Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3. Ergebnisse
PtK2+CD44tail-Zellen verringerte sich die Anzahl der ausgebildeten Protrusions um 50,62% (3,97
+/-2,25) gegenüber den nicht-transfizierten Kontrollzellen (8,04 +/-1,71). Die Anzahl der Protrusions
in den PtK2+CD44tail mut-Zellen (7,99 +/-1,56) entsprach den Kontrollzellen. Dieses Ergebnis lässt
darüber hinaus die Vermutung zu, dass die spezifische Interaktion zwischen ERM-Proteinen und dem
CD44-Rezeptor einen entscheidenden Einfluss auf die Ausbildung der Listerien-induzierten
Protrusions haben könnte.
Wie auch für die RT4-Zelllinien bereits beschrieben, wurde nach der Transfektion der PtK2-Zellen
die Länge der Listerien-induzierten Protrusions ermittelt. Der Vergleich zwischen den
untransfizierten Kontrollzellen und den transfizierten PtK2-Zellen erbrachte keine signifikanten
Unterschiede (siehe auch 3.2).
3.10 Analyse von GFP-CD44/CD44mut-transfizierten und FACS-sortierten PtK2-Zellen
Die bis dahin durchgeführten Experimente deuteten stark auf eine Beteiligung der ERM-Proteine bei
der Ausbildung der Listerien-induzierten Protrusions hin. Die Blockierung der ERM-Proteinfunktion
führte zu einer signifikanten Verringerung in der Anzahl der ausgebildeten Protrusions. Speziell von
der ERM-CD44-Interaktion wurde angenommen, dass sie eine signifikante Rolle bei diesem Prozess
spielt. Somit sollte die Quantität der Inhibierung dieser Interaktion im direkten Zusammenhang mit
der Anzahl der ausgebildeten Protrusions stehen. Dementsprechend sollte die Protrusionzahl umso
geringer sein, desto stärker bzw. effizienter die Blockierung der ERM-CD44-Assoziation wäre. Somit
stellte sich die Frage, inwieweit eine maximale CD44tail Expression die Protrusionanzahl reduzieren
würde. Darüber hinaus war zu beantworten, ob durch eine sehr starke Inhibierung der ERM-Proteine
bzw. der Interaktion zum CD44-Rezeptor die Protrusion-Ausbildung gänzlich inhibiert werden
könnte. In den unter 3.9 beschriebenen Versuchen wurden alle positiv-exprimierenden Zellen
unabhängig der Expressionsstärke ausgewertet. Zur Überprüfung der oben postulierten Korrelation
war es jedoch nötig, Zellpopulationen zu vergleichen, die unterschiedlich starke Expressionslevel
aufwiesen. Um verschieden stark exprimierende Zellpopulationen einfach selektieren zu können,
wurden die PtK2-Zellen mit den GFP-markierten CD44tail transfiziert. Damit war es möglich, die
direkte Expression des CD44tail und damit gleichzeitig die ERM-Inhibierung bzw. die Blockierung
der ERM/CD44-Bindung durch die Intensität der GFP-Fluoreszenz quantifizieren zu können.
Durch die Verwendung eines FACS-Sorters war es möglich, die transfizierten Zellen an Hand ihrer
Expressionsstärken in definierte Populationen aufzuteilen. So sollten drei unterschiedlich stark
CD44tail-exprimierende Populationen selektiert und miteinander verglichen werden. Die Parameter
wurden so definiert, dass das FACS-Gerät die Zellen in schwach („low“), mittel bis stark („high“)
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