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Aus der Neurologischen Klinik
des St. Josef-Hospital Bochum
- Universitätsklinik -
der Ruhr Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Ralf Gold
Effekte der immunmodulatorischen Substanz Laquinimod im Rattenmodell der
Experimentellen Autoimmunen Neuritis
Publikationsbasierte
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Kalliopi Pitarokoili
aus Heraklion, Kreta
Griechenland
2016

Dekan:
Referent:
Korreferent:
Prof. Dr. med. Albrecht Bufe
Prof. Dr. med. Ralf Gold
Prof. Dr. med. Claus Haase
Tag der mündlichen Prüfung: 14.04.2016
!

Abstract
Kalliopi Pitarokoili
Effekte der immunmodulatorischen Substanz, Laquinimod im Rattenmodell der Experimentellen
Autoimmunen Neuritis
Einleitung und Zielsetzung: Das Guillain-Barré Syndrom und die chronische inflammatorische
demyelinisierende Polyneuropathie sind autoimmune entzündliche Krankheiten des peripheren Nervensystems
mit zunehmender Inzidenz, jedoch mit wenigen und nicht zufriedenstellenden Therapiemöglichkeiten. Das Ziel
der vorliegenden Dissertation war, der immunmodulatorischen Substanz, Laquinimod, was schon
tierexperimentell und in Phase III Studien für Patienten mit Multipler Sklerose getestet wird, als Therapie beim
Tiermodell der autoimmunen Neuritiden, der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN), zu überprüfen.
Methoden: Insgesamt 38 Lewis Ratten wurden am Tag 0 mit P2 53-728 Peptid subkutan immunisiert und täglich
von Tag 0 bis Tag 28 mit verschiedenen Konzentrationen von Laquinimod (6,25mg/kg, 12,5mg/kg, 25mg/kg)
oral einmal täglich behandelt. Bei der Kontrollgruppe wurde Leitungswasser oral appliziert. Die Beurteilung des
Krankheitsverlaufs erfolgte täglich. Am Tag der maximalen Ausprägung der klinischen Symptomatik ( Tag 16
nach Immunisierung) wurden die Tieren mittels elektrophysiologischer, histologischer und
durchflusszytometrischer Verfahren untersucht.
Ergebnis: Die klinische Beurteilung ergab eine signifikante Besserung der EAN unter 12,5mg/kg Laquinimod
mit entsprechender Reduktion der Immunzellen-Infiltration und der Demyelinisierung im peripheren
Nervensystem (PNS), was elektrophysiologisch mittels Messung der Nervenleitgeschwindigkeit des
N.ischiadicus bestätigt werden konnte. Zusätzlich zeigte die durchflusszytometrische Analyse der
Immunzellpopulationen der peripheren Lymphknoten und Milz am Tag 16 eine Induktion der plasmatozytoiden
dendritischen Zellen, eine Population mit bekannten immunmodulatorischen Eigenschaften.
Diskussion: Zusammenfassend wurde in der aktuellen Studie gezeigt, dass die immunmodulatorische Substanz
Laquinimod zusätzlich zu den autoimmunen Erkrankungen des zentralen Nervensystems auch autoimmune
Krankheiten des peripheren Nervensystems positiv beeinflussen kann. Potenzielle Mechanismen mittels
regulatorischer dendritischer Zellen wurden zum ersten Mal in dieser Studie aufgezeigt, jedoch bleibt unser
Verständnis bezüglich des Wirkmechanismus von Laquinimod immer noch unvollständig und benötigt weitere
experimentelle Abklärung.
!

Meiner Familie
in Dankbarkeit gewidmet.
!

Inhaltsverzeichnis
1 !Einleitung ........................................................................................................................ 4
1.1 Guillain Barre Syndrom und pathophysiologische Grundlagen
"#$ Chronische inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie und
pathophysiologische Grundlagen!
1.3 Das Tiermodell der experimentellen autoimmunen Neuritis
1.4 Laquinimod als immunmodulatorische und neuroprotektive Substanz
1.5 Laquinimod und experimentelle autoimmune Neuritis
2 Zielsetzung ...................................................................................................................... 10
3 Methoden ........................................................................................................................ 11
3.1 Induktion der experimentellen autoimmunen Neuritis und Laquinimod Behandlung
3.2 Elektrophysiologische Analysen
3.3 Immunhistochemische Analysen
3.4 Durchflusszytometrische Analysen
3.5 Statistische Auswertung
4 Ergebnisse ....................................................................................................................... 15
4.1 Klinische Effektivität von Laquinimod
4.2 Elektrophysiologische Effektivität von Laquinimod
4.3 Histologische Effektivität von Laquinimod
4.4 Effekte von Laquinimod auf Immunzellpopulationen
5 Diskussion ....................................................................................................................... 23
6 Zusammenfassung ......................................................................................................... 26
7 Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 27
!
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"!

