytokinen Verhaltensänderungen wie Schlafstörungen und Adipositas 

hervorrufen, die ebenfalls mit neurokognitiven Störungen verknüpft sind und diese vielleicht 

sogar fördern. Einschränkend muss gesagt werden, dass eine direkte Kausalität zwischen 

diesen Faktoren mit HAND nur schwer zu zeigen ist. So ist durch den bei HAND auftretenden 

Verlust der kognitiven Leistungsfähigkeit ein vermehrtes Auftreten von Depressionen 

beschrieben (Pinheiro et al., 2016) die mit Schlafstörungen in Verbindung gebracht werden 

können (Harris et al., 2009). Ebenfalls darf nicht außer Acht gelassen werden, dass die 

meisten HIV + Patienten in der westlichen Welt mit Medikamenten der cART behandelt werden, 

die im Verdacht stehen, Schlafstörungen und Depression zu fördern (Treisman and Soudry, 

2016). Vor diesem Hintergrund bleibt die Frage interessant, ob durch eine Behandlung der 

Entzündung im ZNS mit immunmodulatorischen Stoffen die neurokognitive Beeinträchtigung, 

aber auch die ebenfalls auftretenden Begleiterscheinungen wie Schlafstörungen, Adipositas 

und Depressionen verbessert werden können. 

5.5 Fazit 

Wie eingangs bereits zitiert, handelt es sich bei HAND um ein dynamisches Puzzle 

verschiedenster Faktoren (Zayyad and Spudich, 2015), an dessen Ende die 

Neurodegeneration und die Beeinträchtigung des HIV + Patienten stehen. In dieser Arbeit 

konnten die Wechselwirkungen zwischen HIV transduzierten monozytären Zellen und 

mikroglialen Zellen näher charakterisiert werden und eine funktionelle Relevanz im Hinblick 

auf daraus entstehende Neurotoxizität aufgezeigt werden. Dabei standen die hier 

83

eobachteten Interaktionen zwischen den Zelltypen im Einklang mit der für HAND postulierten 

„bystander hypothesis“. 

Anhand des entwickelten Zellkulturmodells konnte gezeigt werden, dass den HIVtransduzierten 

monozytären Zellen eine Verstärkerfunktion zukommt, die in einer 

ausgeprägteren Aktivierung der Co-Kultur resultierte. Dabei wurde deutlich, dass nicht die 

viralen Partikel ursächlich für eine vollständige Aktivierung waren, sondern dass HIV 

transduzierte monozytäre Zellen vorliegen mussten. Dieser Tatsache, die Anhand einer 

verstärkten Sekretion der Zytokine CXCL10, CCL5, CCL2 und IL-6 beobachtet werden konnte, 

folgte konsekutiv die Neurodegeneration embryonaler Rattenneurone, beziehungsweise 

fötaler humaner Neurone. Der Überstand von Mono-Kulturen mit HIV-Partikeln induzierte 

dahingehend keinen Anstieg der Neurotoxizität. Der neurotoxische Effekt des Überstandes 

konnte durch die Behandlung der Co-Kultur mit den pharmakologischen Substanzen 

Teriflunomid und MMF vermindert werden. Dabei wurde deutlich, dass die Behandlung mit 

beiden Substanzen einen positiven Effekt auf das Überleben der Neurone mit sich brachte 

(Abbildung 21). Anhand der unterschiedlich abgeschwächten Aktivierung der Co-Kultur nach 

Zugabe von Teriflunomid oder MMF kann vermutet werden, dass die Wirkweise über 

verschiedene Signalwege orchestriert wurde. Der genaue Wirkmechanismus beider 

Substanzen bleibt unverstanden. Ein Einfluss auf die Regulation von MMPs, Hämoxygenase- 

1 und proinflammatorischer Zytokine ist hierbei denkbar. Zukünftige Experimente sind nötig, 

um den genauen Einfluss beider pharmakologischer Substanzen in diesem Zusammenhang 

näher zu beleuchten. Dabei muss beachtet werden, dass die hier erhobenen Daten einem 

Zellkulturmodell entstammen, dass sich von der in vivo Situation unterscheidet, 

beziehungsweise dies nur nachbildet. 

