Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
Für die Aufnahme von Sequenzen müssen zusätzliche Parameter festgelegt werden:
Anzahl der Einzelbilder, Möglichkeit der Kombination von Fluoreszenz- und Phasenkontrast-
Aufnahmen und Zeit zwischen den Einzelbildaufnahmen.
2.14.3 Immunfluoreszenzmikroskopie fixierter Zellen
Die fixierten Präparate (s.2.10.2) werden mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 135TV,
63er bzw. 100er Ölimmersionsobjektiv) mit Standard-Epifluoreszenzfiltern für Rhodamin und
Fluorescein (GFP) betrachtet und ausgewertet.
Die fixierten Proben werden in eine Objektivträger-Halterung am Mikroskop eingespannt,
Einzelbildaufnahmen werden wie unter 2.14.2 beschrieben durchgeführt. Zur Aufnahme von
Fluoreszenz- und Phaenkontrastbildern wird eine gekühlte CCD-Kamera (Princeton Instruments Inc.)
verwendet.
2.14.4 Digitale Bildverarbeitung
Mit Hilfe der Programme IPLab und Photophop 6.0 werden die aufgenommen Einzelbilder und
Langzeitsequenzen nachbearbeitet. Hierbei können Kontrast- und Helligkeitsanpassungen
durchgeführt und die Darstellung der Graustufenwerte innerhalb begrenzter Spektren (Normalisation)
korrigiert werden. Außerdem besteht die Möglichkeit, die Hintergrund-Fluoreszenz aus einer
Aufnahme zu beseitigen oder bei Mehrfach-Markierungen fixierter Zellen mehrere Einzelbilder
übereinander zu legen.
Mit Hilfe der IPLab-Erweiterung MicroTome können Signale, die von außerhalb des
Schärfetiefenbereichs kommen, durch mathematische Berechnungen eliminiert werden, wodurch das
Bild aus dem Schärfetiefenbereichs deutlich hervorgehoben wird. Die Berechnung zur Verringerung
dieses „out-of-focus“-Lichts beruht auf verschiedenen Parametern, die den Aufnahme-Bedingungen
angepaßt werden müssen: Wellenlänge des Lichts, numerische Apertur des verwendeten Objektivs,
Größe der Objektfläche und Brechungsindex des Immersionsöls.
55