Abkürzungsverzeichnis
AIDP
Akute inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie
AMAN
Akute motorische axonale Neuropathie
AMSAN
Akute motorische sensible axonale Neuropathie
APES
3-Aminopropyltriethoxysilane
BDNF
Brain-derived Neurotrophic Factor
CFA
Komplettes Freundsches Adjuvans
CIDP
Chronische inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie
EAE
Experimentelle autoimmune Encephalomyelitis
EAN
Experimentelle autoimmune Neuritis
FACS
Fluorescent associated cell sorting
GBS
Guillain-Barré Syndrom
ICAM-1
Intercellular adhesion molecule-1
IVIg
Intravenöse Immunglobuline
KG
Körpergewicht
LFA-1
Leucocyte function associated antigen-1
MS
Multiple Sklerose
NLG
Nervenleitgeschwindigkeit
mNLG
motorische Nervenleitgeschwindigkeit
p.i.
post Immunisierung
PBS
Phospate Buffered Saline
PNS
Peripheres Nervensystem
SEM
Standard error of the mean
VCAM-1
Vascular cell adhesion molecule-1
VLA-4
Very late antigen-4
ZNS
!
Zentrales Nervensystem
!
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Klinischer EAN Verlauf .............................................................................. (15)
Abbildung 2: Elektrophysiologische Analysen .................................................................. (17)
Abbildung 3: Repräsentative histologische Daten (optische Mikroskopie) ....................... (18)
Abbildung 4: Graphische Darstellung der histologischen Daten für T Zellen ................... (19)
Abbildung 5: Graphische Darstellung der histologischen Daten für Makrophagen ........... (19)
Abbildung 6: Repräsentative histologische Daten - Myelin (Fluoreszenz-Mikroskopie) .. (20)
Abbildung 7: Graphische Darstellung der histologischen Daten für Myelin ...................... (21)
Abbildung 8: Graphische Darstellung der plasmatozytoiden dendritischen Zellen ........... (22)
!
!
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1 Einleitung
Das Guillain-Barré Syndrom (GBS) und die chronische entzündliche demyelinisierende
Polyneuropathie (CIDP) sind die häufigsten autoimmunen, vorwiegend demyelinisierenden
Erkrankungen des peripheren Nervensystems (PNS).
!
1.1 Guillain-Barré-Syndrom und pathophysiologische Grundlagen
!
Nach dem fast völligen Verschwinden der Poliomyelitis (“Kinderlähmung”) ist das
GBS in Europa und Nordamerika die häufigste Ursache für akute generalisierte Lähmungen
beim Menschen. Im Erkrankungsverlauf kommt es innerhalb von 4 Wochen zu akuten
autoimmun-vermittelten schlaffen Lähmungen der Extremitäten und bei 70% der Patienten zu
diffusen distalen und symmetrischen Sensibilitätsstörungen mit einer spontanen Rückbildung
(Maurer and Gold, 2002). Pro Jahr erkranken etwa 0,8 bis 1,9 pro 100.000 Personen, GBS
kann in jedem Lebensalter auftreten und Männer sind 1,5mal so häufig betroffen wie Frauen
(Hughes et al., 2013).
Das klinische Erscheinungsbild mit der Abschwächung oder Verlust der
Muskeleigenreflexe und den typischen liquorchemischen Befunden (isolierte Eiweißerhöhung
im Liquor cerebrospinalis bei unauffälliger Zellzahl, so genannte „Dissociation albumino -
cytologique“, als Zeichen der Wurzelbeteiligung) wurden Anfang des letzten Jahrhunderts
(1916) durch die französischen Neurologen G. Guillain und J. A. Barré zusammen mit dem
Deutschen R. Strohl beschrieben. In ca. 50 % der Fälle kommt es zu einer
Hirnnervenbeteiligung (besonders des N. fazialis), bei etwa zwei Dritteln der Patienten zu
einer autonomen Mitbeteiligung mit Herzrhythmusstörungen, Blutdruckschwankungen sowie
Störungen der Blasen- und Darmfunktion und 25% der Betroffenen entwickeln infolge einer
Mitbeteiligung des Zwerchfells und der respiratorischen Hilfsmuskulatur eine
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Ateminsuffizienz mit einer 5-10%igen Letalität. Die nachfolgende Erholungsphase kann
Monate bis Jahre dauern und 20-30% der Patienten zeigen noch nach einem Jahr erhebliche
Behinderung (Kieseier et al., 2004).
Neben klinischen Charakteristika und Liquordiagnostik sind
Nervenleitgeschwindigkeitsmessungen wichtig zur Unterscheidung der GBS-Unterformen.
Die elektroneurographische Diagnostik zeigt entweder Demyelinisierung, die durch
verzögerte distale motorische Latenzen, Leitungsblöcke, verlangsamte motorische
Nervenleitgeschwindigkeiten, sowie abnormale F-Wellen gekennzeichnet wird oder
reduzierte Amplituden der Potenziale, die eine axonale Schädigung repräsentieren.
Die klassische Form des GBS ist in Europa und Nordamerika die akute
inflammatorische demyelinisierende Polyradikuloneuropathie (AIDP), jedoch in China und
Japan wird am häufigsten ein rein motorischer axonaler Typ, die akute motorische axonale
Neuropathie (AMAN), bei hauptsächlich Kindern und Jugendlichen beschrieben. Bei
zusätzlich sensibler Beteiligung wird das Syndrom als akute motorische und sensorische
axonale Neuropathie (AMSAN) definiert. Eine weitere Variante des GBS ist das Miller-
Fisher Syndrom, welches durch Ataxie, Areflexie und Ophthalmoplegie charakterisiert ist
(Hughes et al., 2013).
Wegweisend bezüglich der pathophysiologischen Grundlagen des GBS ist die
Tatsache, dass die erste klinische Symptomatik in etwa zwei Drittel der Fälle ein bis vier
Wochen nach Infektionen der Atemwege oder des Magendarmtraktes auftritt. Die am
häufigsten nachgewiesenen Erreger sind Campylobacter jejuni und Mykoplasmen. Basierend
auf der Theorie des ´Molecular Mimicry´ wird angenommen, dass eine fehlgerichtete
Immunantwort gegen infektiöse Erreger irrtümlich zur Induktion einer Autoimmunantwort
gegen Myelinbestandteile als Folge einer Kreuzreaktion beiträgt. Lipopolysaccharid-
Komponenten von C. jejuni zeigen Homologien zu humanen Gangliosiden (z.B. GM1, GM2,
GD1A, GT1A und GQ1b). Entsprechende Antikörper zusammen mit Antikörpern gegen
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Myelin-Bestandteile (P2, P0, PMP22- Peptide), die als potentielle Autoantigene angesehen
werden können, wurden in GBS-Seren nachgewiesen.
Auf der Basis der oben genannten pathophysiologischen Grundlagen bestehen als
Therapiemöglichkeiten zwei Methoden mit der gleichen Effektivität. Durch die
Plasmapherese werden die neurotoxischen Antikörper, Komplementfaktoren und andere
humorale Mediatoren der Autoimmunereaktion aus dem Serum entfernt. Die intravenöse
Gabe von Immunglobulinen führt zur Neutralisation von Komplement-Bestandteilen, zur
Hemmung der Produktion von Immunglobulinen, zur Fc-Rezeptorblockade und zur
Inhibierung der Produktion von Zytokinen und Aktivierung von Lymphozyten (Kieseier et al.,
2004, Zhang et al., 2013).
1.2 Chronische inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP) und
pathophysiologische Grundlagen
!
CIDP ist eine erworbene Neuropathie, gekennzeichnet durch eine chronische,
monophasische (40%), progrediente (45%) oder schubweise-remittierende (15%),