In dieser Arbeit wurden ebenfalls die molekularen Abläufe bei HAND betrachtet. Es wurde 

deutlich, dass es durch eine HIV Transduktion von monozytären Zellen zu vielschichtigen 

Veränderungen in den Zellen kommt, die unter anderem zu einer veränderten Expression des 

Proteoms in der Zelle führten. Dabei legen die Daten den Schluss nahe, dass es durch die 

Infektion mit HIV zu einer „Kaperung“ des Proteinproduktionsapparates der Zelle kommt, in 

dessen Verlauf die Produktion viraler Proteine hochgefahren wird und zelleigene Proteine 

zurückgefahren werden (Abbildung 21). Diese Ergebnisse decken sich mit postulierten 

Ergebnissen in der Literatur, in denen ähnliche Prozesse durch eine HIV-Infektion von Zellen 

beschrieben wurden. Es bedarf weiterer Versuche um die genauen Veränderungen am 

Proteom durch die Transduktion mit den eingesetzten viralen Partikeln weiter zu verstehen. 

84

Abbildung 21: Modifizierte schematische Darstellung von HIV im ZNS unter Berücksichtigung der Ergebnisse dieser 

Dissertation. Eine Infektion von monozytären Zellen mit HIV führt zu Veränderungen im Proteom. Infizierten 

monozytären Zellen kommt ein Verstärkereffekt in Co-Kultur mit mikroglialen Zellen zu (gelber Feil). Teriflunomid 

(grüner Feil) und MMF (blauer Feil) schwächen die inflammatorischen Prozesse in der Co-Kultur ab, was konsekutiv 

zu weniger Neurodegeneration führt. 

Zusammenfassend tragen die durch das entwickelte und modifizierte Zellkulturmodell 

vorgestellten Ergebnisse zum besseren Verständnis der monozytären und mikroglialen 

Interaktion sowie zu den Erkenntnissen über die molekularen Abläufe im Monozyten nach HIV- 

Infektion bei. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Teriflunomid oder MMF 

einen positiven Einfluss auf das Überleben von Neuronen im Kontext von HAND hatte. Diese 

Ergebnisse sprechen für die Möglichkeit, bei HIV + Patienten neben der obligatorischen 

Behandlung mit cART auch immunmodulatorisch zu intervenieren, um HAND weiter 

abzumildern. 

85

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100

7. Danksagung 

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater und Betreuer Prof. Andrew Chan, der mir mit 

seiner Erfahrung und seinem Wissen zur Seite stand. Dabei bleiben mir die 

wissenschaftlichen Diskussionen, genauso wie die Abende am Napoleon-Grill stets in bester 

Erinnerung. 

Ebenfalls möchte ich mich bei meinem 2. Betreuer Prof. Stefan Wiese bedanken, der mir mit 

seiner Expertise und seinem Rat während des Projekts zur Verfügung stand. 

Mein Dank gilt Prof. Ralf Gold für die Möglichkeit, in seinem Labor meine Doktorarbeit 

anzufertigen und für das frühe Vertrauen in meine Person, sowie die stetige Unterstützung. 

Dr. Simon Faissner und Kirsten Schanzmann, die mit mir das HIV-Trio komplimentiert haben, 

gilt mein Dank für enge, freundschaftliche und gute Zusammenarbeit an diesem Projekt und 

darüber hinaus. 

Lisa Schrewe gilt mein besonderer Dank als gute Freundin und Mit-Promovendin mit der ich 

viel im und neben dem Labor erlebt habe. 

Dr. Seray Demir, Dr. Anke Salmen, Kerstin Tuß-Silczak und Fatima Arakrak aus meiner 

Arbeitsgruppe danke ich für den Rat, die Hilfe und die gemeinsam verbrachte Zeit. 

Der gesamten Arbeitsgruppe von Professor Gold möchte ich für die schöne Zeit, die Hilfe 

und die gute Zusammenarbeit im Labor während meiner Doktorarbeit danken. 

Ein weiterer spannender Aspekt des Dissertationsprojekts war die produktive 

Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern. Dabei möchte ich mich besonders bei Dr. 

