Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3. Ergebnisse
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Bisher war von den ERM-Proteinen bekannt, dass sie an der Grenze zwischen der Zellmembran und
den darrunterliegenden Aktinstrukturen, wie den Mikrovilli, lokalisieren. Somit wird angenommen,
dass die ERM-Proteine u.a. als zelluläre Verbindungsglieder zwischen der Zellmembran und dem
Aktinzytoskelett fungieren (Arpin et al. 1994, Bretscher et al. 1997, Tsukita et al. 1997a). Ebenso ist
bereits nachgewiesen, dass die ERM-Proteine in Listeria-infizierten Zellen ausschließlich in den
ausgebildeten Protrusions lokalisieren, nicht aber an Listerien, die motil oder stationär im Zytoplasma
vorliegen (Sechi et al. 1997). Im Rahmen meiner Diplomarbeit (Pust 1999) wurde die Dynamik von
GFP-markierten ERM-Proteinen am Beispiel von Ezrin und Moesin bei der Ausbildung Listerieninduzierter
Protrusions untersucht. Es zeigte sich, dass die GFP-markierten ERM-Proteine erst bei der
Berührung des Bakteriums mit der Zellmembran und der darauffolgenden Protrusion-Ausbildung
rekrutiert werden und dort vermutlich als Verbindungsglieder zwischen der Protrusion-umhüllenden
Zellmembran und dem Aktinschweif des Bakteriums fungieren. Diese Daten ließen die Vermutung zu,
dass die ERM-Proteine in die Ausbildung der Listerien-induzierten Protrusions involviert sind.
3.1 Transfektion der N- und C-terminalen Domäne des Ezrin in PtK2-Zellen und
Auswirkungen auf die Anzahl der ausgebildeten Protrusions
Die Inhibierung der ERM-Proteine sollte bei einem potentiellen Einfluss dieser Proteinfamilie zu
erheblichen Veränderungen in der Protrusion-Ausbildung führen. Um funktionell mit den ERM-
Proteinen zu interferieren, sollte zunächst die Interaktion mit ihren Bindungspartnern blockiert
werden. Zur Blockierung der ERM-Bindungspartner wurde auf bereits vorliegende GFP-markierte
Ezrin-Konstrukte zurückgegriffen. Die aminoterminale Ezrin-Domäne enthält Bindungsstellen für
zahlreiche Membranproteine bzw. Membran-assoziierte Proteine und der carboxyterminale Teil eine
Bindungsstelle für F-Aktin. Durch die Überexpression der N-terminalen bzw. der C-terminalen
Domäne des Ezrin (N-Ezrin bzw. C-Ezrin) in PtK2-Zellen sollten die Bindungsstellen an den
Membran-Liganden bzw. am Aktinzytoskelett blockiert und so mit den Funktionen der endogenen
ERM-Proteine interferiert werden.
Nach der Transfektion der Zellen mit den GFP-Konstrukten wurden die Zellen mit Listeria
monocytogenes infiziert, fixiert und nach anschließender Antikörpermarkierung am
Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die potentiellen Veränderungen bei der Protrusion-Ausbildung
sollten anhand der relativ leicht messbaren Parameter Protrusionanzahl und Protrusionlänge analysiert
werden. Um zu vermeiden, dass die Protrusionzahl durch eine schwache Infektion limitiert wurde,
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