symmetrische sensomotorische Affektion des PNS mit einer Prävalenz von 2–8/100000
Menschen weltweit. Das Krankheitsbild wird in allen Altersstufen beobachtet, jedoch mehr
zwischen 40-60 Jahren. Männer sind mit 60–70% der Fälle häufiger betroffen als Frauen.
Sie präsentiert sich vor allem mit einer symmetrischen Polyradikuloneuropathie mit
distaler wie proximaler Muskelschwäche, Areflexie und sensiblen Defiziten und einem
variablen Muster bezüglich Ort und Schweregrad der kombinierten sensiblen, motorischen
und autonomen Ausfälle (Yoon et al., 2011).
Pathophysiologisch liegt der CIDP eine autoimmune Reaktion gegen spezifische
Bestandteile der Myelinschicht bzw. gegen das Axon selbst zugrunde. Aktivierte,
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autoreaktive T-Zellen erkennen periphere Nervenautoantigene auf residenten Makrophagen
und überqueren die Blut-Nerven Schranke. Im weiteren kommt es zur lokalen Reaktivierung
und Auslösung einer Immunreaktion im PNS mit weiterer Infiltration von T-Zellen und vor
allem Monozyten und Makrophagen und nachfolgender Demyelinisierung und axonalem
Schaden (Maurer und Gold, 2002). Antikörper gegen sowohl Myelinbestandteile (P2, P0,
PMP22- Peptide) als auch gegen axonale Proteine (z.B. Neurofascin) werden im peripheren
Blut bei ca. 20% der CIDP Patienten nachgewiesen (Kieseier et al., 2004).
Therapeutisch wurde in einer großen retrospektiven Studie ein positiver Effekt nach der
initialen Immuntherapie bei 69 % der Patienten nachgewiesen (64 % nach Kortikosteroiden,
78 % nach hochdosierten intravenösen Immunglobulinen (IVIg) und 56 % nach
Plasmapherese). Am häufigsten erzielt die Therapie eine Symptomstabilisierung ohne
vollständige Remission. Ausreichende evidenzbasierte Daten zur Effektivität einer
Immunsuppression bei CIDP existieren bis heute nicht (Yoon et al., 2011).
1.3 Das Tiermodell der experimentellen autoimmunen Neuritis
!
Die experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut etabliertes Tiermodell,
welches zahlreiche pathophysiologische Mechanismen sowohl des GBS als auch der CIDP
widerspiegelt. Somit eignet sich die EAN hervorragend, um sowohl immunologische
Mechanismen als auch elektrophysiologische und histologische Eigenschaften im PNS zu
untersuchen.
Die EAN kann auf zwei verschiedene Arten ausgelöst werden. Einmal erfolgt die
Auslösung durch aktive, subkutane Immunisierung mit einem peripheren Myelin-Antigen
(wie z.B. dem P2 Protein, gereinigtes PNS-Myelin, rekombinantes humanes P2 Protein oder
P2-Peptid) in einem Adjuvans in suszeptiblen Rattenstämmen wie den Lewis Ratten. Dabei
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kommt es im Anschluss an eine immunologische Induktionsphase (mit Entstehung der
autoimmunen Zellen und Autoantikörpern) zur Effektor-Phase (mit Infiltration der Effektor-
Zellen in das PNS und nachfolgender Demyeliniserung und axonalem Schaden) und zum
Auftreten klinischer Erkrankungszeichen (Lähmungen und Ataxie). Neben dieser sog. aktiv
induzierten EAN kann auch nur die Effektor-Phase der Erkrankung im Modell der sog.
passiven EAN nach Injektion enzephalitogener (z.B. P2 spezifischer) T-Zellen studiert
werden (sog. Passive bzw. adoptive transfer P2-EAN) (Mäurer et al., 2002, Kadbulowski et
al., 1979, Walksmann et al., 1955).
1.4 Laquinimod als immunmodulatorische und neuroprotektive Substanz
!
Laquinimod ist ein oral applizierbarer Immunmodulator, der seit 2007 im Rahmen
randomisierter Phase III Studien bei Patienten mit Multipler Sklerose (MS) geprüft wird. Im
Rahmen der Studien ALLEGRO und BRAVO zeigte sich eine Reduktion der jährlichen
Schubrate um 23% gegenüber der Plazebo-Gruppe und vor allem eine Reduktion der
Krankheitsprogression um 36%, als Zeichen einer möglichen Neuroprotektion, in
Kombination mit einem guten Nutzen-Risiko Profil ohne schwerwiegende Nebenwirkungen
(Comi et al., 2012, Filippi et al., 2013, Haggiag et al ., 2013).
Studien im Tiermodell der MS zeigten für die Substanz (25mg/kg Körpergewicht), dass
sie die Infiltration von Entzündungszellen ins Zentralnervensystem (ZNS), die
Demyelinisierung und die axonale Schädigung reduziert, während es Oligodendrozyten
schützt. Potenzielle Mechanismen sind eine Reduktion der Th-17 Immunantwort und eine
Induktion von B- und T-Zell regulatorischen Immunpopulationen (Wegner et al., 2010,
Aharoni et la., 2012, Jolivel et al., 2013, Toubi et al., 2012, Emerich et al., 2010). Weiterhin
induziert Laquinimod eine Verschiebung des Th1-/Th2-Zytokin-Verhältnisses zugunsten von
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antiinflammatorischen Th2-Zytokinen, also hin zu Interleukin 4 und Interleukin 10 (Jollivel et
al., 2013, Schulze-Tophoff et al., 2012). Die beschriebene Induktion des Brain-derived
neurotrophic factor (BDNF) in ZNS von EAE Mäusen und in Serum von Laquinimodbehandelten
MS-Patienten, könnte die neuroprotektiven Eigenschaften erklären (Thöne et al.,
2012).
1.5 Laquinimod und experimentelle autoimmune Neuritis
!
Die pathophysiologischen Mechanismen autoimmuner Erkrankungen des peripheren und
des zentralen Nervensystems zeigen viele Gemeinsamkeiten. Beide basieren auf der
autoimmunen Wirkung von T-Zellen und Makrophagen und deren Infiltration und
Reaktivierung in PNS und ZNS mit anschließender Demyeliniserung und Neurodegeneration,
in Zusammenhang mit dem Einfluss von regulatorischen Immunpopulationen (regulatorische
T- und B-Zellen und antigenpräsentierende dendritische Zellen).
Hinweise, dass Laquinimod eine immunmodulatorische Wirkung auch in der EAN
entfalten könnte existieren in einem Bericht von Zou et al. Subkutan verabreichtes
Laquinimod in Lewis-Ratten-EAN induzierte eine Besserung der klinischen Zeichen der EAN
durch eine Verschiebung der autoimmunen Antwort hin zur antiinflammatorischen Th2
Richtung (Zou et al., 2002).
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2 Zielsetzung
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Ziel der beschriebenen Experimente war die Wirksamkeit von oralem Laquinimod in
verschiedenen Dosierungen und einen möglichen präventiven Nutzen im Tiermodell der EAN
in Lewis-Ratten zu untersuchen.
Die Effektivität von Laquinimod wurde auf der Basis der
• klinischen Wirksamkeit
• elektrophysiologischen Eigenschaften
• histologischen Veränderungen und
• Analysen der peripheren Immunzellpopulationen
beurteilt.
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3 Material und Methoden
!
3.1 Induktion der experimentellen autoimmunen Neuritis und präventive Laquinimod
Behandlung
!
Am Tag 0 erfolgte die Induktion einer aktiven EAN bei weiblichen Lewis Ratten (6-8
Wochen alt, Charles Rivers Co, Sulzfeld, Deutschland, Gewicht 160-180g). Die Tiere wurden