Thomas Grunwald, Dr. Bastian Grewe, Bettina Tippler und der ganzen Arbeitsgruppe der 

molekularen und medizinischen Virologie im Zentrum für klinische Forschung an der Ruhr- 

Universität Bochum bedanken. Ebenfalls gilt mein Dank Dr. Claudia Lindemann, Dr. Katja 

Kuhlmann und den Mitarbeitern des Medizinischen Proteom-Centers Bochum für die 

Zusammenarbeit und die Expertise im Bereich der großen Welt der Proteine. 

Der Friedrich-Ebert-Stiftung danke ich für die finanzielle und ideelle Förderung während 

meiner Doktorarbeit. 

Am Ende möchte ich nun die Menschen erwähnen, die auf privater Ebene großen Anteil an 

dieser Doktorarbeit hatten. Sie gaben mir Zuspruch und vertrauten in meine Person. Mein 

besonderer Dank gilt meinen Eltern Jens und Isabell, meiner Schwester Friederike mit Jan- 

Peter Bernhard, Sebastian, Samuel und meinen Freunden. 

101

8. Lebenslauf 

geboren am 31.10.1985 in Unna 

ledig 

Beruflicher Werdegang 

09/2012 – heute Wiss. Mitarbeiter, Lehrstuhl für Neurologie (Professor R. Gold) 

St. Josef Hospital Bochum, Ruhr-Universität Bochum 

09/2008 – 09/2010 Student. Hilfskraft, Lehrstuhl für „Allgemeine Zooloie und 

Neurobiologie“ (Professor P. Wahle) 

Hochschulausbildung 

09/2012 – heute Promotionsstudium, Neuroimmunologie, Thema: „Molekulare 

und virale Determinanten bei HIV-assoziierten neurokognitiven 

Störungen“ (Prof. A. Chan), Ruhr-Universität Bochum, 

09/2010 – 08/2012 Master of Science in Biologie, Fakultät für Biologie und 

Biotechnologie, Ruhr Universität Bochum, Abschluss: 1,0 mit 

Auszeichnung 

10/2007 – 08/2010 Bachelor of Science in Biologie, Fakultät für Biologie und 

Biotechnologie, Ruhr Universität Bochum, Abschluss 1,7 

Stipendien / Förderung 

12/2015 – heute Anschubsfinanzierung FoRUM der medizinischen Fakultät der 

Ruhr Universität Bochum (FörderkennzeichenF859-15) 

08/2013 – 07/2016 Stipendiat (Promotionsförderung) der Friedrich-Ebert-Stiftung 

03/2009 – 08/2012 Stipendiat (Grundförderung) der Friedrich-Ebert-Stiftung 

Schulausbildung 

07/1994 – 06/2004 Clara-Schumann-Gymnasium, Holzwickede 

Abschluss: Abitur 

Ehrenamt 

05/2014 – heute Ratsherr im Gemeinderat von Holzwickede 

05/2014 – heute stellv. Fraktionsvorsitzender in Holzwickede 

102

9. Publikationsliste 

Originalpublikationen 

Ambrosius B*, Pitarokoili K*, Schrewe L, Pedreiturria X, Motte J, Gold R Fingolimod 

attenuates experimental autoimmune neuritis and contributes to Schwann-cell mediated 

axonal protection, in preparation Sep 2016 

*joined first-authorship 

Ambrosius B*, Faissner S*, Schanzmann K, von Lehe M, Grunwald T, Gold R, Grewe B, 

Chan A, Teriflunomide and monomethylfumarate reduce HIV-induced microglial/monocytoid 

activation and neurotoxicity, submitted Sep 2016. 


Pitarokoili K, Ambrosius B, Meyer D, Schrewe L, Gold R, Dimethyl Fumarate Ameliorates 

Lewis Rat Experimental Autoimmune Neuritis and Mediates Axonal Protection, PLoS One 

2015 Nov; 10:e0143416 

Faissner S*, Ambrosius B*, Schanzmann K, Grewe B, Potthoff A, Münch J, Sure U, 

Gramberg T, Wittmann S, Brockmeyer N, Überla K, Gold R, Grunwald T, Chan A, 

Cytoplasmic HIV-RNA in monocytes determines microglial activation and neuronal cell death 

in HIV-associated neurodegeneration, Exp Neurol. 2014 Nov;261:685-97 


Pitarokoili K*, Ambrosius B*, Schrewe L, Hayardeny L, Hayden M, Gold R, Laquinimod 

exerts strong clinical and immunomodulatory effects in Lewis rat experimental autoimmune 

neuritis, J Neuroimmunol. 2014 Sep 15;274(1-2):38-45 


Manzel A, Domenig O, Ambrosius B, Kovacs A, Stegbauer J, Poglitsch M, Mueller DN, 

