Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3.3 Lokalisation von Merlin und Ezrin in RT4-D6P2T-Zellen
3. Ergebnisse
Die unter 3.1 dargestellten Versuche zeigten eine deutliche Reduktion der Protrusionanzahl durch die
Inhibierung der ERM-Proteine. Um diesen Effekt weiter untersuchen zu können, wurde die von
Morrison et al. (2001) etablierte Merlin-induzierbare Zelllinie RT4-D6P2T verwendet. Das durch
Doxycyclin überexprimierte und durch Hyaluronsäure aktivierte Merlin bindet an die intrazelluläre
Domäne des ERM-Liganden CD44, was zu einer Delokalisation der ERM-Proteine vom CD44-
Rezeptor führt. Im Gegensatz zu dem vorher gewählten System sollte hier durch die Delokalisation
der ERM-Proteine, die funktionellen Eigenschaften dieser Proteine blockiert werden.
Dieses System wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um eine Bindung der ERM-Proteine mit
einem ihrer Hauptliganden, dem CD44-Rezeptor, zu verhindern und somit die ERM-Proteine
funktionell zu inhibieren. Da insbesondere der Einfluss der ERM-Proteine auf die Ausbildung von
Listerien-induzierten Protrusions untersucht werden sollte, musste zuerst überprüft werden, ob das
überexprimierte und aktivierte Merlin in den Protrusions lokalisiert und gleichzeitig zu einer
Delokalisation der ERM-Proteine aus den Protrusions führt. Um dies nachweisen zu können, wurde
die mit Listerien infizierte, Merlin-induzierbare Zelllinie RT4-D6P2T (RT4-D6P2T+Merlin, Klon 54)
auf Deckgläschen ausgesät. Durch die Zugabe von Doxycyclin und Hyaluronsäure wurde die
Überexpression induziert und Merlin aktiviert, was mit einer Dephosphorylierung einhergeht. Nach
der Fixierung der Zellen wurde das Aktinzytoskelett und das Merlin bzw. Ezrin durch entsprechende
Antikörper fluoreszenzmarkiert.
In RT4-D6P2T+Merlin-Zellen, in denen die Überexpression von Merlin induziert und das Merlin
nicht aktiviert wurde, zeigte sich eine Lokalisation des Merlins im Zytoplasma, vorwiegend in
kernnahen Regionen. In fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen ließ sich nachweisen, dass das
Merlin nicht an stationäre oder motile Listerien rekrutiert wird und nicht in den ausgebildeten
Protrusions (s. Abb. 11 A/B) lokalisiert.
Die Zugabe von Hyaluronsäure und die damit verbundene Aktivierung führte, wie in Abb. 11 C/D
gezeigt ist, zu einer Änderung der zellulären Merlin-Lokalisation. Im Vergleich zu phosphoryliertem,
inaktivem Merlin zeigte sich eine gleichmäßige, zytoplasmatische Verteilung des aktivierten Merlins.
Es konnte ebenfalls eine Lokalisation in den Listerien-induzierten Protrusions nachgewiesen werden,
aber auch das aktivierte Merlin lokalisierte nicht an im Zytoplasma vorliegenden stationären oder
motilen Listerien.
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