Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3. Ergebnisse
Neben der Merlin induzierbaren Zelllinie (RT4-D6P2T+Merlin; Klon 54) standen drei weitere RT4-
D6P2T-Zelllinien zur Verfügung. Als Kontrolle wurden RT4-D6P2T-Zellen verwendet, die mit einem
leeren GST-Vektor transfiziert worden waren (RT4-D6P2T+GST). Des weiteren wurden Zellen
verwendet, die die zytoplasmatische Domäne des humanen CD44 (AS 290-362 des wtCD44)
exprimierten (RT4-D6P2T+CD44tail). Dieser zytoplasmatische Teil des CD44 enthält die sog. ERM-
Bindungsdomäne. Durch die Überexpression des zytoplasmatischen CD44tails sollten die im
Zytoplasma vorliegenden, aktivierten ERM-Moleküle sequestriert und funktionell inhibiert werden.
Als Negativ-Kontrolle dienten RT4-D6P2T-Zellen, die eine mutierte, intrazelluläre CD44-Domäne
exprimieren (RT4-D6P2T+CD44tail mut). Die Substitution der AS Arg293 und Arg294 sowie der AS
Lys298, Lys299 und Lys300 innerhalb der ERM-Bindungsdomäne (s. Tab. 7) führt zu einem Defekt
in der Ezrin- und Merlin-Bindung (Legg und Isacke 1998).
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CD44tail 293-RRCGQKKK-300
CD44tail mut 293-AACGQAAA-300
Tab. 7: Amimnosäuresequenz der ERM-Bindungsdomäne im CD44tail und
CD44tail mut
Auch in diesen Zelllinien wurde die Lokalisation des Ezrin nach der Infektion mit Listeria
monocytogenes fluoreszenzmikroskopisch untersucht (Abb. 13). Es zeigten sich keine Veränderungen
der Ezrin-Lokalisation zwischen den GST-Vektor exprimierenden Zellen und den untransfizierten
Kontrollzellen (Abb. 13A/B). Das Ezrin lag konzentriert in den „microextensions“ und in den
Listerien-induzierten Protrusions vor. Eine identische Verteilung des Ezrin konnte in den infizierten
RT4-D6P2T+CD44tail mut-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 13E/F). Demgegenüber war jedoch in
RT4-D6P2T+CD44tail-Zellen keine Lokalisation des Ezrins in den ausgebildeten Protrusions (Abb.
13C/D) nachzuweisen. Wie bei den RT4-D6P2T+Merlin-Zellen wurde auch in diesen Zellen durch die
Expression des GST oder der CD44-Konstrukte die Zellmorphologie nicht beeinträchtigt (nicht
gezeigt).