Theorie zum Histidase- Versuch
Theorie zum Histidase- Versuch
Theorie zum Histidase- Versuch
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 1 -<br />
<strong>Theorie</strong> <strong>zum</strong> <strong>Histidase</strong>- <strong>Versuch</strong><br />
1.)Charakterisierung der <strong>Histidase</strong><br />
Die <strong>Histidase</strong> hat ein Molekulargewicht von 210- 220 kDa je nach biologischer Herkunft.<br />
<strong>Histidase</strong> aus Pseudomonas putida ist ein Homotetramer mit einem Molekulargewicht von<br />
216kDa. Jede Untereinheit weist 509 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 54 kDa<br />
auf( Beweise dazu wurden durch SDS- und Disk- Gelelektrophorese erbracht).<br />
Die einzelnen Untereinheiten sind für sich enzymatisch nicht aktiv.<br />
<strong>Histidase</strong> weist vier essentielle SH- Gruppen auf, die an der Enzymkatalyse beteiligt sind.<br />
Diese SH- Gruppen sind leicht oxidierbar und nur in ihrer reduzierten Form katalytisch<br />
wirksam.<br />
Durch reduzierende Verbindungen wie z.B. Mercaptoethanol, Glutathion oder<br />
Natriumthioglycolat kann eine Gruppenaktivierung erzielt werden. Die Aufgabe dieser SH-<br />
Gruppen besteht vermutlich in der Bindung des Substratmoleküls im aktiven Zentrum des<br />
Enzyms.<br />
Die <strong>Histidase</strong> verfügt über einen Metall- Cofaktor, der wahrscheinlich ebenfalls bei der<br />
Bindung des Substratmoleküls während der Enzymkatalyse beteiligt ist. Bei diesen Metall-<br />
Cofaktor handelt es sich vermutlich um Mangan.<br />
Die Substratspezifität der <strong>Histidase</strong> ist sehr hoch. <strong>Histidase</strong> reagiert ausschließlich mit L-<br />
Histidin, nicht aber mit D- Histidin. Ihr pH- Optimum liegt bei pH 8,5- 9,5.<br />
Die <strong>Histidase</strong> ist sehr hitzestabil, sie kann bis zu einer Temperatur von 80°C erhitzt werden,<br />
ohne dass daraus ein nennenswerter Aktivitätsverlust resultieren würde. Diese Eigenschaft<br />
macht man sich bei der <strong>Histidase</strong>- Isolierung zunutze.<br />
Früher vermutete man als prosthetische Gruppe im aktiven Zentrum der <strong>Histidase</strong> das<br />
sogenannte Dehydroalanin. Dehydroalanin ist eine chemisch stark modifizierte Aminosäure,<br />
welche in 2 isomeren Formen vorliegen kann.<br />
N<br />
H 2<br />
CH 2<br />
O<br />
OH<br />
Imin- Enamin-<br />
Tautomerie<br />
Erst durch Aufklärung der Kristallstruktur konnte im aktiven Zentrum der <strong>Histidase</strong> die<br />
prosthetische Gruppe, das sog. MIO- System nachgewiesen werden. MIO ist die Abkürzung<br />
für 4- Methyliden-imidazol-5-on. MIO wird durch zwei aufeinanderfolgende H2O-<br />
Eliminierungsschritte aus dem Tripeptid Ala-Ser-Gly ( Alanin- Serin- Glycin) in den<br />
