Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3. Ergebnisse
ermöglichten es, gezielt die ERM-Proteine bzw. die ERM-CD44-Interaktion zu inhibieren. Darüber
hinaus war es möglich, die Fusionsproteine in beliebigen Zelllinien zu exprimieren und die positiv
transfizierten Zellen sehr einfach zu selektieren und somit zu analysieren.
Um mit dem GFP-Vektor kompatible Restriktionsschnittstellen 5’ bzw. 3’ an die zu klonierenden
Gene hinzuzufügen, wurden die zur Verfügung gestellten cDNAs mit den in Tabelle 8 dargestellten
Oligonukleotiden amplifiziert und anschließend zur Sequenzierung in den pCR2.1-TOPO Vektor
kloniert.
CD44tail vorwärts CTAGTGGAAGCTTCGATGCGGCCATGAGTC
CD44tail rückwärts CCAAAATAATGGGGTACCTGGTACACCCC
CD44tail mut vorwärts GGTTCCGCGAAGCTTCATGAGTCGAGC
CD44tail mut rückwärts CCAAAATAATGGGGTACCTGGTACACCCC
Tab. 8: Verwendete Oligonukleotide für die Klonierung der GFP-Fusionsproteine
Hervorgehoben sind die jeweiligen Restriktionsschnittstellen HindIII (AAGCTT) und KpnI
(GGTACC).
Die Gene wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und KpnI aus dem pCR2.1-TOPO Vektor
geschnitten und in dieselben Restriktionsschnittstellen der liniearisierten GFP-Vektoren pEGFP-C2
und pEGFP-N1 ligiert. Die vier daraus entstandenen Fusionsproteine sind mit den
Aminosäuresequenzen der entsprechenden Linker zwischen GFP und CD44tail bzw. CD44tail mut in
der Abb. 20 schematisch dargestellt. Das GFP besteht aus insgesamt 239 Aminosäuren. Die
verwendeten CD44-Domänen bestehen aus den 72 carboxyterminalen Aminosäuren 290-362 des
wtCD44.
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