Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3. Ergebnisse
Kontrollzellen. Ebenso konnte kein relevanter Längenunterschied zwischen schwach, stark und sehr
stark transfizierten PtK2-Zellen beobachtet werden (nicht gezeigt).
3.11 Inhibierung der ERM-Proteine durch RNA-Interferenz (RNAi) und Auswirkungen auf
die Protrusion-Ausbildung
Im vorherigen Experiment (3.10) konnte durch die Selektion von sehr stark CD44tail-exprimierenden
PtK2-Zellen die Protrusionzahl auf ca. 17% gegenüber der Anzahl in den nicht-transfizierten
Kontrollzellen reduziert werden. Eine vollständige Inhibierung der Protrusion-Ausbildung war mit
diesem System nicht erreichbar. Zur vollständigen Inhibierung der ERM-Proteine musste ein anderes
System verwendet werden. Hierfür wurde ein neues Verfahren angewandt, bei dem durch die
Transfektion von kurzen, doppelsträngigen RNA-Fragmenten eine Degradation der Sequenzhomologen
mRNA erfolgt und damit die Expression des entsprechenden Gens reduziert bzw.
inhibiert wird (Elbashir 2001a).
Zum ersten Mal konnte für den Nematoden Caenorhabditis elegans beschrieben werden, dass durch
die Injektion von ds-RNA Genfunktionen beeinträchtigt werden können (Fire et al.1998). Mittlerweile
konnte diese Methode auch für andere Organismen etabliert werden. So sind Effekte, die auf RNAi
zurückzuführen sind, in der Taufliege Drosophila melanogaster (Kennerdell and Carthew 1998), dem
Mehlkäfer Tribolium castaneum (Brown et al. 1999), dem Zebrafisch (Wargelius et al. 1999) und der
Maus (Wianny et al. 2000) beschrieben worden. Auch in Trypanosoma brucei (Ngo et al. 1998) und in
Hydra (Lohmann et al. 1999) konnte durch RNAi die Expression von einigen Genen inhbiert werden.
Mittlerweile konnten auch in Zellen höherer Säugetiere (z.B. Maus), die Expression zahlreicher Gene
durch diese Methode reduziert bzw. inhibiert werden (Harborth et al. 2001, Paddison et al. 2002).
Der für das „gene silencing“ verantwortliche RNAi-Mechanismus wurde lange Zeit nicht verstanden,
und auch heute ist das Phänomen noch nicht vollständig geklärt. Erste Hinweise, dass RNAi über
einen post-transkriptionellen Mechanismus zu wirken scheint, erbrachten Untersuchungen von Fire et
al. (1999). Die dort durchgeführten Experimente zeigten, dass die Injektionen von ds-RNA, die
korrespondierend zu Introns oder regulatorischen Sequenzen waren, zu keinem RNAi Phenotyp
führten. Daraus wurde geschlossen, dass nur ds-RNA, welche kodierenden- und somit Exon-
Sequenzen entspricht, Gen-Interferenz hervorruft. Die RNAi-Phänotypen scheinen aus der
Eliminierung der endogenen mRNA zu resultieren (Fire et al. 1998). Es wird vermutet, dass die
eingeschleuste ds-RNA in einem weiteren Schritt amplifiziert wird, da in der Regel bereits geringe
Mengen an ds-RNA genügen, um einen RNAi-Phänotyp zu verursachen (Fire et al. 1998, Kennerdell
and Carthew 1998). Hinweise auf einen möglichen Amplifikationsschritt ergaben sich aus der Arbeit
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