Positionen 142-144 auf der Aminosäuresequenz gebildet.<br />
HN<br />
CH 3<br />
O<br />
OH
MIO- Bildung:<br />
H<br />
N<br />
142<br />
N<br />
O<br />
142<br />
H +<br />
H<br />
NH<br />
142<br />
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
N<br />
H<br />
N<br />
H<br />
HO<br />
N<br />
H<br />
143<br />
143<br />
143<br />
N<br />
N<br />
OH<br />
- 2 -<br />
MIO konnte bis jetzt nur noch in der Phenylalanin- Ammoniak- Lyase (PAL) nachgewiesen<br />
werden.<br />
2.)Physiologische Bedeutung der <strong>Histidase</strong><br />
OH<br />
OH<br />
H<br />
N<br />
144<br />
O<br />
H 2O<br />
144<br />
O<br />
O<br />
144<br />
O<br />
O<br />
H<br />
N<br />
NH<br />
N<br />
H<br />
H 2O<br />
Die <strong>Histidase</strong> katalysiert die Eingangsreaktion im Hauptabbauweg des Histidins, nämlich die<br />
nicht – oxidative Desaminierung von L- Histidin zu trans-Urocaninsäure.<br />
Bei dieser Reaktion wird NH3 unter Ausbildung einer Doppelbindung eliminiert.<br />
Die <strong>Histidase</strong> ist demnach auch eine Ammoniak- Lyase.<br />
N<br />
Ala- Ser- Gly-<br />
N<br />
H<br />
H SiHRe<br />
H 2N<br />
L- Histidin<br />
H<br />
O<br />
COOH<br />
<strong>Histidase</strong><br />
-NH 3<br />
NH<br />
142<br />
N<br />
143<br />
N<br />
CH 2<br />
144<br />
O<br />
O<br />
NH<br />
MIO = 4- Methyliden- imidazol- 5- on<br />
N<br />
N<br />
H<br />
H<br />
H<br />
trans-Urocaninsäure<br />
COOH
Mechanismus der <strong>Histidase</strong>- Reaktion:<br />
N<br />
NH<br />
142<br />
N<br />
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
N<br />
NH<br />
142<br />
N<br />
143<br />
MIO<br />
N<br />
CH 2<br />
NH<br />
144<br />
O<br />
H Si<br />
L- Histidin<br />
143<br />
N<br />
CH 2<br />
NH<br />
NH<br />
+<br />
3<br />
144<br />
H<br />
O<br />
H Re<br />
H<br />
H<br />
N<br />
O<br />
H<br />
trans- Urocaninsäure<br />
COO -<br />
H<br />
N<br />
O<br />
COO -<br />
- 3 -<br />
1,4-Michael-<br />
Addition<br />
Desaminierung<br />
- NH 3<br />
NH<br />
142<br />
N<br />
H<br />
N<br />
143<br />
N<br />
CH 2<br />
NH<br />
142<br />
+ NH<br />
N<br />
H<br />
N<br />
143<br />
144<br />
N<br />
CH 2<br />
O -<br />
H Si<br />
NH<br />
+<br />
3<br />
NH<br />
H<br />
N<br />
O<br />
H Re<br />
144<br />
O -<br />
H<br />
H<br />
NH<br />
+<br />
3<br />
- B<br />
COO -<br />
Regeneration<br />
H<br />
N<br />
O<br />
H<br />
BH<br />
COO -
Histidin- Stoffwechsel:<br />
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
NH<br />
Histidin- Ammoniak- Lyase<br />
= <strong>Histidase</strong><br />
NH<br />
Urocaninsäuredehydratase<br />
= Urocanase<br />
Imidazolonpropionase<br />
Glutaminsäureformiminotransferase<br />
O<br />
H 2N<br />
NH<br />
NH<br />
H<br />
N<br />
N<br />
COOH<br />
N<br />
NH 3<br />
N<br />
H 2O<br />
