Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
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2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
54<br />
Beleuchtung:<br />
Regelung <strong>der</strong> Beleuchtung durch elektrisch aktivierbarer Schnellverschlüsse (UniBlitz Modul D 122<br />
Shutter-Driver, Visitron Systems), Shutter, manuell o<strong>der</strong> Software-unterstützt.<br />
CCD-Kamera-System:<br />
Auf –20°C gekühlte Charged-Coupled-Device-Kamera (TE/CCD-1000 TKB, Princeton Instruments<br />
Inc.) mit elektronisch aktivierter Kontrolleinheit <strong>und</strong> Verschluß.<br />
Focht-Durchflußkammer <strong>und</strong> Objektivheizung:<br />
Zur Beobachtung von lebenden <strong>Zell</strong>en wird eine beheizbare Focht-Durchflußkammer mit<br />
zugehöriger Kontrolleinheit (Focht Live-Cell Chamber System (FCS2), Bioptics) verwendet. Durch<br />
<strong>die</strong> Verwendung einer Objektivheizung (Bioptics) wird <strong>der</strong> Wärmeverlust über <strong>die</strong> Objektive<br />
verhin<strong>der</strong>t.<br />
Aufnahmekontrolle <strong>und</strong> Bildverarbeitung:<br />
Die Aufnahmekontrolle, Kontrolle <strong>der</strong> Schnellverschlüsse, <strong>die</strong> Kamerasteuerung <strong>und</strong><br />
Bildverarbeitung erfolgt mit <strong>der</strong> IPLab Spectrum Scientific Imaging Software an einem Apple<br />
Macintosh 9500/200. Die weitere Bildverarbeitung für <strong>die</strong> Präsentation erfolgt mit Adobe Photoshop<br />
6.0 <strong>und</strong> Adobe Page Maker an einem Apple Macintosh G4.<br />
2.14.2 Fluoreszenzmikroskopie leben<strong>der</strong> <strong>Zell</strong>en<br />
Zur Mikroskopie leben<strong>der</strong> <strong>Zell</strong>en wird <strong>die</strong> Focht-Durchflußkammer verwendet. Die mit den GFP-<br />
Fusiononsproteinen tranzfizierten <strong>Zell</strong>en bewachsenen Deckgläschen werden in <strong>die</strong> Kammer<br />
eingespannt <strong>und</strong> <strong>die</strong> Kammer vorsichtig mit Observationsmedium (s. 2.3.3) luftblasenfrei befüllt. Die<br />
Kammer <strong>und</strong> das Objektiv werden <strong>auf</strong> 37°C geheizt. Nach <strong>der</strong> <strong>Ausbildung</strong> eines stabilen<br />
Temperaturgra<strong>die</strong>nten kann mit <strong>der</strong> Aufnahme von Sequenzen o<strong>der</strong> Einzelbil<strong>der</strong>n begonnen werden.<br />
Für <strong>die</strong> Aufnahme von Einzelbil<strong>der</strong>n müssen <strong>die</strong> folgenden Parameter festgelegt werden:<br />
Auswahl des Shutters für Fluoreszenz- o<strong>der</strong> Phasenkontrast-Beleuchtung, Belichtungsstärke,<br />
Bildgröße <strong>und</strong> Länge <strong>der</strong> Belichtungszeit.
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