Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
Brutschrank inkubiert, anschließend zweimal mit PBS gewaschen und 2-4 h in Postinfektionsmedium
mit 15µg/ml Gentamycin inkubiert.
2.13 Durchflußzytometrie
Die mit CD44tail-GFP transfizierten RPM-MC- und PtK2-Zellen werden anhand der
Fluoreszenzintensität des transferierten GFP-Fusionsproteins mittels Durchflußzytometrie in definierte
Populationen (sehr stark, stark und schwach exprimierende) sortiert.
Die zu sortierenden Zellen werden auf einer 10 cm Schale bei etwa 80 % Konfluenz trypsinisiert,
pelletiert (1000 x g, 4 min, RT) und in 1 ml eiskalten FACS-Puffer (2 % FCS in PBS) resuspendiert.
Die suspendierten Zellen werden bis zur Durchflußzytometrie auf Eis gehalten. Direkt vor der
Durchflußzytometrie wird zur Markierung von toten Zellen Propidiumiodid bis zu einer
Endkonzentration von 10 µg/ml zugegeben.
Es wurden den Parametern entsprechend 1x10 4 – 1x10 5 lebende Zellen im FACS-Gerät (“fluorescence
activated cell sorter“, Becton Dickinson Vantage mit Cell-Quest Software) aussortiert, mit Standard-
Medium gewaschen und in einer 6 cm Schale plattiert. Um einer Kontamination vorzubeugen, wird
dem Medium neben Penecilin/Streptomycin noch 50 µg/ml Gentamycin zugesetzt.
2.14 Digitale Fluoreszenzmikroskopie
Bei der Fluoreszenzmikroskopie werden spezielle Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) an Proteine
oder andere Zellbestandteile gekoppelt. Durch Anregung dieser Farbstoffe mit einer definierten
Wellenlänge emittieren sie Licht mit einer längeren Wellenlänge, beginnen also zu fluoreszieren.
Dadurch ist es möglich, die räumliche und zeitliche Lokalisation der markierten Zellbestandteile in
einer lebenden oder fixierten Zelle zu bestimmen.
Das optische System eines Fluoreszenzmikroskops weist im Gegensatz zu einem normalen Mikroskop
einige Besonderheiten auf. Es besteht aus zwei Sperrfiltern und einem dichroitischen Spiegel. Eine
Quecksilberhochdruckdampflampe strahlt Licht auf den ersten Sperrfilter, dieser ermöglicht nur den
Durchtritt von Licht einer bestimmten Wellenlänge, mit der die Fluorochrome angeregt werden sollen.
Das Licht trifft auf den dichroitischen Spiegel, welcher das Licht reflektiert und durch das Objektiv
auf die Probe leitet. Die Fluorochrome absorbieren das Licht und emittieren energiärmeres, also
längerwelliges Licht. Das längerwellige Licht wird von dem dichroitischen Spiegel nicht reflektiert
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