COOH<br />
THF<br />
H 2O<br />
- 4 -<br />
COOH<br />
NH 2<br />
COOH<br />
COOH<br />
COOH<br />
5- Formimino- THF<br />
COOH<br />
L- Histidin<br />
trans-Urocaninsäure<br />
HO<br />
NH<br />
N<br />
COOH<br />
4- Imidazolon-5-propionsäure<br />
N- Formiminoglutaminsäure<br />
L- Glutaminsäure
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 5 -<br />
Der oxidative Abbau des Histidins zu Glutaminsäure stellt den Hauptabbauweg dieser<br />
Aminosäure dar. Glutaminsäure ist nicht nur das Hauptabbauprodukt im Histidinstoffwechsel<br />
sondern auch im Katabolismus der Aminosäuren Arginin, Prolin und Glutamin.<br />
Die Glutaminsäure nimmt somit eine zentrale Stellung im Stoffwechsel dieser Aminosäuren<br />
ein. Zusammen mit NAD + wird sie zur entsprechenden Iminosäure dehydriert und<br />
anschließend durch eine oxidative Desaminierung in α- Ketoglutarat überführt.<br />
Diese 2- Oxosäure kann durch eine oxidative Decarboxylierung in Succinyl- CoA übergehen.<br />
Damit wäre der Anschluss an den Endabbau aller Nährstoffe im Tricarbonsäure- Cyclus<br />
gefunden.<br />
Zu einem geringen Teil kann Histidin auch durch Transaminierung ( zu α- Keto- β-<br />
imidazolpropionsäure) und durch Decarboxylierung ( Histamin ) katabolisiert werden.<br />
3.) Generelle Abbauwege von Aminosäuren<br />
1. nicht- oxidative Desaminierung<br />
2. oxidative Desaminierung<br />
3. Umwandlung der Seitenkette unter Erhalt der α- Amino- carbonsäure- Gruppierung. Es<br />
entsteht hierbei stets Glycin.<br />
4. Decarboxylierung von Aminosäuren unter Entstehung der entsprechenden biogenen<br />
Aminen<br />
5. Transaminierung von Aminosäuren. Als Aminogruppen- Akzeptoren fungieren hierbei 2-<br />
Oxosäuren wie z.B. Oxalacetat oder α- Ketoglutarat.<br />
Bei den Reaktionsweisen 3,4,5 handelt es sich um Pyridoxalphosphat- abhängige Reaktionen.<br />
Pyridoxalphosphat ist ein Derivat von Vitamin B6.<br />
4.)Induktion der Enzymsynthese auf der Genebene<br />
Werden Bakterienzellen der Gattung Pseudomonas in einem Nährmedium angezogen, das L-<br />
Histidin als einzige Kohlenstoff- und Stickstoff- Quelle enthält, so müssen diese<br />
chemotrophen Bakterien den gesamten Energiebedarf für ihren Stoffwechsel aus dem<br />
L- Histidinkatabolismus beziehen.<br />
Hierzu werden die am Histidinabbau beteiligten Enzyme verstärkt syntetisiert, so daß deren<br />
Gehalt in der Zelle bis <strong>zum</strong> 1000- fachen des Normalwertes ansteigen kann. Solche Enzyme,<br />
die bei Bedarf verstärkt gebildet werden, nennt man induzierbare Enzyme.<br />
Die Induktion der Enzymsynthese erfolgt dabei durch Stoffwechselmetabolite oder wie auch<br />
in diesem Fall durch das Substrat (L- Histidin ) selbst.<br />
Die Regulation der Enzyminduktion vollzieht sich auf der Genebene.
