Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
Das Peroxidase-Substrat (Lumi-Light Western Blotting Substrate, Roche) wird den Angaben des
Herstellers entsprechend angesetzt. Die gewaschene Membran wird für ca. 1 min bei RT mit der
proteintragenden Seite nach oben mit Substrat benetzt. Anschließend lässt man das Substrat vorsichtig
auf Filterpapier ablaufen und legt die Membran luftblasenfrei zwischen zwei Overhead-Folien. Auf
der so eingeschlagenen Membran wird für 5 Sekunden bis zu 30 Minuten ein Röntgenfilm (BIOMAX
MR, Kodak) durch Auflegen exponiert. Dieser wird in einer automatischen Entwicklungsmaschine
(Agfa Curix 50) entwickelt.
46
Blocklösung:
10x TBS:
TBS-T:
10% FCS in TBS-T
Tris-HCl, pH 7,6 0,2 M
NaCl 1,37 M
0,1% TWEEN-20 (v/v) in TBS
Zielprotein primärer Antikörper sekundärer Antikörper
ERM anti-Ezrin C-19 (Santa Cruz), 1:500 Esel-anti-Ziege IgG-Peroxidase
(Dianova), 1:2000
Ezrin anti-Ezrin 3C12 (NeoMarkers), 1:1000 Ziege-anti-Maus IgG- + IgM-Peroxidase
(Dianova), 1:2000
Merlin anti-Merlin C-18 (Santa Cruz), 1:1000 Ziege-anti-Kaninchen IgG-Peroxidase
(Dianova), 1:2000
α-Tubulin anti-α-Tubulin α3A2 IgG, 1:50000 Ziege-anti-Maus IgG- + IgM-Peroxidase
(Dianova), 1:2000
GFP anti-GFP 101G4 IgG Zellüberstand Ziege-anti-Maus IgG- + IgM-Peroxidase
(Dianova), 1:2000
Phospho-Thr anti-Phosphothreonin IgG (Biomol),
1:1000
Tab. 3: Verwendete Antikörper für die Immundetektion
Ziege-anti-Maus IgG- + IgM-Peroxidase
(Dianova), 1:2000