Substitution von molekularen Klammern an den Naphthalin ...

Durchführung
⎛
2 ⎞
Δδ
max ⎜ 1 ⎛
1 ⎞ 1 ⎛
1 ⎞
⎟
δ = ⋅
⎜ ⎜
⎜[
R]
+ +
⎟ − ⋅
⎜ + +
⎟
0 [ S]
0
[ R]
0 [ S]
0 −[
R]
0⋅
[ S]
⎟ (10)
[ S] 0 2
⎝
⎝
K a ⎠ 4 ⎝
K a ⎠
⎠
Δ 0
Bei den Titrationsexperimenten wird die chemische Verschiebung Δδ des
Substrats in Abhängigkeit von der Rezeptorkonzentration [R]0 bei konstanter
Substratkonzentration [S]0 verfolgt. In einem NMR-Röhrchen wird dazu eine
definierte Menge mR des Rezeptors eingewogen und in einem separaten Gefäß
die Substratstammlösung hergestellt. Die Substratkonzentration [S]0 wird so
eingestellt, dass zu Beginn der Titration der Rezeptor in 2- bis 3-fachem
Überschuss im Bezug auf das Substrat vorliegt. Der Rezeptor wird in 0.6 mL der
Substratlösung gelöst. Von dieser Startlösung wird ein 1 H-NMR-Spektrum
aufgenommen. Zu der Startlösung werden nachfolgend definierte Volumina (8 x
50 µL, 6 x 100 µL, 2 x 200 µL) der Substratlösung zugegeben und das jeweilige
1
H-NMR-Spektrum gemessen. Durch die sukzessive Zugabe der Substratlösung
wird im Verlauf der Messung die Konzentration der Rezeptors [R]0 erniedrigt, so
dass am Ende der Titration eine äquimolare Konzentration von Rezeptor und
Substrat vorliegt. Aus den gemessenen NMR-Spektren wird die chemische
Verschiebung δobs der Substratsignale abgelesen. Nach Gleichung (7) werden mit
den ermittelten δ−Werten die Δδ−Werte berechnet. Durch Auftragung der
Δδ−Werte gegen die Rezeptorkonzentration [R]0 und die nicht lineare Anpassung
der Daten nach Gleichung (9) mit dem Programm TableCurve2D werden die
Assoziationskonstante Ka und die Sättigungsverschiebung Δδmax des untersuchten
Protons ermittelt. Bei Anwesenheit mehrerer nicht äquivalenter Substratprotonen
erfolgt die Auswertung für jedes Proton einzelnd. Als Folge der abnehmenden
Δδmax-Werte und dem damit verbundenen Fehler in der Bestimmung der
Assoziationskonstanten werden für die unterschiedlichen Protonen
unterschiedliche Werte für die Ka erhalten. Um diesen Fehler zu minimieren,
werden die Assoziationskonstanten Ka anhand des Protons mit dem größten
Δδmax-Wert bestimmt. Da die Komplexkonzentration [RS] abhängig von der
Konzentration der Substratlösung und dem Quotienten aus beobachteter
Verschiebung einer Protonensorte zur Sättigungsverschiebung der jeweiligen
Protonensorte ist, wird Gleichung (11) in Gleichung (12) umgeformt. Die Δδmax-
Werte der anderen Substratprotonen können nach der Gl. (12) berechnet werden.
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