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 6 -<br />
Der Regulationsmechanismus hierbei kann u.a. mit Hilfe des Jacob- Monod- Modells anhand<br />
des Lactose- (lac)- Operons von Escherichia coli erklärt werden ( siehe hierzu Lehrbücher zur<br />
Genetik oder Mikrobiologie).<br />
Die Induzierbarkeit der Synthese bestimmter Enzyme kann natürlich auch bei deren<br />
Isolierung aus einem Zellrohextrakt ausgenutzt werden.<br />
4.) Stereospezifität der <strong>Histidase</strong>- Reaktion<br />
Setzt man L- Histidin in Anwesenheit von D2O mit <strong>Histidase</strong> um, so entsteht trans-<br />
Urocaninsäure. Da aber die Reaktion reversibel ist, wird Histidin zu einem geringen<br />
Prozentsatz wieder zurückgebildet. Anstelle des abgespaltenen Protons wird nun aber<br />
Deuterium (aus dem Lösungsmittel) eingebaut (direkt nachweisbar mittels NMR-<br />
Spektroskopie).<br />
Die Tatsache, dass nur eines der beiden H- Atome am β- C- Atom des Histidins durch<br />
Deuterium ersetzt wird, weist darauf hin, dass bei der Eliminierungsreaktion durch die<br />
<strong>Histidase</strong> nur ein bestimmtes der beiden H- Atome eliminiert wird.<br />
Die Reaktion verläuft demnach stereospezifisch d.h. das Enzym kann die beiden H- Atome<br />
des Histidins am β- C- Atom voneinander unterscheiden.<br />
Wäre dies nicht der Fall, so wären beide H- Atome am β- C- Atom durch Deuterium ersetzt.<br />
Diese beiden H- Atome sind zueinander diastereotop. Diastereotope Gruppen können generell<br />
durch Enzyme unterschieden werden. Die durch die <strong>Histidase</strong> katalysierte Eliminierung<br />
verläuft antiperiplanar.<br />
N<br />
N<br />
H<br />
H SiHRe<br />
H 2N<br />
L- Histidin<br />
H<br />
COOH<br />
<strong>Histidase</strong><br />
-NH 3<br />
N<br />
N<br />
N<br />
H<br />
H<br />
H<br />
trans-Urocaninsäure<br />
N<br />
H<br />
H SiD<br />
H 2N<br />
+D 2O<br />
+NH 3<br />
H<br />
COOH<br />
COOH
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 7 -<br />
4.) <strong>Histidase</strong> ( Histidin Ammoniak- Lyase)<br />
Zur Bestimmung der Gesamtaktivität der <strong>Histidase</strong> aus Pseudomonas Putida ( welche in<br />
Escherichia coli überexprimiert wurde), wird ihre Eigenschaft L- Histidin zu trans-<br />
Urocaninsäure umzusetzen, ausgenutzt.<br />
Über die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Warburg kann dann die spezifische<br />
Aktivität berechnet werden.<br />
Anschließend wird mit dieser <strong>Histidase</strong> eine Inhibitionskinetik- zur Bestimmung des Ki-<br />
Wertes von L- Cystein- erstellt.<br />
Zuletzt soll noch der molare Extinktionskoeffizient einer ausgegebenen trans- Urocaninsäure<br />
spektrometrisch ermittelt werden.<br />
N<br />
N<br />
H<br />
H SiHRe<br />
H 2N<br />
L- Histidin<br />
H<br />
COOH<br />
<strong>Histidase</strong><br />
-NH 3<br />
N<br />
N<br />
H<br />
H<br />
H<br />
trans-Urocaninsäure<br />
COOH
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 8 -<br />
Reagenzien für den gesamten <strong>Versuch</strong>steil <strong>Histidase</strong>:<br />
1.) 10 mM Tris- HCL- Puffer pH = 7,2<br />
Die erforderliche Menge für 200 ml dieses Puffers wird in ein geeignetes Gefäß eingewogen,<br />
in H2O bidest. gelöst und mit HCL oder NaOH der pH- Wert eingestellt.<br />
M Tris- HCL= 121,14g/mol<br />
2.) 0,1M Pyrophosphatpuffer 10 µM ZnCL2 pH = 9,3<br />
