Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
und ü.N in Wasser gelassen. Danach werden sie für 1 h in 50 µg/ml Poly-L-Lysin-Lösung beschichtet,
wieder mehrmals gewaschen und ü.N. in Wasser gelassen. Am nächsten Tag erfolgt unter UV-Licht
für 30 min die Sterilisation.
2.12.4 Trypsinisieren und Passage
Nachdem die Zellen eine bestimmte Konfluenz erreicht haben (s. Kap. 2.9.1) werden sie enzymatisch,
durch das Zerstören von Zell-Matrix-Verbindungen von dem Boden der Kulturschale abgelöst,
verdünnt und in einer neuen Kulturschale wieder ausgesät.
Die Zellen werden zunächst mit vorgewärmten PBS gewaschen und in Trypsin-EDTA-Lösung
(Gibco) solange inkubiert, bis sich die Mehrzahl der Zellen sichtbar abgerundet hat. Anschließend
werden sie mit einer Pipette abgelöst, vereinzelt und mit frischen vorgewärmten Medium verdünnt
und in einer neuen Kulturschale replattiert.
2.12.5 Antibiotika-Selektion von stark CD44-exprimierenden RPM-MC-Zellen
Zur Herstellung von stark CD44-exprimierenden RPM-MC-Zellen muss zuerst die heterogene
Zellpopulation soweit verdünnt werden, dass statistisch sich nur eine Zelle/Mikrotiterwell befindet und
entsprechend ausgesät. Nach ca. 1 Woche werden die gewachsenen Kolonien durch Zugabe von 50 µl
Trypsin/well vorsichtig abgelöst und in eine 6cm Kulturschale übertragen. Ab dieser Passage werden
die Zellen immer unter Zugabe von 1mg/ml Neomycin (G418) weiterkultiviert. Nachdem diese
Platten zu 80% konvluent bewachsen sind, werden die Zellen trypsinisiert und 1:10 auf eine 10 cm
Zellkulturschale ausgesät. Von den Resistenzklonen werden Zellextrakte angefertig und mittels
Western-Blot auf den Expressionsgehalt des CD44-Rezeptors analysiert. Stark CD44-exprimierende
Zellklone werden zur späteren Analyse weiter kultiviert, die restlichen Zellklone werden verworfen.
2.12.6 Bestimmung der Zellzahl
Zur Bestimmung der Zellzahl werden die Zellen abgelöst, verdünnt und in einer Neubauer-
Zählkammer ausgezählt.
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