zunächst mit Inhalation von 1,5-2% Halothan in Sauerstoff in Narkose versetzt. Danach
erfolgt eine einmalige subkutane Immunisierung mit 250!g P2 53-78 Peptid (Charité, Berlin,
Dr. Rudolf Volkmer) in komplettem Freundschen Adjuvans (CFA) mit Mycobacterium
tuberculosis, H37RA (Difco, Detroit, MI, Endkonzentration = 0.5 mg/ml in einem
Gesamtvolumen von 200 !l) an der Schwanzbasis und in die Flanken. Alle Experimente
wurden von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät Bochum genehmigt
(Tierversuchsantrag 84–02.04.2014-A106).
Im Rahmen der Untersuchung der präventiven Effekte von Laquinimod (ABR-215062,
TEVA Pharmaceutical Companies) wurden die Lewis Ratten in vier Gruppen randomisiert.
(n=11/Gruppe) und die Experimente wurden zweimal durchgeführt:
Gruppe 1: Orale Applikation von 300!l Leitungswasser (sham) pro Tag. Initiierung der
Behandlung am Tag der Immunisierung (Tag 0 p.i.) und einmal täglich für 28 Tage insgesamt.
Gruppe 2: Behandlung mit Laquinimod 6,25mg/kg KG (Körpergewicht) pro Tag oral,
verdünnt in 300!l Leitungswasser. Initiierung der Behandlung am Tag der Immunsierung
(Tag 0 p.i.) und einmal täglich für 28 Tage insgesamt (n=5).
Gruppe 3: Behandlung mit Laquinimod 12,5mg/kg KG pro Tag oral, verdünnt in 300!l
Leitungswasser. Initiierung der Behandlung am Tag der Immunisierung (Tag 0 p.i.) und
einmal täglich für 28 Tage insgesamt.
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Gruppe 4: Behandlung mit Laquinimod 25 mg/kg KG pro Tag oral, verdünnt in 300!l
Leitungswasser. Initiierung der Behandlung am Tag der Immuniserung (Tag 0 p.i.) und
einmal täglich für 28 Tage insgesamt.
Der primäre Endpunkt der Untersuchungen war die klinische Beurteilung. Der klinische
Verlauf der EAN wurde täglich über einen Zeitraum von 28 Tagen (Enders et al., 1998) nach
folgendem Score beobachtet: 0. normal, 1. Reduzierter Schwanztonus, hängende
Schwanzspitze 2. Schwanzlähmung, 3. Reflexverlust, 4. Gangataxie, 5. Leichte Paraparese, 6.
mittlere Paraparese, 7. schwere Paraparese oder Paraplegie, 8. Tetraparese, 9. Moribund 10.
Tod.
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen (Nervenleitgeschwindigkeit und F-Wellen) des
N. ischiadicus
!
Die elektrophysiologischen Untersuchungen zur Überprüfung der
Nervenleitgeschwindigkeit wurden vor der Immunisierung (Normal-/Basiswert, Tag -1) und
am Maximum der Erkrankung (Tag 16) durchgeführt. Zur Messung der motorischen
Nervenleitungsgeschwindigkeit wurde der N. ischiadicus distal (Sprunggelenk) und proximal
(Austritt der lumbalen Wurzeln aus Wirbelsäule) mit feinen Nadelelektroden
(Stimulationselektroden) stimuliert, während die Ableitelektroden an der Hinterpfote
eingebracht wurden. Über die Stimulationselektrode erfolgte ein Stromimpuls (Keypoint
Apparatus, Dantec, Skovlunde, Denmark). Aus der Latenz zwischen Stromimpuls und
Muskelerregung nach proximaler und distaler Stimulation sowie aus dem Abstand der
proximalen und distalen Stimulationelektroden wurde die Nervenleitungsgeschwindigkeit
(NLG) berechnet (Taylor et al., 2003). Zusätzlich wurde nach 10-maliger, supramaximaler
distaler Stimulation die F-Wellen-Latenz als Zeichen der proximalen Wurzelbeteiligung bei
Neuritis gemessen. Als F-Wellen Persistenz (Zeichen der proximalen Myelin Schädigung)
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wurde der Anzahl der F-Wellen nach 10maliger distaler Stimulation definiert. Als
Leitungsblock (Zeichen der Myelin Schädigung) wurde eine >50% Reduktion der Amplitude
des motorischen Potenziales nach proximaler Stimulation im Vergleich zur distalen
Stimulation definiert. Für die gesamte Messung inklusive Platzierung der Nadelelektroden
wurden die Versuchstiere mit einer i.p. Injektion von Ketamin/Xylazin (Ketamin: 50 mg/kg
Körpergewicht; Xylazin 10 mg/kg Körpergewicht; Injektionsvolumen
300 !l) betäubt.
Mittels Wärmelampe wurde ein Auskühlen der Tiere verhindert.
3.3 Histologische Untersuchungen des N. ischiadicus
!
Zur Gewebegewinnung für histologische Analysen wurden die Tiere am Tag 16 p.i.
(maximaler Score) und am Tag 28 p.i. (Versuchsende) (n=8) in tiefer Ketamin/Xylazin
Narkose (Ketamin: 50 mg/kg Körpergewicht; Xylazin 10 mg/kg Körpergewicht;
Injektionsvolumen 300 !l)
mit PBS (Phosphate Buffered Saline, Gibco) transcardial
perfundiert und dadurch gleichzeitig getötet. Der N. ischiadicus wurde entnommen und dann
mit Tissue Tek O.C.T (Vogel) eingebettet und am Cryocut 3000 (Leica) bei -23°C 10 µm dick
geschnitten und auf APES-beschichtete Objektträger übertragen. Nach Fixierung der Gewebe
in Aceton für 10 min in 20°C erfolgte die Färbung mit monoklonalen Antikörpern gegen T-
Zellen (anti-CD3, Hycultec, 1:100) und Makrophagen (anti-CD68, Hycultec, ED61, 1:100)
mittels Streptavidin-Biotin Technique (Dako ARK Kit). Zusätzlich wurde mittels
FluoroMyelin TM
Färbung die Demyelinisierung und mittels DAPI (4",6-Diamidin-2-
phenylindol) DNA in Zellkernen durch Fluoresenzmikroskopie (BX51; Olympus, Tokyo,
Japan) visualisiert.
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3.4 Analysen der Immunzellpopulationen
!
Für die immunologischen Untersuchungen mittels Durchflusszytometrie (FACS,
Fluorescence Activated Cell Sorting) und Analyse der peripheren Immunpopulationen in den
inguinalen Lymphknoten und Milz wurden die Tiere am Tag der Erkrankung mit dem
maximalen Score (Tag 16) mit CO 2 Narkose getötet. Folgende Populationen wurden mittels
FACS Canto II (BD Pharmingen, Heidelberg) Gerät und FlowJo Software (Tree Star)
analysiert: CD4 + T Zellen, CD11b + Zellen, CD4 + CD11b + dendritische Zellen (DCs), CD4 +
CD25 + FoxP3 + regulatorische T-Zellen (Tregs), NKRP1A + , CD27 + , CD11b +
(Subpopulationen von NK Zellen) und CD4 + CD11b - MHCII +
plasmatozytoide DCs
(Antikörper von BD Pharmingen oder eBioscience).
3.5 Statistische Auswertung
!
Die statistische Datenanalyse und die graphische Darstellung erfolgte mit der
einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Softwarepaket Prism (GraphPad, San
Diego, CA). Ein P-Wert von < 0.05 wurde als statisch signifikant definiert und ein P-Wert <
0.0001 als statistisch hochsignifikant.
!
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4 Ergebnisse
!
4.1 Klinische Effekte von Laquinimod
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Die klinische Symptomatik der EAN begann 11 Tage nach der Immunisierung und
folgende EAN-Inzidenzen wurden beobachtet: Kontrollgruppe, 6,25mg/kg und 25mg/kg
Laquinimod-behandelte Gruppen 100 %, die 12,5mg/kg Laquinimod-behandelte Gruppe
zeigte eine Inzidenz von 45,5 %.
Die Dosierung von 12.5mg/kg KG reduzierte am effektivsten die Schwere der
Krankheit mit einem maximalen Durchschnittscore von 1 (Kontrollgruppe, maximaler
Durchnittscore von 6, 12,5 mg/kg vs. Kontrollgruppe, p

