Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
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Verwendete Puffer <strong>und</strong> Lösungen:<br />
- Coomassie-Färbelösung:<br />
- Coomassie-Entfärber:<br />
2.10.6 Silber-Färbung<br />
Coomassie Brillant Blue R250 0,1 % (w/v)<br />
Isopropanol 45 % (v/v)<br />
Essigsäure 9 % (v/v)<br />
H2O 46 % (v/v)<br />
Essigsäure 10 % (v/v)<br />
Methanol 40 % (v/v)<br />
H2O 50 % (v/v)<br />
2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
Die Silber-Färbung wird mit einem "Silver Stain Plus Kit" (Bio-Rad) in gründlich gereinigten<br />
Glasschalen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion wird abgestoppt, indem das Gel<br />
in 5% (v/v) Essigsäure überführt wird. Anschließend wird das Gel ggf. gescannt <strong>und</strong> getrocknet.<br />
2.11 Immunologische Arbeitsmethoden<br />
2.11.1 Imm<strong>und</strong>etektion <strong>und</strong> Chemolumineszenz<br />
Die spezifische Detektion bestimmter geblotteter <strong>Proteine</strong> <strong>auf</strong> <strong>der</strong> PDVF-Membran erfolgt durch<br />
Antikörpermarkierung. Die Chemolumineszenz stellt ein hochsensitives Nachweisverfahren zur<br />
Detektion von immobilisierten Antigenen dar. Sie basiert <strong>auf</strong> <strong>der</strong> Peroxidaseaktivität, <strong>die</strong> an <strong>die</strong><br />
Sek<strong>und</strong>ärantikörper gekoppelt ist <strong>und</strong> in Anwesenheit von H2O2 Luminol oxi<strong>die</strong>rt. Bei <strong>die</strong>sem Prozess<br />
wird Licht freigesetzt, welches einen Röntgenfilm belichtet.<br />
Die Inkubation mit dem primären Antikörper findet bei Raumtemperatur für 1h <strong>auf</strong> dem Schwenktisch<br />
statt. Zur Absättigung unspezifischer Bindungen wird <strong>die</strong> Membran über Nacht bei 4°C in<br />
Blocklösung geschwenkt. In Abhängigkeit vom nachzuweisenden Protein wird <strong>der</strong> primäre Antikörper<br />
als purer Hybridomazellüberstand o<strong>der</strong> in Blocklösung verdünnt eingesetzt (s. Tab. 3). Nach<br />
einstündiger Inkubation wird <strong>die</strong> Membran für jeweils 10 min mit TBS-T, TBS-T mit 0,5 M NaCl,<br />
TBS-T mit 0,5% Triton-X 100 (v/v) <strong>und</strong> TBS-T bei Raumtemperatur gewaschen. Es folgt <strong>die</strong><br />
Inkubation mit dem Peroxidase-gekoppelten sek<strong>und</strong>ären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur.<br />
Abschließend wird <strong>die</strong> Membran wie oben beschrieben gewaschen <strong>und</strong> in PBS gelagert.<br />
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