Gold R, Linker RA, Angiotensin IV is induced in experimental autoimmune encephalomyelitis 

but fails to influence the disease, J Neuroimmune Pharmacol. 2014 Sep;9(4):533-43 

103

Vorträge: 

- Interaktion von Astrozyten mit HIV-transduzierten Monozyten im zentralen 

Nervensystem (Björn Ambrosius, Simon Faissner, Bastian Grewe, Bettina Tippler, 

Klaus Überla, Ralf Gold, Thomas Grunwald, Andrew Chan) (26. September 2012, 

DGN 2012, Hamburg) 

- Neurotoxicity of microglia-derived cytokines in HIV associated neurocognitive 

disorders (Björn Ambrosius, Kirsten Schanzmann, Simon Faissner, Bastian Grewe, 

Bettina Tippler, Klaus Überla, Ralf Gold, Gabriele Arendt, Thomas Grunwald, Andrew 

Chan) (13.September 2013, DGNN 2013, Göttingen) 

- Anti-inflammatory and neuroprotective role of Fingolimod in experimental autoimmune 

neuritis in Lewis rats (Björn Ambrosius, Kalliopi Pitarokoili, Lisa Schrewe, Ralf Gold) 

(19. April 2016, AAN 2016, Vancouver) 

Poster: 

- Reverse Transcription of HIV-RNA in infected Monocytes is not necessary to activate 

human microglia: Investigation of the microglial bystander hypothesis in Neuro-AIDS 

(Simon Faissner, Björn Ambrosius, Seray Demir, Klaus Überla, Ralf Gold, Thomas 

Grunwald, Andrew Chan) (21. – 28. April 2012, AAN 2012, New Orleans) 

- Microglial activation by HIV-infected monocytoid cells in the central nervous system is 

no dependent on reverse transcription of HIV-genome (Björn Ambrosius, Simon 

Faissner, Bettina Tippler, Bastian Grewe, Klaus Überla, Ralf Gold, Thomas Grunwald, 

Andrew Chan) (28. – 29. Juni 2012, Summer Frontiers: Training the innate immunity 

2012, Nijmegen) 

- Microglia show a different cytokine response pattern compared to astrocytes after 

interaction with HIV-infected monocytoid cells: Specifying the bystander hypothesis in 

Neuro-AIDS (Björn Ambrosius, Simon Faissner, Bastian Grewe, Bettina Tippler, 

Melanie D. Mark, Klaus Überla, Ralf Gold, Thomas Grunwald, Andrew Chan) (13. – 

17. Oktober 2012, SFN 2012, New Orleans) 

- CXCL10, CCL5 und IL-6 in Liquor cerebrospinalis von neuropsychologisch 

unbeeinträchtigten HIV + Patienten korrelieren mit Neurofilament H (Simon Faissner, 

Björn Ambrosius, Anja Potthoff, Kirsten Schanzmann, Norbert Brockmeyer, 

Gabriele Arendt, Ralf Gold, Thomas Grunwald, Andrew Chan) (20.September.2013, 

DGN2013, Dresden) 

104

- Neuroprotective effects of laquinimod in Lewis rat experimental autoimmune neuritis 

(Kalliopi Pitarokoili, Björn Ambrosius, Lisa Schrewe, Liat Hayardeny, Michael 

Hayden, Ralf Gold) (18. – 25. April 2015, AAN 2015, Washington DC) 

- Clinical histological and electrophysiological effects of Fingolimod in experimental 

autoimmune neuritis (Björn Ambrosius, Kalliopi Pitarokoili, Lisa Schrewe, Ralf Gold) 

(28. – 29. Januar 2016, Novartis Research Day, Berlin) 

105

10. Eigenständigkeitserklärung 

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät 

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es 

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig 

übereinstimmende Exemplare. 

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in 

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. 

Bochum, den 

_____________________________________ 

(Unterschrift) 

106

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