Abbildung 1: Klinischer EAN Verlauf vom Kontrollgruppe (Leitungswasser) und von oralen
Laquinimod-behandelten Gruppen: 6,25mg/kg (n=5), 12,5mg/kg (n=11) und 25mg/kg (n=11)
täglich an den Tagen 0-27 nach Immunisierung. In der Darstellung sind Mittelwerte und
Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben.
4.2 Elektrophysiologische Effekte von Laquinimod
Elektrophysiologisch, wurden die Art (axonaler Schaden, Demyelinisierung, proximale
Wurzelbeteiligung) und die Schwere der Schädigung untersucht.
- Axonaler Schaden: Am Maximum der Krankheitssymptomatik (Tag 16) konnten keine
manifesten axonalen Schaden im Sinne von distaler und proximaler Amplitudenreduktion der
Potenzialen nachgewiesen werden, was zu dem Model einer akuten demyelinisierenden
Erkrankung gehört.!
- Myelinschädigung (Leitungsblöcke, Nervenleitgeschwindigkeiten und F-Wellen):
1. Die Kontrollgruppe zeigte am Tag 16 p.i. sog. Leitungsblöcke mit einer Inzidenz
von 37,5% jedoch Laquinimod behandelte Tieren zeigten keine Leitungsblöcke.
2. Die motorische Nervenleitgeschwindigkeiten (mNLG) zeigten sich bei der
Kontrollgruppe und der 6,25mg/kg Laquinimod-behandelten Gruppe verlangsamt am Tag 16
p.i. versus Tag -1 (Kontrollgruppe (n=11): Durchschnitt-mNLG 36,1 m/s versus 30,1 m/s, p <
0,001, Laquinimod 6.25mg/kg (n=5): Durchschnitt-mNLG 39,6 m/s versus 32,9 m/s).
Laquinimod 12,5mg/kg und 25m/kg hat eine Reduktion der mNLG am Tag 16 p.i. im
Vergleich zum Tag -1 verhindert (Abbildung 2).
3. Die F-Wellen Persistenz am Tag 16 p.i. war: Kontrollgruppe 40%, Laquinimod
6,25mg/kg-Gruppe 36%, Laquinimod 25mg/kg-Gruppe 46% Laquinimod 12.5mg/kg-Gruppe
81% (p < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe).
Eine elektroneurographische Kontrolle am Tag 27 p.i. zeigte eine Normalisierung der
!
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mNLG und der F-Wellen bei der Kontrollgruppe und 6,25mg/kg Laquinimod-behandelten
Tieren.
45
**
mNLG m/sec
40
35
30
25
20
-1
-1
16
-1
-1
16
16
16
Kontrollgruppe laq 6,25mg/kg laq 12,5mg/kg laq 25mg/kg
!
!
Abbildung 2: Motorische Nervenleitgeschwindingkeiten (mNLG), berechnet nach proximaler
und distaler Stimulation des N. ischiadicus am Tag -1 und 16 p.i.: Eine signifikante
Verlangsamung der NLG für die Kontrollgruppe (n=11) und 6,25mg/kg Laquinimodbehandelte
Tieren (n=5), aber nicht für 12,5mg/kg (n=11) und 25mg/kg (n=11) Laquinimodbehandelte
Gruppen wurde gezeigt. Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM)
angegeben, p-Wert **p

