Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
3.3 Lokalisation von Merlin <strong>und</strong> Ezrin in RT4-D6P2T-<strong>Zell</strong>en<br />
3. Ergebnisse<br />
Die unter 3.1 dargestellten Versuche zeigten eine deutliche Reduktion <strong>der</strong> <strong>Protrusion</strong>anzahl durch <strong>die</strong><br />
Inhibierung <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong>. Um <strong>die</strong>sen Effekt weiter untersuchen zu können, wurde <strong>die</strong> von<br />
Morrison et al. (2001) etablierte Merlin-induzierbare <strong>Zell</strong>linie RT4-D6P2T verwendet. Das durch<br />
Doxycyclin überexprimierte <strong>und</strong> durch Hyaluronsäure aktivierte Merlin bindet an <strong>die</strong> intrazelluläre<br />
Domäne des <strong>ERM</strong>-Liganden CD44, was zu einer Delokalisation <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> vom CD44-<br />
Rezeptor führt. Im Gegensatz zu dem vorher gewählten System sollte hier durch <strong>die</strong> Delokalisation<br />
<strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong>, <strong>die</strong> funktionellen Eigenschaften <strong>die</strong>ser <strong>Proteine</strong> blockiert werden.<br />
Dieses System wurde in <strong>der</strong> vorliegenden Arbeit verwendet, um eine Bindung <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> mit<br />
einem ihrer Hauptliganden, dem CD44-Rezeptor, zu verhin<strong>der</strong>n <strong>und</strong> somit <strong>die</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong><br />
funktionell zu inhibieren. Da insbeson<strong>der</strong>e <strong>der</strong> <strong>Einfluss</strong> <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> <strong>auf</strong> <strong>die</strong> <strong>Ausbildung</strong> von<br />
Listerien-induzierten <strong>Protrusion</strong>s untersucht werden sollte, musste zuerst überprüft werden, ob das<br />
überexprimierte <strong>und</strong> aktivierte Merlin in den <strong>Protrusion</strong>s lokalisiert <strong>und</strong> gleichzeitig zu einer<br />
Delokalisation <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> aus den <strong>Protrusion</strong>s führt. Um <strong>die</strong>s nachweisen zu können, wurde<br />
<strong>die</strong> mit Listerien infizierte, Merlin-induzierbare <strong>Zell</strong>linie RT4-D6P2T (RT4-D6P2T+Merlin, Klon 54)<br />
<strong>auf</strong> Deckgläschen ausgesät. Durch <strong>die</strong> Zugabe von Doxycyclin <strong>und</strong> Hyaluronsäure wurde <strong>die</strong><br />
Überexpression induziert <strong>und</strong> Merlin aktiviert, was mit einer Dephosphorylierung einhergeht. Nach<br />
<strong>der</strong> Fixierung <strong>der</strong> <strong>Zell</strong>en wurde das Aktinzytoskelett <strong>und</strong> das Merlin bzw. Ezrin durch entsprechende<br />
Antikörper fluoreszenzmarkiert.<br />
In RT4-D6P2T+Merlin-<strong>Zell</strong>en, in denen <strong>die</strong> Überexpression von Merlin induziert <strong>und</strong> das Merlin<br />
nicht aktiviert wurde, zeigte sich eine Lokalisation des Merlins im Zytoplasma, vorwiegend in<br />
kernnahen Regionen. In fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen ließ sich nachweisen, dass das<br />
Merlin nicht an stationäre o<strong>der</strong> motile Listerien rekrutiert wird <strong>und</strong> nicht in den ausgebildeten<br />
<strong>Protrusion</strong>s (s. Abb. 11 A/B) lokalisiert.<br />
Die Zugabe von Hyaluronsäure <strong>und</strong> <strong>die</strong> damit verb<strong>und</strong>ene Aktivierung führte, wie in Abb. 11 C/D<br />
gezeigt ist, zu einer Än<strong>der</strong>ung <strong>der</strong> zellulären Merlin-Lokalisation. Im Vergleich zu phosphoryliertem,<br />
inaktivem Merlin zeigte sich eine gleichmäßige, zytoplasmatische Verteilung des aktivierten Merlins.<br />
Es konnte ebenfalls eine Lokalisation in den Listerien-induzierten <strong>Protrusion</strong>s nachgewiesen werden,<br />
aber auch das aktivierte Merlin lokalisierte nicht an im Zytoplasma vorliegenden stationären o<strong>der</strong><br />
motilen Listerien.<br />
61