Die erforderliche Menge an Na4P2O7 * 10 H2O und ZnCL2 für 200ml Puffer wird in ein<br />
geeignetes Gefäß eingewogen, in H2O bidest. gelöst und mit H3PO4 oder NaOH der pH- Wert<br />
eingestellt. In Anbetracht der geringen Menge an ZnCL2 ist es sinnvoll eine 10 mM<br />
Stammlösung herzustellen und die erforderliche Menge durch Verdünnung <strong>zum</strong> Puffer<br />
hinzuzufügen.<br />
M Na4P2O7 * 10 H2O = 446,06g/mol<br />
M ZnCL2 = 136,29g/mol<br />
3.) 0,1M DTT, 10 ml<br />
Berechnete Menge in ein 15 ml Falcon- Tube einwiegen und in 10 ml H2O bidest. lösen.<br />
MDTT = 154,20g/mol<br />
4.) 0,5M L- Histidin, 10 ml<br />
Berechnete Menge an L- Histidin- Monohydrochlorid- Monohydrat in ein 15 ml Falcon- Tube<br />
einwiegen und in 10 ml H2O bidest. lösen.<br />
ML- Histidin- Monohydrat = 209,63 g/mol<br />
5.) 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7,4 ; 1000 ml<br />
In ein geeignetes Gefäß werden 6,98g K2HPO4 und 1,35g KH2PO4 eingewogen und in<br />
1 Liter H2O bidest. gelöst, Mit H3PO4 oder KOH wird der pH- Wert gegebenenfalls auf 7,4<br />
korrigiert.<br />
6.) 20 mM L- Cystein, 10 ml<br />
Berechnete Menge an L- Cystein in ein 15 ml Falcon- Tube einwiegen und in 10 ml H2O<br />
bidest. lösen.<br />
ML- Cystein = 121,16g/mol
Durchführung:<br />
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 9 -<br />
4.1. Isolierung der <strong>Histidase</strong> aus Escherichia coli:<br />
E.coli- <strong>Histidase</strong>- Zellen aus 125 ml Anzucht werden in ca. 30 ml (soviel, dass das<br />
Ultraschallaufschlußgefäß bis ca. 1 cm unter den Rand gefüllt ist) 10 mM Tris- HCL<br />
pH 7,2 auf Eis resuspendiert, in ein Ultraschall- Aufschlußgefäß überführt und<br />
5- 10 min bei 65- 70 % Leistung mit Ultraschall aufgeschlossen (solange, bis die Lösung klar<br />
ist). Das Aufschlußgefäß wird dabei immer mit Eis gekühlt.<br />
Danach wird die aufgeschlossene Proteinsuspension in einen gekühlten Metall-<br />
Zentrifugenbecher umgefüllt und 40 min bei 4°C und 18000 rpm abzentrifugiert, um<br />
Zellrückstände zu entfernen<br />
( Sorvall- Zentrifuge, Rotor SS 34 ).<br />
Die überstehende, noch trübe Lösung des Rohextraktes wird in einen 100 ml Rundkolben<br />
überführt und pro 10ml Volumen mit 100 µl 0,1 M MgSO4, 100 µl 0,5 M L- Histidin und<br />
100 µl 0,1 M DTT versetzt. Der Rohextrakt wird im Ölbad unter Rühren 15 min bei 80°C<br />
erhitzt<br />
Unter diesen rigorosen Bedingungen denaturieren nahezu alle Enzyme außer der <strong>Histidase</strong>,<br />
welche nach erneuter Zentrifugation bei 4°C, 18000 rpm und 30 min Dauer im Überstand<br />
bleibt.<br />
Das Volumen des Überstandes (ml) wird bestimmt und die Enzymlösung kaltgestellt,<br />
während die <strong>Histidase</strong>- Gesamtaktivität bestimmt wird.<br />
4.2. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Warburg<br />
Zu bestimmende Proteinproben werden gegen eine Referenzküvette mit Puffer bei 260 nm<br />
und 280 nm gemessen. Zuvor muss bei diesen Wellenlängen der Nullabgleich mit Puffer<br />
durchgeführt werden.<br />
Die Proteinkonzentration wird wie folgt berechnet:<br />
Proteinkonzentration (mg/ml) = 1,5 x A280 – 0,75 x A260 x Verdünnungsfaktor<br />
Puffer für die Messung der <strong>Histidase</strong>- Konzentration: 10 mM Tris- HCL pH 7,2<br />
Die Menge an <strong>Histidase</strong>- Lösung sollte so gewählt sein, so dass ungefähr eine Absorption im<br />
Bereich von E = 0,2 bis E = 1 gemessen wird.
