Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
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2.11.2 Immunfluoreszenz<br />
2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
Bei <strong>der</strong> indirekten Immunfluoreszenz fixierter <strong>Zell</strong>en erfolgt <strong>die</strong> Visualisierung <strong>der</strong> <strong>Proteine</strong> nicht<br />
durch <strong>die</strong> direkte Kopplung eines Fluoreszenzfarbstoffs an das Protein, son<strong>der</strong>n durch <strong>die</strong><br />
Hybridisierung <strong>der</strong> <strong>Proteine</strong> mit einem Primärantikörper gegen den ein fluoreszenzmarkierter<br />
sek<strong>und</strong>ärer Antikörper gerichtet ist. Durch <strong>die</strong> Bindung mehrerer Sek<strong>und</strong>ärantikörper an einem<br />
primären Antikörper wird eine hohe Sensitivität erreicht, <strong>der</strong>en Prinzip auch in quantitativen<br />
Methoden genutzt wird (z.B. ELISA).<br />
Um Aussagen über <strong>die</strong> Lokalisation <strong>der</strong> <strong>Proteine</strong> machen zu können, müssen <strong>die</strong>se zunächst mit<br />
Paraformaldehyd, welches Proteinkomponenten miteinan<strong>der</strong> vernetzt, fixiert werden. Damit <strong>die</strong><br />
Antikörper in <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en <strong>und</strong> <strong>die</strong> entsprechenden Kompartimente gelangen können, müssen <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en<br />
mit einem Detergens permeabilisiert werden, in <strong>die</strong>ser Arbeit wird das Detergens Triton X-100<br />
verwendet.<br />
Durchführung <strong>der</strong> Fixierung <strong>und</strong> Antikörper-Hybridisierung:<br />
Bei <strong>der</strong> Durchführung ist zu beachten, dass <strong>die</strong> verwendeten Lösungen alle <strong>auf</strong> RT vorgewärmt sind.<br />
Die Deckgläschen werden zweimal mit PBS für 10 min gewaschen, mit 3,7% (w/v) Paraformaldehyd<br />
in PBS für 20 min bei RT fixiert <strong>und</strong> anschließend für 1 min mit 0,2% Triton-X 100 permeabilisiert.<br />
Nachdem <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en fixiert <strong>und</strong> permeabilisiert sind, werden sie zur Absättigung von unspezifischen<br />
Bindungsstellen 15 min mit 1% BSA in TBS inkubiert. Anschließend werden 15 µl des primären<br />
Antikörpers (s.u.) <strong>auf</strong> einen Streifen Parafilm getropft, das Deckgläschen umgekehrt <strong>auf</strong> <strong>die</strong>sen<br />
Tropfen gelegt <strong>und</strong> 30 min hybridisiert. Überschüssige Antikörper werden durch zweimaliges<br />
Waschen (je 10 min) mit TBS entfernt. Es folgt <strong>die</strong> 30 minütige Hybridisierung mit dem<br />
Sek<strong>und</strong>ärantikörper (s. Tab. 4) <strong>und</strong> zweimaliges Waschen mit TBS. Die Deckgläschen werden<br />
umgekehrt <strong>auf</strong> einen Tropfen ProLong Antifade (Molekular Probes) <strong>auf</strong> einen Objektträger gelegt<br />
<strong>und</strong> 1 h bei 37°C getrocknet. Die Lagerung <strong>der</strong> Objekte erfolgt bei 4°C im Dunkeln.<br />
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