Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
48<br />
Zielprotein primärer Antikörper sek<strong>und</strong>ärer Antikörper<br />
Ezrin anti-Ezrin 3C12 (NeoMarkers),<br />
1:100<br />
anti-Ezrin C-15 (Santa Cruz),<br />
1:200<br />
anti-Ezrin C-19 (Santa Cruz),<br />
1:100<br />
CD44 anti-HCAM (Santa Cruz), 1:200<br />
anti-CD44 IgG 5G8, 1:200<br />
Merlin anti-NF2 C-18 (Santa Cruz),<br />
1:100<br />
Ziege-anti-Maus IgG (Molecular Probes), 1:500<br />
Esel-anti-Ziege IgG (Dianova), 1:200<br />
Esel-anti-Ziege IgG (Dianova), 1:200<br />
Esel-anti-Ziege IgG (Dianova), 1:200<br />
Ziege-anti-Maus IgG (Molecular Probes), 1:500<br />
Ziege-anti-Kanninchen IgG (Dianova), 1:200<br />
Listerien anti-Listerien-Serum K52, 1:100 Ziege-anti-Kanninchen IgG (Dianova), 1:200<br />
F-Aktin Texas-Red konjungiertes Phalloidin (Dianova), 1:200<br />
Alexa Fluor 488 konjungiertes Phalloidin (Molecular Probes), 1:200<br />
Alexa Fluor 350 konjungiertes Phalloidin (Molecular Probes), 1:50 – 1:100<br />
Tab. 4 : In <strong>der</strong> Immunfluoreszenz verwendete Antikörper<br />
2.11.3 Reinigung von monoklonalen Antikörpern über Protein G<br />
Die monoklonalen Antikörper (mAk) werden aus Überständen von Hybridom-Suspensionskulturen<br />
isoliert. Der Kulturüberstand wird zunächst bei 10000 x g in einem GS3-Rotor abzentrifugiert <strong>und</strong><br />
anschließend durch einen Faltenfilter (Whatman) gegeben. Bevor <strong>der</strong> Überstand <strong>auf</strong> <strong>die</strong> Säule gegeben<br />
wird, wird <strong>die</strong> Säule mit 30 ml PBS gewaschen. Der <strong>Zell</strong>überstand wird dann über <strong>die</strong> mit etwa 10 ml<br />
Protein-G-Sepharose gepackte Säule geschickt.<br />
Vor <strong>der</strong> Elution wird <strong>die</strong> Säule mit 40-80 ml PBS gewaschen <strong>und</strong> zur Kontrolle <strong>die</strong> OD280 <strong>der</strong><br />
Waschlösung gemessen. Die Elution erfolge mit 0,1 M Glycin, pH 3,0 <strong>und</strong> das Eluat wird in 1,5 ml<br />
Fraktionen gesammelt, wobei zur Neutralisation des Eluats jeweils 100 µl Tris-HCl, pH 8,8 vorgelegt<br />
wird.<br />
Die Antikörperkonzentrationen <strong>der</strong> einzelnen Fraktionen wird durch Messung <strong>der</strong> OD280 gegen das<br />
Elutionsmittel ermittelt. Fraktionen mit einer OD280 über 1,0 werden vereinigt <strong>und</strong> gegen PBS<br />
dialysiert, Fraktionen mit einer OD280 zwischen 0,1 <strong>und</strong> 1 werden mit Centriprep-10 Röhrchen<br />
(Amicon) umgepuffert <strong>und</strong> <strong>auf</strong>konzentriert (5000 x g, 4°C).
Change language