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 10 -<br />
4.3. Test der <strong>Histidase</strong>- Gesamtaktivität<br />
Testmedium:<br />
In eine 1ml Quarzküvette werden folgende Lösungen einpipettiert:<br />
865µl 0,1M Pyrophoshatpuffer 10 µM ZnCL2 pH = 9,3<br />
15µl 0,1M DTT<br />
50µl <strong>Histidase</strong>lösung<br />
Den Testansatz 5 min bei 25°C inkubieren lassen, Nullabgleich am Spektrometer<br />
durchführen. Anschließend erfolgt der Reaktionsstart durch Zugabe von 70µl 0,5M<br />
Histidinlösung.<br />
Die Messung wird bei 277nm , 25°C, in 1cm Quarzküvetten (1 ml Volumen) durchgeführt.<br />
Die Menge an <strong>Histidase</strong> soll so gewählt werden, so dass eine 5- minütige Messung im<br />
Absorptionsbereich von E = 0 bis E = 3 möglich ist.<br />
Berechnung der <strong>Histidase</strong>- Gesamtaktivität:<br />
Definition einer internationalen enzymatischen Einheit (IU).<br />
Wellenlänge und pH- Wert hier speziell für <strong>Histidase</strong>:<br />
1 IU = Umsatz von einem µmol Substrat pro Minute<br />
bei 25°C, 277nm und pH 9,3<br />
Die Berechnung basiert auf der Messung der zeitlichen Änderung der optischen Dichte des<br />
Testmediums, unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten von<br />
Urocaninsäure bei 277nm und pH 7,4 (ε = 18,8 ml* µmol -1 * cm -1 ).
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 11 -<br />
Die Formel für die Berechnung der IU basiert auf dem Lambert- Beer- Gesetz:<br />
I<br />
log<br />
I<br />
* c<br />
d<br />
dt<br />
0<br />
=<br />
Ε = ε<br />
Ε = ε<br />
mit c<br />
=<br />
dn<br />
mit<br />
dt<br />
Ε<br />
* l<br />
*<br />
n<br />
V<br />
d<br />
dt<br />
→<br />
c * 1<br />
d<br />
dt<br />
= IU →<br />
Ε = ε *<br />
d<br />
dt<br />
dn<br />
Vdt<br />
Ε = ε *<br />
1*<br />
* 1,<br />
IU<br />
V<br />
wenn<br />
V zeitlich kons<br />
tan t<br />
Weil die Änderung von E nicht nach unendlich kleinen Zeitabschnitten bestimmt wird, kann d<br />
durch ∆ ersetzt werden. Wird außerdem nicht die gesamte Enzymlösung, sondern nur ein<br />
kleiner Teil und der noch in Verdünnung für die Messung verwendet wurde, muß ein<br />
Verdünnungsfaktor berücksichtigt werden.<br />
Aus dem Lambert- Beer- Gesetz ergibt sich dann folgende Formel für die Berechnung der<br />
enzymatischen Einheiten ( International Units):<br />
IU<br />
∆Ε*<br />
Vk<br />
* V<br />
∆t<br />
* ε * l * v<br />
= Die Einheit der IU ist [ µmol/ min].<br />
In diesen Formeln bedeuten die Variablen:<br />
I0 = Lichtintensität bestimmter Wellenlänge nach 0cm<br />
I = Lichtintensität bestimmter Wellenlänge nach 1cm<br />
n = Molzahl [ mol ]<br />
E = Adsorption oder optische Dichte<br />
ε = molarer Extinktionskoeffizient [ml * µmol -1 * cm -1 ]<br />
l = Lichtweg ( Küvettenbreite) [1cm]<br />
c = Konzentration [mol* l -1 ]<br />
V = gesamtes Volumen der Enzymlösung [ml]<br />
Vk = Volumen in der Küvette befindlichen Lösung [ml]<br />
v = zur Messung verwendetes Volumen der Enzymlösung [ml]<br />
t = Zeit [min]
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 12 -<br />
4.4. Bestimmung der spezifischen Aktivität der <strong>Histidase</strong><br />
