Enzymmechanismen - INSTITUT FÜR CHEMIE

Enzymmechanismen 

Karl Gruber 

Kompetenzzentrum Angewandte Biokatalyse GmbH 

c/o Institut f. Chemie 

KFU-Graz 

Molekulare Enzymologie und Proteinengineering, WS 04/05 Karl Gruber 

1 

Methoden 

• Enzymkinetik (Inhibition, pH-Profile, Mutationsstudien… ) 

• Spektroskopie (IR, NMR, ESR,… ) 

• Isotope (kinetischer Isotopeneffekt, Lösungsmittel,… ) 

• Kristallographie, NMR (3D-Struktur) 

• Modellreaktionen (chemische Präzedenz) 

• Modellrechnungen, Datenbanken 

• Derivatisierung (Intermediate, AS im aktiven Zentrum) 

• … 


2

Enzyme sind Katalysatoren 

Arrhenius-Gleichung 

= A⋅ 

e 

E act 


3 


4 

k 

− 

RT 

Säure-Basen-Katalyse 

Nukleophile Katalyse 

(Redox-Reaktionen)

Beeinflussung des 

pKa-Wertes 

durch die Umgebung 

pKa-Werte 


5 


6


7 

Wie arbeiten Enzyme? 

• ‘Nachbarschaftseffekt‘, Nähe reaktiver Gruppen, 

Entropie-Effekte 

• Spannung, selektive Bindung reaktiver Konformere 

• Desolvatisierung 

• dynamische Effekte 

• elektrostatisches Potential im aktiven Zentrum, 

Orientierung von Dipolen, bessere Solvatisierung 

des Übergangszustandes 


8

Enzymkinetik 

Michaelis-Menten Gleichung 

k cat : ‚turnover‘, Zahl der Umsetzungen pro Zeit 

k cat /K M : katalytische Effizienz 


9 

Enzymkinetik 


10

[S]>>K M : 

v nur von 

k cat abhängig 

Enzymkinetik 


11 

[S]

Perfekte Enzyme 

k cat /K M : Geschwindigkeitskonstante einer bimolekularen Reaktion 

Diffusionslimit: 10 8 M -1 s -1 


13 

TST und Tunnel 

Theorie 


14

Klassifizierung von Enzymen 

IUPAC-Nomenklatur (E.C.) 

1. Oxidoreduktasen: Alkoholdehydrogenasen,… 

2. Transferasen: Glycosyltransferasen, Methyltransferasen,… 

3. Hydrolasen: Esterasen, Lipasen, Peptidasen,… 

4. Lyasen: HNL, Ribulose-bisphosphatcarboxylase,… 

5. Isomerasen: Racemasen, Mutasen,… 

6. Ligasen: AS-tRNA-Ligasen 

Art der Reaktion, Substrat 

http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/ 


15 

Klassifizierung von Enzymen 

(CATH) 

http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/ 

C Class 

A Architecture 

T Topology (Faltung) 

H Homology 

----------------------------- 

S Sequence Family 

(Funktion) 

Struktur – Funktion 


16

Klassifizierung von 

Enzymen (ProCat) 

http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PROCAT/PROCAT.html 

Active site consensus template: Ser 152 - His 263 - Asp 176 

Atom Residue Number x y z 

OG Ser 152 5.246 0.555 -0.501 

CB His 263 -1.481 -0.114 -0.054 

CG His 263 0.000 0.000 0.000 

ND1 His 263 0.816 -1.112 0.000 

CD2 His 263 0.797 1.087 0.000 

CE1 His 263 2.039 -0.718 -0.041 

NE2 His 263 2.056 0.613 -0.019 

OD2 Asp 176 0.491 -3.786 0.089 


17 

Hydrolasen 


18

H 

A 

Proteasen (Esterasen, Lipasen) 

H 

R 1 

O 

H 

B – 

δ- 

O 

δ+ 

O 

R 1 

R 

X 

2 

X=-NH-, -O-, -S- 

Me n+ 

X 

H 

A 

R 2 

|Nu-H 


19 

funktionell: 

mechanistisch: 

R 1 

O 

Nu 

+ 

HX 

R 2 

allg.: Acyltransferasen 

Polarisierung der Carbonylgruppe 

Aktivierung des Nukleophils 

Verbesserung der Abgangsgruppeneigenschaften 

Arten von Proteasen 

endo- oder exo- (exo: Amino- bzw. Carboxypeptidasen) 

Spezifizität 

Ser-Proteasen (Cys-Proteasen) 

Metalloproteasen (Zn) 

Aspartylproteasen 


20

Trypsin vs. Subtilisin 

(Gesamtstruktur) 

Trypsin Subtilisin 


21 

Trypsin vs. Subtilisin (ProCat) 

Trypsin Subtilisin 


22

Katalytischer Mechanismus 


23 

Elastase-Inhibitor Komplex 

2.7Å 

1.3Å 

Relibase: http://relibase.ccdc.cam.ac.uk/ 


24 

Pro 

HN 

H 2N 

Asn 

N 

O 

O 

O 

O 

NHCOCH 3 

Ile

Low-Barrier Hydrogen Bond 

‚normale‘ H-Brücke 

lokalisiertes Proton, 

Energiedifferenz der 

Minima ~ pKa- 

Differenz 

LBHB: 

gleicher pKa-Wert, 

delokalisiertes 

Proton 

15.41 ppm 

15.41 ppm 


25 

Ser- vs. Cys-Proteasen 

• sehr ähnlich (analoger Mechanismus, 

SH-Gruppe des Cys ist leichter zu deprotonieren) 

• O 2 -Empfindlichkeit der Cys-Proteasen 

• Papain, Bromelain 

2 Subfamilien von Ser-Proteasen 

Ser-Kodon UCX oder AGC/AGU 

CAC UGC 

His Cys 

CAC AGC 

His Ser 

CAC UCC 

His Ser 


26 

X

α/β-Hydrolase-Faltung 

(Carboxypeptidase C) 

Dieser Faltungstyp wird auch für eine Reihe von Esterasen und Lipasen beobachtet. 


