Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

Verwendete Puffer und Lösungen:
- Coomassie-Färbelösung:
- Coomassie-Entfärber:
2.10.6 Silber-Färbung
Coomassie Brillant Blue R250 0,1 % (w/v)
Isopropanol 45 % (v/v)
Essigsäure 9 % (v/v)
H2O 46 % (v/v)
Essigsäure 10 % (v/v)
Methanol 40 % (v/v)
H2O 50 % (v/v)
2. Material und Methoden
Die Silber-Färbung wird mit einem "Silver Stain Plus Kit" (Bio-Rad) in gründlich gereinigten
Glasschalen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion wird abgestoppt, indem das Gel
in 5% (v/v) Essigsäure überführt wird. Anschließend wird das Gel ggf. gescannt und getrocknet.
2.11 Immunologische Arbeitsmethoden
2.11.1 Immundetektion und Chemolumineszenz
Die spezifische Detektion bestimmter geblotteter Proteine auf der PDVF-Membran erfolgt durch
Antikörpermarkierung. Die Chemolumineszenz stellt ein hochsensitives Nachweisverfahren zur
Detektion von immobilisierten Antigenen dar. Sie basiert auf der Peroxidaseaktivität, die an die
Sekundärantikörper gekoppelt ist und in Anwesenheit von H2O2 Luminol oxidiert. Bei diesem Prozess
wird Licht freigesetzt, welches einen Röntgenfilm belichtet.
Die Inkubation mit dem primären Antikörper findet bei Raumtemperatur für 1h auf dem Schwenktisch
statt. Zur Absättigung unspezifischer Bindungen wird die Membran über Nacht bei 4°C in
Blocklösung geschwenkt. In Abhängigkeit vom nachzuweisenden Protein wird der primäre Antikörper
als purer Hybridomazellüberstand oder in Blocklösung verdünnt eingesetzt (s. Tab. 3). Nach
einstündiger Inkubation wird die Membran für jeweils 10 min mit TBS-T, TBS-T mit 0,5 M NaCl,
TBS-T mit 0,5% Triton-X 100 (v/v) und TBS-T bei Raumtemperatur gewaschen. Es folgt die
Inkubation mit dem Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur.
Abschließend wird die Membran wie oben beschrieben gewaschen und in PBS gelagert.
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