Laquinimod (p

Anzahl von Pan-T Zellen pro mm 2
Querschnitt des N. ischiadicus
800 ***
600
400
200
0
***
Kontrollgruppe
Laquinimod 12.5mg/kg
Laquinimod 25mg/kg
Pan-T Zellen
!
Abbildung 4: Graphische Darstellung von T-Zellen (CD3 + ) Infiltraten im N. ischiadicus am
Tag 16 p.i. Durchschnittswerte der Zellen pro mm 2 Querschnitt des N. ischiadicus
(n=8/Gruppe) für Kontrollgruppe und Laquinimod-behandelte Tieren. In der Darstellung sind
Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben, p-Wert ***p< 0,0001.
!
!
!
!
Anzahl von CD68 + Zellen pro mm 2
Querschnitt des N. ischiadicus
1000
800
600
400
200
0
***
***
Kontrollgruppe
Laquinimod 12,5mg/kg
Laquinimod 25mg/kg
!
!
Abbildung 5: Graphische Darstellung von Makrophagen (CD68 + ) Infiltraten im N.
ischiadicus am Tag 16 p.i. Durchschnittswerte der Zellen pro mm 2 Querschnitt des N.
ischiadicus (n=8/Gruppe) für Kontrollgruppe und Laquinimod-behandelte Tiere. In der
Darstellung sind Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben, p-Wert
***p< 0,0001.
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Abbildung 6: Laquinimod reduzierte die Demyelinisierung (dargestellt durch Fluoromyelin
Färbung) im N. ischiadicus am Tag 16 p.i. bei 12,5mg/kg (d, e, f) und 25mg/kg (g, h, i)
Laquinimod-behandelte Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe (a, b, c). (Querschnitte des
N. ischadicus, Scale bar 50!m).
!
!
! #+!

% Demyelinisierung
40
30
20
10
**
*
Kontrollgruppe
12.5 mg/kg Laquinimod
25 mg/kg Laquinimod
0
!
!
Abbildung 7: Graphische Darstellung der Demyelinisierung (% pro Querschnitt des N.
ischiadicus) nach Fluoromyelin Färbung am Tag 16 p.i. (n=8/Gruppe) von Laquinimod-
behandelten Tieren (12,5mg/kg, 25mg/kg/Tag) und Kontrollgruppe. In Darstellung sind
Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben, *p

% CD4 + Zellen
2.0
1.5
1.0
0.5
Kontrollgruppe
12,5mg/kg Laquinimod
25mg/kg Laquinimod
0.0
CD11b - MHCII +
!
!
Abbildung 8: Durchflusszytometrische Analyse der plasmazytoiden dendritischen Zellen
(CD4 + , CD11b - , MHCII + , % von CD4 + Zellen) in peripheren Lymphknoten von Laquinimodbehandelten
Tieren zeigen eine Tendenz der Zunahme im Vergleich zur Kontrollgruppe. In
der Darstellung sind Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben
(n=6).
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5 Diskussion
!
In der vorliegenden tierexperimentellen Studie konnte eine statistisch signifikante
Besserung des klinischen Verlaufs, der elektrophysiologischen und histologischen Parameter
bei P2-induzierter EAN nach täglicher oraler, präventiver Laquinimod Behandlung
nachgewiesen werden.
Um die wirksamste Dosierung von Laquinimod und in Folge den relevanten
Wirkmechanismus zu verstehen, wurden Dosis-Titration Experimente durchgeführt. Folgende
Ergebnisse sind hier hervorzuheben:
- Die optimalste Dosierung von Laquinimod betrug 12,5mg/kg Körpergewicht. Diese Dosis
unterdrückte fast komplett die klinischen Symptome und elektrophysiologischen Zeichen der
Demyelinisierung (Leitungsblock, NLG Verzögerung und F-Wellen-Latenzen Verzögerung
bzw -Verlust). Diese Daten korrelieren histopathologisch mit einer massiven Reduktion der
T-Zellen und Makrophagen-Infiltrate und entsprechend auch der Demyelinisierung im PNS.
Diese könnte auf einer Reduktion der Infiltration der Immunzellpopulationen in PNS oder
einer peripheren Immunmodulation als potenziellen Wirkmechanismus basieren.
Die Immunzellen-Migration über die Blut-Nerv-Schranke, ist von chemotaktischen
Signalen, die die Bindung und Interaktion der Immunzellen mit Rezeptoren der
Endothelzellen induzieren, abhängig. Tatsächlich zeigten Studien in der EAE, dass
Laquinimod die Leukozyten-Migration im ZNS durch Suppression des Adhäsionmoleküls
VLA-4 hemmen kann (Wegner et al., 2010). Ähnliche Interaktionen zwischen VLA-
4/VCAM-1 (very late antigen-4/vascular cell adhesion molecule-1) und ICAM-1/LFA-1
(intercellular adhesion molecule-1/leucocyte function associated antigen-1) sollen eine
wichtige Rolle für die Leukozyten Migration im PNS spielen (Mäurer et al., 2002). Die
Abklärung solcher Mechanismen ist Gegenstand zukünftiger EAN Experimente mit
Laquinimod.
!
! #$!