27 

Struktur eines Enzyms mit 

unbekannter Funktion 

α/β-Hydrolase Faltung 

ProCat: katalytische 

Triade (Ser-His-Asp) 

-> Protease, Esterase ?? 


28

Hydroxynitril-Lyasen 


29 

Cys81 

Thr11 

Trp128 

Ser80 

Glu79 

His235 

Lys236 

Aktives Zentrum der 

HNL aus Hevea 

brasiliensis 

Asp207 


30

R2 R1 R 2 

R 1 

Ser80 

C 

C O 

O H N NH 

C 

H 

O 

O 

Ser80 

N 

H 

S 

H 

S 

HN 

HN 

H 

O 

HO 

H N 

O 

Cys81 

His235 

Thr11 

O 

O 

Asp207 

R 2 

R 1 

R 2 

R 1 

N 

C 

C 

R 2 

O 

R 1 

O 

OH 

Ser80 

Wagner U. G., Hasslacher M., Griengl H., Schwab H. and Kratky C., Structure 4, 

811-822 (1996) 

Mechanismusvorschlag 1 

CN 

OH 

SH 

H 

NH 

HO 

N 

• basierte auf der beobachteten 

Strukturhomologie zu 

α/β-Hydrolasen 

• Ser-80 als Nukleophil 

• tetraedrisches Hemiacetal 

bzw. Hemiketal-Intermediat 


31 

Mechanismusvorschlag 2 

Substrat-Komplex 

der Hb-HNL 


32

• 2-Hydroxy-6-oxo-nona-2,4-dien-1,9-disäure-5,6-Hydrolase (MhpC) 

Sequenzhomolgie: α/β-Hydrolasefaltung, katalytische Triade (Ser-His-Asp) 

kein kovalentes Intermediat 

• Haloperoxidasen 

α/β-Hydrolase Faltung, Triade: Ser-His-Asp, Mechanismus(?), enzymatische Bildung einer 

Peroxycarbonsäure, nicht-enzymatische Halogenierung 

• Haloalkandehalogenase 

Cl 

Cl 

α/β-Hydrolase Faltung, Triade: Asp-His-Asp, kovalente Bindung zw. Substrat und Asp 


33 

H 

A 

H 

R 1 

O 

Thermolysin 

H 

B – 

δ- 

O 

δ+ 

Me n+ 

X 

H 

A 

R 2 

R H 

X – , H 2O 2, R'-COOH 

H 2O 

Cl 

R X 

Metallo-Proteasen 


34 

OH 

Polarisierung der Carbonylgruppe 

Aktivierung des Nukleophils 

Verbesserung der Abgangsgruppeneigenschaften

HIV-Protease 

Pepsin 

Renin 

Aspartylproteasen 


35 

K S 

Katalytische Antikörper 

E + S 

ES 

K n* 

K e* 

k e:k n ≈ K S:K T 

E + S* 

[ES]* 

E + P 

• Design von Übergangszustandsanaloga 

• Immunsierung 

• Antikörpergewinnung (Ascites, Zellkulturen, rekombinant) 


36 

K T

Struktur von 

Antikörpern 

2 schwere Ketten 

2 leichte Ketten 

Fab-Domäne 

Fc-Domäne 

Antigen-bindender 

Bereich (CDR) 


37 

Beispiele fuer Abzyme-katalysierte 

Reaktionen 

Esterase 

O 2N 

O 

O 

CH 3 

O 2N 

OH – 

O 2N 

O O 

O 

– 

O 

OH 


38 

P 

O 

CH 3 

O 

O OH 

O 2N 

HO 

O 

CH 3 

O

Beispiele fuer Abzyme-katalysierte 

Reaktionen 

Chorismat-Mutase 

CO 2 – 

OH 

O CO 2 – 

– O2C 

OH 

Chorismat Prephenat 

H 

– O2C 

O 

O 


39 

O 

O 

R 

CO 2 – 

CO 2 – 

Aldolasen 

Aldolkondensationen 

2 Klassen: (I) Enamin-Intermediat 

(II) Zn-Ion 

Fructosebisphosphat- 

Aldolase 


40 

– O2C 

OH 

CO 2 – 

O

Aldolase Antikörper 

Ziel: Anitkörper mit aktivem Lysin in der Bindungstasche, 

Analogie zu Klasse-I-Aldolasen 

‘reaktive Immunisierung‘ mit 1,3-Diketon 

C.F. Barbas III et al., Science 278, 2085 (1997) 


41 

Aldolase Antikörper (33F2) 

katalytisches Lysin in hydrophober Umgebung 

(Verschiebung des pKa-Wertes) 

breites Substratspektrum durch reaktive Immunisierung 


42

Enzymmechanismen - INSTITUT FÜR CHEMIE

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