Aus der ermittelten Proteinkonzentration aus 4.2. und der Gesamtaktivität der <strong>Histidase</strong> aus<br />
4.3. kann nun bequem die spezifischen Aktivität der <strong>Histidase</strong> in IU/mg berechnet werden.<br />
4.5. <strong>Histidase</strong>/Inhibitionskinetik<br />
Bestimmung des Ki-Wertes von L- Cystein:<br />
Der Ki-Wert wird mit Hilfe des Lineweaver- Burk- Diagrammes ermittelt. Das Diagramm<br />
wird mit Hilfe von bekannten L- Histidinkonzentrationen (L- Histidinlösung 1-5) erstellt. Die<br />
Menge an <strong>Histidase</strong> sollte so gewählt werden, dass ca. 0,500 ∆E pro min erreicht werden. Die<br />
Konzentrationen der L- Histidin- Lösungen (verdünnt aus der 0,5 M Stammlösung) sollen<br />
1.) 5mM,<br />
2.) 8mM,<br />
3.)10mM,<br />
4.) 15mM und<br />
5.) 35mM<br />
in der Küvette betragen.<br />
Küvettenbestückung für jeden der 5 Ansätze (UV, 277 nm, 1 ml Quarzküvetten) ohne<br />
Inhibitor:<br />
<strong>Histidase</strong> z.B.10 µl<br />
0,1M Pyrophosphat-Puffer pH 9,3/10µM 923 µl bzw. mehr <strong>zum</strong> Auffüllen auf 1ml<br />
ZnCl2<br />
Küvettenvolumen<br />
0,1 M DTT 17 µl<br />
Zur Reduktion der Disulfidbrücken wird das Enzym 5 min inkubiert. Nach Ablauf der<br />
5 min wird ein Nullabgleich durchgeführt. Dann wird durch Zugabe von L- Histidinlösung<br />
der Konzentrationen 1-5 die Reaktion gestartet.
<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 13 -<br />
Küvettenbestückung für jeden der 5 Ansätze (UV, 277 nm, Quarzküvette) mit 0,8 mM bzw.<br />
0,1 mM L-Cystein in der Küvette:<br />
<strong>Histidase</strong> z.B. 10 µl<br />
0,1M Pyrophosphat-Puffer pH 9,3/10µM 873 µl bzw. mehr <strong>zum</strong> Auffüllen auf 1ml<br />
ZnCl2<br />
Küvettenvolumen<br />
0,1 M DTT 17 µl<br />
Zur Reduktion der Disulfidbrücken wird das Enzym 5 min inkubiert. Dann wird durch<br />
gleichzeitige Zugabe von L-Histidinlösung der Konzentrationen 1-5 und 0,8 mM bzw. 0,1<br />
mM L-Cystein ( Konzentration in der Küvette) die Reaktion gestartet.<br />
4.6. Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten<br />
von trans- Urocaninsäure<br />
Zur Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten werden ca. 170 mg ( genauen Wert<br />
notieren ) trans- Urocaninsäure in einem 500 ml Meßkolben in 500 ml<br />
50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 gelöst. Dabei ist äußerst genau zu arbeiten, außerdem<br />
sollte darauf geachtet werden, dass die trans- Urocaninsäure vollständig in Lösung ist!<br />
Mit dem 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 wird bei 277nm ein Nullabgleich<br />
durchgeführt. Anschließend soll die trans- Urocaninsäurelösung in der Küvette so verdünnt<br />
werden, so dass die Extinktion, welche von 3,4mg trans- Urocaninsäure in einem Liter<br />
verursacht wird, in der Küvette gemessen werden kann.<br />
Über die gemessene Extinktion und der in der Küvette vorhandenen Konzentration der trans-<br />
Urocaninsäure in mol/l kann nun bequem über das Lambert- Beersche Gesetz der molare<br />
Extinktionskoeffizient berechnet werden.<br />
E = ε * c* l<br />
l = 1cm<br />
Literaturwert: ε ( 277nm , pH= 7,4) = 18,8ml*µmol -1 *cm -1