Bezüglich peripherer Immunmodulation, wurden durch durchflusszytometrische
Analysen der peripheren Lymphknoten und Milz keine relevanten Unterschiede für
Effektorzellen (CD4 + T Zellen, CD11b + DCs, NKRP1A + +/- CD27, +/- CD11b NK Zellen)
und regulatorische (CD4 + CD25 + FoxP3 +
regulatorische T Zellen, CD11b + CD4 + +/-MHCII
DCs) Immunzellen am Tag 16 p.i. zwischen Kontrollgruppe und Laquinimod-behandelten
Tieren nachgewiesen. EAE Experimente zeigten ähnliche Ergebnisse (Thöne et al., 2012).
Die Population der plasmazytoiden dendritischen Zellen ist eine regulatorische
Population, was in den Ratten von Hubert et al. durchflusszytometrisch definiert wurde
(Hubert et al., 2004). Die aktuelle Studie zusammen mit einer Untersuchung von Jollivel et al.
bei der EAE (Jollivel et a., 2013) zeigte mögliche Effekte von Laquinimod auf pDCs. Jollivel
et al berichteten von einer Zunahme des pDCs Anteils im peripheren Blut in EAE Mäusen
nach Laquinimod Behandlung, sodass eine immunmodulatorische Rolle von pDCs in EAN
sicher möglich wäre.
Eine Einschränkung der durchgeführten durchflusszytometrischen Untersuchungen ist
die isolierte quantitative, jedoch nicht qualitative Beurteilung der Immunzellpopulation
mittels ggf. Zytokinen-Analysen. Eine Induktion der antiinflammatorischen Th2 Zytokine
wurde von Zou et al. für subkutan appliziertes Laquinimod bei der Ratten-EAN nach
Immunisierung mit P0(180-199) berichtet (Zou et al., 2002). Weitere Studien sind nötig um
die funktionelle Veränderung der verschiedenen Immunzellpopulationen in EAN nach
Laquinimod Behandlung zu untersuchen.
Die niedrigste Dosierung (6,25mg/kg) erbrachte keine klinische oder
elektrophysiologische Besserung. Dies steht im Gegensatz zu den Experimenten bei der
Maus-EAE, weil diese Dosierung bei EAE gute Effekte zeigte (Schulze-Topohoff et al.,
2012).
Die Behandlung mit 25mg/kg Laquinimod, wiederum im Gegensatz zu beschriebenen
EAE Experimenten, induzierte keine signifikante Besserung, sondern verzögert nur den
! #%!
!

Beginn der klinischen Symptomatik. Gleichzeitig, konnte jedoch eine Besserung der
elektrophysiologisch nachgewiesenen Demyelinisierung am Tag 16 p.i., eine Reduktion der
T-Zellen- und Makrophagen-Infiltraten und eine nicht so ausgeprägte Reduktion (im
Vergleich zu 12,5mg/kg Laquinimod) der histologisch nachgewiesenen Demyelinisierung
gezeigt werden.
Zusammenfassend, zeigte die 12,5mg/kg Dosierung zusätzliche Effekte die ggf. mehr
gegen Demylinisierung schützen als 25mg/kg Laquinimod. Ein Effekt von Laquinimod auf
myelinbildende Schwann-Zellen könnte diese Beobachtungen erklären. In ZNS könnte von
Brück et al. ein indirekter Effekt von Laquinimod auf astrozytische Zellen in ZNS durch NFkB
Modulation gezeigt werden (Brück et al., 2012).
Alternativ, können die beschriebenen Unterschiede zwischen verschiedenen
Konzentrationen von Laquinimod durch komplexe Rezeptor-Mechanismen verursacht
werden. In Frage kämen zum Beispiel CB1 (Cannabinoid) Rezeptoren, die laut Ruffini et al
in ZNS von Laquinimod moduliert werden können. Im PNS spielen die CB1 Rezeptoren auch
eine immunmodulatorische Wirkung (Ruffini et al., 2012, Romero et al., 2013). Um die
weiteren Wirkmechanismen von Laquinimod in PNS zu klären, wie z.B. NF-kB oder CB1
Effekte, werden weitere experimentelle Ansätze benötigt, die neue therapeutische
Zielmoleküle und Signalwege der Inflammation im PNS besser verstehen lassen.
!
! #&!

Zusammenfassung
Die oben genannten Experimente sprechen für eine starke Wirkung der oralen
immunmodulatorischen Substanz, Laquinimod, bei der Behandlung der experimentellen
autoimmunen Neuritis. Diese Beobachtung, in Kombination mit dem guten Nutzen-Risiko
Profil von Laquinimod, was durch zwei große Phase III Studien bei Patienten mit Multipler
Sklerose bewiesen wurde, zeigen in Richtung der Entwicklung neuer risikoarmer Therapien
für Patienten mit autoimmunen Krankheiten des PNS. Weitere tierexperimentelle Studien sind
erforderlich um den zugrundeliegenden Wirkmechanismus von Laquinimod aufzuzeigen.
!
! #'!

Literaturverzeichnis
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!
! $"!

Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. R. Gold, Direktor der Klinik für Neurologie des St. Josef Hospitals
Bochum, Universitätsklinikum der Ruhr-Universität, danke ich für die Überlassung des
Themas und seine immer hilfreiche Führung und wissenschaftliche Betreuung während der
Durchführung der Experimente.
Lisa Schrewe und Björn Ambrosius und alle Kollegen im neuroimmunologischen Labor in
der Ruhr Universität Bochum, danke ich für die ständige Unterstützung an allen Phasen dieser
wissenschaftlichen Arbeit.
!
!

Kalliopi Pitarokoili MD, MSc
Heckertstrasse 42! Bochum, Nordhein-Westfalen 44807
Telefon: 004917672164523! Fax: 0234-5093024 ! E-Mail: kalliapit@yahoo.gr, Kalliopi.Pitarokoili@ruhr-uni-bochum.de
Persönliche Daten
Geburtsdatum: 25.02.1983
Nationalität:
Familienstand:
Griechin
Ledig
Qualifikationen
4. August 2006 Diplom der medizinischen Fakultät der
Universität Kreta, Griechenland
Gesamtnote : 8,17 ´sehr gut´
30. Juli 2008 Master Diplom
“Medizinische Neurowissenschaften” der
Universität Kreta , Griechenland
Gesamtnote : 9,4 ´ausgezeichnet´
Master Thesis in Cecilie-Vogt Klinik für
Neurologie, Charité Mitte, Berlin, Deutschland
09.2008 - 06.2009 Assistenzärztin, Innere Medizin
Ierapetra, Kreta, Griechenland (9 Monate)
09.2009 – 02.2010 Assistenzärztin, Psychiatrie, Psychiatrisches
Krankenhaus Leros, Dodekanese, Griechenland
(6 Monate)
04.2010 – 04.2015 Assistenzärztin Neurologie, St. Josefs
Krankenhaus, Bochum, Deutschland
Prof. Dr. med. Ralf Gold
05.2015 - aktuell Fuktionsoberärztin Neurologie, St. Josefs
Krankenhaus, Bochum, Deutschland
Prof. Dr. med. Ralf Gold
Studium
Medizinische Fakultät der Universität Kreta
August 2005
Austauschprogramm der ´International
Federation of Medical Student’s Association´
(IFMSA)
Famulatur in Neurochirurgie am Krankenhaus
Arnau de Vilanova Lleyda, Spanien
10.2005 - 02. 2006 Austauschstudentin im Rahmen des Erasmus
Sokrates Programms der Europäischen Union,
Freie Universität, Berlin, Charité in:
Gynäkologie (6 Wochen), Pädiatrie (10
Wochen)
Campus Benjamin-Franklin (PJ-Studentin)

Kalliopi Pitarokoili MD, MSc
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Februar 2006
Famulatur am Zentrum für Neurologie,
Psychiatrie und Psychotherapie St. Joseph-
Krankenhaus Berlin- Weissensee
Wissenschaftliche Weiterbildung
11. 2006 - 07. 2008 Im Rahmen des Masterstudiums „Medizinische
Neurowissenschaften“ der medizinischen
Fakultät der Universität Kreta
Laborpraktika - Master Thesis
1) Pharmakologie (3 Monate)
Methoden: stereotaktische Chirurgie (Sprague
Dawley Ratten),Verhaltensstudien, Western
Blotting
2) Klinische Neurologie Labor (3 Monate)
Methoden: RNA Extraktion aus Zellkulturen,
RT-PCR, PCR, DNA-Sequenzierung, Western
Blotting
3) Cecilie Vogt Klinik für Neurologie,
Neurowissenschaftliches Forschungszentrum
(NWFZ) Institut für Neuroimmunologie
Charité Universitätsmedizin, Berlin,
Deutschland
Dr. rer. nat. Carmen Infante-Duarte
Prof. Dr. med. Frauke Zipp
Master Thesis: TNF-Related Apoptosis Inducing
Ligand (TRAIL) Expression in Natural Killer
(NK) cells and their role in Experimental
Autoimmune Encephalomyelitis (EAE)
09.2008 - 06.2009 Forschungsprogramm der neurologischen
Klinik der Universität Kreta, Heraklion
Thema: Benigne Multiple Sklerose
Leiter: Prof. Dr. med. A. Plaitakis
04.2010 - aktuell - Neuroimmunologisches Labor der Ruhr-
Universität Bochum
Thema: Experimentelle Autoimmune Neuritis
Leiter: Prof. Dr. R. Gold
- Nervensonographie bei Immunneuropathien
Leiter: PD Dr. M.-S. Yoon
Preise und Stipendien
• Staatliche Organisation für Stipendien: Preis für die beste
akademische Leistung in der Medizinischer Fakultät der
2001

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Universität Kreta
• Staatliche Organisation für Stipendien: Preis für die beste
akademische Leistung in der Medizinischer Fakultät der
Universität Kreta
• Stipendium ´Christina Spyraki´ der Universität Kreta für die beste
akademische Leistung in dem ersten Jahr des Masterstudiums für
medizinische Neurowissenschaften
• International Federation of Clinical Electrophysiology ´Young
Investigators Award´
2002
2006-2007
2014
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Electrophysiological and Clinical Findings in Chronic Inflammatory Demyelinating
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Kalliopi Pitarokoili MD, MSc
Heckertstrasse 42! Bochum, Nordhein-Westfalen 44807
Telefon: 004917672164523! Fax: 0234-5093024 ! E-Mail: kalliapit@yahoo.gr, Kalliopi.Pitarokoili@ruhr-uni-bochum.de Seite 4
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increases rat locomotor activity by activating sst(2) and sst (4) receptors in the striatum and via
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Lehrerfahrung
Tätig als Dozentin in der Physiotherapie Schule in
Bochum (Neuroanatomie) (09.2012-aktuell).
09.2012-aktuell

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Sprachen
• Griechisch: Muttersprache
• Spanisch: Grundkenntnisse schriftlich und mündlich
• Englisch: sehr gut schriftlich und mündlich, Certificate of Proficiency, University of Cambridge
• Deutsch: sehr gut schriftlich und mündlich, Deutsches Sprachdiplom

Publikation:
Pitarokoili K, Ambrosius B, Schrewe L, Hayardeny L, Hayden M, Gold R.
Laquinimod exerts strong clinical and immunomodulatory effects in Lewis rat
experimental autoimmune neuritis. J Neuroimmunol. 2014 Sep 15;274(1-2):38-45.
doi: 10.1016/j.jneuroim.2014.06.012. Epub 2014 Jun 24. PubMed PMID: 25005118.
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